以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型及其构建和应用
阅读：83发布：2023-03-04
专利汇可以提供以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型及其构建和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型，属于 生物 医药领域。该模型利用含有NF-κB特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型NF-kB的活性细胞为 基础 构建而成，用于筛选由NF-κB组成型活化造成的 肿瘤 及免疫 疾病 的 治疗 药物。由于采用具有组成型NF-κB活性的细胞，模型细胞中报告基因处于高度活化状态，无需使用外加刺激物，得到的稳定细胞模型可直接用于化合物的筛选，不仅大大降低了筛选的成本，同时也使整个筛选流程从细胞培养→激活NF-κB→加化合物→检测简化为：细胞培养→加化合物→检测，缩短了筛选的周期，减少了操作步骤，提升了系统的 稳定性 、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。，下面是以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型及其构建和应用专利的具体信息内容。
1.以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型，其特征在于：利用含有NF-κB 特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型NF-kB 的活性细胞为基础，构建成稳定的以NF-κB信号为靶点高通量药物筛选细胞模型。
2.如权利要求1所述以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型，其特征在于：所述NF-κB 的特异性结合序列为 5’-GGGRNNYYCC-3’；其中R为嘌呤，Y 为嘧啶，N 为碱基。
3.如权利要求1所述以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型，其特征在于：所述报告系统载体是在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有NF-κB 特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。
4.如权利要求1所述以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型，其特征在于：所述具有组成型NF-κB的活性细胞为DU145，前列腺癌细胞、HepG2，人肝癌细胞、H1299人肺癌细胞、A549人肺癌细胞、HCT119人结肠癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞、MDA-MB-468人乳腺癌细胞或 MDA-MB-231人乳腺癌细胞。
5.如权利要求1所述以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型的构建，包括以下工艺步骤：
（1）报告系统载体构建：利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有NF-κB 特异性结合序列以及3’端含有 TATA 盒序列的 DNA 片段，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体；
（2）细胞模型的构建：将报告系统载体转染具有组成型NF-κB活性细胞后，用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，选取对NF-κB信号抑制剂有响应的克隆，即为以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型。
6.如权利要求1所述以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型用于筛选由NF-κB组成型活化造成的肿瘤及免疫疾病的治疗药物。
7.如权利要求6所述以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型用于筛选由NF-κB组成型活化造成的肿瘤及免疫疾病的治疗药物，其特征在于：所述药物筛选的方法包括以下工艺步骤：
（1）将所述药物筛选细胞模型用100 μl培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为30%~40%；
（2）在培养基中加入待筛选化合物0.1 μl~2μl，继续培养24 小时；
（3）在上述96孔板中加入50 μl稳定型荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率，当荧光抑制率达到40%以上得到初筛产物；
（4）以化合物细胞毒性实验消除化合物对细胞模型的直接损伤，荧光抑制率达仍在40%以上得到复筛产物，即为以NF-kB为靶点的抑制药物。
以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型及其构建和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型，尤其涉及一种以具有组成型NF-κB活性细胞为基础的药物筛选细胞模型；本发明同时还涉及该药物筛选细胞模型的构建方法和应用。
