器
技术领域
[0001 ] 本
发明属于分子生物学及
微生物学技术领域。 背景技术
[0002] 伴随着工、农、
畜牧业的快速发展，留体类激素和多环芳烃类物质造成的环境和食 品污染日益严重，给人类生活健康带来了巨大危害。如何快速、高效的检测这两类污染物倍 受国内外政府部
门和相关研究机构的关注。目前，环境、食品中留体类激素及多环芳烃污染 物检测方法主要为化学和生物两大类：前者多为色谱及质谱法，仪器设备大型昂贵，检测样 品单一，样品前处理复杂，而且无法检测未知污染物；某些生物学检测方法如细胞增值实验 等，过程繁琐、耗时长、成本高，检测样品单一，对检测环境、实验人员要求严格。
发明内容
[0003] 本发明的目的是：提供一种检测留体类激素及多环芳烃的高效生物化学发光传感 器，将质粒ρΤορο-3 α -Fl和质粒ρ6分别转化进大肠杆菌中，建立了一种萤火虫
荧光素酶基 因标记的高效生物化学发光检测系统，检测对象为留体类激素和多环芳烃两大类物质。
[0004] 本发明的技术方案是：
[0005] 本发明构建了基于睾丸
酮丛毛单胞菌（C.testosteroni，C. Τ)的留体类激素及 多环芳烃高效生物化学发光检测系统。睾丸酮丛毛单胞菌能够以睾丸酮等留体类激素 作为唯一
碳源和
能源，还能降解非固醇类的多环芳烃等物质，通过3α-羟类固醇脱氢酶 (3 α -HSD)等酶的代谢，消化这类底物。荧光素酶（Luciferase)是自然界中能够产生生物 荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为“Wiotinus pyrali”的萤火虫体内的荧 光素酶（firefly luciferase)。萤火虫荧光素酶灵敏度高，适用于高通量筛选，因此自1986 年起，萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得了广泛的应用。
[0006] 本发明将质粒ρΤορο-3 α -Fl和质粒ρ6分别转化进大肠杆菌中，建立了一种萤火 虫荧光素酶基因标记的高效生物化学发光检测系统。在重组质粒ρΤορο-3 α-Fl的顺势 β -半乳糖苷酶（LacZ)启动子基因（见序列1)下游依次插入了 3 α -HSD启动子等
调控序列 (见序列2) 470
碱基对及萤火虫荧光素酶报告基因（见序列3) 1647碱基对；重组质粒ρ6含 有3 α -HSD全部调控基因（见序列4)，共5257碱基对。当环境中存在雌激素等物质时，可 以诱导Ρ6质粒上3 α -HSD的调控
序列表达调控作用的蛋白，该蛋白可使质粒ρΤορο-3 α -Fl 上的启动子启动进而表达出荧光素酶，加入荧光素酶底物后，能够产生化学发光，此时发光 强度严格受到诱导物含量的控制。
[0007] 质粒ρΤορο-3 α -Fl中顺势LacZ启动子基因能够作用于其本身质粒中的3 α -HSD 的调控序列和启动子基因，促进其后的荧光素酶大量表达，加入荧光素酶底物后，能够产生 强化学发光，对其发光
信号具有放大、增强作用。根据该高效生物化学发光
传感器的发光强 度大小，通过对照标准曲线可以计算出特异性物质的相对含量。[0008] 本发明的构建方法：
[0009] 1、将质粒ρΤορο-3 α -Fl转化进大肠杆菌HBlOl中，经过双抗性筛选得到一株重组 大肠杆菌HBlOl-Fl ：
[0010] (1)取新鲜制备的大肠杆菌HBlOl感受态细胞，将细胞均勻悬浮后置于
冰上。
[0011] (2)加入质粒 ρΤορο-3 α -Fl，冰浴。
[0012] (3) 42 V
水浴热激90秒，迅速放置冰上3分钟。
[0013] (4)加37°C预热的LB培养基，37°C，120转每分振荡培养60分钟以上；
[0014] (5)将细菌涂布在含有卡那霉素（karmmycin)和
