用于测定雄性能育性状态的方法和检验试剂盒
阅读：647发布：2022-05-03
专利汇可以提供用于测定雄性能育性状态的方法和检验试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开内容提供用于测定雄性能育性状态的方法。所述方法包括测定诱导精子获能之后的GM1 定位 模式，鉴定各种模式的百分比，特别是[(AA+APM)/GM1定位模式的总数目]的比率，和测定某些GM1定位模式的百分比是否响应诱导的获能而改变。基于某些模式的定位模式的百分比响应诱导的获能的变化，单独或组合其它精子属性，可鉴定雄性能育性状态。，下面是用于测定雄性能育性状态的方法和检验试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种方法，包括：
将来自雄性的精子样品的第一部分暴露于非获能条件以获得体外非获能的精子样品；
将精子样品的第二部分暴露于获能条件以获得体外获能的精子样品；
将体外非获能的精子样品和体外获能的精子样品各自用固定剂固定至少1小时的时期；
将固定的体外非获能的精子样品和固定的体外获能的精子样品各自用GM1定位模式的标记分子处理，其中标记分子具有可检测的标记；
对于标记的固定的体外非获能的精子样品和对于标记的固定的体外获能的精子样品，鉴定超过一种标记的GM1定位模式，所述GM1标记的定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；
比较标记的固定的体外非获能的精子样品的标记的GM1定位模式与标记的固定的体外获能的精子样品的标记的GM1定位模式；
基于比较，将顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态，和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；和基于所鉴定的标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品的GM1标记的定位模式，表征雄性的能育性状态。
2.权利要求1的方法，其中所述表征步骤包括以下步骤：
对于标记的固定的体外获能的精子样品，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；
其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；
比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比；和
基于比较鉴定能育性阈值。
3.权利要求2的方法，其中表征步骤进一步包括：
对于预定数目的标记的固定的体外非获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目，
对于预定数目的标记的固定的体外获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目，
对于标记的固定的体外非获能的精子样品，计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率；和
对于标记的固定的体外获能的精子样品，计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率。
4. 权利要求3的方法，其中超过一种GM1标记的定位模式包括AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、中间(INTER) GM1定位模式、顶体后质膜(PAPM) GM1定位模式、顶端顶体/顶体后(AA/PA) GM1定位模式、赤道段(ES) GM1定位模式和弥散性(DIFF) GM1定位模式。
5.权利要求1的方法，其中获能条件包括暴露于碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质中的一种或多种。
6.权利要求5的方法，其中甾醇外流介质为2-羟基-丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂囊泡、胎儿脐带血清超滤液、脂肪酸结合蛋白或脂质体。
7.权利要求5的方法，其中甾醇外流介质为2-羟基-丙基-β-环糊精。
8.权利要求1的方法，其中非获能条件包括缺乏暴露于碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质中的一种或多种。
9.权利要求1的方法，其中固定剂包括多聚甲醛、戊二醛或其组合。
10.权利要求1的方法，其中超过一种GM1标记的定位模式的标记分子为荧光标记的霍乱毒素b亚基。
11.权利要求1的方法，其中鉴定步骤在暴露步骤之后2-24小时进行。
12. 权利要求1的方法，其中将精子样品的第一部分暴露于非获能条件和将精子样品的第二部分暴露于获能条件同时发生。
13. 权利要求3的方法，进一步包括以下步骤
比较标记的固定的体外非获能的精子的比率与具有已知能育性状态的标记的固定的体外非获能的精子的比率；和
比较标记的固定的体外获能的精子的比率与具有已知能育性状态的标记的固定的体外获能的精子的比率。
14.权利要求1的方法，进一步包括以下步骤：在暴露步骤之前，使用非金属材料制成的宽口吸管和使用不损伤精子膜的试剂处理精液样品以降低精液粘度。
15.用于鉴定雄性的能育性状态的试剂盒，包含：
说明获能精子的一种或多种GM1定位模式和非获能精子的一种或多种GM1定位模式的图表，其中所述获能精子的GM1定位模式和非获能精子的GM1定位模式反映已知能育性状态；
具有足够直径尺寸的孔口的宽口吸管以防止剪切精子膜；
一种或多种以下：获能培养基、非获能培养基、固定剂组合物、用于测定GM1定位模式的标记试剂；条件是组合物不损伤精子膜，其中当在体外施用于精子细胞时，获能培养基和非获能培养基产生指示获能精子的GM1定位模式和指示非获能精子的模式，如图表中所反映的。
16.权利要求15的试剂盒，其中宽口吸管具有至少18规格的孔口尺寸。
17.权利要求15和16中任一项的试剂盒，其中宽口吸管由非金属材料制成。
18. 权利要求15-17中任一项的试剂盒，其中可损伤精子膜的试剂选自：(i) 蛋白酶，(ii) 核酸酶，(iii) 溶粘蛋白剂，(iv) 脂肪酶，(v) 酯酶和(vi) 糖苷水解酶类。
19.权利要求15-18中任一项的试剂盒，进一步包括用于处理精子以避免损伤精子膜的说明书。
20.一种方法，包括：
获得来自雄性的精子样品的第一部分，其已经暴露于体外非获能条件，在固定剂中固定至少一个小时，并且用GM1定位模式的标记分子处理，其中标记分子具有可检测的标记；
获得精子样品的第二部分，其已经暴露于体外获能条件，在固定剂中固定和用GM1定位模式的标记分子处理；
对于标记的固定的体外非获能的精子样品和对于标记的固定的体外获能的精子样品，鉴定超过一种标记的GM1定位模式，所述GM1标记的定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；
比较标记的固定的体外非获能的精子样品的标记的GM1定位模式与标记的固定的体外获能的精子样品的标记的GM1定位模式；
基于比较，将顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态，和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；和基于所鉴定的标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品的GM1标记的定位模式，表征雄性的能育性状态。
21.权利要求20的方法，其中所述表征步骤包括以下步骤：
对于标记的固定的体外获能的精子样品，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；
其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；
比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比；和
基于比较鉴定能育性阈值。
22. 权利要求20的方法，其中表征步骤进一步包括：
对于预定数目的标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目，和
对于标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品，计算各自的AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1定位模式的总数目的总和的比率。
23. 权利要求22的方法，其中表征步骤进一步包括：
比较标记的固定的体外获能的精子样品的比率与具有已知能育性状态的雄性的体外获能的精子的GM1定位模式的比率；和
比较标记的固定的体外非获能的精子样品的比率与具有已知能育性状态的雄性的体外非获能的精子的GM1定位模式的比率。
24.权利要求23的方法，其中已知能育性状态包括能育、不育及其组合。
25. 权利要求20的方法，其中超过一种GM1标记的定位模式为AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、中间(INTER) GM1定位模式、顶体后质膜(PAPM) GM1定位模式、顶端顶体/顶体后(AA/PA) GM1定位模式、赤道段(ES) GM1定位模式和弥散性(DIFF) GM1定位模式。
26.权利要求20的方法，其中获能条件包括暴露于碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质中的一种或多种。
27.权利要求26的方法，其中甾醇外流介质为2-羟基-丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂囊泡、胎儿脐带血清超滤液、脂肪酸结合蛋白或脂质体。
28.权利要求27的方法，其中甾醇外流介质为2-羟基-丙基-β-环糊精。
29.权利要求20的方法，其中非获能条件包括缺乏暴露于碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质中的一种或多种。
30.权利要求20的方法，其中固定剂包括多聚甲醛、戊二醛或其组合。
31.权利要求20的方法，其中GM1定位模式的标记分子为荧光标记的霍乱毒素b亚基。
32.权利要求20的方法，其中鉴定步骤在暴露步骤之后2-24小时进行。
33.权利要求20的方法，其中将精子样品的第一部分暴露于非获能条件和将精子样品的第二部分暴露于获能条件同时发生。
34.权利要求20的方法，进一步包括以下步骤：在获得步骤之前，使用非金属材料制成的宽口吸管和使用不损伤精子膜的试剂处理精液样品以降低精液粘度。
35.一种方法，包括：
将来自雄性的精子样品体外暴露于获能条件；
用固定剂固定获能的精子样品，持续至少1小时；
用GM1定位模式的标记分子处理固定的体外获能的精子样品，其中标记分子具有可检测的标记；
对于标记的固定的体外获能的精子样品，鉴定超过一种GM1标记的定位模式，所述GM1标记的定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；
将顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态，和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；和
表征雄性的能育性状态。
36.权利要求35的方法，其中所述表征步骤包括以下步骤：
对于标记的固定的体外获能的精子样品，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；
其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；
比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比，和
基于比较鉴定能育性阈值。
37.权利要求35的方法，进一步包括以下步骤：
比较GM1定位模式的比率与具有已知能育性状态的雄性的GM1定位模式的比率。
38. 权利要求37的方法，其中比较步骤包括：
对于预定数目的标记的固定的体外获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目，和
计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率。
39. 权利要求35-38中任一项的方法，其中超过一种GM1定位模式为AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、中间(INTER) GM1定位模式、顶体后质膜(PAPM) GM1定位模式、顶端顶体/顶体后(AA/PA) GM1定位模式、赤道段(ES) GM1定位模式和弥散性(DIFF) GM1定位模式。
40.权利要求35的方法，其中获能条件包括暴露于碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质中的一种或多种。
41.权利要求40的方法，其中甾醇外流介质为2-羟基-丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂囊泡、胎儿脐带血清超滤液、脂肪酸结合蛋白或脂质体。
42.权利要求41的方法，其中甾醇外流介质为2-羟基-丙基-β-环糊精。
43.权利要求37的方法，其中已知能育性状态对应于能育雄性。
44.权利要求37的方法，其中已知能育性状态对应于不育雄性。
45.权利要求35的方法，其中固定剂包括多聚甲醛、戊二醛或其组合。
46.权利要求35的方法，其中GM1定位模式的标记分子为荧光标记的霍乱毒素b亚基。
47.权利要求35的方法，其中鉴定步骤在暴露步骤之后2-24小时进行。
48.权利要求35的方法，进一步包括以下步骤：在暴露步骤之前，使用非金属材料制成的宽口吸管和使用不损伤精子膜的试剂处理精液样品以降低精液粘度。
49.一种方法，包括：
获得来自雄性的精子样品的第一部分，其已经暴露于体外获能条件，在固定剂中固定至少一个小时，并且用GM1定位模式的标记分子染色，其中标记分子具有可检测的标记；
对于标记的固定的体外获能的精子样品，鉴定超过一种GM1标记的定位模式，所述GM1定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；
将顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态，和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；和
