1.一种周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗的制备方法，其特征是：包括下列步骤：
（一）引物设计
根据GeneBank中周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的已知序列，应用Primer Premier5.0软件设计引物,在上下游引物的5′端分别引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点,起始、终止密码子以及保护性碱基；
BmGAPDH-P1:上游引物5'-CC GGATCC ACC ATG ATT AAC ATT GAC TAT-3'，下划线序列为BamH Ⅰ酶切位点
BmGAPDH-P2:下游引物5'-CC CTCGAG TTA GGT TGC TGT AGC CAT AT-3'，下划线序列为Xho Ⅰ酶切位点
根据GeneBank中周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的已知序列，应用Primer Premier5.0软件设计引物,在上下游引物的5'端分别引入Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基；
BmCPI-P1:上游引物5'-CC GCTAGC AAC GAT GTC AAT AAA AGA AG-3'，
下划线序列为Nhe Ⅰ酶切位点
BmCPI-P2:下游引物5'-CC GGA TCC CTA TGC ACC AAT TAA AAC-3'，
下划线序列为BamH Ⅰ酶切位点；
（二）PCR扩增BmGAPDH、BmCPI基因
计算引物Tm值，P1Tm=62.02,P2Tm=64.94,在0.5m1Eppendorf管中按下表建立25μl的PCR反应体系：
反应体系在冰上调制，混匀，离心后置PCR仪，94℃预变性3min后，94℃变性45秒，
57℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃再延伸7min，4℃冷却终止反应。扩增完毕后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；
计算引物Tm值，P1Tm=62.01,P2Tm=61.99,在0.5m1Ep管中按下表建立25μl的PCR反应体系：
反应体系在冰上调制，混匀，离心后置PCR仪，94℃预变性3min后，94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环，最后72℃再延伸10min，4℃冷却终止反应。扩增完毕后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；
（三）BmGAPDH、BmCPI基因片段纯化和T载体的连接以及转化
感受态大肠杆菌的制备：
(1)取E.coli DH5α用接种环划种于1.5%琼脂LB平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现；
(2)次日，从LB平板上挑一个直径约2mm的单克隆菌落，接种至3ml LB培养基中,于
37℃250rpm振荡培养过夜；
(3)取菌液0.3ml加入30m1LB液体培养基中，37℃250rpm振荡4-6小时，使之处于对数生长期,冰浴1h；
(4)将培养液分装到1.5ml Ep管4℃离心，4000rpm×5min，弃上清，加入冰浴0.1mol/L MgCl2 100μl悬浮，冰浴30min；
(5)再于4℃离心,4000rpm×5min，弃上清，加入冰浴0.1mol/L CaCl2-10%甘油溶液
300μl悬浮，-70℃保存备用；
纯化BmGAPDH、BmCPI基因片段：
(1)取50μl PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,移入1.5ml预先称重的Ep管中，称胶重；
(2)按400μl/100mg琼脂糖凝胶比例加入Binding Buffer，50℃-60℃水浴10min，使胶彻底融化。加热融胶时，每2min混匀一次；
(3)将融化的胶转移到离心柱中，室温放置2min，8000rpm室温离心l min；
(4)取下离心柱，弃收集管中的废液，将离心柱放入同一收集管中，加入500μl Wash Solution，8000rpm室温离心lmin；
(5)重复步骤(4)一次；
(6)取下离心柱，弃收集管中的废液，空管l2000rpm离心lmin；
(7)将离心柱置于新的灭菌1.5ml Ep管中，在柱子膜中央加入30μl Elution Buffer，室温放置2min；
(8)12000rpm室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。
BmGAPDH、BmCPI基因片段和pGEM-T载体的连接：
在一个灭菌0.5ml Ep管中，建立如下10μl连接体系：
在一个灭菌0.5ml Ep管中，建立如下10μl连接体系：
混匀，4℃连接20h，同时设置不含PCR产物的连接反应体系作为阴性对照；pGEM-T/BmGAPDH、pGEM-T/BmCPI连接反应物的转化：
（1）取一管贮存于－70℃冰箱的DH5α感受态细胞，冰浴化开；
（2）取连接反应物10μl加入新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态，同时设立阴性对照和阳性对照，轻轻混匀，冰浴20min；
（3）于42℃热休克90s，迅速转入冰浴中，继续冰浴3min；
