Protegrin-1抗菌肽衍生物在制备抗口腔致病菌药物中的用途
阅读：742发布：2020-09-05
专利汇可以提供Protegrin-1抗菌肽衍生物在制备抗口腔致病菌药物中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 氨 基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8任意一项所示的多肽在制备抗 口腔 致病菌药物中的用途。本发明还提供了一种抗口腔致病菌的药物及其用途。本发明特定序列的Protegrin-1抗菌肽衍 生物 ，能够特异性杀灭各种口腔致病菌，可用于口腔 疾病 的 治疗 及 预防 ，而且制备的特定制剂， 稳定性 强，对口腔疾病的治疗效果更佳，应用前景良好。，下面是Protegrin-1抗菌肽衍生物在制备抗口腔致病菌药物中的用途专利的具体信息内容。
1.SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8任意一项氨基酸序列所示的多肽在制备抗口腔致病菌药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述口腔致病菌为牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和/或中间普氏菌、变异链球菌、伴放线杆菌、粪肠球菌。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物为治疗口腔疾病的药物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述药物为治疗牙龈炎、牙周炎、牙髓炎、口腔黏膜炎、种植体周围炎、根尖周炎、冠周炎、口臭、龋齿的药物。
5.一种抗口腔致病菌的药物，其特征在于：它是包含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8任意一项氨基酸序列所示的多肽为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：所述制剂由包含下述重量配比的活性成分制备而成：
SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8任意一项氨基酸序列所示的多肽1份、聚赖氨酸1-15份；
优选地，所述制剂由包含下述重量配比的活性成分制备而成：
SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8任意一项所示的多肽1份、聚赖氨酸11份。
7.根据权利要求5或6所述的药物，其特征在于：所述制剂中还含有稳定剂，所述稳定剂为Vc、半胱氨酸、亮氨酸、缬氨酸、羟丙基-β-环糊精中的一种或者一种以上；
优选地，所述制剂由下述重量配比的组分制备而成：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8任意一项所示的多肽1份、聚赖氨酸11份、半胱氨酸0.25份、缬氨酸2份。
8.根据权利要求5-7任意一项所述的药物，其特征在于：所述制剂的剂型为喷雾剂、气雾剂、漱剂、膏剂、膜剂、泡腾剂。
9.权利要求5-8任意一项所述的药物在制备抗口腔致病菌药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：
所述口腔致病菌为牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和/或中间普氏菌、变异链球菌、伴放线杆菌、粪肠球菌；
所述药物为治疗口腔疾病的药物。
Protegrin-1抗菌肽衍生物在制备抗口腔致病菌药物中的
用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及Protegrin-1抗菌肽衍生物在制备抗口腔致病菌药物中的用途。
背景技术
[0002] 人体口腔中存在大量多种类的细菌，包括各种正常菌群或致病菌。其中，口腔正常菌群以血链球菌、唾液链球菌为代表，对保持宿主的正常健康和正常功能发挥作用。口腔致病菌与口腔疾病密切相关，常见口腔致病菌有牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、具核梭杆菌、变异链球菌、伴放线杆菌等。其中，牙龈卟啉单胞菌属于革兰氏阴性厌氧菌，是引起慢性牙周炎的主要致病菌，主要定植于龈沟和牙周袋中。中间普氏菌为革兰氏阴性专性厌氧菌，直接侵袭口腔组织细胞、促进炎症形成，引起中度或者重度牙龈炎、慢性牙周炎、急性坏死性溃疡性龈炎、坏疽性口炎等，对口腔健康危害大。具核梭杆菌也为革兰氏阴性专性厌氧菌，能黏附-侵袭口腔组织，与牙龈炎、牙周炎、牙髓炎、根尖周炎等发病密切相关。变异链球菌是龋齿的主要致病菌，其能将糖类物质降解生成有机酸，造成牙齿磷灰石脱落而发生龋齿。种植体周围炎中常见致病菌为牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、具核梭杆菌、伴放线杆菌、福赛氏拟杆菌、口腔链球菌和螺旋体。根管感染常见细菌为梭杆菌属、卟啉菌属、普雷沃菌属、放线菌属等，其中粪肠球菌是检出率最高的细菌。口腔疾病主要诱因为口腔致病菌，杀灭致病菌能有效治疗各种口腔疾病。
