植物不饱和脂肪酸含量相关蛋白GhSAD在抗寒性鉴定过程中
的应用
技术领域
背景技术
[0002]
棉花是我国重要的
纤维作物及经济作物，在国民经济中具有举足轻重的战略地位。新疆棉区是我国最大的棉花产区，但是由于新疆地区地理
位置特殊，春季
气候多变，无霜期短，生长早期常有倒春寒，后期常有早霜等低温冷害天气。低温不仅会降低棉花的产量，也会使棉花的品质变差，从而直接影响棉花种植的经济效益。因此研究棉花的抗寒机理，培育具有耐寒性的优质棉花具有重要的理论和现实意义。
[0003] 膜脂
相变是植物冷害的原初反应。Lyons的“膜脂相变”学说认为植物膜脂不饱和脂肪酸含量高，膜脂相变
温度会降低，增加了膜的流动性，从而使植物的抗寒性相应提高。此后Levitt、Palta等以及Orvar等研究指出，低温对植物的伤害首先发生在细胞膜上，细胞膜的
稳定性对植物抵抗低温胁迫具有重要的意义，直接影响植物的抗寒性，而细胞膜在低温下的稳定性主要决定于细胞膜磷脂不饱和性。因此，细胞膜膜质不饱和性对植物的抗寒性有着重大影响。
[0004] Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶(stearoyl-ACP desaturase,SAD)在植物质体中催化硬脂酰-ACP脱饱和而在脂肪酸链的C9与C10间引入一个双键形成油酰-ACP的反应，是不饱和脂肪酸合成代谢的关键酶，对植物膜在生理温度下，由凝胶态转化为
液晶态起重要的作用。因此，SAD酶直接决定了
植物油脂中的不饱和脂肪酸的总量以及饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例，可以通过SAD基因的超量表达或反义表达等途径来调控饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的合成定向改变植物种质，以调节植物体中脂肪酸的成分和含量，改善植物的抗寒性。大量研究表明，膜脂中不饱和脂肪酸的比例和含量与植物的抗寒性密切相关。Vega等研究发现，4℃处理下，
马铃薯SAD基因转录
水平较对照组(20℃)有显著升高，因此说明SAD基因的表达与马铃薯的低温适应性有关。Cheesbrough研究发现，长在20℃的大豆的SAD基因活性比生长在35℃的大豆的SAD基因活性高5倍。Polashock J和Ma J等分别将
酵母的SAD基因和菠菜的SAD基因导入
烟草，结果显示转基因烟草的抗寒性均增强。Los分别将正向和反向SAD基因插入植物双元表达载体pBI121中，通过基因工程转入模式植物烟草中，结果表明，转正向表达SAD基因的转基因烟草抗寒性明显增强，反之转反向表达SAD基因的转基因烟草抗寒性明显减弱。
银杏的GbSAD基因在4℃和15℃处理下该基因的水平稳步上升。陆地棉GhSAD2基因在不同程度低温处理下均有上调表达。Liu等在GenBank中注册了陆地棉SAD基因的全长cDNA序列(X95988.1)，但关于棉花SAD基因在抗寒性相关方面的研究未见报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种植物不饱和脂肪酸含量相关蛋白GhSAD在抗寒性鉴定过程中的应用。克隆陆地棉GhSAD2基因，构建植物表达载体pBI121-GhSAD2，并将该表达载体通过叶盘法转化烟草，通过测定转基因阳性烟草的
电解质渗透率及其表型性状来探究GhSAD2基因在抗寒方面的作用，以期为提高棉花抗寒性提供理论指导。
[0006] 其具体技术方案为：
[0007] 一种植物不饱和脂肪酸含量相关蛋白GhSAD在抗寒性鉴定过程中的应用，GhSAD的核苷酸序列如SEQ:ID:NO:1所示，其
氨基酸序列组成的
蛋白质序列如SEQ:ID:NO:2所示。
[0008] 具体应用包括以下步骤：
[0009] 步骤1、材料培养
[0010] 将‘新陆早33号’