表征雄性的能育性状态。
50.权利要求49的方法，其中所述表征步骤包括以下步骤：
对于标记的固定的体外获能的精子样品，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；
其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；
比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比，和
基于比较鉴定能育性阈值。
51.权利要求49的方法，进一步包括以下步骤：
比较GM1定位模式的比率与具有已知能育性状态的雄性的GM1定位模式的比率。
52. 权利要求51的方法，其中比较步骤包括：
对于预定数目的标记的固定的获能精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目，和计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率。
53. 权利要求49-52中任一项的方法，其中超过一种GM1定位模式为AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、中间(INTER) GM1定位模式、顶体后质膜(PAPM) GM1定位模式、顶端顶体/顶体后(AA/PA) GM1定位模式、赤道段(ES) GM1定位模式和弥散性(DIFF) GM1定位模式。
54.权利要求49的方法，其中获能条件包括暴露于碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质中的一种或多种。
55.权利要求54的方法，其中甾醇外流介质为2-羟基-丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂囊泡、胎儿脐带血清超滤液、脂肪酸结合蛋白或脂质体。
56.权利要求55的方法，其中甾醇外流介质为2-羟基-丙基-β-环糊精。
57.权利要求51的方法，其中已知能育性状态对应于能育雄性。
58.权利要求51的方法，其中已知能育性状态对应于不育雄性。
59.权利要求49的方法，其中固定剂包括多聚甲醛、戊二醛或其组合。
60.权利要求49的方法，其中GM1定位模式的标记分子为荧光标记的霍乱毒素b亚基。
61.权利要求49的方法，其中鉴定步骤在暴露步骤之后2-24小时进行。
62.权利要求49的方法，进一步包括以下步骤：在获得步骤之前，使用非金属材料制成的宽口吸管和使用不损伤精子膜的试剂处理精液样品以降低精液粘度。
63.一种方法，包括以下步骤：
获得精子样品，其中精子样品的至少一部分已经暴露于体外获能条件以获得体外获能的精子，已经暴露于固定剂至少1小时，和已经对于GM1染色；
获得精子样品的一个或多个精液参数的值；
基于一种或多种GM1标记的定位模式测定标记的固定的体外获能的精子样品的Cap-Score，所述GM1标记的定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体后质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；和
基于测定的Cap-Score和一个或多个获得的精液参数，计算雄性的雄性能育性指数(MFI)值。
64.权利要求63的方法，其中精子样品的一个或多个精液参数选自原始精子样品的体积、精子浓度、精子能动性和精子形态学。
65. 权利要求63的方法，其中Cap-Score基于AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和中间(INTER) GM1定位模式、顶体后质膜(PAPM) GM1定位模式、顶端顶体/顶体后(AA/PA) GM1定位模式、赤道段(ES) GM1定位模式和弥散性(DIFF) GM1定位模式。
66.权利要求63的方法，进一步包括以下步骤：在获得步骤之前，使用非金属材料制成的宽口吸管和使用不损伤精子膜的试剂处理精液样品以降低精液粘度。
67.一种方法，包括以下步骤：
用荧光标记处理体外获能的精子细胞的样品；
获得一个或多个获能的荧光图像，其显示与荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式；
将各自在获能的荧光图像中显示的顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态，和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；
对于荧光标记的体外获能的精子细胞，测量获能的荧光图像中显示的包括AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式在内的GM1定位模式的数目，以测定[(AA GM1定位模式加APM GM1 定位模式)/总GM1定位模式]的百分比；
确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；
其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；
比较[(AA GM1定位模式和APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比；和
基于比较鉴定能育性阈值。
68.权利要求67的方法，其中鉴定步骤还基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液pH、精液粘度和/或精子形态学及其组合。
69. 权利要求67的方法，其中超过一种GM1定位模式包括AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、INTER GM1定位模式、PAPM GM1定位模式、AA/PA GM1定位模式、ES GM1定位模式和DIFF GM1定位模式。
70.权利要求67的方法，其中将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5小时-3小时、3小时-12小时、6小时-12小时、3小时-24小时、12小时-24小时或18小时-24小时的获能时期。
71.权利要求67的方法，其中将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时或至少48小时的固定时期，持续范围为0.5-3小时、3-12小时、6-12小时、3-18小时、6-18小时、6-24小时、12-24小时、18-24小时、18-30小时、18-36小时、24-30小时、24-26小时、18-48小时、24-
48小时或36-48小时的固定时期。
用于测定雄性能育性状态的方法和检验试剂盒
[0001] 与相关申请的交叉参考本申请要求于2016年2月17日提交的美国临时申请号62/296,420、于2016年4月14日提交的美国临时申请号62/322,252、于2016年4月28日提交的美国临时申请号62/328,890的权益，其各自以其整体结合。
[0002] 公开内容的领域本发明一般地涉及雄性能育性领域，更具体地涉及基于诱导精子获能之后的GM1神经节苷脂分布模式测定雄性能育性状态。
[0003] 公开内容的背景在美国，10%的夫妻具有不育相关的医疗预约，40%的不育与雄性有关。全球而言，这转换为超过七千三百万的不育夫妻。典型的雄性生殖健康检查评估精子数目、外观和能动性。
不幸地，一半的不育男性具有满足这些描述性标准的正常参数的精子，在自然受孕和辅助生殖技术例如子宫内授精(IUI)二者再三失败后仅鉴定为具有“特发性不育”。由于每一个失败的周期为夫妻造成巨大的生理、情绪和经济损失并且其每年耗费美国医疗保健系统超过$50亿，因此对实用的精子功能检验存在巨大需求。精子功能的数据将允许临床医生将其患者引导至给予他们最好的受孕机会的辅助生殖技术。
不幸地，一半的不育男性具有满足这些描述性标准的正常参数的精子，在自然受孕和辅助生殖技术例如子宫内授精(IUI)二者再三失败后仅鉴定为具有“特发性不育”。由于每一个失败的周期为夫妻造成巨大的生理、情绪和经济损失并且其每年耗费美国医疗保健系统超过$50亿，因此对实用的精子功能检验存在巨大需求。精子功能的数据将允许临床医生将其患者引导至给予他们最好的受孕机会的辅助生殖技术。
[0004] 一旦进入雌性生殖道，精子不能立即使卵受精。相反，其必须经历功能成熟化过程，称为“获能”。该过程依赖于其通过在其细胞膜中具有特定变化而响应特定刺激物的能力，即神经节苷脂GM1的分布模式响应暴露于获能刺激物的变化。
[0005] 已经鉴定了各种GM1定位模式并与获能或非获能相关。具体地，在牛和人精子中顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式与获能相关。精子获能可定量表述为Cap-Score™值，经由Cap-Score™精子功能检验(“Cap-Score™Test”或“Cap-Score”)产生，定义为([顶端顶体(AA) GM1定位模式的数目+顶体质膜(APM) GM1定位模式的数目]/GM1标记的定位模式的总数目)，其中测量每一定位模式的数目，然后最终转化为百分比评分。除了APM GM1定位模式和AA GM1定位模式之外，其它标记的定位模式包括内衬细胞GM1定位模式、中间(INTER) GM1定位模式、顶体后质膜(PAPM) GM1定位模式、顶端顶体/顶体后 (AA/PA) GM1定位模式、赤道段(ES) GM1定位模式和弥散性(DIFF) GM1定位模式(Travis等人,“Impacts of common semen handling methods on sperm function (常见精液处理方法对精子功能的影响),”The Journal of Urology, 195 (4), e909 (2016))。
[0006] 公开内容的概述在一个实施方案中，本文公开用于测定雄性的能育性状态的方法和试剂盒。在一个实施方案中，本公开内容描述用于基于某些GM1定位模式的数目响应诱导的体外获能的变化而鉴定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，GM1定位模式为内衬细胞GM1定位模式。
[0007] 本文所公开的一个实施方案为用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤。将体外获能的精子细胞样品用荧光标记处理。获得一个或多个获能的荧光图像，其中图像显示与荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式。将获能的荧光图像中各自显示的顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式各自分配为获能状态，内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态。对于获能的荧光图像中显示的荧光标记的体外获能的精子细胞，测量GM1定位模式的数目，以测定[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比，所述模式包括AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式。在一个实施方案中，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值，其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育。比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0008] 在另一个实施方案中，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值，其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示正常雄性能育性；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示异常雄性能育性。比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0009] 本文公开的另一个实施方案为用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将来自雄性的精子样品的第一部分暴露于非获能条件以获得体外非获能的精子样品；将精子样品的第二部分暴露于获能条件以获得体外获能的精子样品；将体外非获能的精子样品和体外获能的精子样品用固定剂固定至少：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时或24小时的时期；将固定的体外非获能的精子样品和固定的体外获能的精子样品用GM1定位模式的标记分子处理，其中标记分子具有可检测的标记；对于标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品，鉴定超过一种标记的GM1定位模式，所述GM1标记的定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；比较标记的固定的体外非获能的精子样品的标记的GM1定位模式与标记的固定的体外获能的精子样品的标记的GM1定位模式；基于比较，将顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态，和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；和基于所鉴定的标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品的GM1标记的定位模式，表征雄性的能育性状态。在一个实施方案中，表征步骤包括以下步骤：对于标记的固定的体外获能的精子样品，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育。比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0010] 在另一个实施方案中，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值，其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示正常雄性能育性；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示异常雄性能育性。比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0011] 在一个实施方案中，在暴露步骤之前，将精液样品使用非金属材料制成的宽口吸管和使用选自用于降低精液粘度的各种试剂的不损伤精子膜的试剂处理以降低精液粘度。在一些这样的实施方案中，膜损伤试剂潜在地可包括(i) 蛋白酶，(ii) 核酸酶，(iii) 溶粘蛋白剂，(iv) 脂肪酶，(v) 酯酶和(vi) 糖苷水解酶类。在一些实施方案中，重复鉴定步骤，直至内衬细胞GM1定位模式的数目基本恒定。在一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目为标记细胞的总数目的小于5%、小于3%；或范围为标记细胞的总数目的1%-5%、2%-5%。在另一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外非获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目小于标记细胞的总数目的25%、20%、15%或10%；或范围为标记细胞的总数目的2%-25%、2%-20%、2-15%、2-10%、2-5%。在一些实施方案中宽口吸管具有至少