背景技术
[0002] 核 因 子 -κB（NF-κB ，nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)是重要的转录因子，主要包括 RelA （p65）、RelB、c-Rel、p50 和 p52，通常 NF-κB 以同源或者异源二聚体的形式存在，其中 p65/p50 二聚体是最常见的 NF-κB 形式。正常情况NF-κB下参与了多种生理反应，如与细胞粘附、分化、凋亡、细胞外基质的降解、炎性细胞趋化、免疫激活等等基因。多种因素可以激活NF-κB而引发下游反应，包括多种细胞因子（如肿瘤坏死因子TNFα及白细胞介素IL-1β等）、应激刺激、LPS（脂多糖）、病毒或其它外源核酸、自由基等等。在经典的通路中，NF-κB二聚体由于结合了其抑制蛋白 IκB（Inhibitor of NF-κB）而大部分滞留在细胞质中，外加刺激或病理情况下（诸如上述诱导因素）由于 IκB 被过量降解而导致 NF-κB 活化入核，行使一系列功能；同时近些年的研究表明NF-κB 二聚体如p65/p50可以在与其它一些蛋白结合的过程中被活化行使功能（如STAT3）。
[0003] NF-κB是迄今少数几个研究比较透彻、且公认的在疾病中扮演重要角色的关键分子之一。异常活化的NF-κB活性通常与肿瘤发生、发展及转移，免疫异常诸如关节炎、自身免疫、哮喘、某些心脏病等疾病相关。研究发现，在许多类型的肿瘤中，像乳腺癌、结肠癌、前列腺癌，恶性淋巴瘤细胞等等，都有持续活化的NF-κB活性。研究表明，在这一类肿瘤细胞中，抑制NF-κB活性将有效的降低肿瘤细胞的存活、增殖等过程，有效地降低其恶性程度；因此，抑制NF-κB的活性自然成为减缓和治疗免疫系统疾病的重要方案之一（Wang等人：
Science 1996； Wu等人：EMBO J 1996；Wang等人：Nat Med 1999，Yamamoto等人：J Biol Chem 1999；Yamamoto等人：Curr Mol Med 2001；Yamamoto等人：J Clin Invest 2001）。
Science 1996； Wu等人：EMBO J 1996；Wang等人：Nat Med 1999，Yamamoto等人：J Biol Chem 1999；Yamamoto等人：Curr Mol Med 2001；Yamamoto等人：J Clin Invest 2001）。
[0004] 基于上述原因，一直以来研究者们试图寻找特异性好，副作用低的NF-κB抑制剂，以最终用于临床，缓解和治疗数目庞大的相关患者。然而时至今日理想的产品少之又少，很大程度缘于没有一套高效而简易的筛选方法。基于报告系统的高通量筛选方法虽已经出现并用于实践，并取得了一定成效，但仍然有一些不可克服的缺点，比如需要外源刺激（先用激活剂激活NF-κB，再去筛选抑制剂），这样不仅筛选步骤多，而且筛选成本也较高，尤其是像细胞因子IL-1β和 TNFα等激活剂的使用将大大增高成本；即使像LPS类激活剂使用成本较低，但由于其本身毒性较大，限制了其使用；同时筛选体系每增加一步，会使报告系统的不稳定性增加（额外的操作必然会带来额外的不确定因素）。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法。
[0007] 本发明还有一个目的，就是提供一种以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型在药物筛选中的应用。
[0008] （一）以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型药物筛选细胞模型本发明以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型，是利用含有NF-κB 特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型NF-kB 的活性细胞为基础，构建成稳定的以NF-κB信号为靶点高通量药物筛选细胞模型。
所述NF-κB 的特异性结合序列为 5’-GGGRNNYYCC-3’；其中R为嘌呤，Y 为嘧啶，N 为碱基。
所述NF-κB 的特异性结合序列为 5’-GGGRNNYYCC-3’；其中R为嘌呤，Y 为嘧啶，N 为碱基。
[0009] 所述报告系统载体是在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有NF-κB 特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。
[0010] 所述具有组成型NF-κB活性细胞，为一类具有持续活化NF-κB活性的细胞，包括DU145，前列腺癌细胞、HepG2，人肝癌细胞、H1299人肺癌细胞、A549人肺癌细胞、HCT119人结肠癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞、MDA-MB-468人乳腺癌细胞或 MDA-MB-231人乳腺癌细胞等等。
[0011] （二）以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型的构建本发明以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型的构建包括以下工艺步骤：
（1）报告系统载体构建：利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有NF-κB 特异性结合序列以及3’端含有 TATA 盒序列的 DNA 片段，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体。
