技术领域及发明内容

本发明涉及一种生物反应器装置。本发明还涉及一种培养活体细 胞的方法。

根据本发明，本文提供了一种生物反应器装置，其包括一保持器， 其中容纳着由开孔泡沫材料制成的三维基质，泡沫材料的内部为多孔 的，活体细胞容纳在其多孔的内部，且由此来实现固附，生物反应器 装置还包括一种容纳在保持器中的液体，该液体为氧气载体，其浸泡 并渗入到基质中，液体至少在部分上是水性的并且包含一种合成或半 合成的载氧成分，该载氧成分包括至少一种从一组材料中选出的组分， 这组材料包括不含细胞的血红蛋白、交联血红蛋白、微脂粒封装的血 红蛋白以及全氟化碳，基质是用泡沫材料制成的单体或整体连续介质， 泡沫材料为开孔的泡沫材料，且该装置构成一载氧液体循环回路的部 件，该循环回路用于使载氧液体流入到保持器中、用于使所述液体循 环灌注通过其中培养着活体细胞的基质、以及用于使其从保持器中循 环流出。

对于“合成”成分，是指载氧成分是通过人造工艺、而非生物步骤 制成的，而“半合成”成分则意味着该载氧成分是通过对生物制备的原 材料进行人工合成而制成的。

开孔泡沫材料可以是具有生物相容性和生物稳定性的材料，其可 以是聚合泡沫材料。因而，该泡沫材料可以是一种聚合物泡沫，该聚 合物是从一组材料中选出的，这组材料包括：聚氨酯聚合物、聚氯乙 烯聚合物、聚乙烯聚合物、聚丙烯聚合物、聚苯乙烯聚合物、上述聚 合物的共聚物、苯乙烯—丁二烯共聚物、苯乙烯—丙烯腈共聚物、丙 烯腈—丁二烯—苯乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、聚酰胺聚 合物、聚己二酰己二胺聚合物、聚亚己基癸二酰胺聚合物、聚己酸内 酯聚合物、聚对苯二甲酸乙二酯聚合物、聚对苯二甲酸丁二醇酯聚合 物、聚碳酸酯聚合物、聚缩醛聚合物、聚乙烯醇聚合物、尿素甲醛聚 合物、含氟聚合物、含硅聚合物以及上述聚合物和共聚物的混合物。

如上文提到的那样，基质是用所述泡沫材料制成的单体或整体连 续的介质。

活体细胞可以是动物细胞—尤其是哺乳动物的细胞，载氧液体构 成了一种血液代用品，其可作为二氧化碳的载体。如下文将要更为详 细地描述的那样，在使用中，载氧液体灌注流经生物反应器装置，并 流过装置中的基质，在该基质中，活体细胞吸收载氧液体中的氧气， 载氧液体吸收细胞产生的二氧化碳。这样，尽管该载氧液体具有载送 氧气的重要功能，但这并不是其唯一的功能，其还作为二氧化碳的载 体，并具有下文将要描述的其它功能。更具体来讲，载氧液体可包括 一种水性的液体，且载氧液体具有至少一种从一组材料中选出的组分， 该组分作为所述的合成或半合成的载氧成分，这组材料包括：不含细 胞(cell-free)的血红蛋白、交联血红蛋白、微脂粒封装的血红蛋白以 及全氟化碳，其中，优选为全氟化碳。合成或半合成的载氧成分可以 是全氟化碳，载氧液体可以是有机物相和水相的乳浊液，有机物相包 括全氟化碳，且其通常为乳浊液中的分散相，水相为乳浊液的连续相， 并包括水性液体，水相通常包括血浆。而合成或半合成的成分则可以 是不含细胞的血红蛋白，不含细胞的血红蛋白被溶解到水性液体—例 如血浆中。合成或半合成的成分还可以是微脂粒质封装的血红蛋白， 微脂粒封装的血红蛋白作为悬浮物悬浮在水性液体—例如血浆中。因 而，此处所用“载氧液体”一词的含义应当包括乳浊液、溶液以及悬 浊液，在这些液体中，通过乳化作用、溶解或悬浮作用将合成或半合 成的成分散布到一种水性液体—例如血浆中。