18规格、16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
18规格、16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
[0012] 在另一个这样的实施方案中，表征步骤进一步包括以下步骤：对于预定数目的标记的固定的体外非获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目；对于预定数目的标记的固定的体外获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目；对于标记的固定的体外非获能的精子样品，计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率；和对于标记的固定的体外获能的精子样品，计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率。
[0013] 在本文所公开的一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：比较标记的固定的体外非获能的精子的比率与具有已知能育性状态的标记的固定的体外非获能的精子的比率；和比较标记的固定的体外获能的精子的比率与具有已知能育性状态的标记的固定的体外获能的精子的比率。
[0014] 本文所公开的又一个实施方案为用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法步骤以下步骤：获得来自雄性的精子样品的第一部分，其已经暴露于体外非获能条件，在固定剂中固定至少：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时或24小时，和用GM1定位模式的标记分子处理，其中标记分子具有可检测的标记；获得精子样品的第二部分，其已经暴露于体外获能条件，在固定剂中固定和用GM1定位模式的标记分子处理；对于标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品，鉴定超过一种GM1标记的定位模式，所述GM1标记的定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；比较标记的固定的体外非获能的精子样品的标记的GM1定位模式与标记的固定的体外获能的精子样品的标记的GM1定位模式；基于比较，将顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；和基于所鉴定的标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品的GM1标记的定位模式表征雄性的能育性状态。在一个这样的实施方案中，表征步骤包括以下步骤：确定与标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比和基于比较鉴定能育性阈值。
[0015] 在另一个实施方案中，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值，其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示正常雄性能育性；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示异常雄性能育性。比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0016] 在一些实施方案中，重复鉴定步骤，直至内衬细胞GM1定位模式的数目基本恒定。在一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目为标记细胞的总数目的小于5%、小于3%；或范围为标记细胞的总数目的1%-5%、2%-5%。在另一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外非获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目小于标记细胞的总数目的25%、20%、15%或10%；或范围为标记细胞的总数目的2%-25%、2%-20%、2-15%、2-10%、2-5%。
[0017] 在这种方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：对于预定数目的标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目，和计算标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品各自的AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1定位模式的总数目的总和的比率。
[0018] 在另一个实施方案中，表征步骤进一步包括以下步骤：比较标记的固定的体外获能的精子样品的比率与具有已知能育性状态的雄性的体外获能的精子的GM1定位模式的比率；和比较标记的固定的体外非获能的精子样品的比率与具有已知能育性状态的雄性的体外非获能的精子的GM1定位模式的比率。
[0019] 本文所公开的又一个实施方案为用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将来自雄性的精子样品体外暴露于获能条件；用固定剂固定获能的精子样品至少：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时或24小时，用GM1定位模式的标记分子处理固定的体外获能的精子样品，其中标记分子具有可检测的标记；对于标记的固定的体外获能的精子样品，鉴定超过一种GM1标记的定位模式，所述GM1标记的定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式，将顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；和表征雄性的能育性状态。在一个实施方案中，表征步骤包括以下步骤：确定与标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比，和基于比较鉴定能育性阈值。
[0020] 在另一个实施方案中，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值，其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示正常雄性能育性；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示异常雄性能育性。比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0021] 在一个实施方案中，在暴露步骤之前，将精液样品使用非金属材料制成的宽口吸管和使用选自用于降低精液粘度的各种试剂的不损伤精子膜的试剂处理以降低精液粘度。在一些实施方案中，膜损伤试剂可潜在地选自 (i) 蛋白酶，(ii) 核酸酶，(iii) 溶粘蛋白剂，(iv) 脂肪酶，(v) 酯酶和(vi) 糖苷水解酶类。在一些实施方案中，重复鉴定步骤，直至内衬细胞GM1定位模式的数目基本恒定。在一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目为标记细胞的总数目的小于5%、小于3%；或范围为标记细胞的总数目的1%-5%、2%-5%。在另一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外非获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目小于标记细胞的总数目的25%、20%、15%或10%；或范围为标记细胞的总数目的2%-25%、2%-20%、2-15%、2-10%、2-5%。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少18规格、
16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
[0022] 在这样的方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：比较GM1定位模式的比率与具有已知能育性状态的雄性的GM1定位模式的比率。在一个这样的实施方案中，比较步骤包括以下步骤：对于预定数目的标记的固定的体外获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目；和计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率。
[0023] 本文所公开的另一个实施方案为用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：获得来自雄性的精子样品的第一部分，其已经暴露于体外获能条件，在固定剂中固定至少：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时或24小时，和用GM1定位模式的标记分子染色，其中标记分子具有可检测的标记；对于标记的固定的体外获能的精子样品，鉴定超过一种GM1标记的定位模式，所述GM1定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；将顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；和表征雄性的能育性状态。在一些实施方案中，表征步骤包括以下步骤：确定与标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比和基于比较鉴定能育性阈值。
[0024] 在另一个实施方案中，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值，其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示正常雄性能育性；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示异常雄性能育性。比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0025] 在一些实施方案中，重复鉴定步骤，直至内衬细胞GM1定位模式的数目基本恒定。在一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目为标记细胞的总数目的小于5%、小于3%；或范围为标记细胞的总数目的1%-5%、2%-5%。在另一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外非获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目小于标记细胞的总数目的25%、20%、15%或10%；或范围为标记细胞的总数目的2%-25%、2%-20%、2-15%、2-10%、2-5%。
[0026] 在这样的方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：比较GM1定位模式的比率与具有已知能育性状态的雄性的GM1定位模式的比率。在一个这样的实施方案中，比较步骤包括以下步骤：对于预定数目的标记的固定的体外获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目，和计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率。
[0027] 本文所公开的另一个实施方案为用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：获得精子样品，其中，至少精子样品的一部分已经暴露于体外获能条件以获得体外获能的精子，已经暴露于固定剂至少：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时或24小时，并且已经对于GM1染色；获得精子样品的一个或多个精液参数的值；基于一种或多种GM1标记的定位模式测定标记的固定的体外获能的精子样品的Cap-Score，所述GM1标记的定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体后质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；和基于测定的CAP评分和一个或多个获得的精液参数计算雄性的雄性能育性指数(MFI)值。在一个实施方案中，精子样品的一个或多个精液参数选自原始精子样品的体积、精子浓度、精子能动性和精子形态学。在一些实施方案中，重复鉴定步骤，直至内衬细胞GM1定位模式的数目基本恒定。
[0028] 在一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目为标记细胞的总数目的小于5%、小于3%；或范围为标记细胞的总数目的1%-5%、2%-5%。在另一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外非获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目小于标记细胞的总数目的25%、20%、15%或10%；或范围为标记细胞的总数目的2%-25%、2%-20%、2-15%、2-10%、2-5%。