（1）报告系统载体构建：利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有NF-κB 特异性结合序列以及3’端含有 TATA 盒序列的 DNA 片段，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体。
[0012] 插入序列位于荧光素酶报告基因的上游，当NF-κB活化时，便可增强荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译，从而增强了荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时即可检测到更强的荧光；抑制NF-κB活性时，荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译的水平都降低，也就抑制细胞内荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时荧光强度也就减弱。
[0013] （2）细胞模型的构建：将报告系统载体转染具有组成型NF-κB活性细胞后，用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，选取对已知NF-κB信号抑制剂（如TPCA-1，Bay11-7082等已知NF-κB上游信号抑制剂）有响应的克隆，即为以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型。
[0014] 在具有组成型NF-κB活性的细胞中，报告系统载体能很好地被活化，当使用NF-κB信号通路抑制剂时即可使荧光被显著抑制，构建的细胞模型也就无需在外源刺激下灵敏地用于高通量药物筛选。
[0015] （三）以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型的应用本发明以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型用于筛选由NF-κB组成型活化造成的肿瘤及免疫疾病的治疗药物。具体筛选药物的方法如下：
（1）将所述药物筛选细胞模型用100 μl培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为30%~40%；
（2）在培养基中加入待筛选化合物0.1 μl~2μl，继续培养24 小时；
（3）在96孔板中加入50 μl稳定型荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率，当荧光抑制率达到40%以上得到初筛产物；
（4）以化合物细胞毒性实验消除化合物对细胞模型的直接损伤，荧光抑制率达仍在40%以上得到复筛产物，即为以NF-κB为靶点的抑制药物。
（1）将所述药物筛选细胞模型用100 μl培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为30%~40%；
（2）在培养基中加入待筛选化合物0.1 μl~2μl，继续培养24 小时；
（3）在96孔板中加入50 μl稳定型荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率，当荧光抑制率达到40%以上得到初筛产物；
（4）以化合物细胞毒性实验消除化合物对细胞模型的直接损伤，荧光抑制率达仍在40%以上得到复筛产物，即为以NF-κB为靶点的抑制药物。
[0016] 本发明相对于现有技术具有以下优点：以NF-κB信号通路为靶点，采用基于具有组成型NF-κB活性（即持续NF-κB活性）的细胞系为策略，使报告系统本身在细胞中处于高度活化状态，无需使用外加刺激，得到的稳定细胞模型可直接用于化合物的筛选，不仅大大降低了筛选的成本，同时也使整个筛选流程从 细胞培养→激活NF-κB→加化合物→检测 简化为 细胞培养→加化合物→检测，缩短了筛选的周期，减少了操作步骤，提升了系统的稳定性、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。附图说明
[0017] 图1为使用 Western-Blot 方法检测本发明所涉及的细胞中 NF-κB 活性结果。
[0018] 图2为使用凝胶电泳阻抑试验（EMSA）检测本发明所涉及的细胞中 NF-κB 活性结果。
[0019] 图3为所用报告载体基本骨架。
[0020] 图4为所构建的报告系统载体 κB -luc 插入序列的测序结果图。
[0021] 图5为利用 293T 细胞检测报告系统载体 κB –luc 响应能力。
[0022] 图6为抗药物筛选细胞模型对NF-κB活性升高的响应。
[0023] 图7为使用 Western-Blot方法检测DU145细胞在已知抑制剂TPCA-1处理后的NF-κB活性变化。
[0024] 图8为抗药物筛选细胞模型对NF-κB活性降低的响应。
[0025] 图9为经过复筛后所得到的化合物对NF-κB信号的抑制效果。
[0026] 图10为使用Western-Blot 方法检测所筛的8215和11017的化合物对NF-κB活化的抑制能力。
具体实施方式
[0027] 下面以DU145细胞为例说明本发明以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型的结构、构建方法和应用作进一步说明。
