一种磁珠富集法开发菜豆SSR引物的制备方法
阅读：717发布：2021-12-08
专利汇可以提供一种磁珠富集法开发菜豆SSR引物的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 磁珠 富集法开发菜豆SSR引物的制备方法，其步骤：首先用MseI对菜豆基因组DNA进行酶切，利用AFLP扩增原理创建文库；第二，基因组PCR文库与 生物 素标记的重复序列探针进行杂交；第三，通过对杂交 混合液 加入到表面包被有一层链霉亲和素的磁珠中；第四，将洗脱液纯化的微卫星DNA作为DNA模板，用PCR扩增方法使得微卫星DNA片断得到放大；第五，将纯化后的PCR扩增产物连接到T载体上克隆，得到插入片断的DNA序列；第六，重复核心区两侧设计引物，进行引物筛选，得到有效的微卫星位点。且简单易行，引物效率高，从48对引物中得到了20对有效的引物，为大批量的开发SSR引物提供保障。，下面是一种磁珠富集法开发菜豆SSR引物的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种磁珠富集法开发菜豆SSR引物的制备方法，包括下列步骤：
A、菜豆基因组DNA的提取：
选取菜豆品种，按照常规的栽培管理和肥水措施种植，小苗长出5-6片叶子，取嫩叶
0.4克利用CTAB法提取基因组DNA；
B、提取基因组DNA浓度的检测：
提取基因组DNA的浓度用分光光度计检测，进行SSR引物开发的基因组DNA浓度要达到100ng-1ug/ul；
C、酶切基因组DNA：
用Mse I对菜豆基因组DNA进行酶切，利用AFLP扩增原理在酶切片断的两端加上单链寡核苷酸接头，并用与接头配套的接头引物进行PCR扩增放大，创建基因组PCR文库，对文库进行纯化；
D、Mse I酶切片段加接头：
酶切DNA产物用Mse I接头：接头序列Oligo-MseI A5-TACTCAGGACTCAT-3’，Oligo-Mse I B 5-GACGATGAGTCCTGAG-3’加T4 DNAligase进行连接，混匀后，置16℃恒温水浴锅温浴过夜，然后放在4℃冰箱中保存备用；
E、酶切连接的PCR预扩增：
以步骤D酶切连接好的产物为模板，以MseI-N：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’为引物进行PCR扩增，反应条件：第一步1个循环，94℃5min，第二步18个循环，94℃1min，53℃1min，
72℃1min，第三步1个循环72℃10min，4℃保存，反应产物使用1％W/V琼脂糖电泳检测；
F、PCR预扩增产物与生物素探针杂交：
在66-70℃下使得PCR文库与所选用的生物素标记的重复序列探针进行杂交；磁珠的表面包被有一层链霉亲和素，生物素标记的探针与含重复序列单元的DNA片断杂交结合以后，通过洗涤过程并用磁场固定，在变性条件下含重复序列的微卫星DNA被TE缓冲液洗脱；
将洗脱液纯化以后作为DNA模板；
杂交体系总体积为100μL，总共平行配制2管分装，进行杂交，在PCR仪上进行，反应程序为95℃变性5min；杂交66-70℃下保持1-2h，杂交反应完毕后往反应体系中加入300μL TEN100溶液，混匀后置于4℃保存备用，将加有300μL TEN100的杂交混合液加入到经过预处理的磁珠中，室温上放置30min，然后对杂交的磁珠进行洗脱，SDS溶液于室温下洗涤磁珠3次，每次5min，三次漂洗后再用400μL预热至55℃的0.2×SSC+0.1％SDS溶液洗涤1次，加入50μL TE8.0，用移液器吸打均匀，然后于95℃下水浴5min，冻存于-20℃，取得目的DNA片段，以洗脱产物为底物，以MseI-N为引物，用纯化后的5μL目的DNA洗脱片段用于PCR扩增，扩增条件与上面的PCR预扩增条件一致，扩增30个循环；
G、连接转化克隆：
将纯化后的PCR扩增产物连接到T载体上进行克隆，操作依照pMD 18-T载体连接，连接反应体系为10μL，连接条件为16℃1hr，于-70℃冰箱中取出一管感受态细胞，置于冰浴中融化，加入5μL连接产物，冰浴30min，冰浴结束后42℃热激90sec，再冰浴5min，然后加入1mL预冷的液体LB培养基，于37℃的摇床上复苏培养45min，复苏培养结束后于
4℃10000rpm离心1min，以沉淀细胞；去上清，剩余200-300μL培养基重悬细胞，往每个LB平板上加入4μLIPTG和40μL X-gal，涂布均匀，每100μL菌液涂一个平板，待液体吸收完毕后，将平板倒置于37℃过夜；
H、阳性克隆的挑取、培养、筛选和测序：
挑选阳性克隆用载体通用引物测序，得到的插入片断的DNA序列，挑选出微卫星DNA序列，将培养好的平板在4℃放置，使菌落显色，用无菌牙签挑取白色克隆到500μL液体培养基中，37℃摇床上以200rmp转速培养过夜，4℃保存菌液；
取1μL菌液用于PCR模板，扩增条件为：95℃5min；94℃40s；54℃30s；72℃1min；循环30次；72℃7min。取2μL产物于1％W/V琼脂糖凝胶上电泳，用全自动凝胶成像分析系统记录电泳结果；