[0029] 在本文所描述的方法的各个实施方案中，超过一种GM1标记的定位模式包括AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、中间(INTER) GM1定位模式、顶体后质膜(PAPM) GM1定位模式、顶端顶体/顶体后(AA/PA) GM1定位模式、赤道段(ES) GM1定位模式和弥散性(DIFF) GM1定位模式。
[0030] 在一个实施方案中，将精子样品的第一部分暴露于非获能条件和将精子样品的第二部分暴露于获能条件同时发生。
[0031] 在一个实施方案中，本文公开用于鉴定雄性能育性状态的试剂盒，其包含：说明获能精子的一种或多种GM1定位模式和非获能精子的一种或多种GM1定位模式的图表，其中所述获能精子的GM1定位模式和非获能精子的GM1定位模式反映已知能育性状态；具有足够直径尺寸的孔口的宽口吸管以防止剪切精子膜；一种或多种以下：获能培养基、非获能培养基、固定剂组合物、用于测定GM1定位模式的标记试剂；条件是固定剂组合物不损伤精子膜，其中当在体外施用于精子细胞时，获能培养基和非获能培养基产生指示获能精子的GM1定位模式和指示非获能精子的模式，如图表中所反映的。在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于处理精子以避免损伤精子膜的说明书。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少18规格、16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
[0032] 在本文所描述的某些实施方案中，体外获能条件包括暴露于碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质中的一种或多种。在一些实施方案中，甾醇外流介质为2-羟基-丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂囊泡、胎儿脐带血清超滤液、脂肪酸结合蛋白或脂质体。在一个实施方案中，甾醇外流介质为2-羟基-丙基-β-环糊精。
[0033] 在一个实施方案中，非获能条件包括缺乏暴露于碳酸氢根离子、钙离子和甾醇外流介质中的一种或多种。
[0034] 在本文所描述的某些实施方案中，固定剂为醛固定剂。在一个实施方案中，固定剂包括多聚甲醛、戊二醛或其组合。在某些实施方案中，GM1的亲和分子为荧光标记的霍乱毒素b亚基。
[0036] 在图中：图1显示正常人精子和来自不育雄性的精子在非获能条件或获能条件下的INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES和DIFF GM1定位模式；
图2A显示在非获能条件下在正常人精子中INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES和DIFF GM1定位模式的相对分布；
图2B显示在获能条件下在正常人精子中INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES和DIFF GM1定位模式的相对分布；
图2C显示在获能条件下在来自不育雄性的人精子中INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES和DIFF GM1定位模式的相对分布；
图3显示在获能条件和非获能条件下，一组正常雄性的人精子中和一组不育雄性的人精子中，作为孵育时间的函数的组合APM和AA定位模式的相对数目，以及每组雄性的临床结果；
图4显示用促进获能的刺激物孵育的来自已知能育供体的精子中AA和APM定位模式的百分比；
图5显示来自疑似低生育力/不育供体的精子中AA和APM定位模式的百分比与能育男性的统计阈值的比较；和
图6A、6B、6C和6D显示在获能条件下来自不育雄性的精子中GM1的内衬细胞GM1定位模式。
图2A显示在非获能条件下在正常人精子中INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES和DIFF GM1定位模式的相对分布；
图2B显示在获能条件下在正常人精子中INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES和DIFF GM1定位模式的相对分布；
图2C显示在获能条件下在来自不育雄性的人精子中INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES和DIFF GM1定位模式的相对分布；
图3显示在获能条件和非获能条件下，一组正常雄性的人精子中和一组不育雄性的人精子中，作为孵育时间的函数的组合APM和AA定位模式的相对数目，以及每组雄性的临床结果；
图4显示用促进获能的刺激物孵育的来自已知能育供体的精子中AA和APM定位模式的百分比；
图5显示来自疑似低生育力/不育供体的精子中AA和APM定位模式的百分比与能育男性的统计阈值的比较；和
图6A、6B、6C和6D显示在获能条件下来自不育雄性的精子中GM1的内衬细胞GM1定位模式。
[0037] 公开内容的详述参考附图，本发明的各个实施方案在下面更充分地描述。示出本发明的一些但并非所有实施方案。实际上，本发明的各个实施方案可以以许多不同的形式体现，并且不应解释为限制于明确描述的实施方案。应理解至少本发明的一些图和描述已经简化以集中于与清楚理解本发明相关的要素，同时为了清楚起见，消除本领域普通技术人员将理解也可构成本发明的一部分的那些要素。然而，由于这样的要素为本领域所熟知，并且因为其不一定帮助更好地理解本发明，这种要素的描述在本文中不提供。
[0038] 本文所确定的每一参考文献通过引用以其整体结合。
[0039] 除非本文中特别阐述，术语“一个”、“一种”和“所述”不限制于一个要素，而是应解读为意指“至少一个”。
[0040] “约”理解为意指参考值的+和 – 10%范围。然而，关于值使用“约”不排除仅参考值的可能性。例如，“约1 h”理解为完全支持“54分钟”、“1小时”和“66分钟”。
[0041] 本公开内容基于以下观察结果：某些GM1定位模式可提供关于雄性能育性状态的信息。测定GM1定位模式在美国专利号7,160,676、7,670,763和8,367,313中描述，其公开内容通过引用结合到本文中。本公开内容提供用于测定雄性能育性状态的方法和试剂盒。在某些实施方案中，所述方法基于某些GM1定位模式的百分比在暴露于体外获能刺激物时的变化。在其它实施方案中，所述方法特别地基于内衬细胞GM1定位模式的百分比在暴露于体外获能刺激物时的变化。
[0042] 在一个实施方案中，本文公开用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使来自个体的精子样品经受体外获能和体外非获能条件，测定某些GM1定位模式的百分比在暴露于体外获能条件时的变化，和基于变化水平，鉴定能育性状态。
[0043] 术语“体外获能的”精子指在促进获能过程的条件下孵育的精子。在一个实施方案中，获能条件包括在培养基中存在碳酸氢根离子、钙离子和甾醇受体例如血清白蛋白或环糊精的一种或多种。在一个实施方案中，体外获能条件包括在培养基中存在碳酸氢根和钙离子，和存在甾醇受体。在一个实施方案中，甾醇受体为甾醇外流介质。获能精子已获得经历顶体胞吐的能力并获得高度活性的能动性模式。术语“体外非获能的”精子指未用一种或多种以上列出的获能刺激物孵育的精子。在一个实施方案中，非获能条件包括缺乏获能条件。在另一个实施方案中，非获能条件包括缺乏一种或多种获能所需的刺激物。非获能精子不经历生理学配体例如透明带、来自透明带的增溶蛋白或孕酮所诱导的顶体胞吐。另外，在非获能条件下孵育的精子也将不显示高度活性的能动性。
[0044] 在一个实施方案中，获能可通过暴露于外部刺激物例如碳酸氢根和钙离子以及甾醇外流介质，例如，2-羟基-丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂囊泡、脂质体等在体外诱导。在某些实施方案中，可鉴定的GM1定位模式变化在精子体外暴露于一种或多种这些刺激物时观察到。
[0045] 在一个实施方案中，收集后，精液样品通常以一些方式处理，包括一种或多种以下：液化、洗涤和/或富集。在一些实施方案中，液化涉及允许样品在室温或在37 ℃(或其间的任何温度)液化，持续不同的时期(通常15-20 分钟，但范围为10-60分钟)。液化为将精浆从凝胶转化为更流体/液体的稠度的过程。精浆将通常在无任何操作时液化，但对于特别粘稠的样品，或如果期需加速该过程或制订处理所有样品的一致的液化方案，个体可处理样品以达到液化。在某些实施方案中精液样品通过使用非金属材料制成的宽口吸管处理以降低精液粘度。在一些实施方案中宽口吸管具有至少18规格、16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。在某些实施方案中，也可通过加入不损伤精子膜的各种试剂达到液化。应避免的试剂为损伤精子膜的那些。精子可通过离心和重悬洗涤，并经受精液分析，和/或经受一个或多个选择过程，包括：顶部分层，和通过密度梯度离心；顶部分层，和通过密度梯度离心，接着收集富含精子的级分，接着重悬和洗涤；顶部分层，和通过密度梯度离心，接着收集富含精子的级分并在其上方覆盖较低密度介质，能动精子将向上游入其中；或在样品上方覆盖较低密度介质并允许能动精子向上游入其中。
[0046] 初步加工之后，可对精子计数，给定数目的精子然后可放置在包含体外非获能或体外获培养基的容器(例如管)中，以达到期需的终浓度。在一个实施方案中，精子最终的典型浓度为1,000,000/ml (终浓度范围可为250,000/ml-250,000,000/ml)。
[0047] 用于在体外非获能和体外获能条件下孵育精子的基础培养基可为生理缓冲溶液例如，但不限于，人输卵管液(HTF)、改良的人输卵管液(mHTF)、Whitten培养基、改良的Whitten培养基、KSOM、磷酸缓冲盐水、HEPES-缓冲盐水、Tris-缓冲盐水、Ham’s F-10、Tyrode培养基、改良的Tyrode培养基、TES-Tris (TEST)-卵黄缓冲液或Biggers、Whitten和Whittingham (BWW)培养基。基础培养基可具有一种或多种确定的或复杂的蛋白源和其它因子加入其中，包括胎儿脐带血清超滤液、人血浆蛋白粉(Plasmanate)、蛋黄、脱脂乳、白蛋白、脂蛋白或脂肪酸结合蛋白，以促进活力或以足以帮助诱导获能的浓度。典型的获能刺激物包括一种或多种以下：碳酸氢根(通常20-25 mM，范围为5-50 mM)、钙(通常1-2 mM，范围为0.1-10 mM)和/或环糊精(通常1-3 mM，范围为0.1-20 mM)。环糊精可包括2-羟基-丙基-β-环糊精和/或甲基-β-环糊精。孵育温度通常为37 ℃(范围为30℃-38℃)，孵育时间通常为1-4小时 (范围为30分钟-18小时)，尽管基线样品可在孵育期开始时(“时间零”)获取。
[0048] 在一个实施方案中，为了产生GM1模式，将精子用标准基础培养基(例如磷酸缓冲盐水、改良的Whitten培养基或其它类似培养基)洗涤并用在其上具有可检测标记的GM1标记分子孵育。由于GM1具有可用作表位的胞外糖残基，其可不必固定和透化细胞而可视化。然而，固定细胞导致更好的样本保存、更容易的可视化(与辨别泳动的精子中的模式相比)和允许更长的可视化时间，同时有助于模式形成。已知用于精子的组织学研究的各种固定剂在本领域技术人员的能力范围内。合适的固定剂包括多聚甲醛、戊二醛、Bouin’s 固定剂和包含二甲胂酸钠、氯化钙、苦味酸、单宁酸等的固定剂。在一个实施方案中，使用多聚甲醛、戊二醛或其组合。
[0049] 固定条件可从约0.004% (重量/体积)多聚甲醛-约4% (重量/体积)多聚甲醛，尽管通常使用约0.01%-约1% (重量/体积)多聚甲醛。在一个实施方案中，可使用约0.005% (重量/体积)多聚甲醛-约1% (重量/体积)多聚甲醛。在一个实施方案中，可使用约4%多聚甲醛(重量/体积)、约0.1%戊二醛(重量/体积)和约5 mM CaCl2/磷酸缓冲盐水。
[0050] 精子样品在固定剂中固定的时期可改变。在一个实施方案中，精子样品在固定剂中固定约5小时或更短。在一个实施方案中，精子样品在固定剂中固定大于约5小时。在另一个实施方案中，精子样品在固定剂中固定约5小时、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约9.5小时、约10小时、约10.5小时、约11小时、约11.5小时、约12小时、约12.5小时、约13小时、约13.5小时、约14小时、约14.5小时、约15小时、约15.5小时、约16小时、约16.5小时、约17小时、约17.5小时、约18小时、约18.5小时、约19小时、约19.5小时、约20小时、约20.5小时、约21小时、约21.5小时、约22小时、约
22.5小时、约23小时、约23.5小时、约24小时、约24.5小时、约25小时、约25.5小时、约26小时、约26.5小时、约27小时、约27.5小时、约28小时、约28.5小时、约29小时、约29.5小时、约
30小时或从上述时间可确定的任何范围(例如约26-约28小时或约3-约5小时)。
22.5小时、约23小时、约23.5小时、约24小时、约24.5小时、约25小时、约25.5小时、约26小时、约26.5小时、约27小时、约27.5小时、约28小时、约28.5小时、约29小时、约29.5小时、约
30小时或从上述时间可确定的任何范围(例如约26-约28小时或约3-约5小时)。
[0051] 活的或固定的精子中的GM1定位模式可通过使用标记结合技术获得。可使用对GM1神经节苷脂具有特异亲和性的分子。标记分子可直接连接可检测标记(例如荧光团)或可通过其上具有可检测标记的第二个标记分子检测。例如，已知霍乱毒素的b亚基特异性结合GM1。因此，标记的(例如荧光标记的)霍乱毒素b亚基可用于获得GM1的分布模式。在一个实施方案中，连接荧光团的霍乱毒素b亚基的终浓度为约10 µg/ml-约15 µg/ml。在另一个实施方案中，连接荧光团的霍乱毒素b亚基的终浓度为约0.1 µg/ml-约50 µg/ml。备选地，可使用标记的GM1抗体。在又一个备选方案中，可使用标记的霍乱毒素b亚基抗体可视化GM1染色模式。在又一个备选方案中，可使用结合与GM1直接结合的第一抗体或与霍乱毒素b亚基结合的第一抗体的标记的第二抗体。术语“GM1染色”或“GM1的染色”或“标记”或相关术语在本文中用于意指由于结合GM1的标记的亲和分子而引起的细胞上或细胞中见到的染色。例如，当荧光标签/标记的霍乱毒素b亚基用于定位GM1时，信号或染色来自霍乱毒素b亚基但指示GM1位置。术语“信号”和“染色”可互换地使用。可检测的标记使得其能够产生可检测的信号。这样的标记包括放射性核素、酶、荧光剂或生色团。标记(或染色)和可视化精子中的GM1分布通过标准技术进行。也可使用霍乱毒素b亚基以外的标记分子。这些包括多克隆和单克隆抗体。GM1神经节苷脂的特异性抗体可通过常规免疫方案产生，或可市售购买(例如，Matreya, Inc., State College, PA)。抗体可针对GM1产生，或可通过使用分子的相关表位的肽模拟物产生。肽模拟物的鉴定和产生为本领域技术人员所熟知。另外，b亚基与霍乱毒素的结合可通过小分子模仿。鉴定与给定试剂具有相似结合性质的小分子为本领域技术人员所熟知。