[0003] 目前对口腔疾病的治疗常使用抗生素，包括青霉素类、头孢菌素类等。抗生素最大的缺点为易产生耐药性，大量滥用抗生素具有严重的危害，造成二次感染，甚至诱导超级细菌。预计到2050年，每年死于抗生素耐药细菌感染的患者预计达到1000万人。因此，应慎用抗生素。而口腔中最常用的非抗生素化药例如氯己定，苦味非常重，在治疗浓度下，若不矫味，病人基本上不愿意使用，因此现在市面上的氯己定产品为了掩味均需加入大量的香精等矫味剂。第二个缺点为长期使用会使口腔黏膜表面和牙齿着色，舌苔发黄、味觉改变。第三个缺点为氯己定易给口腔黏膜造成刺激性，长期使用更不利于保护口腔健康。因此，使用常规化学含漱液治疗口腔疾病也非明智之选。
[0004] 抗菌肽，是广泛存在于高等生物体内的一类小分子多肽，作为天然免疫反应的组成部分，通过与细胞的细菌壁以静电作用结合，使细菌膜产生孔洞，造成细菌内遗传物质外流，而诱导其死亡，并且不易诱导细菌产生耐药性，越来越受到现代科学家的关注。抗菌肽Protegrin-1(PG-1)是从猪中性粒细胞中分离得到的由18个氨基酸残基组成的猪源抗菌肽，目前以Protegrin-1为基础，开发的一系列衍生物，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌均具有良好的杀菌活性，但目前尚无将特定Protegrin-1特定衍生物用于杀灭口腔致病菌的文献报道，更无将特定Protegrin-1衍生物制备稳定型制剂以治疗各种口腔疾病的文献报道。
发明内容
[0005] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供Protegrin-1抗菌肽衍生物在制备抗口腔致病菌药物中的用途。而且本发明以Protegrin-1抗菌肽衍生物为活性成分，辅以特定稳定剂制备的药物制剂，稳定性更强，不易被蛋白酶降解，对各种口腔疾病的治疗效果更佳。
[0006] 本发明提供了SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8任意一项氨基酸序列所示的多肽在制备抗口腔致病菌药物中的用途。
[0007] 为了描述本发明的方便，使用各种氨基酸残基的常规和非常规缩写。这些缩写是本领域技术人员熟悉的，但是为了清楚在下面列出：
[0008] Asp＝D＝天冬氨酸；Ala＝A＝丙氨酸；Arg＝R＝精氨酸；
[0009] Asn＝N＝天冬酰胺；Gly＝G＝甘氨酸；Glu＝E＝谷氨酸；
[0010] Gln＝Q＝谷氨酰胺；His＝H＝组氨酸；Ile＝I＝异亮氨酸；
[0011] Leu＝L＝亮氨酸；Lys＝K＝赖氨酸；Met＝M＝甲硫氨酸；
[0012] Phe＝F＝苯丙氨酸；Pro＝P＝脯氨酸；Ser＝S＝丝氨酸；
[0013] Thr＝T＝苏氨酸；Trp＝W＝色氨酸；Tyr＝Y＝酪氨酸；
[0014] Val＝V＝缬氨酸。
[0015] SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，为Protegrin-1抗菌肽衍生物，序列如下：
[0016] SEQ ID NO.1
[0017] H2N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Tyr-Cys-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys-{D-Val}-Cys-Val-Gly-Arg-CONH2
[0018] H2N-RGGLCYCRGRFCVCVGR-CONH2
[0019] SEQ ID NO.2
[0020] H2N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-{D-Tyr}-Cys-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-CONH2；
[0021] H2N-RGGLCYCRGRFCVCVGR-CONH2
[0022] SEQ ID NO.3