氨苄青霉素（ampicillin)双抗性 的LB琼脂平板上。
[0015] (6)平板在37°C下正向放置1小时以上，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平板倒 置，培养16小时以上。
[0016] (7)挑取单菌落，在液体LB培养基培养，提取质粒鉴定，筛选阳性克隆，即获得重 组大肠杆菌HBlOl-Fl。
[0017] 2、将质粒p6转化进大肠杆菌HBlOl中，经过抗性筛选得到一株重组大肠杆菌 HB101-p6 ：
[0018] (1)取新鲜制备的大肠杆菌HBlOl感受态细胞，将细胞均勻悬浮后置于冰上。
[0019] (2)加入质粒p6，冰浴。
[0020] (3) 42 V水浴热激90秒，迅速放置冰上3分钟。
[0021] (4)加37°C预热的LB培养基，37°C，120转每分振荡培养60分钟以上；
[0022] (5)将细菌涂布在含有氨苄青霉素（ampicillin)抗性的LB琼脂平板上。
[0023] (6)平板在37°C下正向放置1小时，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平板倒置，培 养16小时以上。
[0024] (7)挑取单菌落，在液体LB培养基培养，提取质粒鉴定，筛选阳性克隆，即获得重 组大肠杆菌HB101-p6。
[0026] (1)将重组大肠杆菌HBlOl-Fl按体积比1 ： 50的比例接种于LB培养基中，37°C， 180〜200转每分恒温
培养箱中振荡培养，至OD6tltl = 2. 0〜4. 0。
[0027] (2)取出4000转每分离心20〜30分钟，去上清，加入无菌水将菌体混勻，4000转每分离心20〜30分钟，去上清，重复两次。
[0028] (3)加入原菌体体积1/10的无菌水及终浓度为100yg/ml溶菌酶，充分混 勻，-20°C反复冻融三次，取出，10000转每分离心20〜30分钟，吸取上清即为制备的 HBlOl-Fl无细胞系统细胞浆。
[0029] (4)将重组大肠杆菌HB101-p6按体积比1 ： 50的比例接种于LB培养基中，37°C， 180〜200转每分恒温培养箱中振荡培养，至OD6tltl = 2. 0〜4. 0。
[0030] (5)取出4000转每分离心20〜30分钟，去上清，加入无菌水将菌体混勻，4000转每分离心20〜30分钟，去上清，重复两次。
[0031] (6)加入原菌体体积1/10的无菌水及终浓度为100yg/ml溶菌酶，充分混 勻，-20°C反复冻融三次，取出，10000转每分离心20〜30分钟，吸取上清即为制备的 HB101-p6无细胞系统细胞浆。[0032] (7)将制备的重组大肠杆菌HBlOl-Fl无细胞系统细胞浆与制备的重组大肠杆菌 HB101-p6无细胞系统细胞浆用考
马斯亮蓝法分别测定蛋白含量。用无菌水将两种无细胞系 统细胞浆分别稀释到0.0aiig/ml，并按体积比1 ： 1的比例混合，即为制备的高效生物化学 发光传感器试剂。
[0033] 4、建立高效生物化学发
光标准检测曲线
[0034] (1)将检测样品的标准品用无水
乙醇溶解，分别配制浓度为lfM/L、lpM/L、InM/L、 1 μ M/L、ImM/L的标准检测液。
[0035] (2)取高效生物化学发光传感器试剂分别加入标准检测液，空白对照加入无水乙 醇，静置，再加入荧光素酶底物，用荧光酶标仪检测其化学发光值，建立标准检测曲线。
[0036] 本发明检测对象是：
[0037] 留体类激素和多环芳烃两类物质，样品检测浓度范围为：10_15至10_3摩尔每升。
[0038] 本发明的有益效果是：