将含有插入片段并且大小的阳性克隆取一半菌液测序，另一半加入20％V/V菌甘油，混匀后于-70℃冻存备份，用M13+通用引物测序，测序在ABI 3730XLDNA Sequencer上进行，所用反应试剂为ABI PRISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit，每反应的有效长度达700-800bp，用M13引物从另外一段进行测序，并将正反向测序结果进行拼接；
J、序列分析和微卫星位点的分类与设计：
用软件SSRHunter从得到的序列中查找出含有重复单元的微卫星序列，测序，根据Weber提出的标准将微卫星分为3类：完美型，指没有中断的或附近没有其它种类重复序列的重复序列；非完美型，指2个或以上的同种重复序列被3个碱基以下的非重复序列所间隔；复合型，指一种重复序列与其它种类的重复序列被3个以下的非重复序列所间隔，将挑选出的微卫星序列去除载体序列，在序列上标记出Mse I接头的位置，再用引物设计软件Primer Premier 5.0在两端接头和核心重复区域之间设计正向和反向PCR扩增引物，用于相应位点的PCR扩增；
K、微卫星引物检验：
对每个位点引物的有效性合多态性进行筛选，得到有效的微卫星位点，挑选两个DNA模板对所有合成的引物进行PCR扩增，退火温度使用设计引物时的默认温度为50-62℃，微卫星PCR扩增反应体系为15μL，扩增条件为：94℃5min；94℃40s，Tm 30s，72℃40s，
35cycles；72℃7min，PCR扩增产物按照5：1以体积比例加入上样缓冲液，95℃变性5分钟后置于冰上，在8％变性聚丙烯酰胺凝胶上加样检测，在上样的同时往其中一个加样孔加入
0.1gPBR322/Msp I Marker，正常扩增的引物对用挑选出的DNA模板在退火50-62℃下进行PCR扩增的结果在聚丙烯酰胺胶上电泳的结果读带，选择带型清晰，至少有两个或两个以上等位基因的引物筛选出来。
一种磁珠富集法开发菜豆SSR引物的制备方法
技术领域
背景技术
[0002] SSR标记虽然效果好，可靠性高，但其关键点又在于SSR引物的开发。只有在有一定数量的SSR引物之后，才可能对某一物种进行SSR标记的分析。特别是对于没有测序过的生物物种，对于其DNA碱基序列知之甚少或一无所知的物种只能利用一些特殊的方法得到这种重复序列以及其两边的侧翼序列来设计SSR引物。目前SSR引物的来源，概括起来有以下四种途径：1.关文献；2.近缘种的引物(例如同属不同种)；3.数据库搜寻法：在GenBank等公共数据库中搜寻SSR序列，根据侧翼序列设计引物；4.自己从研究对象基因组文库中筛选SSR位点两翼序列设计引物。针对那些大多数测序很少的物种第4种方法几乎是唯一途径，也是最根本、有效的方法。从基因组文库得到SSR位点的方法目前又包括了经典方法、富集法和省略筛库法。
[0003] 建立所研究物种的基因组文库，然后用含有SSR的探针与之杂交，筛选阳性克隆，测序，根据SSR两侧的DNA序列设计引物。该传统方法又可分为两种：一是一种是筛选大插入片段基因组文库，显示出与探针有强杂交信号的克隆被进一步纯化，分成亚克隆，然后又一次杂交筛选含重复序列的克隆。另一种是将基因组DNA用限制性内切酶消化成200-1500bp的小片段，也可以用超声波处理基因组DNA，得到的片段相对更小，200-600bp，再用DNA聚合酶I的Klenow大片段将它补平。构建和筛选小插入片段基因组文库。两种方法各有缺点，第一种对大的亚克隆难以测序，第二种得到SSR阳性克隆的得率很低，只有
2％-3％。这种传统经典方法开发引物的效率很低，但操作简单，易掌握，在现已获得的SSR标记中，四分之三以上的是利用经典方法开发出的。
2％-3％。这种传统经典方法开发引物的效率很低，但操作简单，易掌握，在现已获得的SSR标记中，四分之三以上的是利用经典方法开发出的。
[0004] 富集法通过建立和筛选微卫星富集文库，提高了SSR克隆的得率。它又分为利用含SSR的PCR引物进行PCR富集(即引物法富集)和用含SSR的探针进行杂交富集(即杂交法富集)两种方法。
[0005] 引物法富集微卫星一般是指使用同目的微卫星重复互补的寡核苷酸作为引物，通过PCR反应在文库构建前或构建后富集微卫星位点。Elaine等以狗的基因组DNA为材料，采用经典方法先获得一个小插入片段的初级基因组文库，然后以5′磷酸化的核苷酸(CA)n为引物进行一步PCR，转化到细菌，得到一个含(CA)n富集文库。随机挑取单克隆培养后转膜，杂交，再次筛选，得到的结果是：40％-50％都是阳性克隆，比之前的传统方法效率提高了50倍(Elaine et al.，1992)。
[0006] 目前使用较多的引物开发策略是基于选择性杂交的富集方法，具有代表性的是两种杂交方法，根据所使用的介质不同分为尼龙膜法和磁珠富集法。尼龙膜法通过吸附在尼龙膜上的许多微卫星探针来富集基因组中的微卫星片段；洗脱结合片段；进行PCR扩增；连接载体转化大肠杆菌；阳性克隆测序。应用尼龙膜法，6iovannim用11个微卫星重复探针从Saccharum spp中筛选微卫星位点，富集效率提高了40％。磁珠富集法的基本原理是首先用生物素标记重复序列特异探针并与基因组DNA酶切片段杂交，再利用生物素与链亲和素亲和性强的特性，用包被链亲和素的磁珠进行磁力吸附完成重复序列目标片段的富集。经过磁珠富集后使克隆测序量大幅下降且使获得具有重复序列的片段的效率大幅度提高，因此，成为SSR引物开发极其有效的方法而迅速得到广泛应用。目前利用磁珠富集法开发SSR引物的报道有很多。