种子播种在蛭石：营养土为3:1的盆钵中，于28℃(16h/8h)的光照
培养箱中取2～3片真叶的棉花
幼苗叶片，提取植物总RNA，用于基因克隆分析。
[0011] 烟草无菌苗种植：选取选籽粒饱满、
颜色正常的健康烟草种子放入1.5ml的离心管中，用75％
乙醇浸泡30s，30％H202浸泡10min，浸泡过程中用移液枪反复吹打，随后用无菌水冲洗5次，每次1min，最后将种子用牙签或1ml移液枪均匀的点播于MS固体培养基，在28℃(16h昼/8h夜)下培养5d后，选取培养基中长势良好的幼苗接种于1/2MS培养基中，选取生长20d后的无菌烟草苗作为转化植株。
[0012] 步骤2、棉花总RNA的提取和cDNA的制备
[0013] 用CTAB法提取棉花叶片总RNA，用0.8％琼脂糖凝胶120V，10min
电泳鉴定RNA的完整性；然后用核酸蛋白分析仪测定A260、A280值，计算其RNA浓度。反转录之前，RNA样品用DNase I(Takara，日本)处理。以3.5μL RNA为模板按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Takara，日本)描述的方法，合成cDNA第一链，放置于-20℃保存。
[0014] 步骤3、棉花GhSAD2基因的克隆
[0015] 从GenBank下载GhSAD2基因(KX197920)的序列，获得了1个包含全长ORF(Openreading frame)的基因序列，然后根据其开放阅读框序列设计克隆引物，分析GhSAD2基因和pBI121的酶切位点，在每条引物上加入不同的酶切位点，用于构建表达载体。具体引物序列如SEQ:ID:NO:3和SEQ:ID:NO:4所示。
[0016] 采用常规PCR方法克隆棉花GhSAD2基因序列，以棉花cDNA为模板，以高保真聚合酶Pfu高保真酶(全式金，北京)进行PCR扩增，扩增反应体系为：10×EasyPfu Buffer 2μL，2.5mM dNTPs 2μL，EasyPfu DNAPolymerase 0.4μL，模板1μL；正反向引物各1μL，补充ddH2O水到20μL。PCR反应条件为：94℃5min；94℃45s，65.5℃30s，72℃2min30s，30个循环；72℃
10min。将扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的
片段连接至pMD19-T(Takara，日本)克隆载体上，然后测序验证。对测序正确的阳性克隆提取质粒，命名为pMD19-T-GhSAD2。
[0017] 步骤4、棉花GhSAD2基因表达载体的构建
[0018] 用XbaⅠ和SmaⅠ双酶切pMD19-T-GhSAD2质粒和PBI121载体，将酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的大小片段，获得GhSAD2基因片段和PBI121载体片段。将GhSAD2基因的线性片段和酶切消化的PBI121载体片段分子，按3：1摩尔比混合，T4连接酶(全式金，北京)4℃连接过夜。转化大肠杆菌感受态Trans1-T1，涂布在含有卡那青霉素抗性的LB培养基平板，37℃培养过夜，挑取单克隆菌落，用GhSAD2F和GhSAD2R进行菌落PCR鉴定出现预期条带的候选阳性克隆，提质粒，用XbaⅠ、SmaⅠ双酶切鉴定，最终获得PBI121-GhSAD2阳性克隆。
[0019] 步骤5、叶盘法转化烟草
[0020] 将构建正确的重组质粒PBI121-GhSAD2电击转化到GV3101农杆菌菌株，28℃培养2d。将阳性克隆接种于含卡那霉素(50μg/mL)和利福平霉素(50μg/mL)的2mL LB液体培养基中，28℃培养20h左右，然后按体积1：50比例接种至50mL含卡那霉素和利福平霉素的LB液体培养基中，28℃培养至OD值＝1.2～1.6，4000r/min离心10min，用转化液重悬沉淀混匀至OD值＝0.4～0.6，然后进行烟草的转化。
