技术领域
[0001] 本
发明涉及共焦显微成像技术，具体涉及一种利用柱偏振涡旋光束的超分辨共焦显微成像方法及装置。
背景技术
[0002] 现代
生物学和材料科学的发展对微观结构的研究提出了越来越高的
分辨率需求，希望从分子
水平揭示生命过程和材料性能的物理本质。但受到光学衍射极限的限制，普通光学
显微镜的横向分辨率一般只能达到200nm，纵向分辨率约500nm，这对于研究亚细胞结构和分子结构已无能为
力。虽然
电子显微镜（Electron Microscopy）、
原子力显微镜（Atom Force Microscopy）、近场扫描
光学显微镜（Near-field Scanning Optical Microscope,NSOM）等技术可以获得很高的分辨率，但是由于缺乏特异性的探针标记，不适合
定位单个
蛋白质分子，而且也不适合观察活细胞和细胞膜的动态变化过程。因此，如何利用光学方法突破传统光学显微镜的分辨率极限，使其既具有纳米尺度的光学分辨本领又可以连续监测生物大分子和细胞器微小结构的演化，成为光学显微成像技术的一个重要挑战和机遇。
[0003] 共焦
荧光显微（Confocal Microscopy）是一种典型的点扫描成像技术，是目前应用最广泛的一种光学显微成像技术。共焦显微镜的工作原理如图1所示，以
激光器1为
光源，采用包括照明针孔2和探测针孔7的双针孔的结构形成物像共轭，然后激光通过二向色镜3和透镜4聚焦在焦平面5上形成点光源，在物镜焦平面上对样品6逐点扫描，荧光
信号经过探测针孔7滤波后被探测器8收集，由于只有激光焦点处激发的荧光可以通过探测针孔，所以激光共焦显微具有极低的背景噪声，而且通过逐层扫描样品，可以实现三维成像。该技术通过牺牲视场的办法来改善分辨率，其横向分辨率是相同数值孔径的普通光学显微镜的1.4倍，轴向分辨率可以达到亚微米级。但目前商用的共焦显微镜还无法实现超分辨共焦显微成像。
[0004] 对于共焦显微成像技术来说，实现超分辨的关键是获得小于衍射极限的聚焦光斑，因此减小入射光
波长和增大成像物镜的数值孔径是最直接的手段。2001年，A Drechsler和C Liu等人分别研究了基于数值孔径接近1的抛物反射聚焦透镜和浸入式大孔径的共焦测量技术，实现高分辨率。但是这种调整对于提高分辨率的能力还是非常有限的，因为入射光波长不能无限减小，而成像物镜数值孔径也是有限大小的。近些年研究表明，采用光瞳滤波、4Pi照明以及干涉等技术途径，可进一步提高共焦系统的测量分辨率，但提高效果并不十分明显，因此必须寻找新的技术突破口。
[0005] 已有研究表明，聚焦光斑的尺寸与光束的偏振态也有很大的关系，通过有目的地调控光场空间的偏振态及
相位分布可以产生一些独特的聚焦场分布，包括超分辨聚焦光斑，这为实现超分辨共焦显微成像技术提供了一种新的选择。
发明内容
[0006] 本发明将柱偏振涡旋光束引入到共焦显微成像系统中来获得超小的实心聚焦光斑，以获得一种超分辨的显微成像。
[0007] 本发明提供一种基于柱偏振涡旋光束的超分辨共焦显微成像装置，包括以下部分：针孔
滤波器，从激光器发出的光束经过针孔滤波器，获得一强度均匀的高斯基模光束；
准直透镜，所述高斯基模光束被
准直透镜准直为平行光束；偏振及相位转换系统，所述平行光束经过偏振及相位转换系统，得到具有预定偏振及相位分布的柱偏振涡旋光束；光瞳滤波器，所述柱偏振涡旋光束经过所述光瞳滤波器滤波后，经过分束镜反射并被聚光镜聚焦到待测样品上；滤光片，从样品反射的