[0007] 李炟等将马尾松核基因组DNA用Sau3A I酶切后回收300-1000bp片段，连接接头，PCR后与用生物素标记的微卫星探针(AC)15、(AG)15杂交；运用磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段。将获得的序列通过PCR扩增后，连接pGEM-T载体，转化入感受态大肠杆菌，得到微卫星序列文库。然后用PCR法直接对文库进行扩增，获得58个阳性克隆，经测序分析，获微卫星序列33个，最后成功设计出马尾松微卫星引物19对(李炟等，2007)。
[0008] 孙效文等将草鱼(Ctenopharyngodon idella)基因组DNA经Sau3AI酶切，回收纯化400-900bp片段，连上接头，构建“基因组PCR文库”。用生物素标记的(CA)15作探针与其杂交，杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上，经一系列的洗涤过程，富集含有微卫星的片段。PCR扩增放大微卫星片段，再进行克隆和测序，根据微卫星两端的保守序列设计引物，并且还通过同位素标记的探针(CA)15进行二次杂交筛选，获得阳性克隆132个，所得到的阳性克隆经测序，86.36％含有微卫星序列，共获得130个微卫星DNA序列，设计SSR引物83对(孙效文等，2005)。
[0009] 从报道的文献来看磁珠富集法只要通过几步简单的操作就能得到富含微卫星位点的DNA片段，减低了实验成本，缩短了实验周期，且成功率高，是目前较为简单有效的SSR引物开发方法。
[0010] 菜豆(Phaseolus vulgaris L.)是世界上种植面积最大的食用豆类之一。菜豆原产中南美洲，中国栽培的菜豆是15世纪直接从美洲引入，“中国中心”被认为是菜豆的次级起源中心，具有丰富的遗传多样性。菜豆是我国重要蔬菜种类，在我国栽培历史悠久。普通菜豆在我国分布地区广泛，品种资源非常丰富。中国大部分省(市、区)有菜豆分布，但主要分布于黑龙江、内蒙古、山西、陕西、湖北、四川、贵州、云南等省区。据不完全统计中国普通菜豆播种面积近120.51万公顷。
[0011] 目前已进行了农艺性状鉴定并编入中国食用豆类品种资源目录的普通菜豆资源有4480份，这些资源已入国家种质库保存。M.R.Escribano等对种植在西班牙西北部4种不同环境中的56个菜豆品种的18个农艺性状进行了遗传多样性研究结果显示品种间所有性状均有显著差异且多数性状有显著的基因环境互作效应。栾非时等对60个菜豆品种资源黑龙江省43个栽培种国际热带农业中心13个半野生种和波兰4个矮生品种的形态标记进行了聚类分析结果将之分为两大类即矮生种为一类蔓生种及半野生种合为一类。
[0012] 中国农科院蔬菜花卉所张赤红等对324份普通菜豆种质资源的10个农艺性状进行了分析，结果表明，我国普通菜豆种质资源具有丰富的形态多样性，平均多样性指数为1.632，高于国外材料，并利用36对SSR引物对332份国内普通菜豆、16份国外普通菜豆和
29份野生菜豆的遗传多样性进行了分析。徐兆生等对38份菜豆种质进行了田间综合鉴定评价，以选出综合性状优良的优异种质，提供生产和科研利用。中国农科院作物品种资源研究所、蔬菜花卉所、江苏省沿海地区农科所、东北农大等单位进行了菜豆品种资源的收集，并对资源进行了综合评价，认为我国普通菜豆种质资源具有丰富的形态多样性，平均多样性指数高于国外材料，菜豆种质资源遗传基础较宽，亲缘关系较远，遗传变异主要存在于蔓生种群内部，菜豆变种群内遗传多样性较为丰富，可以作为育种材料储备种质资源。并从中筛选出一批抗病性强、嫩荚蛋白质含量高的优良种质材料。
29份野生菜豆的遗传多样性进行了分析。徐兆生等对38份菜豆种质进行了田间综合鉴定评价，以选出综合性状优良的优异种质，提供生产和科研利用。中国农科院作物品种资源研究所、蔬菜花卉所、江苏省沿海地区农科所、东北农大等单位进行了菜豆品种资源的收集，并对资源进行了综合评价，认为我国普通菜豆种质资源具有丰富的形态多样性，平均多样性指数高于国外材料，菜豆种质资源遗传基础较宽，亲缘关系较远，遗传变异主要存在于蔓生种群内部，菜豆变种群内遗传多样性较为丰富，可以作为育种材料储备种质资源。并从中筛选出一批抗病性强、嫩荚蛋白质含量高的优良种质材料。
[0013] 分子育种包括分子标记辅助选择(MAS)和利用基因工程手段育种。分子标记辅助选择是分子标记技术用于作物改良的重要领域，是传统育种技术和现代生物技术相结合的产物。有很多重要性状(如产量和后期叶部或穗部病害抗性等)只有在成熟植株上才能表现出来，因此采用传统方法在播种后数月或数年均不能对其进行选择。而利用分子标记就可以对幼苗(甚至对种子)进行检测，从而大大节省培育植株所浪费的人力、物力和财力。
[0014] 在众多的分子标记中SSR分子标记具有共显性、多态性丰富、在豆类基因组中分布广等众多优点。目前只是对已知的编码序列的微卫星进行了筛选和鉴定，大量的非编码区的微卫星还有待开发和利用。因此本发明以中国菜豆为研究对象开在整个基因组范围内开发出更多菜豆品种的SSR引物。