（4）加入200μl LB液体培养基，于37℃缓摇孵育45min；
（5）取培养物，涂于预先制备好的1.5%琼脂LB平板，25ml琼脂LB液中加入100mg/ml Amp25μl、24mg/ml IPTG40μl和20mg/ml X-gal50μl，正面于室温放置30min，待胶表面没有液体流动时，倒置平板，于37℃温箱过夜培养12～16h后，置于4℃2h；
（四）pGEM-T/BmGAPDH、pGEM-T/BmCPI阳性重组克隆的筛选和鉴定
阳性重组克隆的筛选：
(1)从琼脂平板上挑取直径2mm的白色单斑,接种于3ml LB液体培养基中，37℃恒温
250rpm震荡培养过夜12h，抽提质粒；
(2)取过夜菌液1.5ml加入Ep管内，l2000rpm离心2min，彻底弃上清；
(3)加入100μl包含50mmol/L葡萄糖、5mmol/L三羟甲基氨基甲烷
Tris.HCl、1.0mmol/L乙二胺四乙酸的溶液Ⅰ，用振荡器彻底悬浮菌液；
(4)加入200μl含有0.4mol/L NaOH、2%SDS的溶液Ⅱ，立即温和混匀，使细菌裂解，室温放置2min；
(5)加入200μl含有5mol/L醋酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、水28.5mL的溶液Ⅲ，立即上下颠倒离心管5-10次，使充分中和，室温放置，5min后，12000rpm离心5min；
(6)将步骤(5)中的上请转移至收集管内的离心柱中，10000rpm室温离心1min；
(7)弃废液，于离心柱中加入500μl的Wash Solution，12000rpm室温离心1min；
(8)再重复步骤(7)；
(9)取下离心柱，弃收集管中的废液，空管l2000rpm离心lmin；
(10)弃废液，将离心柱置于新的灭菌1.5ml Ep管中，加入40μl Elution Buffer，50℃放置2min后，12000rpm室温离心1min。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA；
(11)琼脂糖凝胶电泳观察结果；
pGEM-T/BmGAPDH、pGEM-T/BmCPI阳性重组克隆的鉴定：
(1)PCR鉴定:
pGEM-T/BmGAPDH PCR反应体系
pGEM-T/BmCPI PCR反应体系
反应体系在冰上调制，混匀，离心后置PCR仪，94℃预变性3min后，94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃再延伸7min，4℃冷却终止反应；扩增完毕后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(2)酶切鉴定：
取经PCR鉴定正确的重组质粒,用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切,建立25μl酶切体系，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；
双酶切反应体系
取经PCR鉴定正确的重组质粒,用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切,建立25μl酶切体系，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；
双酶切反应体系
用封口膜封住开口，37℃水浴酶切4h，打开封口，继续加入体系；
双酶切反应体系
37℃水浴酶切4h,65℃灭活10min；经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(3)核酸序列测序鉴定：
将含有pGEM-T/BmGAPDH、pGEM-T/BmGAPDH重组质粒的大肠杆菌的菌液测序；
（五）pcDNA3.1(+)/BmGAPDH/BmCPI重组表达质粒构建与鉴定
pcDNA3.1(+)/BmGAPDH/BmCPI重组质粒构建：
(1)表达载体和目的片段的制备
将重组质粒pGEM-T/BmGAPDH用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，重组质粒pGEM-T/BmCPI用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，表达载体pcDNA3.1(+)质粒用Xho Ⅰ和Nhe Ⅰ进行双酶切，酶切体系及条件同上，经过双酶切后的BmGAPDH片段、BmCPI片段及pcDNA3.1(+)片段分别经低溶点琼脂糖电泳后纯化回收；
(2)表达载体和目的片段的连接
配制一块琼脂糖凝胶，将刚刚回收的样品分别等量上样，紫外分光光度计检测所回收DNA的浓度，以便为下步的连接比例做参考，将上述三个回收片段以4:4:1比例进行连接；
目的基因和载体的摩尔比为4:4:1，建立25μl连接体系：
连接反应体系
PCR仪16℃条件水浴下连接20h；
(3)连接产物转化感受态DH5α菌
连接转化方法同前，取连接液转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布于LB-Amp(100mg/ml)平板上，37℃过夜培养；
pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组质粒鉴定：
(1)初步鉴定
在转化平板上挑取数个单菌落进行摇菌培养，分别提取质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，将明显大于空载体质粒的条带初步筛选为重组克隆株；
(2)PCR鉴定