[0021] 步骤6、转基因烟草的PCR鉴定和GUS活性
染色[0022] 按照CTAB法提取野生型烟草与转基因烟草基因组DNA，用GhSAD2F和GhSDA2R引物和进行PCR扩增，检测GhSAD2基因是否成功导入并整合到转基因烟草中。表达载体PBI121-GhSAD2携带GUS报告基因,用GUS染色
试剂盒进行染色，以PCR检测为阳性的转基因烟草叶片为试验材料，野生型烟草为对照组。将待检测组织置于2mL的离心管中，用X-Gluc染液将其浸没，28℃显色反应2h，用75％乙醇脱色至对照叶片完全脱色为止，观测并拍照。
[0023] 步骤7、转基因烟草抗寒性的鉴定
[0024] 选取苗龄60d左右，长势一致的转基因烟草和野生型烟草为试验材料，在4℃处理48h后测定其
电解质渗漏率，重复3次，取平均值，然后进行丙二
醛MDA含量测定，脯氨酸含量的测定。
[0025] 进一步，步骤7中，测定其电解质渗漏率的方法具体为：取相同部位叶片，避开主叶脉，用打孔器打取相同数量的叶片，再用去离子水冲洗三次，然后放于100mL三
角瓶中，加入40mL ddH2O，以120r min的速度在摇床上振荡2h。用电导率仪测定电解质渗漏率S1，随后沸水浴15min，冷却至室温后再测S2，计算相对电导率，相对电导率＝S1/S2×100％，每个植株重复测定3次，取平均值。
[0026] 进一步，步骤7中，丙二醛MDA含量的测定方法具体为：
[0027] a.试剂的配制：10％三氯乙酸TCA：称取100g的TCA溶于蒸馏水中，定容至1000ml；0.6％硫代巴比妥酸TBA：称取0.6g的TBA，加入少量1M的氢
氧化钠溶解后，再用10％的三氯乙酸定容至200ml；
[0028] b.MDA的提取过程：称取受温度胁迫的棉花真叶叶片0.2-0.5g，置于研钵中，加入少量的
石英砂和2ml 10％TCA，充分
研磨，再加3ml 10％TCA，进一步研磨至匀浆状态，将其转入离心管中，再向研钵中加入5ml 10％TCA溶液冲洗，全部转入离心管中，摇匀，4000rpm离心10min，上清液为样品种MDA的提取液。
[0029] c.显色反应及测定：取2ml提取液，对照组为2ml蒸馏水，加入2ml 0.6％TBA，上下颠倒混匀，沸水中反应15min，冷却至室温，取反应液用紫外分光光度计测定其在532nm、600nm和450nm
波长下的吸光度A值。
[0030] d.含量的计算：MDA的浓度(μmol/L)＝6.45×(D532-D600)-0.56×D450[0031]
[0032] 进一步，步骤7中，脯氨酸含量的测定方法具体为：
[0033] a.试剂：3％磺基水杨酸：称取3g磺基水杨酸溶于蒸馏水中，定容至100ml；2.5％酸性茚三
酮：称取2.5g茚三酮溶于60ml的
冰醋酸和40ml 6M的
磷酸中，70℃水浴溶解，4℃保存；脯氨酸标准液配制(10μg/ml)：称取20mg脯氨酸溶于少量的蒸馏水中，定容至200ml脯氨酸母液，取该母液50ml，加蒸馏水定容至500ml。
[0034] b.标准曲线的制作：取7支试管进行编号，按表5-1加入试剂后，置于沸水浴中热浴30min，冷却至室温，每管加入4ml的
甲苯溶液，震荡混匀，静置直至色素全部转移至甲苯中，吸取上层含脯氨酸的甲苯溶液至比色杯中，测量520nm处的吸光值，以甲苯溶液在520nm处的吸光值作为空白对照。以脯氨酸含量为横坐标，520nm处的吸光度为纵坐标，制作脯氨酸含量的标准曲线。
[0035] c.样品的提取及测定：取不同温度处理的棉花叶片0.1-0.5g，剪碎，放入离心管中，加入5ml 3％磺基水杨酸，置于沸水浴中热浴10min，期间晃动3-4次，冷却至室温，3000rpm离心5min，所得上清液为本实验脯氨酸的提取液；取2ml溶液与离心管中，分别加入
2ml的冰醋