[0052] 对于人精子，当精子在体外获能条件下时已经观察到8种不同的GM1定位模式(详见实施例1)。这些模式称为INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES、DIFF和内衬细胞。INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES和DIFF模式在图1中示出，内衬细胞模式在图6A、6B、6C和6D中示出，其各自在下文进一步描述：INTER：绝大多数荧光信号在赤道段周围的带中，且一些信号在覆盖顶体的质膜中。通常存在信号梯度，大部分在赤道段，然后向顶部逐渐减少。横跨赤道段的带中在精子头部的边缘常常存在信号强度的增加。
[0053] APM (顶体质膜)：与INTER相比该模式中在赤道信号和向顶端移动的信号之间存在较小的差异。即，信号在覆盖顶体的质膜中更均匀分布。APM信号从向顶端移动的明亮的赤道INTER带见到，或其可起始进一步直至顶端，并且存在于更小的区域，如同其与AA为连续区。
[0054] AA (顶端顶体)：在该模式中，荧光向顶端变得越来越集中，亮度增加且信号区域减小。
[0055] PAPM (顶体后质膜)：信号只在顶体后质膜中。
[0056] AA/PA (顶端顶体/顶体后)：信号位于覆盖顶体的质膜和顶体后质膜二者中。赤道段的信号缺失。
[0057] ES (赤道段)：亮信号仅在赤道段见到。其可伴随横跨赤道区域的精子头部增厚。
[0058] DIFF (弥散性)：弥散性信号在整个精子头部见到。
[0059] 内衬细胞：信号在顶体后区域上面和覆盖顶体的质膜处以及赤道段底部(即，顶体后/赤道带)见到。信号在赤道段周围缺失。
[0060] 术语“GM1定位模式”与“模式”或“定位模式”可互换地使用。
[0061] 图6A、6B、6C和6D显示在获能条件下来自不育雄性的精子中GM1的内衬细胞GM1定位模式。具体地，图6A显示内衬细胞GM1定位模式，其中信号均匀分布在顶体后/赤道带处和覆盖顶体的质膜处。图6B显示内衬细胞GM1定位模式，其中覆盖顶体的质膜处的信号比顶体后/赤道带处的信号亮。图6C和6D显示顶体后/赤道带处的信号，其比覆盖顶体的质膜处的信号亮。
[0062] 观察到INTER、AA、APM模式和这些模式的组合与具有正常精子膜结构的有活力的精子(因此能育性)正相关，而PAPM、AA/PA、ES、DIFF和内衬细胞模式不与活力、正常膜结构和能育性正相关。如果在非获能条件下孵育，多数具有正常膜结构的有活力的精子将显示INTER模式，特征为多数标记在赤道段附近，其余延伸通过覆盖顶体的质膜。另外，当暴露于获能刺激物时存在APM和AA模式的数目增加。APM模式显示在覆盖顶体的质膜中更一致的信号，而AA模式显示在精子头部的嘴部分、顶端顶体增加的信号强度和减少的信号向赤道段向尾部移动。在体外非获能条件下孵育的不育个体的精子具有与在体外非获能条件下孵育的正常个体的精子的GM1定位模式相似的GM1定位模式。
[0063] 本文所公开的一个实施方案为用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将来自雄性的精子样品的第一部分暴露于非获能条件以获得体外非获能的精子样品；将精子样品的第二部分暴露于获能条件以获得体外获能的精子样品；用固定剂固定体外非获能的精子样品和体外获能的精子样品，持续至少：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时或24小时的时期；用GM1定位模式的标记分子处理固定的体外非获能的精子样品和固定的体外获能的精子样品，其中标记分子具有可检测的标记；对于标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品，鉴定超过一种标记的GM1定位模式，所述GM1标记的定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；比较标记的固定的体外非获能的精子样品的标记的GM1定位模式与标记的固定的体外获能的精子样品的标记的GM1定位模式；基于比较，将顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；和基于所鉴定的标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品的GM1标记的定位模式表征雄性的能育性状态。在一个实施方案中，表征步骤包括以下步骤：
确定与标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比和基于比较鉴定能育性阈值。
确定与标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比和基于比较鉴定能育性阈值。
[0064] 在另一个实施方案中，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值，其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示正常雄性能育性；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示异常雄性能育性。比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0065] 在一个实施方案中，在暴露步骤之前，将精液样品使用非金属材料制成的宽口吸管和使用选自用于降低精液粘度的各种试剂的不损伤精子膜的试剂处理以降低精液粘度。在一些实施方案中，膜损伤试剂选自(i) 蛋白酶，(ii) 核酸酶，(iii) 溶粘蛋白剂，(iv) 脂肪酶，(v) 酯酶和(vi) 糖苷水解酶类。在一些实施方案中，重复鉴定步骤，直至内衬细胞GM1定位模式的数目基本恒定。在一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目为标记细胞的总数目的小于5%、小于3%；或范围为标记细胞的总数目的1%-5%、2%-5%。在另一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外非获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目小于标记细胞的总数目的25%、20%、15%或10%；或范围为标记细胞的总数目的2%-
25%、2%-20%、2-15%、2-10%、2-5%。在一些实施方案中宽口吸管具有至少18规格、16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
25%、2%-20%、2-15%、2-10%、2-5%。在一些实施方案中宽口吸管具有至少18规格、16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
[0066] 在一个这样的实施方案中，表征步骤可包括以下步骤：对于预定数目的标记的固定的体外非获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目；对于预定数目的标记的固定的体外获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目；对于标记的固定的体外非获能的精子样品，计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率；和对于标记的固定的体外获能的精子样品，计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率。
[0067] 在一个这样的实施方案中，所述方法可进一步包括以下步骤：比较标记的固定的体外非获能的精子的比率与具有已知能育性状态的标记的固定的体外非获能的精子的比率；和比较标记的固定的体外获能的精子的比率与具有已知能育性状态的标记的固定的体外获能的精子的比率。
[0068] 本文所公开的一个实施方案为用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：获得来自雄性的精子样品的第一部分，其已经暴露于体外非获能条件，在固定剂中固定至少：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时或24小时，用GM1定位模式的标记分子处理，其中标记分子具有可检测的标记；获得精子样品的第二部分，其已经暴露于体外获能条件，在固定剂中固定并用GM1定位模式的标记分子处理；鉴定标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品的超过一种GM1标记的定位模式，所述GM1标记的定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；比较标记的固定的体外非获能的精子样品的标记的GM1定位模式与标记的固定的体外获能的精子样品的标记的GM1定位模式；基于比较，将顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态，和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；和基于所鉴定的标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品的GM1标记的定位模式表征雄性的能育性状态。在一个实施方案中，表征步骤包括以下步骤：确定与标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比和基于比较鉴定能育性阈值。
[0069] 在另一个实施方案中，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值，其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示正常雄性能育性；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示异常雄性能育性。比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0070] 在一些实施方案中，重复鉴定步骤，直至内衬细胞GM1定位模式的数目基本恒定。在一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目为标记细胞的总数目的小于5%、小于3%；或范围为标记细胞的总数目的1%-5%、2%-5%。在另一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外非获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目小于标记细胞的总数目的25%、20%、15%或10%；或范围为标记细胞的总数目的2%-25%、2%-20%、2-15%、2-10%、2-5%。
[0071] 在这种方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：对于预定数目的标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目，和计算标记的固定的体外非获能的精子样品和标记的固定的体外获能的精子样品各自的AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1定位模式的总数目的总和的比率。
[0072] 在一个这样的实施方案中，表征步骤可进一步包括以下步骤：比较标记的固定的体外获能的精子样品的比率与具有已知能育性状态的雄性的体外获能的精子的GM1定位模式的比率；和比较标记的固定的体外非获能的精子样品的比率与具有已知能育性状态的雄性的体外非获能的精子的GM1定位模式的比率。
[0073] 本文所公开的一个实施方案为用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将来自雄性的精子样品体外暴露于获能条件；用固定剂固定获能的精子样品至少：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时或24小时，用GM1定位模式的标记分子处理固定的体外获能的精子样品，其中标记分子具有可检测的标记；鉴定标记的固定的体外获能的精子样品的超过一种GM1标记的定位模式，所述GM1标记的定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；将顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；和表征雄性的能育性状态。在一个实施方案中，表征步骤包括以下步骤：确定与标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比，和基于比较鉴定能育性阈值。
[0074] 在另一个实施方案中，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值，其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示正常雄性能育性；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示异常雄性能育性。比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0075] 在一个实施方案中，在暴露步骤之前，精液样品使用非金属材料制成的宽口吸管和使用选自用于降低精液粘度的各种试剂的不损伤精子膜的试剂处理以降低精液粘度。在一些实施方案中，膜损伤试剂选自(i) 蛋白酶，(ii) 核酸酶，(iii) 溶粘蛋白剂，(iv) 脂肪酶，(v) 酯酶和(vi) 糖苷水解酶类。在一些实施方案中，重复鉴定步骤，直至内衬细胞GM1定位模式的数目基本恒定。在一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目为标记细胞的总数目的小于5%、小于3%；或范围为标记细胞的总数目的1%-5%、2%-5%。在另一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外非获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目小于标记细胞的总数目的25%、20%、15%或10%；或范围为标记细胞的总数目的2%-