[0015] 综上所述，菜豆在我国需求量非常大，在蔬菜中占有重要的地位，同时我国的菜豆种质资源丰富，遗传多样性多，因此急需开发更多的SSR引物，将分子标记辅助育种与常规育种结合起来才能加速菜豆育种的进程，培育新品种，迅速实现社会和经济效益。
发明内容
[0016] 本发明的目的是在于提供了一种磁珠富集法开发菜豆SSR引物的制备方法，利用磁珠法进行SSR引物开发，能够简单、快速地筛选菜豆整个基因组中的微卫星序列，在短时间内能开发大量的SSR引物，只有开发一定数量的SSR引物之后，才可能对某一物种进行SSR标记的分析。因此，本发明能为菜豆遗传图谱的构建以及基因定位等工作需要大量的SSR分子标记的实现提供了保障。
[0017] 一种磁珠富集法开发菜豆SSR引物的制备方法，包括下列步骤：
[0018] 1.菜豆基因组DNA的提取：
[0019] 选取具有菜豆一般特征的菜豆品种。按照常规的栽培管理和肥水措施种植，待小苗长出5-6片叶子，取嫩叶0.4克利用CTAB法提取基因组DNA。
[0020] 所述的菜豆，又称芸豆(俗称二季豆或四季豆)，豆科科菜豆属。芸豆适宜在温带和热带高海拔地区种植，比较耐冷喜光属异花授粉菜豆、短日照作物，芸豆根系发达，叶绿色，互生，心脏形，花为虫叶形花，总状花序，花梗长15-18厘米。开花多结荚少。它营养丰富，蛋白质含量高，即是蔬菜又是粮食，还可作糕点和豆馅，是出口创汇的重要农副产品。芸豆学名菜豆，蝶形花科菜豆属。
[0021] 2.提取基因组DNA浓度的检测：
[0022] 提取基因组DNA的浓度用分光光度计检测。能够进行SSR引物开发的基因组DNA浓度要达到100ng-1ug/ul。
[0023] 3.酶切基因组DNA：
[0024] 用Mse I对菜豆基因组DNA进行酶切，利用AFLP扩增原理在酶切片断的两端加上单链寡核苷酸接头，并用与接头配套的接头引物进行PCR扩增放大，创建基因组PCR文库，对文库进行纯化。
[0025] 4.Mse I酶切片段加接头：
[0026] 酶切DNA产物用Mse I接头(接头序列：Oligo-MseI A5-TACTCAGGACTCAT-3’，Oligo-Mse I B 5-GACGATGAGTCCTGAG-3’)加T4 DNAligase进行连接，混匀后，置16℃恒温水浴锅温浴过夜，然后放在4℃冰箱中保存备用。
[0027] 5.酶切连接的PCR预扩增：
[0028] 以步骤4酶切连接好的产物为模板，以MseI-N：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’为引物进行PCR扩增。反应条件：第一步1个循环，94℃5min，第二步18个循环，94℃1min，53℃1min，72℃1min，第三步1个循环72℃10min，4℃保存。反应产物使用1％W/V琼脂糖电泳检测，刚好出现弥散区即可，如图1。
[0029] 6.PCR预扩增产物与生物素探针杂交：
[0030] 在合适的温度(66-70℃)下使得PCR文库与所选用的生物素标记的重复(2碱基重复10-15次，3或4碱基重复5-8次)序列探针进行杂交；由于磁珠的表面包被有一层链霉亲和素，并且这种链霉亲和素与生物素有很强的亲和力，因此生物素标记的探针与含重复序列单元的DNA片断杂交结合以后，就可以很容易地被磁珠吸附，通过非严格洗脱和严格洗脱(见下文)并用磁场固定，可以很容易地去除未被杂交的DNA片断其他成分，从而达到高度富集微卫星序列的目的；在变性条件下含重复序列的微卫星DNA被TE缓冲液洗脱；将洗脱液纯化以后作为DNA模板。
[0031] 杂交体系总体积为100μL，总共平行配制2管(分别为(AC)13(AG)13)然后分装，进行杂交。在PCR仪上进行，反应程序为95℃变性5min；最适杂交温度(66-70℃)下保持1-2h。杂交反应完毕后往反应体系中加入300μL TEN100溶液，混匀后置于4℃保存备用。
将加有300μL TEN100的杂交混合液加入到经过预处理的磁珠中，室温(20-25℃，以下相同)上放置30min，期间不时轻轻地搅动或吹打溶液，避免磁珠沉淀从而更有效地吸附杂交后的DNA。然后对杂交的磁珠进行非严格洗脱(用400μL TEN1000于室温下洗涤磁珠3次，每次5min，不时搅动或吹打混合物。3次漂洗后再用400μL预热至55℃的TEN1000溶液洗涤1次)和严格洗涤(用400μL 0.2×SSC(3M NaCl，0.3M Na3C6H5O7.2H2O；pH7.0，以下相同)+0.1％(0.1g SDS，100ml 2d H2O，以下相同)SDS溶液于室温下洗涤磁珠3次，每次5min，不时搅动或吹打混合物。三次漂洗后再用400μL预热至55℃的0.2×SSC+0.1％SDS溶液洗涤1次。用磁架固定磁珠，移去洗涤液)。加入50μL TE8.0，用移液器吸打均匀，然后于95℃下水浴5min。不时搅动或吹打混合物。用磁架固定磁珠，迅速吸出上清液，冻存于-20℃，取得目的DNA片段。以洗脱产物为底物，以MseI-N为引物，用纯化后的5μL目的DNA洗脱片段用于PCR扩增，扩增条件与上面的PCR预扩增条件一致，扩增30个循环。