光信号经过聚光镜和分束镜后入射到一滤光片上，该滤光片只允许光信号中的荧光信号透射；探测器，所述荧光信号被聚光镜聚焦到探测针孔上，并被后面的探测器探测，转换为
电信号输出；三维平移台，所述样品放置于所述三维平移台上，通过移动三维平移台可实现样品不同
位置的探测，从而实现样品的
三维扫描成像。
[0008] 可选的，所述具有预定偏振及相位分布的柱偏振涡旋光束是拓扑电荷数为0的径向偏振光或拓扑电荷数为1的切向偏振涡旋光。
[0009] 可选的，还包括
液晶偏振转换器与涡旋相位片，用于生成柱偏振涡旋光束，入射的
激光束首先经过一偏振片转换为一垂直或水平方向的线偏振光，然后再经过一液晶偏振转换器转换为径向偏振光或切向偏振光，获得的径向偏振光或切向偏振光通过后面的偏振旋转器可得到具有任意初始偏振方位
角的柱矢量光束，然后该柱矢量光束再经过一涡旋相位片转换为柱偏振涡旋光束，其中，偏振旋转器由两个半波片组成，若两波片快轴的夹角为则光束偏振旋转角为 而且这种旋转与入射光束初始偏振方位无关。
[0010] 可选的，还包括4f相干滤波系统和空间光
调制器，用于生成柱偏振涡旋光束，准直的线偏振光束照明一个计算机控制的位相型空间光调制器,然后进入由两个共焦透镜组成的4f系统；在空间光调制器上加载一个预设的二维全息光栅，光透过二维全息光栅后分别在x方向和y方向上分成多级次的衍射光波，
频谱面上x轴和y轴的+1级次光通过双孔滤波器提取出，经过紧贴每个孔的1/4波片被分别转换成左旋圆偏振光和右旋圆偏振光，再经过透镜后焦面与x轴夹角为45°的位相型Ronchi光栅，使得左旋和右旋的两束圆偏振光重新共线
叠加，通过调整空间光调制器上二维全息光栅的周期，使其与Ronchi光栅的
频率相匹配，便可获得所需的特定形式的柱偏振涡旋光束。
[0011] 本发明还提供一种基于柱偏振涡旋光束的超分辨共焦显微成像方法，包括以下步骤：从激光器发出的光束经过针孔滤波器，获得一强度均匀的高斯基模光束，所述高斯基模光束被准直透镜准直为平行光束，所述平行光束经过一偏振及相位转换系统，得到某一特定偏振及相位分布的柱偏振涡旋光束，所述柱偏振涡旋光束经过光瞳滤波器滤波后，经过分束镜反射并被聚光镜聚焦到待测样品上，从样品反射的光信号经过聚光镜和分束镜后入射到一滤光片上，该滤光片只允许光信号中的荧光信号透射，所述荧光信号被聚光镜聚焦到探测针孔上，并被后面的探测器探测，转换为电信号输出，待测样品放置于一三维平移台上，通过移动三维平移台可实现样品不同位置的探测，以实现样品的三维扫描成像。
附图说明
[0012] 图1是共焦显微镜的工作原理图。
[0013] 图2(a)－图2(d)是柱矢量光束横截面上的偏振分布特性，其中图2(a)初始方位角为φ0的柱矢量光束，图2(b)是径向偏振光束，图2(c)是切向偏振光束，以及图2(d)是利用涡旋相位片获得涡旋光束的方法。
[0014] 图3(a)是基于柱偏振涡旋光束的共焦显微成像系统，图3(b)是差动共焦检测系统。
[0015] 图4(a)－图4(b)是偏振及相位转换系统结构示意图。
[0016] 图5是光瞳滤波器的结构示意图。
[0017] 图6(a)－图6(d)则给出了采用两种不同光瞳滤波器结构时得到的聚焦光斑强度分布。