[0023] H2N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Tyr-Cys-Arg-Gly-Arg-{D-Phe}-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-CONH2；
[0024] H2N-RGGLCYCRGRFCVCVGR-CONH2
[0025] SEQ ID NO.4
[0026] H2N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-{D-Tyr}-Cys-Arg-Gly-Arg-{D-Phe}-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-CONH2；
[0027] H2N-RGGLCYCRGRFCVCVGR-CONH2
[0028] SEQ No.5
[0029] H2N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-{D-Tyr}-Cys-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys-{D-Val}-Cys-Val-Gly-Arg-CONH2；
[0030] H2N-RGGLCYCRGRFCVCVGR-CONH2
[0031] SEQ No.6
[0032] H2N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Tyr-Cys-Arg-Gly-Arg-{D-Phe}-Cys-{D-Val}-Cys-Val-Gly-Arg-CONH2；
[0033] H2N-RGGLCYCRGRFCVCVGR-CONH2
[0034] SEQ No.7
[0035] H2N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-{D-Tyr}-Cys-Arg-Gly-Arg-{D-Phe}-Cys-{D-Val}-Cys-Val-Gly-Arg-CONH2；
[0036] H2N-RGGLCYCRGRFCVCVGR-CONH2
[0037] SEQ No.8
[0038] H2N-Arg-Gly-Gly-{D-Leu}-Cys-{D-Tyr}-Cys-Arg-Gly-Arg-{D-Phe}-Cys-{D-Val}-Cys-{D-Val}-Gly-Arg-CONH2。
[0039] H2N-RGGLCYCRGRFCVCVGR-CONH2
[0040] 其上述8条氨基酸序列第5位和第14位Cys、第7位和第12位Cys形成2对二硫键。
[0041] 其中，所述口腔致病菌为牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和/或中间普氏菌、变异链球菌、伴放线杆菌、粪肠球菌。
[0042] 其中，所述药物为治疗口腔疾病的药物。
[0043] 其中，所述药物为治疗牙龈炎、牙周炎、牙髓炎、口腔黏膜炎、种植体周围炎、根尖周炎、冠周炎、口臭、龋齿的药物。
[0044] 本发明还提供了一种抗口腔致病菌的药物，它是包含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8任意一项氨基酸序列所示的多肽为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
[0045] 其中，所述制剂由包含下述重量配比的活性成分制备而成：
[0046] SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8任意一项氨基酸序列所示的多肽1份、聚赖氨酸1-15份；
[0047] 优选地，所述制剂由包含下述重量配比的活性成分制备而成：
[0048] SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8任意一项所示的多肽1份、聚赖氨酸11份。
[0049] 其中，所述制剂中还含有稳定剂，所述稳定剂为Vc、半胱氨酸、亮氨酸、缬氨酸、羟丙基-β-环糊精中的一种或者一种以上；
[0050] 优选地，所述制剂由下述重量配比的组分制备而成：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8任意一项所示的多肽1份、聚赖氨酸11份、半胱氨酸0.25份、缬氨酸2份。
[0051] 其中，所述制剂的剂型为喷雾剂、气雾剂、漱剂、膏剂、膜剂、泡腾剂。
[0052] 本发明还提供了上述药物在制备抗口腔致病菌药物中的用途。
[0053] 其中，所述口腔致病菌为牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和/或中间普氏菌、变异链球菌、伴放线杆菌、粪肠球菌；