将加有300μL TEN100的杂交混合液加入到经过预处理的磁珠中，室温(20-25℃，以下相同)上放置30min，期间不时轻轻地搅动或吹打溶液，避免磁珠沉淀从而更有效地吸附杂交后的DNA。然后对杂交的磁珠进行非严格洗脱(用400μL TEN1000于室温下洗涤磁珠3次，每次5min，不时搅动或吹打混合物。3次漂洗后再用400μL预热至55℃的TEN1000溶液洗涤1次)和严格洗涤(用400μL 0.2×SSC(3M NaCl，0.3M Na3C6H5O7.2H2O；pH7.0，以下相同)+0.1％(0.1g SDS，100ml 2d H2O，以下相同)SDS溶液于室温下洗涤磁珠3次，每次5min，不时搅动或吹打混合物。三次漂洗后再用400μL预热至55℃的0.2×SSC+0.1％SDS溶液洗涤1次。用磁架固定磁珠，移去洗涤液)。加入50μL TE8.0，用移液器吸打均匀，然后于95℃下水浴5min。不时搅动或吹打混合物。用磁架固定磁珠，迅速吸出上清液，冻存于-20℃，取得目的DNA片段。以洗脱产物为底物，以MseI-N为引物，用纯化后的5μL目的DNA洗脱片段用于PCR扩增，扩增条件与上面的PCR预扩增条件一致，扩增30个循环。
[0032] 7.连接转化克隆：
[0033] 将纯化后的PCR扩增产物连接到T载体上进行克隆。具体操作依照TaKaRa公司提供的pMD 18-T载体连接试剂盒(购自Promega)使用说明书。连接反应体系为10μL，其构成见表1。连接条件为16℃1hr。
[0034] 表1DNA片段与T载体连接反应体系
[0035]
[0036]
[0037] 于-70℃冰箱中取出一管感受态细胞(M15，100μL)，立即置于冰浴中使其刚刚融化(如果是新鲜制作的感受态细胞，可以直接加入连接混合物)。然后加入5μL连接产物，冰浴30min。冰浴结束后42℃热激90sec，再冰浴5min，然后加入1mL预冷的液体LB培养基(不含氨苄)，于37℃的摇床(150rpm)上复苏培养45min。复苏培养结束后于4℃10000rpm离心1min，以沉淀细胞；去上清，剩余200-300μL培养基重悬细胞。往每个LB平板上加入4μL IPTG和40μL X-gal，涂布均匀，每100μL菌液涂一个平板，待液体吸收完毕后(15min左右)，将平板倒置于37℃过夜(12-16hr)。
[0038] 8.阳性克隆的挑取、培养、筛选和测序：
[0039] 挑选阳性克隆用载体通用引物测序，得到的插入片断的DNA序列，挑选出合适的微卫星DNA序列。将培养好的平板(菌落生长良好并且分布均匀)在4℃放置若干小时，使菌落充分显色。用无菌牙签挑取白色克隆到500μL(含50μLAmp)液体培养基中。37℃摇床上以200rmp转速培养过夜，4℃保存菌液。
[0040] 取1μL菌液用于PCR模板。扩增条件为：95℃5min；94℃40s；54℃30s；72℃1min；循环30次；72℃7min。取2μL产物于1％W/V琼脂糖凝胶上电泳，用全自动凝胶成像分析系统记录电泳结果；琼脂糖凝胶上电泳，并用全自动凝胶成像分析系统记录电泳结果。
[0041] 将含有插入片段并且大小合适(450-800bp)的阳性克隆取一半菌液送北京华大中生科技发展有限公司测序(图2)。另一半加入20％V/V灭菌甘油，混匀后于-70℃冻存备份。用M13+通用引物测序，测序在ABI 3730XL DNA Sequencer上进行，所用反应试剂为ABI PRISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit，每反应的有效长度可达700-800bp左右。对于含有较好重复片段的序列，用M13引物从另外一段进行测序，并将正反向测序结果进行拼接，以确保序列的准确性。
[0042] 9.序列分析和微卫星位点的分类与设计：
[0043] 用软件SSRHunter(version 1.3.0；李强)从得到的序列中查找出含有重复单元的微卫星序列。反其中重复次数较多(2碱基重复10-15次，3或4碱基重复5-8次)、测序结果非常好、并且重复区域两翼具有足够保守区的序列作为微卫星位点。下图显示一个理想的微卫星位点的DNA序列(图3)及其测序峰形图(图4)
[0044] 根据Weber(1990)提出的标准将微卫星分为3类：完美型(perfect)，指没有中断的或附近没有其它种类重复序列的重复序列；非完美型(imperfect)，指2个或以上的同种重复序列被3个碱基以下的非重复序列所间隔；复合型(compound)，指一种重复序列与其它种类的重复序列被3个以下的非重复序列所间隔。
[0045] 先将挑选出的微卫星序列用在线工具VecScreen(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/)去除载体序列，然后在序列上标记出Mse I接头(A和B)的位置，再用引物设计软件Primer Premier 5.0(Rozen and Skaletsky 1988)在两端接头和核心重复区域之间设计正向和反向PCR扩增引物，用于相应位点的PCR扩增。
[0046] 10.微卫星引物有效性检验：
[0047] 对每个位点引物的有效性合多态性进行筛选，得到有效的微卫星位点。随机挑选两个质量较好的DNA模板对所有合成的引物进行PCR扩增，退火温度优先使用设计引物时的默认温度为50-62℃，若得不到扩增产物或者扩增效果不好，则对退火温度进行调整。