酸溶液和2ml的2.5％的酸性茚三酮溶液，沸水浴30min，冷却至室温，加入4ml甲苯溶液，混匀，静置1min，吸取上层溶液于比色杯中，测定525nm处的吸光度，以甲苯作为空白对照。
[0036] d.含量的计算：
[0037]
[0039] 本发明将目的基因GhSAD2已整合到烟草及棉花的基因组中，共获得转基因植株9株，转化率为75％。陆地棉GhSAD2基因能够显著增强非低温驯化植物烟草的抗寒性，从而提高植物细胞的低温防御能
力，为进一步探究该基因的功能鉴定了
基础。
附图说明
[0040] 图1陆地棉SAD2基因的扩增，其中，M.DL2000；1-4.PCR fragment of GhSAD2；
[0041] 图2pMD19-T-GhSAD2的双酶切验证，其中，M.DL2K；1-2.双酶切产物；
[0042] 图3pBI121-GhSAD2表达载
体模式图；
[0043] 图4重组子pBI121-GhSAD2的双酶切验证，其中，M.DL2K；1-2.重组子双酶切产物；
[0044] 图5重组子pBI121-GhSAD2的PCR验证，其中，M.DL2K；1-5.重组质粒pBI121-GhSAD2扩增产物；
[0045] 图6转基因烟草的PCR鉴定，其中，M.DL2K；1-12.转pBI121-GhSAD2基因烟草PCR产物；13.重组子pBI121-GhSAD2扩增产物；14.野生型烟草DNA扩增产物；
[0046] 图7烟草GUS组织化学活性染色，图7a.转pBI121-GhSAD2基因烟草，图7b.野生型阴性对照；
[0047] 图8低温处理下不同基因型烟草的冷害症状，其中，图8a.图8c.转pBI121-GhSAD2基因烟草图8b.野生型烟草；
[0048] 图9低温处理下3种基因型烟草相对电导率的变化，其中，小写字母a和b表示相同处理下不同株系处理间差异显著(P＜0.05)。
具体实施方式
[0049] 下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0050] 1.材料与方法
[0051] 1.1材料
[0052] 1.1.1植物材料 ‘新陆早33号’种子和烟草种子由新疆农垦科学院棉花所提供。
[0053] 1.1.2菌株和载体 大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1购于北京全式金生物有限公司、克隆载体pMD19-T购于日本TaKaRa公司、根癌农杆菌GV3101、表达载体pBI121由新疆石河子大学绿洲生态重点实验室提供。
[0054] 1.1.3试剂与工具酶 凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、T4连接酶、Pfu高保真酶、Taq DNA聚合酶、DNA标准分子量均购自北京全式金生物技术有限公司，限制性内切酶、PrimerScriptTM RT Reagent Kit购自日本TaKaRa公司，
蔗糖、MS购自Sigma公司其他试剂均为国产分析纯。
[0055] 1.4.4引物 引物及测序均由上海
生物工程技术服务有限公司合成。
[0056] 1.2试验方法
[0057] 1.2.1材料培养 将‘新陆早33号’种子播种在蛭石：营养土为3:1的盆钵中，于28℃(16h/8h)的光照培养箱中取2～3片真叶的棉花幼苗叶片，提取植物总RNA，用于基因克隆分析。
[0058] 烟草无菌苗种植：选取选籽粒饱满、颜色正常的健康烟草种子放入1.5ml的离心管中，用75％乙醇浸泡30s，30％H202浸泡10min，浸泡过程中用移液枪反复吹打，随后用无菌水冲洗5次，每次1min，最后将种子用牙签或1ml移液枪均匀的点播于MS固体培养基，在28℃(16h昼/8h夜)下培养5d后，选取培养基中长势良好的幼苗接种于1/2MS培养基中，选取生长20d后的无菌烟草苗作为转化植株。