以上述初步鉴定为阳性克隆的pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组质粒做为模板，分别用BmGAPDH、BmCPI的PCR反应体系进行PCR反应，PCR反应体系及条件与pGEM-T/BmGAPDH、pGEM-T/BmCPI阳性重组克隆的PCR鉴定相同，凡扩增出目的基因的即为阳性重组克隆。同时以空载体质粒为模板做阴性对照；
(3)酶切鉴定
取初步鉴定的重组质粒DNA进行双酶切，做三管，分别用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ，Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ以及Xho Ⅰ和Nhe Ⅰ进行双酶切反应，同时以相应质粒做对照。用1.0%低溶点琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段大小；
双酶切反应体系
取经PCR鉴定正确的重组质粒,用Xho Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切,建立25μl酶切体系，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；
双酶切反应体系
用封口膜封住开口，37℃水浴酶切4h，打开封口，继续加入体系；
双酶切反应体系
取经PCR鉴定正确的重组质粒,用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切,建立41μl酶切体系，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；
双酶切反应体系
取经PCR鉴定正确的重组质粒,用Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切,建立40μl酶切体系，37℃水浴酶切6h,65℃灭活10min；用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；
（六）pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组质粒的大量抽提纯化
(1)将含有重组质粒的菌种室温融化后取50ul加入到含有50ul100mg/ml Amp的100ml LB溶液中置于37℃恒温、250rpm的摇床培养12-16h，之后放置4度冰箱冷却；
(2)菌液培养12-16h后，使用紫外分光光度计测定其OD600值，如果OD600数值在
0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，则可以用来进行质粒的抽提；
(3)取过夜菌至50ml离心管内，5000rpm离心1分钟，收集沉淀，弃上清；
(4)每管加入5ml质粒大量抽提试剂盒的悬浮液,重悬细胞沉淀；
(5)之后每管加入5ml质粒大量抽提试剂盒的裂解液，颠倒离心管4-6次，室温放置
3-5分钟，使细菌完全裂解，溶液透明；
(6)每管加入5ml质粒大量抽提试剂盒的结合液，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生，然后5000rpm室温离心10-20分钟；
(7)将上清倒入或吸入到质粒纯化柱内，室温离心2分钟，倒弃收集管内液体；
(8)在质粒纯化柱内加入7ml质粒大量抽提试剂盒的洗涤液，室温离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体，之后再5000rpm室温离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发；
(9)将质粒纯化柱置于50ml离心管上，加入2ml质粒大量抽提试剂盒的洗脱液至管内柱面上，放置2分钟，然后5000rpm室温离心2分钟，所得液体中加入10ml DNA纯化结合液，混匀后加到原质粒纯化柱内；
(10)再次室温离心2分钟后，倒弃收集管内液体；
(11)在质粒纯化柱内加入15ml质粒大量抽提试剂盒的洗涤液，5000rpm室温离心2分钟，近一步洗去杂质后，倒弃收集管内液体；
(12)5000rpm室温离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发；
(13)将质粒纯化柱置于50ml离心管上，加入2ml洗脱液至管内柱面上，放置2分钟；
(14)5000rpm室温离心2分钟，所得液体即为超纯质粒；
(15)用生理盐水将纯化的质粒稀释至终浓度为1mg/mL，-20℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗的制备方法，其特征是：
所述快速连接缓冲液由132mM Tris-HCl、20mM MgCl2、2mM DTT、2mM ATP、15%聚乙二醇组成。
3.根据权利要求1所述的周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗的制备方法，其特征是：
免疫佐剂为非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸为核心的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)，序列如下：
CpG ODN1826 5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′，并全链硫代磷酸骨架修饰，增强其核酸酶抗性；用生理盐水溶解配制成1mg/mL。