[0048] 微卫星PCR扩增反应体系为15μL，其构成如下表。扩增条件为：94℃5min；94℃40s，Tm 30s，72℃40s，35cycles；72℃7min。PCR扩增产物按照5：1以体积比例加入上样缓冲液，95℃变性5分钟后迅速置于冰上，然后在8％变性聚丙烯酰胺凝胶上加样检测。在上样的同时往其中一个加样孔加入0.1gPBR322/Msp I Marker，作为扩增产物的相对分子量标准。最后用银染的方法染色读带。将能够正常扩增的引物对用挑选出的DNA模板在最适退火温度(50-62℃)下进行PCR扩增的结果在聚丙烯酰胺胶上电泳的结果读带，选择带型清晰，至少有两个或两个以上等位基因的引物筛选出来。通过本实验共得到20对多态性好的SSR引物。
[0049] 本发明的特点：磁珠富集法的是利用生物素标记重复序列特异探针并与基因组DNA酶切片段杂交，再利用生物素与链亲和素亲和性强的特性，用包被链亲和素的磁珠进行磁力吸附完成重复序列目标片段的富集。经过磁珠富集后使克隆测序量大幅下降且使获得具有重复序列的片段的效率大幅度提高，因此，成为SSR引物开发极其有效的方法而迅速得到广泛应用。本发明的优点：通过几步简单的操作就能得到富含微卫星位点的DNA片段，减低了实验成本，缩短了实验周期，且成功率高，是目前较为简单有效的SSR引物开发方法。本发明共挑取了105个阳性克隆进行测序，其中有48个测序序列能设计引物，从48对引物中得到了20对有效的引物，有效引物得率为19％(20/105)而Matthew W Blair等通过基因组的对3123个EST筛选引物的得到120个有效的SSR引物，有效引物得率为3.8％(120/3123)，由此可见本发明开发SSR引物效率高，且简单易行，能为大批量的开发SSR引物提供保障。附图说明
[0050] 图1为一种预扩产物示意图(PCR不同循环次数)。
[0051] “1”和“2”为不同的菜豆品种经过酶切与接头连接的产物为模板，以MseI-N：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’为引物进行PCR扩增；其中的14*，16*，18*，22*分别指PCR循环14次，16次，18次，22次。
[0052] 图2为一种菌液PCR产物示意图。
[0053] 图中不同的加样孔为以挑去的不同阳性克隆为模板，以M13为引物进行PCR扩增的结果。选取500以上的条带进行测序。
[0054] 图3为一种AG重复测序序列之一。
[0055] 该序列为完美序列，TC两碱基重复13次，微卫星序列位于474-499之间。
[0056] 图4为一种AG重复测序峰形示意图。
[0057] TC两碱基重复13次的微卫星序列位于474-499之间，在它的两侧可以设计引物，就是本方法要开发的SSR引物序列之一。
具体实施方式
[0058] 下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明。
[0059] 实施例1：
[0060] 一种磁珠富集法开发菜豆SSR引物的制备方法，其步骤是：
[0061] A、提取菜豆基因组DNA，对基因组进行酶切，建立AFLP-PCR文库：
[0062] 菜豆品种乔育(由武汉市蔬菜科学研究所提供优良菜豆品种，蔓生，叶色绿，花色浅黄)。这个品种是优质的菜豆品种，具有菜豆品种的一般特征。按照常规的栽培管理和肥水措施种植，待小苗长出5-6片叶子，取嫩叶0.4克利用CTAB法提取基因组DNA。
[0063] (1)10ml的Eppeddorf管中加入4ml 3×CTAB提取液(含0.2％β-巯基乙醇(W/V)，在65℃水浴锅中预热。
[0064] (2)取0.4克菜豆的嫩叶放到研钵中，加入适当液氮迅速多次研磨成细粉，转入预热的CTAB提取液中，将离心管盖紧以防止β-巯基乙醇挥发。放回水浴中保温(65℃)40min，保温过程中轻晃几次，保持摇匀。
[0065] (3)取出Eppenddorf管，置于冰上迅速冷却到室温，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，轻微混合均匀且充分，使其彻底地混合成为乳状液，然后4℃下离心12000rpm10min，轻轻将上清液吸取1ml放于1.5ml离心管中，放于-20℃冰箱中备用。
[0066] (4)上面提取的DNA中加入1倍体积冰冷的100％(V/V)乙醇。
[0068] (6)加入1mlTE和1μl RNase(10mg/ml)，在37℃中保温40min。
[0069] (7)加入等体积氯仿/异戊醇抽提一次。12000rpm离心10min，吸取上清液转入另外一个Eppendorf管中，加入1/10体积的醋酸钠和2倍体积冰冷的无水乙醇，-20℃放置1h。
[0070] (8)10000rpm离心10min，小心倒掉上清液。
[0071] (9)加入70％(V/V)的乙醇1ml洗涤3次，150μl TE重悬DNA。
[0072] (10)放于-20℃冰箱中保存。
[0073] 提取基因组DNA的浓度用分光光度计检测。用MseI对菜豆基因组DNA进行酶切，酶切反应在PCR仪或者水浴锅37℃反应3h，然后65℃处理20min以灭活MseI酶。配置配20ul的反应体系(NEB buffer 2：2.0μL，100×NEB BSA：0.2μL，MseI 10U/ul：0.5μL，DNA：10μL，ddH2O：补至20μL)，酶切琼脂糖检测。