25%、2%-20%、2-15%、2-10%、2-5%。在一些实施方案中宽口吸管具有至少18规格、16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
25%、2%-20%、2-15%、2-10%、2-5%。在一些实施方案中宽口吸管具有至少18规格、16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
[0076] 在这种方法的一个实施方案中，所述方法可进一步包括以下步骤：比较GM1定位模式的比率与具有已知能育性状态的雄性的GM1定位模式的比率。在一个实施方案中，已知能育性状态对应于能育雄性。在另一个实施方案中，已知能育性状态对应于不育雄性。在一个这样的实施方案中，比较步骤包括以下步骤：对于预定数目的标记的固定的体外获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目，和计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率。
[0077] 本文公开的一个实施方案为用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：获得来自雄性的精子样品的第一部分，其已经暴露于体外获能条件，在固定剂中固定至少：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时或24小时，和用GM1定位模式的标记分子染色，其中标记分子具有可检测的标记；鉴定标记的固定的体外获能的精子样品的超过一种GM1标记的定位模式，所述GM1定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；将顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式分配为获能状态和将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态；和表征雄性的能育性状态。在一个实施方案中，表征步骤包括以下步骤：确定与标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值；其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育；比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比和基于比较鉴定能育性阈值。
[0078] 在另一个实施方案中，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值，其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示正常雄性能育性；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示异常雄性能育性。比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0079] 在一些实施方案中，重复鉴定步骤，直至内衬细胞GM1定位模式的数目基本恒定。在一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目为标记细胞的总数目的小于5%、小于3%；或范围为标记细胞的总数目的1%-5%、2%-5%。在另一个这样的实施方案中，进行鉴定步骤之后，测定标记的固定的体外非获能的精子的内衬细胞GM1定位模式的数目，直至该数目小于标记细胞的总数目的25%、20%、15%或10%；或范围为标记细胞的总数目的2%-25%、2%-20%、2-15%、2-10%、2-5%。
[0080] 在这种方法的一个实施方案中，所述方法可进一步包括以下步骤：比较GM1定位模式的比率与具有已知能育性状态的雄性的GM1定位模式的比率。在一个实施方案中，已知能育性状态对应于能育雄性。在另一个实施方案中，已知能育性状态对应于不育雄性。在一个这样的实施方案中，比较步骤包括以下步骤：对于预定数目的标记的固定的体外获能的精子样品，测定每一GM1标记的定位模式的数目，和计算AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率。
[0081] 本文公开的一个实施方案为用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：获得精子样品，其中精子样品的至少一部分已经暴露于体外获能条件以获得体外获能的精子，已经暴露于固定剂至少：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时或24小时，并且已经对于GM1染色；获得精子样品的一个或多个精液参数的值；基于一种或多种GM1标记的定位模式测定标记的固定的体外获能的精子样品的Cap-Score，所述GM1标记的定位模式为顶端顶体(AA) GM1定位模式、顶体后质膜(APM) GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式；和基于测定的CAP评分和一个或多个获得的精液参数计算雄性的雄性能育性指数(MFI)值。在一个实施方案中，精子样品的一个或多个精液参数选自原始精子样品的体积、精子浓度、精子能动性和精子形态学。
[0082] 本文所公开的一个实施方案为用于测定雄性能育性状态的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤。将体外获能的精子细胞样品用荧光标记处理。获得一个或多个获能的荧光图像，其中图像显示与荧光标记的体外获能的精子细胞相关的一种或多种GM1定位模式。将获能的荧光图像中各自显示的顶端顶体(AA) GM1定位模式和顶体质膜(APM) GM1定位模式各自分配为获能状态，将内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式分配为非获能状态。对于获能的荧光图像中显示的荧光标记的体外获能的精子细胞，测量GM1定位模式的数目，以测定[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比，所述模式包括AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式和所有其它标记的GM1定位模式。确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值，其中[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示能育；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比并且大于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示低生育力；小于比参考平均百分比低两个标准差的百分比指示不育。比较[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0083] 在另一个实施方案中，确定与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比相关的能育性阈值，其中基于已知能育的群体的分布统计，[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比对应于：大于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示正常雄性能育性；小于比参考平均百分比低一个标准差的百分比指示异常雄性能育性。比较标记的固定的体外获能的精子样品的[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的百分比与[(AA GM1定位模式加APM GM1定位模式)/总GM1定位模式]的参考百分比。能育性阈值基于比较鉴定。
[0084] 在一个这样的实施方案中，鉴定步骤还基于下列一个或多个：患者人口统计资料、雌性伴侣的生殖状态、精子浓度、总能动性、前进能动性、精液体积、精液pH、精液粘度和/或精子形态学及其组合。
[0085] 在本文所描述的方法的各个实施方案中，将精子细胞用获能条件体外处理，持续：至少1小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时的获能时期，持续范围为0.5-
3小时、3-12小时、6-12小时、3-24小时、12-24小时或18-24小时的获能时期。
3小时、3-12小时、6-12小时、3-24小时、12-24小时或18-24小时的获能时期。
[0086] 在本文所描述的方法的各个实施方案中，将体外获能的精子细胞用固定剂处理，持续：至少0.5小时、至少3小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时或至少48小时的固定时期，持续范围为0.5-3小时、3-12小时、6-12小时、3-18小时、6-18小时、6-24小时、12-24小时、18-24小时、18-30小时、18-36小时、24-30小时、24-26小时、
18-48小时、24-48小时、or 36-48小时的固定时期。
18-48小时、24-48小时、or 36-48小时的固定时期。
[0087] 在本文所描述的方法的各个实施方案中，超过一种GM1标记的定位模式包括AA GM1定位模式、APM GM1定位模式、内衬细胞GM1定位模式、中间(INTER) GM1定位模式、顶体后质膜(PAPM) GM1定位模式、顶端顶体/顶体后(AA/PA) GM1定位模式、赤道段(ES) GM1定位模式和弥散性(DIFF) GM1定位模式。
[0088] 在一个实施方案中，将精子样品的第一部分暴露于非获能条件和将精子样品的第二部分暴露于获能条件同时发生。
[0089] 雄性个体可为人或非人动物。在非人动物的情况下，鉴定与能育性状态相关的模式可基于本文所提供的教导进行。非人动物包括马、牛、狗、猫、猪、山羊、绵羊、鹿、兔、鸡、火鸡，各种种类的鱼和各种动物园物种。
[0090] 在一个实施方案中，本公开内容的方法提供用于将雄性指定为可能不育的方法，包括获得来自个体和来自正常对照的已经在获能和非获能条件下孵育和任选固定的精子中的GM1定位模式(例如，一种或多种内衬细胞、AA、APM和所有其它GM1定位模式)，和比较GM1定位模式。在正常对照中，将观察到显示某些定位模式的精子的百分比的统计上显著的变化。如果在来自检验个体的精子中未观察到相同变化，则该个体指定为具有异常的能育性状态。在一个实施方案中，提供正常和异常能育性状态的信息的模式为内衬细胞、INTER、AA和/或APM定位模式。因此，在来自已知具有正常的能育性状态的个体的样品(可用作对照)中，与暴露于体外非获能条件的精子相比，当暴露于体外获能条件时较高百分比的精子显示AA和/或APM定位模式，较低百分比的精子显示内衬细胞和/或INTER定位模式。如果观察到与精子暴露于体外非获能条件时相比，在暴露于体外获能条件时，一种或多种这些定位模式的百分比无差异或无显著差异，则个体指定为具有能育性问题。在上述实施方案的变更中，对照可来自已知不育或低生育力的个体。在该实施方案中，如果当体外获能时在内衬细胞、INTER、AA和/或APM定位模式中来自检验个体的GM1模式变化与对照相同，则个体可认为是低生育力或不育。
[0091] 在上述实施方案的又一个变更中，来自检验个体的样品可不与对照比较评估。如果当暴露于体外获能条件时观察到内衬细胞、INTER、AA和/或APM模式的数目无变化，或无显著变化，则个体可认为是异常的并且可指定进一步检验，而如果观察到这样的变化，即内衬细胞和/或INTER降低，AA增加，和/或APM增加，则个体可指定为具有正常能育性。
[0092] 在一个实施方案中，所述方法包括分析GM1定位模式以鉴定暴露于体外获能条件的精子中AA和APM模式的数目。该数目可表述为一种或多种GM1分布模式相对于总数的百分比。在一个实施方案中，能育性基于AA和/或APM定位模式的数目与预定的能育性阈值，例如分类为不育和低生育力的个体之间的阈值(即，截断)水平，或分类为低生育力的个体和分类为能育的那些之间的阈值水平的比较预测。
[0093] 在其它实施方案中，能育性阈值可通过统计分析来自具有已知能育性的男性群体的精子中存在的模式确定。为了本申请的目的，如果雄性具有妊娠伴侣或使用自然受孕或者三轮或更少轮的子宫内授精在三年内成为父亲生孩子，则该雄性认为是能育或具有正常的雄性能育性。为了本申请的目的，如果雄性在6-12个月不使用避孕未能实现妊娠并需要超过三轮子宫内授精以实现妊娠，则该雄性认为是低生育力。为了本申请的目的，如果雄性在一年内不使用避孕未能实现妊娠或使用重复轮次的子宫内授精未能实现妊娠，则该雄性认为是不育。为了本申请的目的，异常的雄性能育性包括低生育力和不育雄性。
[0094] 如图4中所示，73个精液样品从已知能育的24个男性获得。其精子用获能刺激物(在该情况下4 mM 2-羟基-丙基-β环糊精)孵育，用0.01%多聚甲醛(终浓度)固定。估计具有指示获能的模式(例如，AA+APM)的细胞的百分比。具有AA和APM模式的精子的平均百分比为41%，距该平均值两个标准差计算为27%和55%。
[0095] 分析来自寻求医学评估其能育性状态的14个男性的14个样品中的GM1定位模式。比较具有AA+APM定位模式的精子的相对百分比与从已知能育的男性群体鉴定的统计阈值(图5)。在基线(非刺激，非获能条件)下孵育的样品中未观察到差异。然而，当用4 mM 2-羟基-丙基-β-环糊精孵育时，14个男性中的5个产生显示低百分比的具有AA+APM模式的精子的样品。这5个样品均落在距平均值两个标准差以下。认为大约30-50%的难以受孕的夫妇具有雄性因素组分。这些数据落入预期的范围内。