[0059] 1.2.2棉花总RNA的提取和cDNA的制备 用CTAB法提取棉花叶片总RNA，用0.8％琼脂糖凝胶120V，10min电泳鉴定RNA的完整性；然后用核酸蛋白分析仪测定A260、A280值，计算其RNA浓度。反转录之前，RNA样品用DNase I(Takara，日本)处理。以3.5μL RNA为模板按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Takara，日本)描述的方法，合成cDNA第一链，放置于-20℃保存。
[0060] 1.2.3棉花GhSAD2基因的克隆 从GenBank下载GhSAD2基因(KX197920)的序列，获得了1个包含全长ORF(Open reading frame)的基因序列，然后根据其开放阅读框序列设计克隆引物，分析GhSAD2基因和pBI121的酶切位点，在每条引物上加入不同的酶切位点，用于构建表达载体。具体引物序列及酶切位点参照表1。
[0061] 表1基因扩增的引物
[0062]
[0063] 注:下划线
碱基为PCR扩增时引物中引入的酶切位点。
[0064] Note:Bases underlined are restriction sites added to primers using in PCR amplification.
[0065] 采用常规PCR方法克隆棉花GhSAD2基因序列，以棉花cDNA为模板，以高保真聚合酶Pfu高保真酶(全式金，北京)进行PCR扩增，扩增反应体系为：10×EasyPfu Buffer 2μL，2.5mM dNTPs 2μL，EasyPfu DNA Polymerase 0.4μL，模板1μL；正反向引物各1μL，补充ddH2O水到20μL。PCR反应条件为：94℃5min；94℃45s，65.5℃30s，72℃2min30s，30个循环；
72℃10min。将扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段连接至pMD19-T(Takara，日本)克隆载体上，然后测序验证。对测序正确的阳性克隆提取质粒，命名为pMD19-T-GhSAD2。
[0066] 1.2.4棉花GhSAD2基因表达载体的构建 用XbaⅠ和SmaⅠ双酶切pMD19-T-GhSAD2质粒和PBI121载体，将酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的大小片段，获得GhSAD2基因片段和PBI121载体片段。将GhSAD2基因的线性片段和酶切消化的PBI121载体片段分子，按3：1摩尔比混合，T4连接酶(全式金，北京)4℃连接过夜。转化大肠杆菌感受态Trans1-T1，涂布在含有卡那青霉素抗性的LB培养基平板，37℃培养过夜，挑取单克隆菌落，用GhSAD2F和GhSAD2R进行菌落PCR鉴定出现预期条带的候选阳性克隆，提质粒，用XbaⅠ、SmaⅠ双酶切鉴定，最终获得PBI121-GhSAD2阳性克隆。
[0067] 1.2.5叶盘法转化烟草 将构建正确的重组质粒PBI121-GhSAD2电击转化到GV3101农杆菌菌株，28℃培养2d。将阳性克隆接种于含卡那霉素(50μg/mL)和利福平霉素(50μg/mL)的2mL LB液体培养基中，28℃培养20h左右，然后按体积1：50比例接种至50mL含卡那霉素和利福平霉素的LB液体培养基中，28℃培养至OD值＝1.2～1.6，4000r/min离心10min，用转化液重悬沉淀混匀至OD值＝0.4～0.6，然后进行烟草的转化。
[0068] 1.2.6转基因烟草的PCR鉴定和GUS活性染色 按照CTAB法提取野生型烟草与转基因烟草基因组DNA，用GhSAD2F和GhSDA2R引物和进行PCR扩增，检测GhSAD2基因是否成功导入并整合到转基因烟草中。表达载体PBI121-GhSAD2携带GUS报告基因,用GUS染色试剂盒进行染色，以PCR检测为阳性的转基因烟草叶片为试验材料，野生型烟草为对照组。将待检测组织置于2mL的离心管中，用X-Gluc染液将其浸没，28℃显色反应2h，用75％乙醇脱色至对照叶片完全脱色为止，观测并拍照。