[0054] 所述药物为治疗口腔疾病的药物。
[0055] 本发明特定序列的Protegrin-1抗菌肽衍生物，能够特异性杀灭各种口腔致病菌，而不作用于口腔正常菌群，可用于口腔疾病的治疗及预防，药效明确。而且与聚赖氨酸、稳定剂制备的制剂，稳定性强，对口腔疾病的治疗效果更佳，应用前景良好。
[0057] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
[0058] 下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
[0059] 本发明所用的实验试剂与仪器：
[0060] 美国Oral H-2S Organismes Agar培养基、OXOID的BHI培养基
[0061] 抗坏血酸、半胱氨酸、亮氨酸、缬氨酸、羟丙基-β-环糊精
[0063] 厌氧培养箱(Anaerobox IV，美国GeneScience)
[0064] 立式高压蒸汽灭菌锅(LDZM-40KCS，上海申安医疗器械厂)
[0065] 高效液相色谱仪(watres 2695)
[0066] 实施例1本发明抗口腔致病菌药物的制备
[0067] 称取60-500mg的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8任意一项所示的Protegrin-1抗菌肽衍生物，600-5000mg的聚赖氨酸，再称取一种或多种稳定剂(按照表4的种类及配比)，将组分用蒸馏水溶解后，-20℃预冷冻，-80℃冷冻后，进行冷冻干燥，得到功效成分和稳定剂凝合的混合物。然后将此混合物用蒸馏水溶解，定容至1L，即获得治疗口腔疾病的喷雾。
[0068] 实施例2本发明抗口腔致病菌药物的制备
[0069] 称取40mg的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的Protegrin-1抗菌肽衍生物，440mg的聚赖氨酸，再称取半胱氨酸10mg、缬氨酸80mg，将组分用蒸馏水溶解后，-20℃预冷冻，-80℃冷冻后，进行冷冻干燥，得到混合物。然后将此混合物用蒸馏水溶解，定容至1L，即获得治疗口腔疾病的喷雾。
[0070] 实施例3本发明多肽对口腔致病菌的杀灭作用考察
[0071] 一、不同多肽样品制备
[0072] 分别以聚赖氨酸、Protegrin-1、SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示的多肽及两者的复配物为试样，研究不同多肽对口腔致病菌的作用。
[0073] 药物配方见表1。
[0074] 表1不同多肽试样组方
[0075]
[0076]
[0077] 表1(续)不同多肽试样组方
[0078]
[0079] 备注：
[0080] Protegrin-1的序列为：ArgGlyGlyArgLeuCys Tyr CysArgArgArgPheCys Val Cys Val GlyArg；
[0081] H2N-RGGRLCYCRRRFCVCVGR-CONH2
[0082] SEQ No.9的序列为：
[0083] H2N-Arg-Gly-Gly-Leu-{D-Cys}-Tyr-Cys-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-CONH2；
[0084] H2N-RGGLCYCRGRFCVCVGR-CONH2
[0085] SEQ No.10的序列为：
[0086] H2N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Tyr-Cys-{D-Arg}-Gly-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-CONH2。
[0087] H2N-RGGLCYCRGRFCVCVGR-CONH2
[0088] 其上述Protegrin-1氨基酸序列在6位和15位、第8位和13位形成2对二硫键，SEQ No.9～SEQ No.10氨基酸序列第5位和第14位Cys、第7位和第12位Cys形成2对二硫键。
[0089] 二、对口腔致病菌抑菌效果研究
[0090] 取各药物配方制备的喷雾，以口腔致病菌牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、具核梭杆菌、血链球菌、变异链球菌、伴放线杆菌、粪肠球菌为指示菌，通过体外抑菌实验评价各药物的功效。
[0091] 1、实验方法
[0092] 挑取单菌落于5mL BHI液体培养中，于CO2 11.2％，N2 78.9％，H2 9.9％，37℃培养48h。利用磷酸缓冲液(PBS)调整菌悬液浓度至1×106CFU/mL备用。