所述保持器可以是一反应罐或一反应容器，其具有一载氧液体进 口，其方便地设置在高位处；并具有一载氧液体出口，其方便地设置 在低位处，载氧液体出口所在高度低于载氧液体进口所在高度，从而 形成一低位的载氧液体排出口，保持器可选择地设置一温度调节装置， 用于调整基质和载氧液体的温度，该调节装置例如是一加热/冷却护 套，其具有为水等加热/冷却液体所设置的进口和出口。因而，该装置 就构成了一温度调节液体循环回路的一部分，用于使温度调节液体循 环到保持器中和从保持器中流出，保持器上设置有这种形式的温度调 节装置：其是为保持器设置的一个中空温度调节护套，该护套具有为 调温液体设置的进口和出口，温度调节回路包括：一液体循环装置， 用于使调温液体沿该回路进行循环流动；一恒温器；以及一远离保持 器的传热装置，其可响应于恒温器传来的信号而工作，从而控制调温 液体的温度，进而调节基质和载氧液体的温度。但也可将整套设备或 设施安装到一温控环境中。

该生物反应器装置可构成一便携式设备的部件，或构成一固定设 施的部件，从而相应地将本发明延伸应用到设备或设施中。在这样的 设备或设施中，生物反应器装置如上文提到的那样：构成了一载氧液 体循环回路的部件，该循环回路被设置成使载氧液体流入到保持器中 (例如是经进口)、流经其中固附了活体细胞的基质、并从保持器中流 出(例如是经出口)。该设备或设施还可选设一清除毒素装置—例如一 吸收塔或一离子交换单元。

载氧液体的循环回路包括至少一个装置，该装置是从一组装置中 选出的，这组装置例如为：一用于使载氧液体绕回路循环的循环泵； 诸如过滤器等的生物体清除装置，用于清除从保持器流出的载氧液体 中所含的生物体；分离装置，用于将载氧液体中的合成或半合成成分 与其它成分分离开；二氧化碳清除装置，用于清除出载氧液体所含的 二氧化碳；充氧装置，用于对载氧液体进行充氧；以及脱气装置，用 于对载氧液体执行脱气处理。在一特定实施例中，循环回路可包括上 述这组装置中的多个，这些装置被设置成从保持器开始沿一次序排列， 该装置序列中包括单个生物体清除装置，之后依次是单个的分离装置、 单个的二氧化碳清除装置、单个的充氧装置、单个的脱气装置以及单 个的液体循环装置，保持器连接在液体循环装置之后，从而形成了封 闭或闭环的回路，且液体循环装置被设置成使载氧液体沿一定的方向 在回路中循环，该方向即为所述那组装置的依次连接次序。在这样的 情况下，当载氧液体为乳浊液，且该乳浊液以全氟化碳作为其合成成 分、并以血浆作为其水性液体时，通过所述分离装置利用物理方法就 可将全氟化碳与血浆和目前其它任何的培养基分离开，其中的分离方 法例如是离心分离或过滤，可选为在乳浊液被破乳之后执行分离；但 是对于其它的合成成分，例如不含细胞的血红蛋白或脂质封装的血红 蛋白，则就要采用其它的分离技术，来与所针对的合成载氧成分相适 应；该分离装置的另一功能在于：其作为血浆循环回路的液体储存器。 如上文所指出的那样，在一具体设计方案中，血浆循环回路包括上文 列出的所有装置，且在此情况下，这些装置是按照上文指出的次序依 次串联的，在沿回路流动的方向上，泵紧邻生物反应器装置，并位于 其上游，且生物体过滤器紧邻地设置在生物反应器装置的下游。换言 之，在所述流动方向上，串联次序是这样的：首先为生物反应器装置、 随后是生物体清除装置、之后再是分离装置、二氧化碳清除装置、充 氧装置、脱气装置以及泵，生物反应器装置接在泵之后。可选情况是： 二氧化碳清除装置和充氧装置为同一个装置。