[0029] 试剂：萤火虫荧光素酶测定试剂盒购自Promega公司； TNFα 及IL-1β购自Peprotech公司；TPCA-1以及嘌呤霉素购自 Sigma-Aldrich 公司；用于筛药的96孔板购自Corning公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Fermentas公司；序列合成及测序，上海生工提供；DMEM（高糖）及胎牛血清购自Hyclone（Thermo公司），转染试剂 GenEscort II 购自南京慧基生物；筛选的化合物由国家小分子化合物资源中心提供；各种抗体购自Cell Signaling Technology公司。
[0030] 1、报告系统载体构建将人工合成的包含有NF-κB特异性结合序列（两个5’-GGGACTTTCC-3’及两个
5’-GGGAATTTCC-3’）以及通用的 TATA 盒辅助序5’-TATATAA-3’ 的DNA片段，以 KpnI 和 HindIII 的酶切位点插入到通用的荧光素酶报告载体pBR322-luc-puro，得到的报告系统载体命名为 κB-luc。荧光素酶报告载体pBR322-luc-puro由pBR322载体HindⅢ和SalⅠ之间插入北美萤火虫荧光素酶 (Firefly Luciferase，参见J R de Wet等人：Mol. Cell. Biol. 1987) 报告基因和嘌呤霉素基因（Puromycin，参见Lacalle RA等人：Gene.1989, GenBank: M25346.1）所得，并且荧光素酶报告基因和嘌呤霉素筛选基因通过内部核糖体进入序列（IRES）相连，嘌呤霉素基因终止密码子下游有AATAAA 序列为poly A加尾信号。
pBR322-luc-puro多克隆位点位于原EcoRⅠ和 HindⅢ之间（参见图3）。
5’-GGGAATTTCC-3’）以及通用的 TATA 盒辅助序5’-TATATAA-3’ 的DNA片段，以 KpnI 和 HindIII 的酶切位点插入到通用的荧光素酶报告载体pBR322-luc-puro，得到的报告系统载体命名为 κB-luc。荧光素酶报告载体pBR322-luc-puro由pBR322载体HindⅢ和SalⅠ之间插入北美萤火虫荧光素酶 (Firefly Luciferase，参见J R de Wet等人：Mol. Cell. Biol. 1987) 报告基因和嘌呤霉素基因（Puromycin，参见Lacalle RA等人：Gene.1989, GenBank: M25346.1）所得，并且荧光素酶报告基因和嘌呤霉素筛选基因通过内部核糖体进入序列（IRES）相连，嘌呤霉素基因终止密码子下游有AATAAA 序列为poly A加尾信号。
pBR322-luc-puro多克隆位点位于原EcoRⅠ和 HindⅢ之间（参见图3）。
[0031] 至此，在pBR322-luc-puro荧光素酶报告载体上的完整插入序列如下（测序结果见图4）：。
[0032] 2、报告系统载体性能测试由于 293T 细胞对各种外源细胞因子的刺激比较敏感，便于在外加细胞因子刺激时检测相应信号通路的活化情况，所以使用该细胞作为代表检测报告系统载体是否响应正常。
结果（见图5）表明：在NF-κB信号通路活化时所用报告系统载体响应正常，NF-κB 使用 TNFα 激活。293T 细胞于 12 孔板生长至 50%-70% 密度，转染κB-luc（2 μg/孔），载体与转染试剂的使用比例为1:2（即2 μg质粒，4 μl转染试剂，各溶于50 μl DMEM 无血清培养基，混合成 100 μl 预混液，室温静置20 min，再加入150 μl无血清 DMEM，混匀后加入 12 孔板各孔内）4小时后换成完全培养基（即含有10%胎牛血清的DMEM培养基），
12 小时以后，用 TNFα (50 ng/ml)处理 24 小时，吸去培养基，加入200 μl 裂解液裂解细胞，轻摇10min，取150 μl于96孔板中，加入20 μl普通萤火虫荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪立即测定（1min 以内）荧光素酶的活性，对照及处理各3个重复，并独立重复试验3次（***，p<0.001）。
结果（见图5）表明：在NF-κB信号通路活化时所用报告系统载体响应正常，NF-κB 使用 TNFα 激活。293T 细胞于 12 孔板生长至 50%-70% 密度，转染κB-luc（2 μg/孔），载体与转染试剂的使用比例为1:2（即2 μg质粒，4 μl转染试剂，各溶于50 μl DMEM 无血清培养基，混合成 100 μl 预混液，室温静置20 min，再加入150 μl无血清 DMEM，混匀后加入 12 孔板各孔内）4小时后换成完全培养基（即含有10%胎牛血清的DMEM培养基），
12 小时以后，用 TNFα (50 ng/ml)处理 24 小时，吸去培养基，加入200 μl 裂解液裂解细胞，轻摇10min，取150 μl于96孔板中，加入20 μl普通萤火虫荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪立即测定（1min 以内）荧光素酶的活性，对照及处理各3个重复，并独立重复试验3次（***，p<0.001）。
[0033] 3、药物筛选模型细胞选择通过Western-Blot及EMSA凝胶阻抑实验分析细胞中 NF-κB 的活性，得到多种适用与本报告系统载体的NF-κB活性高（无需额外使用细胞因子刺激细胞）的肿瘤细胞系（见图1，图2），图1为使用Western-Blot方法检测本发明所涉及的细胞中 NF-κB 活性结果。