[0096] 在一个方面，本文公开内容提供用于测定雄性能育性状态的试剂盒。所述试剂盒包含一种或多种以下：具有足够直径尺寸的孔口的吸管以防止剪切精子膜，可用作体外获能刺激物的试剂、获能培养基、非获能培养基、固定剂、用于测定GM1定位模式的标记试剂、说明获能精子的一种或多种GM1定位模式和非获能精子的一种或多种GM1定位模式的图表。这种获能精子的GM1定位模式和非获能精子的GM1定位模式反映已知能育性状态。在这样的试剂盒实施方案中，固定剂组合物应不损伤精子膜。在这样的实施方案中，可损伤精子膜的试剂选自用于降低精液粘度的各种试剂。在一些实施方案中，膜损伤试剂包括蛋白酶、核酸酶、溶粘蛋白剂、脂肪酶、酯酶和糖苷水解酶类中的一种或多种。在另一个试剂盒实施方案中，当体外应用于精子细胞时，获能培养基和非获能培养基产生指示获能精子的GM1定位模式和指示非获能精子的模式，如图表中所反映的。
[0097] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含具有4% 环糊精的试剂以刺激获能。
[0098] 在一个实施方案中，获能培养基包括添加2-羟基-丙基-β-环糊精以给予3 mM终浓度的改良的人输卵管液，非获能培养基包括改良的人输卵管液，固定剂为1%多聚甲醛，用于测定GM1模式的试剂为霍乱毒素的b亚基 (15 µg/ml终浓度)。在其它实施方案中，多聚甲醛的终浓度为0.01%。
[0099] 一个示例性的试剂盒包含用HEPES缓冲的具有庆大霉素的改良的HTF培养基(Irvine Scientific, 参考90126)。使用碳酸氢根或HEPES缓冲的培养基未观察到GM1定位模式、活力或精子回收和获能的差异。因此，碳酸氢根缓冲的培养基也可使用。使用HEPES缓冲液使得测定能够在诊所中使用空气孵育箱或水浴进行，与仅与CO2孵育箱相容相反。相似地，加入添加蛋白，无论市售(HTF-SSSTM, Irvine Scientific或人血浆蛋白粉)或粉末的白蛋白，不改变回收或活力，并且有利地增强获能状态。
[0100] 示例性的试剂盒可进一步包括细胞分离培养基(例如增强的S-Plus细胞分离培养基，90%来自Vitrolife，参考：15232 ESP-100-90%)。示例性的试剂、消耗品和程序证明在人精子上产生有利的GM1标记。
[0101] 示例性的试剂盒可进一步包含宽口吸头(200 µl大孔口吸头, USA scientific, 1011-8400)。示例性的试剂盒可进一步包含宽孔口移液管(General Purpose Transfer Pipettes, Standard Bulb参考号: 202-20S. VWR目录号14670-147)。在一个实施方案中，吸管为非金属的。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少18规格、16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
[0102] 示例性的试剂盒可进一步包含1.5ml管(Treatment cap, noncap, CD) (USA Scientific 14159700)—一个包含粉末形式的环糊精以刺激获能，一个为空的，用于仅培养基的非获能条件。在一些实施方案中，有可能环糊精将存在于单独的管中，向其加入培养基以制成储存溶液，其本身将加入获能管中。
[0103] 当从精浆分离精子时，对于人类男科学实验室通常使用密度梯度收集精子。示例性的试剂盒可进一步包括密度梯度材料和/或说明书以从密度梯度移除精浆然后使用新鲜移液管收集沉淀的精子。
[0104] 示例性的试剂盒可进一步包含固定剂(例如0.1% PFA)，和任选包含信息形式(例如患者需要的形式)、标记和容器/包/小袋等，用于运输、储存或调节目的。例如，试剂盒可包含箔袋、用于邮寄患者样品的具有吸收剂的生物危害包、具有吸收剂的可重复密封包和泡沫管放置支持物。
[0105] 示例性的试剂盒可进一步包含描述本文所公开的任何方法的说明书。
[0106] 在另一个方面，提供用于测量雄性个体的能育性的方法。GM1定位测定可显示精子是否可获能，因此变得有能力使卵受精。如上文所述，该测定可作为在精子头部具有特定GM1定位模式的形态学上正常的精子的百分比评分。APM和AA模式随着精子响应获能刺激物增加。截断可用于区分射精液的相对能育性、基于雄性能育性将精液样品分为各组(例如，区分能育与低生育力与不育男性)。然而，由于精子数目、能动性和形态学也可影响雄性能育性，本公开内容提供用于建立雄性能育性的指数(“雄性能育性指数”或“MFI”)的方法，其包括Cap-Score和一种或多种相关的精液参数(例如，数目、能动性和形态学等)。Cap-Score (也称为GM1评分)为一种或多种GM1模式的数目。例如，Cap-Score可为一种或多种内衬细胞、INTER、AA和APM的数目。可产生强调特定精液参数的不同的指数。例如，本公开内容的指数包括：Cap-Score × %具有前进能动性×绝对数目；
Cap-Score × %形态学正常的精子×绝对数目；
Cap-Score × %总能动性×绝对数目×%形态学正常的精子；和
Cap-Score和这些参数，或其它具体参数的其它变型或组合，其它具体参数包括使用CASA (计算机辅助精子分析)获得的那些，例如：VSL (速度直线)、STR (直线度)、LIN (线性)、VCL (曲线速度)、VAP (速度平均路径)、%能动性、能动性的持续时间、LHA (外侧头幅度)、WOB (摆动)、PROG (前进)和BCF (鞭打数目)等。参见例如世界卫生组织，“WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Sperm (用于检查和处理人精子的WHO实验室手册),” (第5版2010)。
Cap-Score × %形态学正常的精子×绝对数目；
Cap-Score × %总能动性×绝对数目×%形态学正常的精子；和
Cap-Score和这些参数，或其它具体参数的其它变型或组合，其它具体参数包括使用CASA (计算机辅助精子分析)获得的那些，例如：VSL (速度直线)、STR (直线度)、LIN (线性)、VCL (曲线速度)、VAP (速度平均路径)、%能动性、能动性的持续时间、LHA (外侧头幅度)、WOB (摆动)、PROG (前进)和BCF (鞭打数目)等。参见例如世界卫生组织，“WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Sperm (用于检查和处理人精子的WHO实验室手册),” (第5版2010)。
[0107] 雄性能育性指数可体现为用于测量雄性个体的能育性状态的方法。获得精子样品，其中精子样品来自待测量的个体，并且其中至少精子样品的一部分已经暴露于体外获能条件，暴露于固定剂和对于GM1染色，如上文所描述的。一个或多个精液参数的值对于精子样品获得，例如来自个体的原始样品的体积和/或样品的精子的浓度、能动性和/或形态学。MFI从一种或多种GM1模式的数目 (例如，“CAP”评分)和一个或多个获得的精液参数值测定。
在本文所使用的实例中，Cap-Score为在获能条件下在3小时时一种或多种GM1模式的百分比，但Cap-Scores的其它变体根据本公开内容将显而易见(例如其它时间间隔时的数目、GM1模式的数目在获能与非获能之间的变化等)。
在本文所使用的实例中，Cap-Score为在获能条件下在3小时时一种或多种GM1模式的百分比，但Cap-Scores的其它变体根据本公开内容将显而易见(例如其它时间间隔时的数目、GM1模式的数目在获能与非获能之间的变化等)。
[0108] 在一个实施方案中，雄性能育性指数评分可按照下列等式对于男性样品计算：雄性能育性指数/能育性组= a + b1*x1 + b2*x2 + ... + bm*xm 其中a为常数，b1-bm为回归系数，x1-xm为雄性能育性变量，例如Cap-Score、能动性、形态学、体积和浓度。判别函数分析可用于测定哪些能育性变量在两个或更多个天然存在的组之间有区别。例如，为了确定个体是否落入能育、低生育力或不育组，将收集描述精子功能和精液质量的许多能育性变量的数据。判别分析可然后用于确定哪些变量为最好的能育性组预测因子和相对地每一能育性变量应权重多少。
[0109] 雄性能育性指数可由阅读GM1定位测定的实验室产生。实验室可，从一个或多个设施(例如，能育性诊所、精子库等)获得精子样品，和对应于精子样品的精液分析。精液分析信息可包含在GM1定位测定试剂盒所包含的卡上，经电子方式传送至实验室，和/或另外提供。在另一个示例性的实施方案中，实验室获得精子样品的Cap-Score，并且还获得精子样品的精液分析信息。在一个实施方案中，实验室基于获得的Cap-Score和获得的精液分析数据计算雄性能育性指数。
[0110] 用于鉴定雄性能育性状态的示例性方法包括将来自个体的精子样品暴露于体外非获能和体外获能条件。将精子固定并测定固定的精子中所选择的GM1模式的百分比。比较暴露于体外非获能和体外获能条件的精子中不同GM1模式的百分比。暴露于体外获能条件的精子与暴露于体外非获能条件的精子中一种或多种选择的GM1模式的百分比变化指示个体的能育性状态。选择的GM1模式可为内衬细胞、INTER、AA和/或APM。在一个实施方案中，个体的能育性状态通过计算获能精子的AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率测定。
[0111] 用于鉴定雄性能育性状态的示例性方法包括将来自个体的精子暴露于体外获能条件。将精子固定并测定固定的精子中所选择的GM1模式的百分比。比较不同GM1模式的百分比与来自对照的百分比，其中对照精子样品已经暴露于相同的体外获能条件和相同的固定剂。一种或多种选择的GM1模式的百分比变化相对于对照中的变化指示不同于对照的能育性状态的个体能育性状态。GM1模式可为内衬细胞、INTER、AA和/或APM。在一个实施方案中，个体的能育性状态通过计算获能精子的AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率测定。在一个实施方案中，在暴露步骤之前，将精液样品使用非金属材料制成的宽口吸管和使用选自用于降低精液粘度的各种试剂的不损伤精子膜的试剂处理以降低精液粘度。在一些实施方案中，膜损伤试剂选自(i) 蛋白酶，(ii) 核酸酶，(iii) 溶粘蛋白剂，(iv) 脂肪酶，(v) 酯酶和(vi) 糖苷水解酶类。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少18规格、16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
[0112] 在示例性的方法中，对照可为来自已知具有正常的能育性状态的个体或已知具有异常能育性状态的个体的精子样品。对照可为从包括多个个体的数据集，例如包含至少50个个体的数据集获得的值。
[0113] 用于将雄性的能育性状态鉴定为不育、低生育力或能育的示例性方法包括将来自个体的精子样品暴露于体外获能条件。测定样品中的GM1模式。比较一种或多种GM1模式的百分比与能育性阈值，其中小于能育性阈值的百分比指示能育性问题。例如，小于能育性阈值的百分比可指示不育或低生育力的能育性状态。GM1模式可为内衬细胞、INTER、AA和/或APM。在一个实施方案中，个体的能育性状态通过计算获能精子的AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率测定。在一个实施方案中，在暴露步骤之前，将精液样品使用非金属材料制成的宽口吸管和使用选自用于降低精液粘度的各种试剂的不损伤精子膜的试剂处理以降低精液粘度。在一些实施方案中，膜损伤试剂选自(i) 蛋白酶，(ii) 核酸酶，(iii) 溶粘蛋白剂，(iv) 脂肪酶，(v) 酯酶和(vi) 糖苷水解酶类。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少18规格、16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
[0114] 示例性方法中的体外获能条件可包括暴露于i) 碳酸氢根和钙离子，和ii) 甾醇外流介质例如2-羟基-丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂囊泡、胎儿脐带血清超滤液、脂肪酸结合蛋白或脂质体。在一个示例性的方法中，将对照暴露于获能或非获能条件可与检验样品平行进行。
[0115] 用于将雄性的能育性状态鉴定为不育、低生育力或能育的示例性方法包括将来自个体的精子样品暴露于获能条件。测定样品中每一GM1模式的百分比。将一种或多种GM1模式的百分比与不育阈值比较，其中小于不育阈值的百分比指示能育性问题。示例性方法中的获能条件可包括暴露于i) 碳酸氢根和钙离子，和ii) 甾醇外流介质例如2-羟基-丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂囊泡、胎儿脐带血清超滤液、脂肪酸结合蛋白或脂质体。一种或多种GM1定位模式可为内衬细胞、INTER、AA和/或APM。在一个实施方案中，个体的能育性状态通过计算获能精子的AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率测定。在一个实施方案中，在暴露步骤之前，将精液样品使用非金属材料制成的宽口吸管和使用选自用于降低精液粘度的各种试剂的不损伤精子膜的试剂处理以降低精液粘度。在一些实施方案中，膜损伤试剂选自(i) 蛋白酶，(ii) 核酸酶，(iii) 溶粘蛋白剂，(iv) 脂肪酶，(v) 酯酶和(vi) 糖苷水解酶类。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少18规格、16规格或14规格的规格尺寸。在一些实施方案中，宽口吸管具有至少1 mm、1.2 mm或1.4 mm的孔口尺寸。
[0116] 示例性方法中的能育性阈值可为群体的能育性停止大幅增加的AA + APM模式百分比。例如，能育性阈值可为超过50%的群体能育的AA+APM的水平、超过60-85%的群体能育的AA+APM的水平或范围为35-40 (总GM1模式的相对百分比，包含在内)的AA+APM的水平。能育性阈值可为38、38.5、39或39.5% AA + APM (相对于总GM1模式)。
[0117] 一个示例性的方法可进一步包括比较一种或多种GM1模式的百分比与不育阈值，其中小于不育阈值的百分比指示不育。例如，不育阈值可为群体的能育性开始大幅增加的AA + APM模式百分比、低于50%的群体能育的AA+APM的水平、超过60-85%的群体能育的AA+APM的水平或范围为14-18，包含14和18在内(总GM1模式的相对百分比)的AA+APM的水平。不育阈值可为14、14.5、15或15.5% AA + APM (相对于总GM1模式)。