如上文指出的那样，设备或设施可包括一加热/冷却的液体回路， 用于使加热/冷却液在加热/冷却护套中循环，该回路还可选为具有其 自身的液体循环装置—例如泵、在护套中的恒温器以及远离生物反应 器装置的加热/冷却装置，其中的加热/冷却装置可响应于恒温器的信 号而工作，方便的作法是：恒温器是由一连接到可编程逻辑控制器上 的热电偶构成的。

设备或设施可包括一血液循环回路，例如用于接纳或抽取患者或 动物的血液，从而使血液发生循环而同血浆循环回路相接触，由此将 血浆等血液成分输送给载氧液体，并接纳或吸收载氧液体中的水性成 分，并将它们返送到患者身体中。血液循环回路可包括：一例如为泵 的液体循环装置，用于使血液以及血液成分绕血液循环回路循环流 动；一血浆分离装置，用于将从患者抽出的血液分离为不含血细胞的 血浆部分、含有血细胞以及一些血浆的血细胞含有部分；以及一脱气 装置。血浆分离装置可选为包括另一装置——例如一血液过滤器。在 液体沿回路循环流动的方向上，血液循环回路中的各组成装置的排列 次序可以是上面进行列举的次序。因而，首先是从患者开始，第一个 装置是泵，之后依次是血浆分离装置和脱气装置，脱气装置之后再返 回到患者。换言之，载氧液体循环回路可与血液循环回路相连接，用 于使血液循环流动而与载氧液体循环回路中的载氧液体相接触，从而 将不含细胞的血液组分输送到载氧液体回路中，并接收或吸收载氧液 体回路中不含细胞的水性载氧液体成分，血液循环回路包括：一血液 循环装置，用于使血液绕血液循环回路循环流动；一血浆分离装置， 用于将绕血液循环回路循环流动的血液分离为不合血细胞的血浆部 分、含有血细胞以及一些血浆的血细胞含有部分；以及一脱气装置， 用于对绕血液循环回路循环的血液执行脱气处理。如上文所指出的那 样，血液循环回路中各个装置可按一定次序布置，在该次序中，血液 循环装置的后方依次连接着血浆分离装置和脱气装置，血液循环装置 被设置成使血液绕血液循环回路以一定的方向流动，该方向即为血液 循环回路中各装置依次的连接方向。

血浆分离装置可被连接到血浆循环回路上，从而血浆分离装置被 设置成将从患者血液中分离出的血浆输送到血浆循环回路中，方便的 作法是：连接在血浆循环回路中脱气装置的下游、泵和生物反应器装 置的上游；且血浆循环回路的分离装置可按照这样的方式连接到血液 循环回路上：使得分离装置被设置成将从载氧液体中分离出的水性液 体输送到血液循环回路中，方便的作法是：连接在血浆循环回路中血 浆分离装置的下游、脱气装置的上游。换言之，载氧液体循环回路与 血液循环回路之间的连接可以是载氧液体循环回路与血液循环回路中 血浆分离装置之间的连接。

设备或设施方便地包括一条或多条营养素补充管线、一载氧液体 补充管线以及有供氧管线(该供氧管线可以是输送纯氧、或者是输送 氧气与二氧化碳等其它气体的混合气)，每条输送管线都通向血浆循环 回路中的充氧装置；且设备或设施可包括一条或多条真空管线，其连 接到二氧化碳清除装置上，用于抽吸二氧化碳，一生物体流动管线连 接到生物体清除装置上，用于排出生物体清除装置从载氧液体中清除 出的废生物体。设施还可包括一血液调整供应管线，用于向血浆回路 中输送血液调整物质—例如是为了控制血液的pH值或修正血液的其 它化学不平衡，且这些物质被方便地输送到充氧装置中。