[0039] 1、质粒ρΤορο-3 α -Fl中的报告基因萤火虫荧光素酶基因（firefly Iuciferase ： Fl)与之前本实验室利用报告基因绿色荧光蛋白基因（GFP)相比，检测发光强度高出十倍 以上，且检测系统稳定。
[0040] 2、质粒ρΤορο-3 α -Fl中顺势β -半乳糖苷酶基因（LacZ)启动子对萤火虫荧光素 酶基因的表达具有放大、增强效应，进一步扩大了检测的线性范围（10_15至10_3摩尔每升）， 与原绿色荧光蛋白基因（GFP)标记的传感器相比，不同留体类激素、多环芳烃的标准检测 液的检测线性范围可高出3到9个数量级。
[0041] 3、用无细胞系统检测试剂建立的传感器检测时间短，只需15分钟可完成检测，检 测体积小，具有稳定、快速、高效的特点。
[0042] 4、以往的检测方法必须在已知检测物质的前提下才能够检测物质的含量，而高效 生物化学发光传感器可以检测环境中未知留体类激素及多环芳烃的含量。
[0043] 5、可应用于所有留体类激素及多环芳烃的检测。
附图说明
[0044] 图 1、质粒 ρΤορο-3 α -Fl 示意图；
[0045] 图2、质粒ρ6示意图；
[0046] 图3、睾丸酮高效生物化学发光标准检测曲线；
[0047] 图4、雌二醇高效生物化学发光标准检测曲线；
[0048] 图5、苯并芘高效生物化学发光标准检测曲线；
[0049] 具体实施方式：
[0050]
实施例1、用睾丸酮标准品建立高效生物化学发光标准检测曲线
[0051] 1、重组大肠杆菌HBlOl-Fl的构建
[0052] (1)取新鲜制备的100 μ L大肠杆菌HBlOl感受态细胞，将细胞均勻悬浮后置于冰上。
[0053] (2)加入质粒ρΤορο-3 α-Fl 3 μ L，冰上放置30分钟。
[0054] (3) 42 V水浴热激90秒，迅速放置冰上3分钟。
[0055] (4)加600 μ L 37°C预热的LB培养基，37°C，120转每分振荡培养60分钟；[0056] (¾将200 μ L细菌涂布在含有卡那霉素（karmmycin)和氨苄青霉素 (ampicillin)双抗性的LB琼脂平板上。
[0057] (6)平板在37°C下正向放置1小时，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平板倒置，过 夜培养16小时。
[0058] (7)挑取单菌落，在液体LB培养基培养，提取质粒鉴定，筛选阳性克隆，即获得重 组大肠杆菌HBlOl-Fl。
[0059] 2、重组大肠杆菌HB101-p6的构建
[0060] (1)取新鲜制备的100 μ L大肠杆菌HBlOl感受态细胞，将细胞均勻悬浮后置于冰上。
[0061] (2)加入质粒ρ6 3 μ L，冰上放置30分钟。
[0062] (3) 42 V水浴热激90秒，迅速放置冰上3分钟。
[0063] (4)加600 μ L 37°C预热的LB培养基，37°C，120转每分振荡培养60分钟；
[0064] (5)将200 μ L细菌涂布在含有氨苄青霉素（ampicillin)抗性的LB琼脂平板上。
[0065] (6)平板在37°C下正向放置1小时，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平板倒置，过 夜培养16小时。
[0066] (7)挑取单菌落，在液体LB培养基培养，提取质粒鉴定，筛选阳性克隆，即获得重 组大肠杆菌HB101-p6。
[0067] 3、制备高效生物化学发光传感器试剂。
[0068] (1)将重组大肠杆菌HBlOl-Fl按体积比1 ： 50的比例接种于LB培养基中，37°C， 180转每分恒温培养箱中振荡培养，至OD6tltl = 3. 0。
[0069] (2)取出4000转每分离心20分钟，去上清，加入无菌水将菌体混勻，4000转每分 离心20分钟，去上清，重复两次。