[0093] 用打孔器将滤纸制备成直径5mm的圆形滤纸片，于121℃高压蒸汽灭菌30min，用微量进样器吸取供试样品10μL，滴加于滤纸片上，干燥后备用。以无菌水代替供试供试样品制备滤纸片，作为空白对照。
[0094] 将高压灭菌的培养基倾注入无菌培养皿中，待冷却凝固后，每皿加入0.1mL的菌悬液，涂布均匀，待菌悬液吸收后，用无菌镊子将滤纸片贴于上述含菌的培养基中，将平皿放置于厌氧罐中(混合气：CO2 11.2％，N2 78.9％，H2 9.9％；温度：37℃)，培养96h后，取出测定其抑菌圈直径。试验重复3次，计算平均抑菌圈大小。
[0095] 2、效果评价
[0096] 抑菌圈直径均>7mm，表明具有抑菌效果。抑菌圈直径越大，表明药物越敏感，活性越强。采用方差分析，t检验；P<0.05，表示有显著差异。
[0097] 3、实验结果
[0098] 见表2。
[0099] 表2多肽对口腔细菌的抑制作用
[0100]
[0101]
[0102] 备注：*,与Protegrin-1(组方2)对比，P<0.05，具有显著差异。Δ，与Protegrin-1和聚赖氨酸组(组方13)对比，P<0.01，具有极显著差异。
[0103] 由试验结果可知：
[0104] (1)聚赖氨酸、SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的多肽均对各种口腔致病菌具有抑制作用，且抑菌活性强于聚赖氨酸和Protegrin-1(P<0.05)。
[0105] (2)SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示的多肽对口腔致病菌不具有抑制作用。
[0106] (3)聚赖氨酸与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的多肽复配后对口腔致病菌具有较强抑制作用(P<0.01)，且比单独的聚赖氨酸和Protegrin-1的抑菌作用强。
[0107] (4)Protegrin-1、SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示的多肽与聚赖氨酸复配后，其抑菌效果并未增强。
[0108] (5)Protegrin-1对血链球菌具有抑制作用，而对口腔致病菌有抑制作用的聚赖氨酸、SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的多肽对口腔血链球菌不具有抑制作用，不影响口腔中正常菌群代表菌血链球菌的生长。
[0109] 由对比试验可知，Protegrin-1及其不同衍生物的抑菌活性具有显著差异。其中，本发明SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的Protegrin-1衍生物多肽对各种口腔致病菌的活性显著强于聚赖氨酸、Protegrin-1、SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10。且本发明SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的多肽具有不抑制血链球菌的作用，说明本发明中的Protegrin-1衍生物更具优势性，抑制致病菌，而不影响口腔正常菌群生长，制备抗口腔致病菌药物的效果最佳。
[0110] 实施例4本发明多肽复配比例研究
[0111] 1、药物的制备
[0112] 按照表1的重量配比称取SEQ ID NO.1所示的Protegrin-1抗菌肽衍生物、聚赖氨酸，保证总重量为480mg，分别用蒸馏水溶解后，-20℃预冷冻，-80℃冷冻后，进行冷冻干燥，得到功效成分和稳定剂凝合的混合物。然后将此混合物用蒸馏水溶解，定容至1L，得各配比的药物制剂。
[0113] 2、实验方法
[0114] 同实施例3中活性评价方法。
[0115] 3、效果评价
[0116] 抑菌圈直径均>7mm，表明具有抑菌效果。抑菌圈直径越大，表明药物越敏感，活性越强。
[0117] 4、实验结果
[0118] 见表3。
[0119] 表3不同药物功效成分配比对口腔致病菌活性比较
[0120]
[0121]
[0122] 由表3可知，随着SEQ ID NO.1：聚赖氨酸配比的比例升高，两种多肽成分对各口腔致病菌(牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普氏菌、变异链球菌、伴放线杆菌、粪肠球菌)的抑菌活性逐渐增强，其中，当其比例1:11时，活性最强，当比例再增加时，其抑菌活性已不再增强。