本发明还扩展出一种用于培养活体细胞的方法，该方法包括：将 一种液体循环流过一基质，该液体为载氧液体，并至少部分地包括一 种半合成或合成的载氧成分，基质由开孔的泡沫材料制成，其内部是 多孔的，活体细胞固附到该内部中，基质构成一载氧液体循环回路的 部件，该循环回路用于使载氧液体循环流动，使其流入到容纳着三维 基质的一保持器中、流过所述基质、并从保持器中流出，细胞从液体 中吸收氧气和养分，液体吸收细胞产生的二氧化碳和其它代谢产物， 基质是用所述开孔泡沫材料制成的单体或整体连续介质，且通过将载 氧液体灌注通过基质来使载氧液体循环流过所述基质。

更详细来讲，所述基质构成了如上所述生物反应器装置的一个部 件；且载氧液体也如上文参照本发明设备或设施所介绍的那样。自然 地，活体细胞还将吸收载氧液体中除氧气之外的其它成分—例如营养 物，且载氧液体也将吸收细胞除二氧化碳之外的其它代谢产物。

如上述那样，生物反应器装置可构成此处所述设备或设施的一个 部分，从而通过使液体围绕载氧液体循环回路—例如血浆循环回路循 环流动、并流过保持器中的基质来将液体灌注通过基质，该方法可选 择地包括如下的一个或多个步骤：

通过监测基质的温度、以及生物反应器的保持器内部的温度，并 使加热/冷却液体以合适的流量和温度绕加热/冷却液回路流动，从而 将基质与保持器内部的温度保持在理想的数值范围内，这样对它们的 温度进行控制；

利用一生物体过滤器从载氧液体中过滤出生物体，并沿生物体流 动管线将其排到废物收集处；

在分离装置中，将载氧液体分离为诸如血浆相的水性相、以及有 机全氟化碳等的合成成分含有相，同时沿血浆循环回路输送分离出的 合成成分含有相，并将分离出的水性相输送到血液循环回路中；

利用二氧化碳清除装置，从载氧液体中清除出二氧化碳，沿真空 管线将清除出的二氧化碳被从二氧化碳清除装置中抽吸走；

在充氧装置中对载氧液体进行充氧，并可选地在充氧装置中向载 氧液体中输送营养补充物、载氧液体补充量、以及血液调整物质；以 及

在血浆循环回路的脱气装置中对载氧液体执行脱气处理，载氧液 体被泵作用着而绕血浆循环回路流动。

具体来讲，载氧液体可包括一种血浆形式的水性成分，通过使载 氧液体绕一载氧液体循环回路流动、并流经基质，而使液体灌注充满 基质，所述方法包括步骤：调节基质以及载氧液体的温度，以将基质 和载氧液体的温度保持在一理想的数值范围内。在此情况下，方法可 包括步骤：从绕载氧液体循环回路流动的载氧液体中清除生物体，并 将清除出的生物体排出废弃。方法还包括步骤：对绕载氧液体回路流 动的载氧液体进行分离，而分离出水性相和含半合成或合成载氧成分 的相，水性相基本上不含所述的载氧成分，且所述方法包括步骤：将 分离出的含半合成或合成成分的相保留在载氧液体循环回路中，并将 分离出的水性相输送到与载氧液体循环回路相连接的血液循环回路 中。

所述方法还包括对患者的血液进行处理的过程，从而其可包括如 下的一个或多个步骤：

抽取患者的血液—尤其是静脉血；

将血液分离为血浆部分和含血细胞的部分，血浆部分被输送到血 浆循环回路内的载氧液体中，同时，含血细胞的部分被返送到患者的 身体中(如下文将要描述的那样，随同从血浆循环回路中分离出的血 浆相)；