结果表明包括DU145在内的一系列肿瘤细胞比正常细胞具有更高的NF-κB活性，以 p65第
536位丝氨酸（Ser536）的磷酸化表征，标注为“pSer536-p65”，磷酸化水平越高，活性越高。
图2为使用凝胶电泳阻抑试验（EMSA）检测本发明所涉及的细胞中NF-κB活性结果。表明图
1中所用几种肿瘤细胞活化的NF-κB都比正常细胞HME1具有更高的DNA结合能力。其中，HME1，人乳腺表皮细胞（正常对照细胞）；DU145，前列腺癌细胞；HepG2，人肝癌细胞；H1299和A549为人肺癌细胞，HCT119，人结肠癌细胞；Hela，人宫颈癌细胞；MCF-7、MDA-MB-468和 MDA-MB-231为人乳腺癌细胞。
结果表明包括DU145在内的一系列肿瘤细胞比正常细胞具有更高的NF-κB活性，以 p65第
536位丝氨酸（Ser536）的磷酸化表征，标注为“pSer536-p65”，磷酸化水平越高，活性越高。
图2为使用凝胶电泳阻抑试验（EMSA）检测本发明所涉及的细胞中NF-κB活性结果。表明图
1中所用几种肿瘤细胞活化的NF-κB都比正常细胞HME1具有更高的DNA结合能力。其中，HME1，人乳腺表皮细胞（正常对照细胞）；DU145，前列腺癌细胞；HepG2，人肝癌细胞；H1299和A549为人肺癌细胞，HCT119，人结肠癌细胞；Hela，人宫颈癌细胞；MCF-7、MDA-MB-468和 MDA-MB-231为人乳腺癌细胞。
[0034] 4、药物筛选模型构建及性能测试将 κB-luc 转染 DU145 细胞（10cm 培养皿）48 小时后，1传 3，并加入嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，初始浓度为 5 μg/ml，2周后降为 2.5 μg/ml，待形成克隆（共约 3 周）后，用胰酶消化单克隆于 96 孔板，长起后再转入 48 孔板，6 孔板直至 10cm 培养皿和冻存，期间用浓度为 2.5 μg/ml的 嘌呤霉素继续维持2周。首先选取荧光素酶阳性的克隆，再检测这些克隆是否响应正常，由于即使组成型活化，信号通路一般还能对外加细胞因子有所反应，故所选阳性克隆的荧光素酶活性在细胞因子刺激时应当还能有所增加；并且由于是组成型激活，NF-κB 信号通路的抑制剂应当能使荧光素酶的活性减少，经筛选最终得到反应比较理想的细胞株，命名为145Ⅷ。所选用的抑制剂 TPCA-1为已知 NF-κB信号通路的抑制剂，作用于 NF-κB 上游 IKK2，最终减少 NF-κB 活化（参见图7 Western-Blot分析。DU145细胞传代于10 cm培养皿中，至60%~70%汇合度时，加入1 μM 或2 μM TPCA-1处理24h，同时加入DMSO作为对照），选用的 TPCA-1（1 μM）浓度经MTT实验证实对 DU145 细胞无明显生长抑制（24 小时）。图6表明145Ⅷ在外源TNFα（50 ng/ml）或IL-1β（50 ng/ml）刺激时荧光还有2~3倍提升。图8表明经 TPCA-1 处理，克隆145Ⅷ荧光素酶活性减少 49.3%（***，p<0.001）。细胞接种于 96 孔板（10，000个/孔，100 μl） 生长12 小时，换含有上述细胞因子TNFα（50 ng/ml）或IL-1β（50 ng/ml），或抑制剂TPCA-1（1 μM）的新培养液,继续培养 24 小时后，加入50 μl 稳定型荧光素酶底物（Steady-Glo），避光反应10 min后使用荧光/化学发光分析仪测定荧光素酶的活性。
[0035] 5、模型应用待筛选的抑制剂来自国家小分子化合物资源中心，选取1440种天然产物。
[0036] 将药物筛选细胞模型用100 μl培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为30%~40%；加入待筛选化合物0.25 μl（25 μM），继续培养24 h，在96孔板中加入50 μl稳定型荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率。得到 28 种有抑制性、且抑制率在40%以上的化合物，把这 28 种化合物浓度减半再次筛选，并以化合物细胞毒性实验（这里用MTT实验）消除化合物对细胞模型的直接损伤，得到仍对药物筛选细胞模型荧光素酶活性抑制率在40%以上的化合物有2种，即为能特异性抑制NF-κB的复筛产物，分别为编号时8215和11017的两种化合物（图9）。
[0037] 经Western-Blot分析验证该编号为8215和11017的化合物除了可以抑制DU145细胞中NF-κB报告系统所产生的荧光外，对人乳腺癌细胞MDA-MB-231持续活化的NF-κB活性有非常好的抑制效果（参见图10），NF-κB p65的活性水平得到了有效地抑制，证明该药物筛选模型不仅有良好的可行性和可靠性，同时有良好的通用性（所筛的化合物能在多种情况下抑制STAT3的活性）。其中，DU145细胞或MDA-MB-231传代于10 cm培养皿中，至60%汇合度时，加入编号为8215和11017的化合物（10 μM）处理2h，同时以DMSO作为对照。
[0038] 上述实验证明，通过以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型复筛得到的化合物确为以NF-κB为靶点的抑制药物，从而证明该药物筛选细胞模型的有效性。
[0039] 大量实验表明在多种具有组成型NF-κB活性的细胞中，本发明以NF-κB为靶点的药物筛选细胞模型都能取得便捷、快速、高效的筛选效果。
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