类雌激素毒性快速检测试片的制备方法
专利汇可以提供类雌激素毒性快速检测试片的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种类雌 激素 毒性快速检测试片的制备方法，该试片能够实现对类雌激素毒性的快速在线检测，它包括下列步骤：首先是对 抗原 的诱导和分离纯化，离心获得血清，将VTG蛋白溶液脱盐冻干成为冻干粉；其次是 抗体 的诱导，获得抗血清；再是抗体的分离纯化，分离后的卵黄蛋白原抗体除盐后冻干；第四是胶体金—抗体结合物的制备；第五是胶体金—抗体结合物的 吸附 ；第六是抗原和抗体的 固化 ；第七是试片的装配。本发明方法简单，操作方便，试片体积小，便于携带和使用，适合环保、科研、商检及食品 水 产等单位进行类雌激素污染检测。，下面是类雌激素毒性快速检测试片的制备方法专利的具体信息内容。
1、一种类雌激素毒性快速检测试片的制备方法，其步骤如下：
A、抗原的诱导和分离纯化，配制17α-乙炔基雌二醇溶液，将100mg17α- 乙炔基雌二醇先溶于5mL丙酮中，再转溶于10mL豆油，丙酮用氮气吹干，腹 腔注射，5mg/kg，暴露5-7天，取鱼血，4℃离心获得血清，血清通过离子交换 层析柱，填料为DEAE Sepharose CL-6B，柱子用0.025mol/L Tris·HCl，pH7.5 平衡，加样2mL，梯度洗脱，收集洗脱液，将VTG蛋白溶液脱盐冻干成为冻干 粉；
B、抗体的诱导，免疫兔获得卵黄蛋白原抗体，在兔皮内注射1mgVTG蛋白， 1mg蛋白溶于1mL水中，再加入1mL佐剂，第28、42、56天各加强免疫一次， 70天颈动脉放血，4℃离心获得抗血清；
C、抗体的分离纯化，抗血清通过亲和层析柱，填料为Protein A Sepharose CL-4B，分离后的卵黄蛋白原抗体除盐后冻干；
D、胶体金-抗体结合物的制备，首先是待标抗体稳定量的确定，用光电比色 法或目测法；其次是抗体的标记，在电磁搅拌下，将抗体蛋白质溶液加入胶体金 溶液中，加入蛋白质时应逐滴加入；再是浓缩，用超滤离心管浓缩到原体积的 1/10量；
E、胶体金-抗体结合物的吸附，将玻璃纤维膜浸没在浓缩过的胶体金标记抗 体的溶液中，待完全浸透后取出，晾干；
F、试片的装配，在一个不吸水的底衬上，依次粘贴吸水材料(1)、玻璃纤 维膜(2)、硝酸纤维膜(3)、吸水材料(6)，硝酸纤维膜(3)上分别固定了抗 体(4)和抗原(5)。
2、根据权利要求1所述的一种类雌激素毒性快速检测试片的制备方法，其 特征在于抗体的分离纯化，其步骤是：
(a)、20倍柱体积的0.1mol/L Tris·HCl，pH8.0平衡柱子；
(b)、上抗血清样品；
(c)、依次用10倍柱体积的100mmol/L Tris·HCl，pH8.0和10倍柱体积 的10mmol/L Tris·HCl，pH8.0洗柱；
(d)、加入5倍柱体积的100mmol/L Gly，pH3.0，收集样品，每管预先加 入200μL 1mol/L Tris·HCl，pH8.0，每管收集0.5mL；
(e)、在280nm处测定收集样品的吸光值以检出IgG组分，流出组分中IgG 的浓度为1mg/mL；
(f)、10倍柱体积的100mmol/L Tris·HCl，pH8.0调节柱床。
技术领域
本发明涉及一种类雌激素毒性快速检测试片的制备方法，该方法制备的检测 试片能够实现对类雌激素毒性的快速在线检测，以便确定类雌激素的生态毒理学 效应，也可以作为环保、科研、商检及食品水产等单位进行类雌激素污染的检测 和研究。
背景技术
雌激素是人和动物体内重要的化学信使之一，对生长发育、内分泌功能、生 殖功能起着重要的作用。现已发现，水环境中存在着一类具有雌激素活性，能够 模拟雌激素功能的环境化学物质，称之为类雌激素。这类物质主要包括避孕药中 的合成雌激素；植物产生的某些天然物质和一些人工合成的环境污染物(如多氯 联苯、DDT、邻苯二甲酸酯、烷基酚等)。由于这些物质能够影响机体正常的激 素代谢，干扰内分泌功能，导致发育生殖异常，因而越来越受到人们的关注和重 视。
由于类雌激素的种类繁多，化学结构差异很大，很难用某个通用的化学结构 式表示。因而，很难使用化学仪器来鉴别。由于化学分析不能给出类雌激素的毒 性效应，仅能检测已知类雌激素的种类和浓度，这样，即使检测出某些类雌激素 具有相同的环境浓度，但也无法区分它们的雌激素活性的大小。因此，目前对类 雌激素毒性的检测主要是通过生物筛选来进行。生物筛选是根据化合物对生物的 雌激素效应，来确定所测化合物是否为类雌激素，其主要方法有：
动物实验。通过测定类雌激素对性成熟前实验动物(如大鼠和小鼠)子宫生 长的促进作用来评价其雌激素活性，评价标准有子宫湿重和子宫湿重与体重之 比。在鱼中则为性腺与体重之比。这种方法是经典的类雌激素毒性检测方法，它 能够检测多种雌激素，灵敏度较高，操作也较方便，但受到实验本身所选指标的 限制，存在较大的实验误差。