[0123] 血链球菌为口腔中正常菌群，能拮抗致病菌生长，作为口腔益生菌的代表。当两种多肽配比≤1:11时，对血链球菌生长无影响，但当两种多肽配比>1:12时，对血链球菌表现出抑制作用。因此，比例1:11是两种多肽组分效果最好的配比，且不影响口腔正常菌群的生长。具有只杀致病菌，保护益生菌的特性。确定1:11为两种多肽最优的配比。
[0124] 实施例5本发明多肽复配稳定剂对致病菌的杀灭作用考察
[0125] 一、实验药物的制备
[0126] 以SEQ ID NO.1和聚赖氨酸为功效成分，复配不同种类稳定剂，考察对口腔致病菌的作用，使用的各药物配方组成如下(以1L计)：
[0127] 表4药物配方组成
[0128]
[0129]
[0130] 表4(续)药物配方组成
[0131]
[0132] 表4(续)药物配方组成
[0133]
[0134]
[0135] 表4(续)药物配方组成
[0136]
[0137] 表4(续)药物配方组成
[0138]
[0139] 表4(续)药物配方组成
[0140]
[0141]
[0142] 表4(续)药物配方组成
[0143]
[0144] 表4(续)药物配方组成
[0145]
[0146]
[0147] 序号1-56的组方，由功效成分或(及)稳定剂组成，其中功效成分为2种多肽，分别是SEQ ID NO.1所示的Protegrin-1抗菌肽衍生物、聚赖氨酸，稳定剂为Vc、半胱氨酸、亮氨酸、缬氨酸、羟丙基-β-环糊精中的一种或多种。
[0148] 二、对口腔致病菌抑菌效果研究
[0149] 方法同实施例3中抑菌效果研究。
[0150] 3、实验结果
[0151] 见表5。
[0152] 表5各药物组方对口腔细菌的抑制作用
[0153]
[0154]
[0155]
[0156] 由表5可知，
[0157] (1)组方3号效果强于1和2号，说明两种多肽复配后，对各种口腔细菌的抑菌活性显著强于单独的一种多肽(P<0.05)。表明多肽复配后能协同增强抑菌活性。且通过之前实验筛选获得两种多肽成分最优配比为1:11。
[0158] (2)在复配的多肽配方中加入一种稳定剂，如单独加入50mg/L的Vc、或10mg/L的半胱氨酸、或60mg/L的亮氨酸、或40mg/L的缬氨酸、或200mg/L的羟丙基-β-环糊精后，不能增强两种多肽的抑菌活性。单独的稳定剂在此浓度条件下不能提高多肽的抑菌活性。
[0159] (3)加入单一稳定剂的配方中，随着稳定剂浓度的升高，其协同增效能力越强。当Vc浓度100mg/L时，半胱氨酸浓度20mg/L时，亮氨酸浓度120mg/L时，缬氨酸浓度40mg/L时，羟丙基-β-环糊精400mg/L时，能显著增强两种多肽对口腔致病菌的抑制活性，且随着浓度升高，协同增效能力越强。即若体系中加入单独稳定剂提高多肽功效时，需使稳定剂达到一定浓度。表明一定浓度的稳定剂能协同增强产品的抑菌活性。
[0160] (4)加入特定的Vc、或者半胱氨酸、或者亮氨酸、或者缬氨酸、或者羟丙基-β-环糊精的一种及以上稳定剂的配方中，其对口腔细菌的抑菌活性明显强于单独的稳定剂体系。表明混合稳定剂体系的协同增效能力强于单独的稳定剂体系。其中实验结果显示，组方29表现出最强的抑菌活性，稳定剂为半胱氨酸10mg，缬氨酸80mg(P<0.01)。
[0161] (5)只有特定的稳定剂，且具有一定浓度的稳定剂才能对多肽功效成分配方起到协同增效功能。
[0162] (6)加入不同浓度VE和脯氨酸的配方中，不能增强两个多肽的抑菌活性，且随着浓度的增加也不具有增强抑菌活性的能力。表明单独VE和脯氨酸不适合作为本配方的稳定剂。
[0163] (7)将一定浓度的VE和脯氨酸与具有功效的Vc或半胱氨酸等稳定剂复配加入配方后，也不能协同增强Vc或半胱氨酸对多肽的抑菌活性加强作用。表明了无论是单独的VE、脯氨酸，还是其与具有协同效果的其他稳定剂复配，均不能增强药物功效成分的抑菌活性。表明VE和脯氨酸不适合作为功效成分的稳定剂。
[0164] (8)各药物组方对血链球菌均无抑制作用。血链球菌为口腔中正常菌群，能拮抗致病菌生长，作为口腔益生菌的代表。表明含两种多肽的组方及含稳定剂的药物组方对口腔致病菌代表菌具有很强抑制作用，但不影响口腔正常菌群的生长。具有只杀致病菌，保护益生菌的特性。
[0165] 因此，两种功效成分具有相互协同增强效果的作用；且在功效成分中加入特定种类及用量的稳定剂，能显著提高产品配方的抑菌活性，功效成分与稳定剂之间也发挥了协同增效的作用。本发明组方中选择特定多肽配比及稳定剂，可以极大程度提高制剂的疗效，突破性的解决了抗菌肽易被酶降解的问题。
[0166] 三、临床效果考察
[0167] 选择上述组方序号3、9、27、37、41、29，共6个组方配比，对其进行牙周炎有效性的临床评价。
[0168] (一)对牙周炎临床研究
[0169] 1、评价方法