在含细胞部分返回到患者体中之前对其执行脱气处理；以及

将由血浆循环回路中分离装置从载氧液体中分离出的水性相—例 如血浆相输送到患者体中，最好是在对含细胞部分执行脱气步骤之前， 将水性相输送到含细胞部分中。

具体来讲，在下文中，将用该方法对人体血液进行处理，该方法 包括步骤：将从血液循环回路输送来的血液分离为血浆部分和含细胞 的部分，血浆部分输送到载氧液体循环回路中的载氧液体中，而含细 胞的部分被留在了血液循环回路中。在此情况下，可用半透性的屏障 来将血浆部分与含细胞的部分相互分离，其中，血浆部分可透过该半 透屏障，但该半透屏障却不允许血细胞透过。

在本发明一特定实施例中，活体细胞可以是肝细胞，例如为人体 或猪的肝细胞。因而，细胞可以是猪的肝细胞，这种细胞是从一原生 细胞培养体获得的，或者肝细胞也可以是人体的肝细胞，其是从一恶 性或变性细胞系获得的，其中的细胞系例如为HUH7细胞系，或者优 选为HEP-G2细胞系，这些细胞可选为与实质细胞共同培养。因而， 具体来讲，所述活体细胞可从一组细胞中选择，这组细胞包括：猪肝 脏细胞、人体肝脏细胞、狒狒肝脏细胞以及这些细胞的混合物，这些 细胞通过对血液执行一种人造肝功能，而对血液进行处理。

如果设备或设施带有与患者相连接的血液循环回路且生物反应器 中包含肝细胞，则生物反应器中肝细胞的量应当优选为能执行患者所 需的至少20％—最为理想为至少30％的基本肝功，该比例最好为更 大。另外，优选的是：应当向肝细胞输送氧气和营养物，并从肝细胞 清除二氧化碳，输送氧气和养分的速率以及清除二氧化碳的速率应当 足以在足够长的时间内维持细胞的活性和细胞的代谢活动，从而可允 许在患者体内进行肝脏再生或移植，其中的时间例如为14天或更长。 具体来讲，当设备或设施连接到患者上时，其最好具有生物相容性和 生物稳定性，且最好应当将患者的排异反应减到最小。在这样的应用 环境中，可以领会：生物反应器将作为一人造器官—也就是说一人造 肝脏，其可模仿患者自身的正常肝功，并具有一些可能还未知的功能。 一般来讲，基质中肝细胞的数量可执行成年人所需基础肝功的至少 20％—优选为至少30％，在其中的基质中灌注了载氧液体，通过一充 氧装置向载氧液体输送氧气，并利用血浆向载氧液体输送营养物，由 充氧装置将载氧液体中二氧化碳清除出去，且通过血浆将载氧液体中 的细胞代谢产物清除出去，执行输送或清除的各个速率足以使载氧液 体注满基质，用以在至少3天—优选为至少7天、最佳为至少14天的 时间内维持细胞的活性和代谢活动。

当用作人造肝脏时，生物反应器装置需要其中的活体细胞能获得 供应，尤其是获得氧气和营养物质，同时应能清除出二氧化碳以及其 它的代谢产物；与此同时，活体细胞必须要暴露于血液或分离出的血 液成分中，其中的血液成分例如为血浆部分，肝脏细胞对这些物质执 行它们预期的代谢功能—例如为清除掉血液或其组分中的神经毒素和 肝毒素、产生神经营养性因子和肝脏营养性因子以及产生出肝脏特有 的抗血友病因子。在此方面，血浆分离装置例如可形成一种半透性的 屏障，其例如为半透膜，其能允许不含细胞的液体透入到载氧液体中， 但却不允许血液中的细胞透过，类似的情形也适用于生物体过滤器和 血浆循环回路中的分离装置，它们例如可形成这样一种半透性屏障： 其允许不含细胞的水性液体重新进入到血液循环回路中，其中的水性 液体中已分离出了载氧液体所含的大部分合成成分。自然，也可采用 离心机等其它的分离装置来取代上述措施。