细胞培养。利用对雌激素敏感的细胞系检测类雌激素活性。所用的细胞系有 人乳腺癌MCF7、T47D细胞和ZR-75-1细胞、Hela细胞、大鼠子宫原代细胞、 大鼠垂体原代细胞、鼠淋巴细胞经基因转染的LeC-9细胞等。环境化合物的雌激 素活性可以通过细胞的增殖试验检验；其活性也可以通过雌激素作用元件调控的 基因表达和雌激素所诱导的孕激素生成来加以检测。目前使用最为广泛的是 MCF7细胞系，它的好处在于能反映对人体的作用，并且灵敏度较高。在用细胞 培养进行类雌激素毒性检测时，假阳性或假阴性的比例较高，这是该方法主要的 不足之处，也是在使用这种方法时必须注意的问题。
雌激素受体结合试验。体外测定类雌激素与雌激素受体的特异性亲和力来检 测其活性大小。雌激素需与受体蛋白结合为复合物，才能作用于相应的靶器官产 生作用。受体亲和力与雌激素活性之间具有明显的相关性，但激素与受体的结合 并不一定激活雌激素受体和激素控制的基因表达。类雌激素与受体的亲和力大小 可以通过对氚标记雌二醇的竞争性抑制反应来测定。该法由于需要使用同位素标 记物，所以实验操作具有一定的危害性。
卵黄蛋白原(Vitellogenin，VTG)诱导。卵黄蛋白原是卵生脊椎动物中卵黄 蛋白的前体，通常只有性成熟的雌鱼中才能产生。但在类雌激素存在时，性成熟 的雄鱼和幼鱼体内也能产生卵黄蛋白原，通过检测性成熟的雄鱼和幼鱼体内是否 存在卵黄蛋白原可以确定环境化合物是否具有雌激素效应。目前检测卵黄蛋白原 主要有ELISA和Western Blotting两种方法。该法最大的不足是由于卵黄蛋白原 是一种种特异性蛋白，因而，检测不同鱼体内的卵黄蛋白原时，需要有相应的卵 黄蛋白原和卵黄蛋白原抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种类雌激素毒性快速检测试片的制备方法，方法 简单可靠，操作简便，解决了类雌激素毒性的快速在线检测问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：卵黄蛋白原通常情况下只有 性成熟的雌鱼中才能产生，虽然，性成熟的雄鱼和幼鱼体内也存在卵黄蛋白原的 基因，但在正常情况下并不表达。当环境中存在类雌激素时，性成熟的雄鱼和幼 鱼体内的卵黄蛋白原基因能够被诱导表达，在体内合成卵黄蛋白原。因此，通过 检测性成熟的雄鱼和幼鱼体内是否存在卵黄蛋白原就可以确定其生活的环境是 否受到类雌激素的污染。
检测试片以免疫层析为原理，能够定性或半定量检测卵黄蛋白原。检测试片 从下到上依次为吸水材料、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、吸水材料。玻璃纤维膜上 吸附了胶体金标记的卵黄蛋白原抗体，硝酸纤维膜上依次固定了卵黄蛋白原抗体 和卵黄蛋白原。鱼血清样品从下至上层析。如果样品中含有卵黄蛋白原，则与从 玻璃纤维膜上复溶下来的胶体金标记的卵黄蛋白原抗体结合，形成抗原抗体复合 物。复合物继续向上层析，与硝酸纤维膜上固定的卵黄蛋白原抗体结合显色，而 未与卵黄蛋白原结合的胶体金标记卵黄蛋白原抗体则再继续向上层析与卵黄蛋 白原结合显色。即样品中含有卵黄蛋白原时，检测试片显示两条红线，样品中不 含卵黄蛋白原时，检测试片显示一条红线。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：检测试片建立在抗原和抗体 的结合反应基础之上，因而具有很强的专一性和可靠性，能够定性或半定量检测 样品中卵黄蛋白原的存在，从而确定类雌激素是否存在。检测试片体积很小，便 于携带和使用。使用时仅需100μL左右的鱼血清，整个分析过程可在30分钟内 完成，不需要特殊仪器和试剂，操作人员也无需特殊培训，非常适合野外的在线 检测。可以作为环保、科研、商检及食品水产等单位进行类雌激素污染检测的手 段之一，也可以作为确定类雌激素的初筛方法，与实验室精确的化学分析相辅相 成。
附图说明
图1为一种类雌激素毒性快速检测试片的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述：
(1)抗原的诱导和分离纯化
配制17α-乙炔基雌二醇(17α-ethinylestradiol，EE2)溶液：将100mg17 α-乙炔基雌二醇先溶于5mL丙酮中，再转溶于10mL豆油，丙酮用氮气吹干。
腹腔注射，5mg/kg。暴露5-7天。取鱼血，4℃离心获得血清。
血清通过离子交换层析柱，填料为DEAE Sepharose CL-6B。柱子用 0.025mol/L Tris·HCl，pH7.5平衡，加样2mL，梯度洗脱(左：0.025mol/L Tris·HCl， pH7.5，0.5mol/L NaCl；右：0.025mol/L Tris·HCl，pH7.5)。部分收集器收 集洗脱液，以电泳确定各管中是否含有VTG。将VTG蛋白溶液脱盐冻干成为冻 干粉。