[0074] Mse I 接 头 序 列：Oligo-MseI A 5-TACTCAGGACTCAT-3’，Oligo-MseI B5-GACGATGAGTCCTGAG-3’。制备接头：将Oligo-Mse I A和Oligo-Mse I B分别配成50μM贮存液，充分溶解后，取出等体积Oligo-MseI A和Oligo-MseI B各50μL，充分混匀后于94℃变性5min，取出后缓慢冷却至室温，保存于-20℃备用至浓度为25uM。连接体系：总体系20ul(7ul酶切DNA产物+1.5ul 10×ligase buffer+4ul T4DNAl igase(3U/ul)+2.5ul MseI混合接头)。混匀后，置16℃恒温水浴锅温浴过夜，然后放在4℃冰箱中保存备用。
[0075] B、酶切连接的PCR预扩增：
[0076] (1)Mse I-N引物序列5’-GAT GAG TCC TGA GTA AN-3’(N＝A，T，G，C)共四对组成混合引物。
[0077] (2)预扩增反应体系
[0078] 预扩增反应总体积为20μL，总共平行配制3管。然后分装后，进行PCR扩增。扩增反应构成如表2：
[0079] 表2预扩增反应体系
[0080]
[0081] (3)预扩增PCR条件：94℃5min；94℃1min，53℃1min，72℃1min；72℃7min。设计3组不同循环数(16/18/20cyles)，每组相差2循环，以确定最优化扩增条件。
[0082] (4)预扩增产物的电泳检验
[0083] 取3μLPCR反应产物，加入1μL上样缓冲液，混匀后于1％W/V琼脂糖凝胶电泳。成功的标志是电泳产物中出现一个smear区域(200-800bp)。使得smear区域刚刚出现的循环数(18)为最佳扩增循环数。
[0084] C、PCR预扩增产物与生物素探针杂交：
[0085] (1)杂交体系和条件
[0086] 杂交体系总体积为100μL，总共平行配制2管(分别为(AC)13(AG)13)然后分装，进行杂交。杂交体系表3：
[0087] 表3杂交构成体系
[0088]
[0089] 在PCR仪上进行，反应程序为95℃变性5min；最适杂交温度(68℃)下保持1h。杂交反应完毕后往反应体系中加入300μL TEN100溶液，混匀后置于4℃保存备用。
[0090] (2)磁珠杂交和洗涤
[0091] ①磁珠的预处理
[0092] 将2mg磁珠用300μL TEN100溶液仔细洗涤3次，每次5min，每次洗涤结束时用磁架固定磁珠，吸出上清液。洗涤完毕后，用40μL TEN100溶液悬浮磁珠，置于4℃保存备用。
[0093] ②磁珠杂交
[0094] 将加有300μL TEN100的杂交混合液加入到经过预处理的磁珠中，室温上放置30min，期间不时轻轻地搅动或吹打溶液，避免磁珠沉淀从而更有效地吸附杂交后的DNA。
[0095] ③磁珠洗涤
[0096] a.磁珠吸附完毕后，用磁架固定磁珠，移去杂交混合液。
[0097] b.非严格洗脱(nonstringency wash)：用400μL TEN1000于室温下洗涤磁珠3次，每次5min，不时搅动或吹打混合物。3次漂洗后再用400μL预热至55℃的TEN1000溶液洗涤1次。
[0098] c.严格洗脱(stringency wash)：用400μL 0.2×SSC+0.1％SDS溶液于室温下洗涤磁珠3次，每次5min，不时搅动或吹打混合物。3次漂洗后再用400μL预热至55℃的0.2×SSC+0.1％SDS溶液洗涤1次。用磁架固定磁珠，移去洗涤液。
[0099] d.目的DNA片段的洗脱：加入50μL TE8.0，用移液器吸打均匀，然后于95℃下水浴5min。不时搅动或吹打混合物。用磁架固定磁珠，迅速吸出上清液，冻存于-20℃。
[0100] D.目的DNA片段的纯化和扩增：
[0101] 以两次洗脱产物为底物，以MseI-N为引物，用纯化后的5μL目的DNA洗脱片段用于PCR扩增，扩增条件与上面的PCR预扩增条件一致，扩增30个循环。
[0102] (1)载体连接
[0103] 具体操作依照TaKaRa公司提供的pMD 18-T载体连接试剂盒使用说明书。连接反应体系为10μL，其构成如表4。连接条件为16℃1hr。
[0104] 表4DNA片段与T载体连接反应体系
[0105]
[0106] (2)连接产物的转化
[0107] 于-70℃冰箱中取出一管感受态细胞(M15，100μL)，立即置于冰浴中使其刚刚融化(如果是新鲜制作的感受态细胞，可以直接加入连接混合物)。然后加入5μL连接产物，冰浴30min。冰浴结束后42℃热激90sec，再冰浴5min，然后加入1mL预冷的液体LB培养基(不含氨苄)，于37℃的摇床(150rpm)上复苏培养45min。复苏培养结束后于4℃10000rpm离心1min，以沉淀细胞；去上清，剩余200-300μL培养基重悬细胞。往每个LB平板上加入4μL IPTG和40μL X-gal，涂布均匀，每100μL菌液涂一个平板，待液体吸收完毕后(15min左右)，将平板倒置于37℃过夜(12-16hr)。
[0108] E、阳性克隆的挑取、培养和筛选：
[0109] (1)阳性克隆的挑取、培养