[0118] 用于鉴定雄性的能育性状态的示例性方法包括获得精子样品，其中精子样品来自个体并且其中精子样品已经暴露于非获能或获能条件、固定、对于GM1染色。测定精子中所选择的GM1模式的数目。比较暴露于体外非获能和体外获能条件的精子中不同GM1模式的百分比。暴露于体外获能条件的精子相对于暴露于体外非获能条件的精子中一种或多种选择的GM1模式的百分比变化指示个体的能育性状态。GM1模式可选自AA、APM、INTER、内衬细胞及其组合。在一个实施方案中，个体的能育性状态通过计算获能精子的AA GM1定位模式的数目和APM GM1定位模式的数目的总和与GM1标记的定位模式的总数目的总和的比率测定。
[0119] 用于鉴定雄性个体的能育性状态的示例性方法包括获得精子样品，其中精子样品来自个体并且其中精子样品已经暴露于体外获能条件，已经固定并且已经对于GM1的存在情况染色。测定精子中所选择的GM1模式的数目。将一种或多种不同的GM1模式的百分比与来自对照的模式的百分比或预定的标准比较。对照精子样品已经暴露于相同的体外获能条件和相同的固定剂。一种或多种选择的GM1模式的百分比变化相对于对照中的变化指示不同于对照的能育性状态的个体能育性状态。
[0120] 用于鉴定雄性个体的能育性状态的示例性方法包括获得精子样品，其中精子样品来自个体，并且其中精子样品已经暴露于体外获能条件，已经固定并且已经对于GM1模式染色。测定样品中的GM1定位模式。将一种或多种GM1模式的百分比与不育阈值比较，其中小于不育阈值的百分比指示能育性问题。
[0121] 用于测量雄性个体的能育性状态的示例性方法包括获得精子样品，其中精子样品来自个体，并且其中精子样品已经暴露于体外获能条件，已经固定并且已经对于GM1模式染色。获得原始样品的体积以及原始样品中精子的浓度、能动性和形态学中的一个或多个的值。精子样品的Cap-Score作为样品中一种或多种GM1定位模式的百分比测定。个体的雄性能育性指数(MFI)值基于测定的Cap-Score和获得的体积、浓度、能动性和形态学中的一个或多个计算。例如，MFI值可通过乘以Cap-Score、体积、浓度、能动性值和形态学值计算。能动性可为能动的精子的百分比。形态学可为形态学正常的精子的百分比。
[0122] 用于测量雄性个体的能育性状态的示例性方法包括获得个体的精子样品的Cap-Score，其作为样品中一种或多种GM1定位模式的百分比。获得原始样品的体积以及原始样品中精子的浓度、能动性和形态学中的一个或多个的值。个体的雄性能育性指数(MFI)值基于测定的Cap-Score和获得的体积、浓度、能动性和形态学中的一个或多个计算。
[0123] 本发明通过下列说明性的实施例进一步描述，其不解释为限制。
[0124] 实施例1该实施例提供用人精子获得的GM1定位模式的示范。从雄性供体收集射出的精子，并允许在37℃液化20 mins，然后进行体积、初始计数、能动性和形态学评估。将1 mL精液样品铺在15 mL圆锥形管中的1 mL密度梯度(90% Enhance-S; Vitrolife, San Diego, California, USA)之上。将管在300 x g离心10分钟。将底部1 mL级分转移至新的15 mL管，然后重悬在4 mL mHTF中。将其在600 x g离心10分钟。将上清液移除，并将精子沉淀重悬在
0.5 mL mHTF中。然后评估经洗涤精子的浓度和能动性。然后将等体积的精子加入两个管，以致于每一管的终体积为300 µl，并且精子的终浓度为1,000,000/ml。第一个管包含mHTF (非获能条件)，第二个管包含mHTF加终浓度3 mM的2-羟基-丙基-β-环糊精(获能条件)。将精子孵育不同的时间长度，但通常使用3小时。这些孵育在37℃进行。
0.5 mL mHTF中。然后评估经洗涤精子的浓度和能动性。然后将等体积的精子加入两个管，以致于每一管的终体积为300 µl，并且精子的终浓度为1,000,000/ml。第一个管包含mHTF (非获能条件)，第二个管包含mHTF加终浓度3 mM的2-羟基-丙基-β-环糊精(获能条件)。将精子孵育不同的时间长度，但通常使用3小时。这些孵育在37℃进行。
[0125] 孵育期结束时，将每一管的内含物温和混合，从每一管移出18 µl并转移至单独的微量离心管。将2 µl 1% (重量/体积)多聚甲醛加入以达到终浓度0.1%。在另一个实施方案中，加入0.1% (重量/体积)的多聚甲醛以达到终浓度0.01%。将这些管温和混合并在室温孵育15分钟，在此时加入0.3 µl 1 mg/ml霍乱毒素b亚基。将两个管的内含物再次温和混合，并允许在室温孵育另外的5分钟。从每一管移出5 µl并放置在载玻片上用于通过荧光显微术评估。为了提供复染，加速测定焦平面和增加荧光信号的寿命，有时加入3 µl DAPI/Antifade。
[0126] 如图2中所示，正常人精子中的GM1定位模式反映对获能条件的响应。完全的响应仅在具有正常能育性的男性中见到；响应的模式在具有未解释的不育的男性中大幅减少或缺失，这些男性在先前的子宫内授精(IUI)或体外受精(IVF)尝试中失败。图1显示人精子中的GM1模式。然而，为了诊断测定的目的，反映异常的模式例如PAPM、AA/PA、ES和DIFF可分组以便于分析。图2A-2C显示在非获能条件(NC，图2A)或获能条件(CAP，图2B)下孵育的正常精液中不同模式的相对分布。当暴露于CAP时INTER模式的减少在正常精液中见到(图2C)，同时还见到AA模式和APM模式的显著增加。与这些正常数据相比，来自已知具有未解释的不育的男性群组的精子也经受GM1测定。在这些精子中，AA模式和AMP模式在获能条件下几乎无增加。
[0127] 实施例2在该实施例中，研究34个患者的临床史以进行其GM1测定评分相对于曾经达到临床妊娠证据的历史的密切分析。如果患者夫妇在3个或更少个周期内达到一些受精/临床妊娠的证据(即使限于生化证据或在超声上无心搏的囊)，雄性患者被定义为“能育”。
[0128] 对这34名患者的数据分析显示如果对在3小时时间点的获能样品评分应用截断40% (APM + AA)，则发现7/8的“通过”(具有评分39.5%或更大)指定为“能育”(87.5%)。26个“失败”(具有评分39.4%或更低)中，仅3/26具有临床妊娠的证据(11.5%) (参见下表1)。
[0129] 如果减少截断，将预测更多的临床上低生育力的人将得到通过评分，通过测定并且在3个周期内能育的百分比应下降。有趣地，在能育性(如通过<= 3个周期的标准所定义的)方面的结果不是平滑梯度或连续曲线。即，无论定义在40或35的测定失败，其不与能育性机会的任何显著变化相关，能育性机会常常较低(11.5-14.3%之间)。相反，通过35 vs 40的测定对应于非常大的能育性机会差异(范围分别为53.8-87.5%)。为了加强和重申此点，组合的APM + AA百分比5%的变化对应于能育性历史中超过30%的变化。
[0130] 这些结果提示雄性能育性更像是“阶跃函数”，其中雄性能育性测定的评分范围对应于“能育”、“低生育力”或“不育”的分类，而不是小的评分变化等于相应的小但连续的雄性能育性 (达到临床妊娠的机会)变化。这些数据强烈表明大体上38.5-40的评分将为“低生育力”或“能育”指定之间的截断。数据的进一步检查提示< 14.5%的截断可用作可能“不育”的指定。
[0131] 总结在平均精液参数方面均类似的这些男性的数据，提示下列范围(基于绝对评分)：不育: < 14.5, 低生育力: 14.5-38.4, 能育: ≥ 38.5。
[0132] 备选地，可通过比较APM和/或AA模式的相对数目随着在获能条件下的孵育时间的变化或相对于在非获能条件下观察到的相对数目评估样品的能育性。例如，可比较在获能条件下孵育3小时后APM + AA的相对数目与孵育开始时那些模式的相对数目。在又一个实施方案中，可比较APM和/或AA频率的变化与从连续的时间点(例如1、2和3小时)获得的结果。实际上，可在Y轴上绘制相对频率，在X轴上绘制时间点，并评估在非获能和获能条件下INTER、APM和/或AA样品的一种或多种的增加数目的变化的斜率或速率。当该分析方法在63名患者的群组中进行时，鉴定了具有匹配正常参考群组的评分的31名男性，且基线GM1模式在非获能培养基中为17%-22%-28%和在获能培养基中为26%-31%-38%，分别对应于1、2和3小时孵育(参见图3)。鉴定了32名低于参考值在非获能培养基中为15%-20%-24%和在获能培养基中为20%-25%-29%的男性。数目、能动性和正常形态学的百分比的精液分析参数(使用严格的WHO标准)在两组之间相当。具有正常范围GM1模式的群体具有子宫内受精(IUI)妊娠率45.2% (14/31)，其中8个(25.8%)产生至少一次胎儿心搏。该群组中三对另外的夫妇凭自己而怀孕。对于具有低于参考的GM1模式的男性，IUI临床妊娠率仅为6.3% (2/32; P=0.03)。在该组中，13个经历ICSI，6个怀孕(46.2%)。
[0133] 实施例3精子细胞如实施例1中所述处理但在固定剂中孵育24小时。标记的精子然后通过荧光显微术评估。鉴定内衬细胞的新的GM1定位模式，如图6A、6B、6C和6D中所说明的。在内衬细胞中，如图6A中所说明的，在赤道段的底部/顶体后区域的顶部和覆盖顶体的质膜处存在GM1信号。信号在顶体后/赤道区域和覆盖顶体的质膜中均匀分布。在赤道段还存在缺乏信号的带。如图6B中所说明的，覆盖顶体的质膜处的信号比顶体后/赤道带处的信号更亮。如图6C和6D中所说明的，顶体后/赤道带处存在的信号比覆盖顶体的质膜处的信号更亮。
[0134] 将来自单一供体的精子细胞洗涤，在获能(Stim)和非获能(Non-Stim)两种条件下孵育，然后在第0天(维持固定大约5小时)和第1天(维持固定大约27.5小时)评分。对于Stim处理从第0天到第1天内衬细胞的百分比几乎无变化。相反，对于Non-Stim处理，内衬细胞的百分比从第0天到第1天从3%增加至22%。连同此变化，INTER随后从76%降低至51%。这些数据与在第1天从第0天具有inter模式的细胞发展的内衬细胞模式一致。
[0135] 表1 % AA % APM % Inter %内衬细胞 %其它
Non-Stim第0天 0 16 76 3 6
Stim第0天 7 19 62 4 8
Non-Stim第1天 4 14 51 22 10
Stim第1天 4 24 53 3 16
实施例4
将来自单一供体的细胞洗涤，在获能(Stim)和非获能(Non-Stim)两种条件下孵育，然后在第0天 (维持固定大约4小时)和第1天(维持固定大约25小时)评分。由于在第0天观察的很少的内衬细胞，在第0天包含或不包含内衬细胞的数目用于测定Cap-Score获得相似的Cap-Score。然而，随着内衬细胞在第1天出现，取决于如何解释内衬细胞，可获得不同的Cap-Scoretm值。例如，当将内衬细胞视为非获能时，对于Stim和non-Stim处理获得相似的
tm tm
Cap-Score 。然而，如果将内衬细胞视为获能、单独的或从Cap-Score 计算移除，对于Non-Stim处理获得比Stim处理更大的Cap-Score。对于Non-Stim处理获得更大的Cap-Scoretm值无意义，因为这些精子细胞在基础条件下孵育，因此将不会显示与获能相关的GM1模式。这些观察结果提供进一步补充证据：内衬细胞代表非获能状态并且当计算Cap-tm
Score 时应如此对待。
Non-Stim第0天 0 16 76 3 6
Stim第0天 7 19 62 4 8
Non-Stim第1天 4 14 51 22 10
Stim第1天 4 24 53 3 16
实施例4
将来自单一供体的细胞洗涤，在获能(Stim)和非获能(Non-Stim)两种条件下孵育，然后在第0天 (维持固定大约4小时)和第1天(维持固定大约25小时)评分。由于在第0天观察的很少的内衬细胞，在第0天包含或不包含内衬细胞的数目用于测定Cap-Score获得相似的Cap-Score。然而，随着内衬细胞在第1天出现，取决于如何解释内衬细胞，可获得不同的Cap-Scoretm值。例如，当将内衬细胞视为非获能时，对于Stim和non-Stim处理获得相似的
tm tm
Cap-Score 。然而，如果将内衬细胞视为获能、单独的或从Cap-Score 计算移除，对于Non-Stim处理获得比Stim处理更大的Cap-Score。对于Non-Stim处理获得更大的Cap-Scoretm值无意义，因为这些精子细胞在基础条件下孵育，因此将不会显示与获能相关的GM1模式。这些观察结果提供进一步补充证据：内衬细胞代表非获能状态并且当计算Cap-tm
Score 时应如此对待。
[0136] 表2实施例5
将来自18个独特供体的40个不同的精液样品洗涤，将精子在获能(Stim)和非获能(Non-Stim)两种条件下孵育，然后在第0天和第1天评分。当将内衬细胞视为非获能时第0天和第1天获得的Cap-ScoreTM值之间观察的显著相关性(r=0.32; n=40; p<0.05)。相反，当将内衬细胞视为获能、分离为基于GM1定位模式的获能或非获能单元(bin)或者简单地从Cap-ScoreTM移除时，第0天和第1天之间未观察到相关性。这些观察结果支持以下观点：随着精子维持过夜，内衬细胞定位模式发展，并且在第0天这些精子显示inter/非获能模式。将内衬TM
细胞作为非获能对待随时间稳定Cap-Score 并且与反映不育细胞的该模式一致。此外，这些数据证明将内衬细胞解释为非获能适用于群体。尽管如此，内衬细胞在第1天的出现是供体依赖性的。这引发以下可能性：这些内衬细胞的观察可提供关于这些供体和其精子受精的能力的额外信息。
将来自18个独特供体的40个不同的精液样品洗涤，将精子在获能(Stim)和非获能(Non-Stim)两种条件下孵育，然后在第0天和第1天评分。当将内衬细胞视为非获能时第0天和第1天获得的Cap-ScoreTM值之间观察的显著相关性(r=0.32; n=40; p<0.05)。相反，当将内衬细胞视为获能、分离为基于GM1定位模式的获能或非获能单元(bin)或者简单地从Cap-ScoreTM移除时，第0天和第1天之间未观察到相关性。这些观察结果支持以下观点：随着精子维持过夜，内衬细胞定位模式发展，并且在第0天这些精子显示inter/非获能模式。将内衬TM
细胞作为非获能对待随时间稳定Cap-Score 并且与反映不育细胞的该模式一致。此外，这些数据证明将内衬细胞解释为非获能适用于群体。尽管如此，内衬细胞在第1天的出现是供体依赖性的。这引发以下可能性：这些内衬细胞的观察可提供关于这些供体和其精子受精的能力的额外信息。
[0137] 尽管本公开内容已经关于一个或多个具体的实施方案描述，将理解的是，本公开内容的其它实施方案可不脱离本公开内容的精神或范围进行，并且这种其它的实施方案意在落入本公开内容的范围内。
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