[0070] (3)加入原菌体体积1/10的无菌水及终浓度为100yg/ml溶菌酶，充分混 勻，-20°C反复冻融三次，取出，10000转每分离心20分钟，吸取上清即制备的重组大肠杆 菌HBlOl-Fl无细胞系统细胞浆。
[0071] (4)将重组大肠杆菌HB101-p6按体积比1 ： 50的比例接种于LB培养基中，37°C， 180转每分恒温培养箱中振荡培养，至OD6tltl = 3. O。
[0072] (5)取出4000转每分离心20分钟，去上清，加入无菌水将菌体混勻，4000转每分 离心20分钟，去上清，重复两次。
[0073] (6)加入原菌体体积1/10的无菌水及终浓度为100yg/ml溶菌酶，充分混 勻，-20°C反复冻融三次，取出，10000转每分离心20分钟，吸取上清即为制备的重组大肠杆 菌HB101-p6无细胞系统细胞浆。
[0074] (7)将制备的重组大肠杆菌HBlOl-Fl无细胞系统细胞浆与制备的重组大肠杆菌 HB101-p6无细胞系统细胞浆用考马斯亮蓝法分别测定蛋白含量。用无菌水将两种无细胞系 统细胞浆分别稀释到0.0aiig/ml，并按体积比1 ： 1的比例混合，即为制备的高效生物化学 发光传感器试剂。
[0075] 4、建立睾丸酮标准品高效生物化学发光标准检测曲线
[0076] (1)将睾丸酮标准品用无水乙醇溶解，分别配制浓度为lfM/L、lpM/L、lnM/L、 1 μ M/L、ImM/L的标准检测液。[0077] (2)取每100 μ L高效生物化学发光传感器试剂分别加入2 μ L 5个浓度的睾丸酮 标准检测液，空白对照组加入2 μ L无水乙醇，共六个样品，30°C放置10分钟后，每个样品均 加入5μ L的荧光素酶底物，用荧光酶标仪检测其化学发光值，并建立标准曲线。
[0078] 表1.睾丸酮化学发光检测结果
[0079]
[0080] 睾丸酮标准品检测范围为10_15至10_6摩尔每升，检测化学发光强度与浓度符合三 次多项式曲线:y = -16434x3+149201x2-321112x+408121, R2 = 0. 9973
[0081] 实施例2、用雌二醇标准品建立高效生物化学发光标准检测曲线
[0082] 1、重组大肠杆菌HBlOl-Fl的构建
[0083] (1)取新鲜制备的100 μ L大肠杆菌HBlOl感受态细胞，将细胞均勻悬浮后置于冰上。
[0084] (2)加入质粒ρΤορο-3 α-Fl 3 μ L，冰上放置30分钟。
[0085] (3) 42 V水浴热激90秒，迅速放置冰上3分钟。
[0086] (4)加600 μ L 37°C预热的LB培养基，37°C，120转每分振荡培养60分钟；
[0087] (¾将200 μ L细菌涂布在含有卡那霉素（karmmycin)和氨苄青霉素 (ampicillin)双抗性的LB琼脂平板上。
[0088] (6)平板在37°C下正向放置1小时，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平板倒置，过 夜培养16小时。
[0089] (7)挑取单菌落，在液体LB培养基培养，提取质粒鉴定，筛选阳性克隆，即获得重 组大肠杆菌HBlOl-Fl。
[0090] 2、重组大肠杆菌HB101-p6的构建
[0091] (1)取新鲜制备的100 μ L大肠杆菌HBlOl感受态细胞，将细胞均勻悬浮后置于冰上。
[0092] (2)加入质粒ρ6 3 μ L，冰上放置30分钟。
[0093] (3) 42 V水浴热激90秒，迅速放置冰上3分钟。
[0094] (4)加600 μ L 37°C预热的LB培养基，37°C，120转每分振荡培养60分钟；