[0110] a.一般将每个平板的克隆菌落控制在200个左右，以方便挑选阳性克隆。将培养好的平板(菌落生长良好并且分布均匀)在4℃放置若干小时，使菌落充分显色(阳性克隆为白色，空质粒为蓝色或淡蓝色)。
[0111] b.用无菌牙签挑取白色克隆到500μL(含50μLAmp)液体培养基中。
[0112] c.37℃摇床上以200rmp转速培养过夜，4℃保存菌液
[0113] (2)PCR检验阳性克隆
[0114] 取1μL菌液用于PCR模板。扩增反应体系为15μL，同时做阴性对照，反应体系构成见表5。扩增条件为：95℃5min；94℃40s；54℃30s；72℃1min；循环30次；72℃7min。
[0115] 表5用于检测阳性克隆的PCR反应体系
[0116]
[0117] 取2μL产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，并用全自动凝胶成像分析系统记录电泳结果。将含有插入片段并且大小合适(450-800bp)的阳性克隆取一半菌液送北京华大中生科技发展有限公司测序。另一半加入20％灭菌甘油，混匀后于-70℃冻存备份。用M13+通用引物测序，测序在ABI 3730XL DNA Sequencer上进行，所用反应试剂为ABI PRISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit，每反应的有效长度可达700-800bp左右。对于含有较好重复片段的序列，用M13引物从另外一段进行测序，并将正反向测序结果进行拼接，以确保序列的准确性。
[0118] F、序列分析和微卫星位点的分类与设计：
[0119] 用软件SSRHunter(version 1.3.0；李强)从得到的序列中查找出含有重复单元的微卫星序列。先将挑选出的微卫星序列用在线工具VecScreen去除载体序列，然后在序列上标记出Mse I接头(A和B)的位置，再用引物设计软件Primer Premier 5.0(Rozen and Skaletsky，1988)在两端接头和核心重复区域之间设计正向和反向PCR扩增引物，用于相应位点的PCR扩增。在设计引物时，相关的参数无为默认值(引物长度在18-27bp之间，最适长度为20bp；扩增退火温度在50-63℃之间，最适温度为60℃；GC含量(GC％)在20-80％之间，最适含量为50％；扩增产物长度在100-500bp之间，最适长度为200bp)。
[0120] G、微卫星引物有效性检验：
[0121] (1)微卫星PCR扩增
[0122] 随机挑选两个质量较好的DNA模板对所有合成的引物进行PCR扩增，退火温度优先使用设计引物时的默认温度为50-62℃，若得不到扩增产物或者扩增效果不好，则对退火温度进行调整。
[0123] 微卫星PCR扩增反应体系为15μL，其构成如表6。扩增条件为：94℃5min；94℃40s，Tm 30s，72℃40s，35cycles；72℃7min。
[0124] 表6微卫星扩增反应体系
[0125]
[0126] (2)PCR扩增产物检测
[0127] PCR扩增产物按照5∶1以体积比例加入上样缓冲液，95℃变性5分钟后迅速置于冰上，然后在8％变性聚丙烯酰胺凝胶上加样检测。在上样的同时往其中一个加样孔加入0.1g PBR322/Msp I Marker，作为扩增产物的相对分子量标准。最后用银染的方法染色读带。具体操作步骤如下：
[0128] ①洗玻璃板。用刷子将玻璃板洗净烘干，灌胶前再用酒精擦洗3遍。
[0129] ②硅化和反硅化玻璃板。将配制好的硅化剂(200μL剥离硅烷+2mL 95％乙醇)倾倒在短板上，用滤纸迅速擦拭均匀；将配置好的反硅化剂(9μL亲和硅烷+18μL冰乙酸+2mL 95％乙醇)倾倒在长板上，用滤纸迅速擦拭均匀。然后在通风厨里晾干15分钟。
[0130] ③灌胶。将玻璃板安装好，稍倾斜放于平桌面上。在一个小烧杯中加入60mL配置好的尿素单体胶，400μL 10％AP，40μL TEMED后摇匀后缓慢灌胶，避免出现气泡.[0131] ④凝胶。把胶板水平放置，反插入梳子，放置3小时。
[0132] ⑤预电泳。将梳子拔出，把胶板和梳子洗净，在电泳槽上安装好胶板，上槽和下槽各灌1×TBE 400mL。45w恒功率电泳1小时至45℃。
[0133] ⑥上样电泳。上样前先停止预电泳，用枪将上样面吹洗干净，然后插好梳子。每孔点样3μL，45w电泳1.5小时。
[0134] ⑦银染。第一步，将长板拆下放入1.5L10％的醋酸溶液中固定30分钟；第二步，移去固定液，用去离子水漂洗3次，每次两分钟；第三步，在含1.5‰甲醛溶液的1‰硝酸银染液中染色30分钟；第四步，去离子水漂洗10秒；第五步，显影液(3％碳酸钠溶液)显色至带清晰；第六步，将固定液倒入显色液中停显。
[0135] ⑧照相保存。用数码相机对显色过的胶板照相。
[0136] (3)多态性微卫星位点的筛选
[0137] 将能够正常扩增的引物对用挑选出的DNA模板在最适退火温度下进行PCR扩增的结果在聚丙烯酰胺胶上电泳的结果读带，选择带型清晰，至少有两个或两个以上等位基因的引物筛选出来。
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