诸如肝脏细胞等的肝细胞是固附依赖性的，也就是说，其固附到 适当的三维基质上将便于其生长和细胞分裂，并增强其有关肝功代谢 的功能。本发明的开孔泡沫材料在三维基质中形成了足够大的表面积， 足以接纳细胞的着附和固附，其中的固附是由细胞自身来完成的；但 如果细胞不能固附就位，或如果需要改善固附效果，就可将细胞封装 在聚合物罩壳中，该罩壳可以是多孔或可透过性的，罩壳可被制成或 允许粘附到基质上，或者是与基质为一体。取而代之，也可以在泡沫 自身上覆盖一种固附增强物质—例如胶原质。

本发明提供了一种用于培养活体细胞的方法，该方法包括步骤： 使一种液体循环地流过一基质，该液体为载氧液体，并至少部分地包 括一种半合成或合成的载氧成分，基质由泡沫材料制成，其内部是多 孔的，活体细胞固附到该内部中，基质构成一载氧液体循环回路的部 件，该循环回路用于使载氧液体循环流动，使其流入到容纳着三维基 质的一保持器中、流过所述基质、并从保持器中流出，细胞从液体中 吸收氧气和养分，液体吸收细胞产生的二氧化碳和其它代谢产物，其 中，基质是用所述开孔泡沫材料制成的单体或整体连续介质，且通过 将载氧液体灌注过基质来使载氧液体循环流过所述基质。

该载氧液体包括一种血浆形式的水性成分，并通过使液体沿一载 氧液体循环回路流动而将液体灌注通过基质，该方法还包括对基质和 载氧液体的温度进行调节步骤，从而将基质与载氧液体的温度保持在 理想的数值范围内。

所述方法还包括步骤：从围绕载氧液体循环回路流动的载氧液体 中分离出生物质，并将分离出的生物质排到废物收集处。

所述方法还包括步骤：对围绕载氧液体回路流动的载氧液体进行 分离，而分离出水性相和含半合成或合成载氧成分的相，水性相基本 上不含所述的载氧成分，且所述方法包括步骤：将分离出的含半合成 或合成成分的相保留在载氧液体循环回路中，并将分离出的水性相输 送到与载氧液体循环回路相连接的血液循环回路中。

所述方法还包括：对人体血液进行处理的过程，并包括将血液循 环回路的血液分离为血浆部分和含细胞部分的步骤，其中的血浆部分 被输送到载氧液体循环回路内的载氧液体中，含细胞部分被留在血液 循环回路中。

根据所述方法，用半透性的屏障(70)来将血浆部分与含细胞部 分相互分离，其中，血浆部分可透过该半透屏障，但该半透屏障却不 允许血细胞透过。

所述活体细胞从一组细胞中选择，这组细胞包括：猪肝脏细胞、 人体肝脏细胞、狒狒肝脏细胞以及这些细胞的混合物，这些细胞通过 对血液执行一种人造肝的功能，而对血液进行处理。

基质中肝细胞的数量可执行成年人所需基础肝功的至少20％，在其 中的基质中灌注了载氧液体，通过一充氧装置向载氧液体输送氧气，并 利用血浆向载氧液体输送营养物，由充氧装置将载氧液体中的二氧化碳 清除出去，且通过血浆将载氧液体中的细胞代谢产物清除出去，各个速 率足以使载氧液体注满基质，以在至少3天的时间内维持细胞的存活和 代谢活动。

附图说明

下文将参照附图，通过示范的、非限定性实施例来对本发明进行 介绍，在附图中，唯一的一个附图是根据本发明的设施的流路示意图。

具体实施方式