[0095] (5)将200 μ L细菌涂布在含有氨苄青霉素（ampicillin)抗性的LB琼脂平板上。
[0096] (6)平板在37°C下正向放置1小时，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平板倒置，过 夜培养16小时。
[0097] (7)挑取单菌落，在液体LB培养基培养，提取质粒鉴定，筛选阳性克隆，即获得重 组大肠杆菌HB101-p6。
[0098] 3、制备高效生物化学发光传感器试剂。
[0099] (1)将重组大肠杆菌HBlOl-Fl按体积比1 ： 50的比例接种于LB培养基中，37°C， 180转每分恒温培养箱中振荡培养，至OD6tltl = 3. 0。
[0100] (2)取出4000转每分离心20分钟，去上清，加入无菌水将菌体混勻，4000转每分离心20分钟，去上清，重复两次。
[0101] (3)加入原菌体体积1/10的无菌水及终浓度为100yg/ml溶菌酶，充分混 勻，-20°C反复冻融三次，取出，10000转每分离心20分钟，吸取上清即为制备的重组大肠杆 菌HBlOl-Fl无细胞系统细胞浆。
[0102] (4)将重组大肠杆菌HB101-p6按体积比1 ： 50的比例接种于LB培养基中，37°C， 180转每分恒温培养箱中振荡培养，至OD6tltl = 3. O。
[0103] (5)取出4000转每分离心20分钟，去上清，加入无菌水将菌体混勻，4000转每分 离心20分钟，去上清，重复两次。
[0104] (6)加入原菌体体积1/10的无菌水及终浓度为100yg/ml溶菌酶，充分混 勻，-20°C反复冻融三次，取出，10000转每分离心20分钟，吸取上清即为制备的重组大肠杆 菌HB101-p6无细胞系统细胞浆。
[0105] (7)将制备的重组大肠杆菌HBlOl-Fl无细胞系统细胞浆与制备的重组大肠杆菌 HB101-p6无细胞系统细胞浆用考马斯亮蓝法分别测定蛋白含量。用无菌水将两种无细胞系 统细胞浆分别稀释到0.0aiig/ml，并按体积比1 ： 1的比例混合，即为制备的高效生物化学 发光传感器试剂。
[0106] 4、建立雌二醇标准品高效生物化学发光标准检测曲线
[0107] (1)将雌二醇标准品用无水乙醇溶解，分别配制浓度为lfM/L、lpM/L、lnM/L、 1 μ M/L、ImM/L的标准检测液。
[0108] (2)取每100 μ L高效生物化学发光传感器试剂分别加入2 μ L 5个浓度的雌二醇 标准检测液，空白对照组加入2 μ L无水乙醇，共六个样品，30°C放置10分钟后，每个样品均 加入5μ L的荧光素酶底物，用荧光酶标仪检测其化学发光值，并建立标准曲线。
[0109] 表2.雌二醇化学发光检测结果
[0110]
[0111] 雌二醇标准品检测范围为10-15至10-6摩尔每升，检测化学发光强度与浓度符合 三次多项式曲线：y = -15615x3+147277x2-340838x+436881, R2 = 0. 9844
[0112] 实施例3、用苯并芘标准品建立高效生物化学发光标准检测曲线
[0113] 1、重组大肠杆菌HBlOl-Fl的构建
[0114] (1)取新鲜制备的100 μ L大肠杆菌HBlOl感受态细胞，将细胞均勻悬浮后置于冰上。
[0115] (2)加入质粒ρΤορο-3 α-Fl 3 μ L，冰上 放置30分钟。
[0116] (3) 42 V水浴热激90秒，迅速放置冰上3分钟。
[0117] (4)加600 μ L 37°C预热的LB培养基，37°C，120转每分振荡培养60分钟；
[0118] (¾将200 μ L细菌涂布在含有卡那霉素（karmmycin)和氨苄青霉素 (ampicillin)双抗性的LB琼脂平板上。