(2)抗体的诱导
免疫新西兰大白兔获得卵黄蛋白原抗体。在兔子皮内注射1mgVTG蛋白， 皮内多点注射。1mg蛋白溶于1mL水中，再加入1mL佐剂。
第28、42、56天各加强免疫一次，剂量与第一次相同。
70天颈动脉放血，4℃离心获得抗血清。
(3)抗体的分离纯化
抗血清通过亲和层析柱，填料为Protein A Sepharose CL-4B。
(a)、20倍柱体积的0.1mol/L Tris·HCl，pH8.0平衡柱子
(b)、上抗血清样品
(c)、依次用10倍柱体积的100mmol/L Tris·HCl，pH8.0和10倍柱体积 的10mmol/L Tris·HCl，pH8.0洗柱
(d)、加入5倍柱体积的100mmol/L Gly，pH3.0，收集样品，每管预先加 入200μL 1mol/L Tris·HCl，pH8.0，每管收集0.5mL。
(e)、在280nm处测定收集样品的吸光值以检出IgG组分，流出组分中IgG 的浓度至少为1mg/mL(OD280为1.33)
(f)、10倍柱体积的100mmol/L Tris·HCl，pH8.0调节柱床。
分离后的卵黄蛋白原抗体除盐后冻干。
(4)胶体金-抗体结合物的制备
(a)、待标抗体的准备。将卵黄蛋白原抗体溶于蒸馏水配成蛋白溶液。胶体 金pH调至7.4-7.6，用0.1mol/L K2CO3溶液上调，用0.1mol/LHCl溶液下调。
(b)、待标抗体最适稳定量的确定。
待标抗体最适稳定量的确定可用光电比色法或目测法。
光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液(1mL)，分 别加入5mL胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1mL 10％NaCl溶液，摇匀， 静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520～580nm之间测定，以 OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那 一点处的蛋白质用量为最适稳定量。
目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋 白质逐级稀释后(由5μg～45μg另设对照管)，各取等体积顺序加入一系列装有 1mL胶体金的试管中，5min后，在上述各管内分别加入0.1mL10％氯化钠，混 匀静置2h以上观察结果。小于5nm颗粒的胶体金溶液，每个管内应加入5μL33％ 的双氧水，否则有不变蓝色及聚沉现象。未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体 金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的 试管则胶体金的红颜色不变。其中含蛋白量最低的试管即含稳定1mL胶体金的 必须蛋白量。在此基础上再加上20％即为稳定所需蛋白质的实际用量。
(c)、抗体的标记。
根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记抗体蛋白质的 总量。
在电磁搅拌(使用玻璃外壳搅拌子)下，将抗体蛋白质溶液加入胶体 金溶液中(pH已调至PI超过0.5pH)，加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质 大约5min加完。
在磁性搅拌下加入5％的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1％。
(d)、浓缩。用超滤离心管浓缩到原体积的1/10量。
(5)胶体金-抗体结合物的吸附
将裁剪好尺寸的玻璃纤维膜浸没在浓缩过的胶体金标记抗体的溶液中，待完 全浸透后取出，自然晾干。
(6)抗原和抗体的固化
将抗体和抗原的冻干粉分别配成蛋白溶液。再将抗原和抗体分别固定在硝酸 纤维膜的控制线和检测线上，自然晾干。硝酸纤维膜的其它区域用牛奶中的蛋白 质封闭后，取出自然晾干。
(7)试片的装配
所有部件均装配在一个不吸水的底衬上，从左到右依次在底衬上粘贴吸水材 料1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维膜3、吸水材料6。玻璃纤维膜上吸附了胶体金- 抗体结合物，硝酸纤维膜上分别固定了抗体4和抗原5。样品在试片上的层析由 左向右进行，即使用时应将试片的左端朝下插在样品中，但样品液面不能超过玻 璃纤维膜。
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