[0069] 1.2.7转基因烟草抗寒性的鉴定 选取苗龄60d左右，长势一致的转基因烟草和野生型烟草为试验材料，在4℃处理48h后测定其电解质渗漏率。测定方法采用Gong等的方法，重复3次，取平均值。
[0070] 2.结果与分析
[0071] 2.1棉花GhSAD2基因的克隆
[0072] 从GenBank已公布的数据中，下载棉花GhSAD2的基因序列(KX197920)，用GhSAD2-Xbal和GhSAD2-Sma1引物(表1)，从‘新陆早33’的cDNA中克隆出大小约为1200bp左右的扩增条带(图1)。将特异条带切胶回收后连接PMD19-T vector，转化Trans1-T1感受态细胞后，用蓝白斑筛选阳性克隆送往测序公司进行序列测定。其测序结果通过DNAMAN多重序列对比分析，选取同源性最高的阳性质粒用Xbal和Smal进行双酶切，得到约为1200bp的酶切小片段(图2)，获得预期目的基因。
[0073] 2.2棉花GhSAD2基因表达载体的构建
[0074] 回收约1.2kb的酶切基因片段，与经同酶切的表达载体PBI121的约为14.7kb的大片段相连接，获得重组质粒pBI121-GhSAD2(图3)，载体骨架结构为pBI121载体，携带有CaMV35S启动子、GUS报告基因和卡那霉素抗性筛选基因，GhSAD2基因插入CaM35S下游XbaI和SmaI酶切位点之间。双酶切重组子pBI121-GhSAD2获得的片段和目的片段大小一致，说明表达载体已成功构建(图4)。利用电击法将重组子pBI121-GhSAD2导入农杆菌，经PCR扩增后电泳检测发现有特异片段出现(图5)。说明表达载pBI121-GhSAD2已转入农杆菌GV3101中。
[0075] 2.3转基因烟草的PCR鉴定及GUS活性染色
[0076] 经卡那霉素抗性筛选长势较好的再生烟草共12株，提取DNA并进行PCR扩增检测，结果表明，在9株转基因烟草中均可扩增得到特异带，用GhSAD2-Xbal和GhSAD2-Sma1引物扩增，产物约为1200bp，而阴性对照则无特异带(图6)说明外源基因已整合到基因组中。取PCR鉴定为阳性的转基因烟草组织进行GUS活性染色，经乙醇脱色后，转GhSAD2基因烟草植株的叶脉中呈现出不同程度的蓝色，野生型烟草叶片全呈黄白色(图7)。表明外源GhSAD2基因连接载体pBI121后一起导入烟草中且能稳定表达。
[0077] 2.3转基因烟草的抗寒性鉴定
[0078] 4℃低温胁迫48h后，转pBI121-GhSAD2基因烟草和野生型烟草均表现为植株和叶片萎蔫、下垂，但转pBI121-GhSAD2基因烟草较野生型烟草萎蔫程度较轻(图8)。叶片相对电导率(REC)可以反映植物叶片细胞电解质渗出情况，即细胞膜受损程度。在相同时间的低温处理下，转pBI121-GhSAD2基因两个株系的烟草T1、T2相对电导率显著低于野生型烟草，但后两者无显著差异。表明转pBI121-GhSAD2基因烟草的细胞膜受损程度要明显低于野生型烟草。
[0079] 抗寒性是植物对低温环境的适应能力，不仅包括植物对低温逆境的耐受能力，同时还包括逆境解除后迅速恢复生长的能力。本研究选用与植物抗寒性密切相关的生理指标作为转基因植物抗寒性筛选的方法，通过表型和生理指标相结合的方法，能快速有效的挖掘出低温胁迫下耐寒种质资源，为抗寒性品种的选育和大规模、快速、准确的植物抗耐寒性评价提供依据和方法。
[0080] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉
本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