[0119] (6)平板在37°C下正向放置1小时，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平板倒置，过夜培养16小时。
[0120] (7)挑取单菌落，在液体LB培养基培养，提取质粒鉴定，筛选阳性克隆，即获得重 组大肠杆菌HBlOl-Fl。
[0121] 2、重组大肠杆菌HB101-p6的构建
[0122] (1)取新鲜制备的100 μ L大肠杆菌HBlOl感受态细胞，将细胞均勻悬浮后置于冰上。
[0123] (2)加入质粒ρ6 3 μ L，冰上放置30分钟。
[0124] (3) 42 V水浴热激90秒，迅速放置冰上3分钟。
[0125] (4)加600 μ L 37°C预热的LB培养基，37°C，120转每分振荡培养60分钟；
[0126] (5)将200 μ L细菌涂布在含有氨苄青霉素（ampicillin)抗性的LB琼脂平板上。
[0127] (6)平板在37°C下正向放置1小时，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平板倒置，过 夜培养16小时。
[0128] (7)挑取单菌落，在液体LB培养基培养，提取质粒鉴定，筛选阳性克隆，即获得重 组大肠杆菌HB101-p6。
[0129] 3、制备高效生物化学发光传感器试剂。
[0130] (1)将重组大肠杆菌HBlOl-Fl按体积比1 ： 50的比例接种于LB培养基中，37°C， 180转每分恒温培养箱中振荡培养，至OD6tltl = 3. 0。
[0131] (2)取出4000转每分离心20分钟，去上清，加入无菌水将菌体混勻，4000转每分 离心20分钟，去上清，重复两次。
[0132] (3)加入原菌体体积1/10的无菌水及终浓度为100yg/ml溶菌酶，充分混 勻，-20°C反复冻融三次，取出，10000转每分离心20分钟，吸取上清即为制备的重组大肠杆 菌HBlOl-Fl无细胞系统细胞浆。
[0133] (4)将重组大肠杆菌HB101-p6按体积比1 ： 50的比例接种于LB培养基中，37°C， 180转每分恒温培养箱中振荡培养，至OD6tltl = 3. 0。
[0134] (5)取出4000转每分离心20分钟，去上清，加入无菌水将菌体混勻，4000转每分 离心20分钟，去上清，重复两次。
[0135] (6)加入原菌体体积1/10的无菌水及终浓度为100yg/ml溶菌酶，充分混 勻，-20°C反复冻融三次，取出，10000转每分离心20分钟，吸取上清即为制备的重组大肠杆 菌HB101-p6无细胞系统细胞浆。
[0136] (7)将制备的重组大肠杆菌HBlOl-Fl无细胞系统细胞浆与制备的重组大肠杆菌 HB101-p6无细胞系统细胞浆用考马斯亮蓝法分别测定蛋白含量。用无菌水将两种无细胞系 统细胞浆分别稀释到0.0aiig/ml，并按体积比1 ： 1的比例混合，即为制备的高效生物化学 发光传感器试剂。
[0137] 4、建立苯并芘标准品高效生物化学发光标准检测曲线
[0138] (1)将苯并芘标准品用无水乙醇溶解，分别配制浓度为lfM/L、lpM/L、lnM/L、 1 μ M/L、ImM/L的标准检测液。
[0139] (2)取每100 μ L高效生物化学发光传感器试剂分别加入2 μ L 5个浓度的苯并芘 标准检测液，空白对照组加入2 μ L无水乙醇，共六个样品，30°C放置10分钟后，每个样品均 加入5μ L的荧光素酶底物，用荧光酶标仪检测其化学发光值，并建立标准曲线。[0140] 表3.苯并芘化学发光检测结果
[0141]
[0142] 苯并芘标准品检测范围为10_15至10_3摩尔每升，检测化学发光强度与浓度符合三 次多项式曲线:y = -7930. 5x3+77226x2-145810x+286787, R2 = 0. 9814。