[0170] 采用双盲随机对照设计，将纳入对象随机分为7组(各55例)，分别为对照组、试验组1(组方3)、试验组2(组方9)、试验组3(组方27)、试验组4(组方37)、试验组5(组方41)、试验组6(组方29)，共385例，男150例，女200例，年龄35-60岁，平均42岁。
[0171] 纳入标准：年内未做牙周治疗，1月内未使用抗生素，全口牙现存≥20，颗。每位患者全口4象限牙中选择2颗牙龈红肿，探针出血、龈下结石、咬合痛、牙周探针深度≥4mm；X片示牙槽骨有不同程度吸收；无全身系统性疾病，无药物过敏史；知情同意。
[0172] 排除标准：孕妇和哺乳期妇女，吸烟者，治疗期使用其他药物者，治疗期间中断治疗或未复诊者。
[0173] 治疗方法：将所有受试者进行全口龈上洁治术，1周后复诊。记录牙周指标：牙龈红肿、患者疼痛度、牙周袋深度、附着水平、龈沟出血指数、菌斑指数等，每颗牙探针4个位点，探针最深位点作统计学分析，并以此作为基线。龈下刮治和根面平整后，用3％双氧水和生理盐水反复冲洗牙周袋，棉卷蘸干并隔湿。对照组用无功效成分的溶剂治疗，试验组用不同组方产品进行治疗。将产品喷入牙周，让其充满牙周袋直至溢出，每例每周治疗4次，共4次，用药后2h不得漱口、喝水、进食。末次治疗后2周进行临床检查，并记录临床指标。
[0174] 疗效评价标准：显效：局部用药4周后，牙周袋深度有所减少、菌斑指数减少1.0以上，龈沟出血指数有所减少，附着水平有改变或不变；牙龈出血、疼痛、肿胀症状消失，红肿或脓肿消退，牙周袋深度明显改善。有效：局部用药4周后，牙周袋深度稍有减少或无变化，菌斑指数减少0.5以上，龈沟出血指数稍减少；牙龈出血、疼痛、肿胀等症状明显减轻，红肿或脓肿缩小，牙周袋深度无明显改善。无效：局部用药4周后，牙周袋深度稍减少或反而增加或龈沟出血指数无减少或反而增加；牙齿松动未减轻或反而加重，上述临床症状无明显改善。显效率＝显效/总例数，总有效率＝(显效+有效)/总例数。
[0175] 采用SPSS18.0进行数据分析，采用t检验，P<0.05有统计学差异。
[0176] 2、实验结果
[0177] 以牙周的出血指数、牙周袋深度、菌斑指数及牙龈指数等指标，判断试验组的牙周炎治疗效果，结果见表6。
[0178] 表6治疗牙周炎的疗效比较
[0179]组别 例数 显效 有效 无效 显效率(％) 总有效率(％)
对照组 55 16 8 26 32.00 48.00
试验组1 55 39 7 9 70.91* 83.64*
试验组2 55 52 2 1 94.55* 98.19*
试验组3 55 52 3 0 94.55* 100.00*
试验组4 55 54 1 0 98.18* 100.00*
试验组5 55 55 0 0 100.00* 100.00*
试验组6 55 55 0 0 100.00* 100.00*
对照组 55 16 8 26 32.00 48.00
试验组1 55 39 7 9 70.91* 83.64*
试验组2 55 52 2 1 94.55* 98.19*
试验组3 55 52 3 0 94.55* 100.00*
试验组4 55 54 1 0 98.18* 100.00*
试验组5 55 55 0 0 100.00* 100.00*
试验组6 55 55 0 0 100.00* 100.00*
[0180] *，P<0.05
[0181] 由表6可知，与空白对照组相比，各试验组能显著改善牙周炎病症。与试验组1对比发现，加入一定浓度一种稳定剂或一种以上的稳定剂后，试验组的显效率明显提高，表明稳定剂对于多肽功效的提高具有很强的协同增强作用。
[0182] 牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普氏菌、伴放线杆菌、粪肠球菌与牙龈炎、牙周炎、口腔黏膜炎、种植体周围炎、根尖周炎、冠周炎、牙周炎引起的口臭等疾病密切相关。变异链球菌是龋齿的主要致病菌。本发明组方对这些口腔致病菌具有强抑制作用，表明能有效的治疗相关口腔疾病。加入稳定剂后的配方对口腔代表致病菌具有非常强的抑制作用，由临床试验结果可知，加入一种及以上稳定剂后，能显著增强对口腔疾病的治疗作用。但是所有配方都不会影响口腔正常菌群血链球菌的生长。表明了含有该配方的产品在杀灭致病菌，治疗口腔疾病的同时，能保护益生菌，维持口腔中微生态平衡。
[0183] 以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
[0184] 试验例1本发明组方的稳定性考察
[0185] 将SEQ ID NO.1 40μg/mL，聚赖氨酸440μg/mL按照产品制备工艺配制成不同组方序号的产品，选择其中组方1、组方、组方3(含两种多肽)、组方9、组方21、组方27、组方37、组方41、组方29作为稳定性测试对象。将各药物组方中加入唾液淀粉酶，作用10min、1h、2h后，吸取作用后的样品利用HPLC检测其中功效成分含量，以考察功效成分的稳定性。
[0186] 1、检测方法
[0187] 1.1试剂
[0188] 乙腈(色谱纯)
[0189] 三氟乙酸(色谱纯)
[0190] 1.2标准品及标准曲线绘制
[0191] SEQ ID NO.1所示多肽0.04mg/ml，聚赖氨酸0.44mg/ml。
[0192] 将两个成分混合配制，然后分别吸取2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL注入高效液相色谱仪，以含量为横坐标，峰面积为纵坐标分别绘制SEQ ID NO.1所示多肽和聚赖氨酸的标准曲线。
[0193] 1.3仪器高效液相色谱仪
[0194] 1.4色谱参考条件
[0195] 色谱性：InertsiloDS-sp(5×4.6×250)
[0196] 流动A相：0.08％TFA的水溶液
[0197] 流动B相：乙腈溶液
[0198] 流动相梯度：见表7。
[0199] 表7流动相梯度
[0200]时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
40.00 5 95
0 95 5
40.00 5 95
[0201] 柱温：40℃
[0202] 流速：1.0mL/min
[0203] 检验波长：220nm
[0204] 检验时间：55min
[0205] 1.5样品测定
[0206] 在设定的色谱条件下，分别量取10μL个配方样品注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
[0207] 1.6计算
[0208] 将各配方中测得的SEQ ID NO.1所示多肽和聚赖氨酸的峰面积，根据标准曲线计算产品中功效成分含量。
[0209] 2、检测结果
[0210] 见表8。
[0211] 表8各组方对唾液淀粉酶的稳定性
[0212]
[0213] 由表8可知，本发明特定稳定剂的加入，能显著提高药效成分的稳定性。与未加入稳定剂的序号1～3组相比，功效成分SEQ ID NO.1所示多肽、聚赖氨酸的降解率均显著降低，其中，组方9、组方21、组方27和组方37中抗菌肽衍生物的降解率从5min时的8％降低为1％，从1h的15％降低为2％，从2h的20％降低为2.2％；聚赖氨酸的降解率从5min的3％降低为1％，从1h的5％降低为1.5％，从2h的8％降低为1.6％。组方41和组方29中，SEQ ID NO.1的降解率从5min的8％降低为0.5％，从1h的15％降低为0.5％，从2h的20％降低为1％；聚赖氨酸的降解率从5min的3％降低为0.3％，从1h的5％降低为0.5％，从2h的8％降低为0.5％。
表明稳定剂能显著提高SEQ ID NO.1所示多肽及聚赖氨酸对抗唾液淀粉酶的作用。
表明稳定剂能显著提高SEQ ID NO.1所示多肽及聚赖氨酸对抗唾液淀粉酶的作用。
[0214] 可见，本发明组方，稳定性强，对制剂的功效保持具有重要作用。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种防治牙根尖周炎中草药牙粉工艺 | 2020-05-11 | 608 |
| 一种治疗牙髓炎及根尖周炎的外用止痛散及制备方法 | 2020-05-18 | 817 |
| 一种治疗牙根尖周炎的药物组合物 | 2020-05-14 | 220 |
| 一种用于牙周及根尖周手术的精准测量定位工具 | 2020-05-15 | 869 |
| 一种含银钛合金根管内固位、根尖封闭一体化牙胶尖 | 2020-05-16 | 472 |
| 牙根根尖充填材料及其制备方法 | 2020-05-12 | 604 |
| 一种治疗牙根尖周炎的含漱液 | 2020-05-13 | 315 |
| 一种测量下颌前牙根尖到下颌正中舌侧管距离的方法 | 2020-05-15 | 819 |
| 一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙根尖乳头干细胞亚群及其干性检测方法 | 2020-05-20 | 787 |
| 一种用于牙周及根尖周手术的精准测量定位工具 | 2020-05-21 | 69 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
牙根尖热门专利
-
2 微创万向根尖挺
-
3 固齿止痛散
-
7 一种药物制剂
-
10 牙科综合治疗仪的手柄装置
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