[0018] 图7(a)－图7(b)是切向偏振涡旋光束(m=1)在焦平面上聚焦场的强度分布。
具体实施方式
[0019] 下面结合附图和
实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
[0020] 图2(a)－图2(d)是柱矢量光束横截面上的偏振分布特性，其中图2(a)是初始方位角为φ0的柱矢量光束，图2(b)是径向偏振光束，图2(c)是切向偏振光束，以及图2(d)是利用涡旋相位片获得涡旋光束的方法。
[0021] 如图2(a)所示，柱矢量光束是一类在光束横截面上偏振态关于光束传播轴具有柱对称特性的偏振光束，在光束横截面上的局部，光束的偏振态都为线偏振，但其偏振方向则空间变化。当光束的初始偏振方位角φ0分别为0和π/2时，则得到两种典型的柱矢量光束，即径向偏振光束（图2(b)）和切向偏振光束（图2(c)）。特别地，如图2(d)所示，利用涡旋相位片SPP可以施加一涡旋相位到该光束上，生成一种柱偏振涡旋光束SPPL。也就是说，柱偏振涡旋光束是一种偏振级次为1的涡旋光束，拓扑电荷数可以是任何数，如果是零，就是没有涡旋相位的柱偏振矢量光束。当初始偏振方位角为零时，对应一种独特的柱偏振涡旋光束，即径向偏振涡旋光束，当初始偏振方位角是90°时，则对应另外一种独特的柱偏振涡旋光束，即切向偏振涡旋光束，当初始偏振方位角是其它值时，是其它的柱偏振涡旋光束。所以，确定一个柱偏振涡旋光束的偏振及相位具体分布的参数有两个，即初始偏振方位角（影响偏振分布）和拓扑电荷数（影响相位分布），而偏振级次固定取值为1。
[0022] 在柱坐标下中，柱偏振涡旋光束的光场复振幅可描述为，
[0023]
[0024] 其中，A为一常数，P(r)为光束的光瞳函数，m为涡旋相位的拓扑电荷数，分别是沿着径向和切向的单位矢量。很显然，当m=0时，上式简化为柱矢量光束的光场复振幅表达式。也即是说，柱矢量光束可看做拓扑电荷数为0的柱偏振涡旋光束。
[0025] 图3(a)是基于柱偏振涡旋光束的共焦显微成像系统，图3(b)是差动共焦检测系统。
[0026] 将柱偏振涡旋光束引入到共焦显微成像系统中，建立如图3(a)所示的系统结构。该系统的工作原理是：激光器11发出的光束经过针孔滤波器12后获得一强度较为均匀的高斯基模光束，然后被准直透镜13准直为平行光束，该平行光束经过一偏振及相位转换系统14，得到某一特定偏振及相位分布的柱偏振涡旋光束，该光束经过光瞳滤波器15滤波后，经过分束镜16反射并被聚光镜17聚焦到待测样品18上。从样品反射的光信号经过聚光镜和分束镜后入射到一滤光片20上，该滤光片只允许光信号中的荧光信号透射，该荧光信号被聚光镜21聚焦到探测针孔22上，并被后面的探测器23探测，转换为电信号输出。待测样品放置于一三维平移台19上，通过移动三维平移台可实现样品不同位置的探测，从而实现样品的三维扫描成像。由于将柱偏振涡旋光束引入到共焦显微成像系统中，获得了超小的实心聚焦光斑，所以可以实现超分辨显微成像。
[0027] 可以通过多种方法将入射的激光束转换为特定形式的柱偏振涡旋光束。图4(a)－图4(b)给出了两种典型的生成柱偏振涡旋光束的方法。
[0028] 图4(a)是基于液晶偏振转换器与涡旋相位片生成柱偏振涡旋光束的方法。入射的激光束首先经过一偏振片41转换为一垂直或水平方向的线偏振光，然后再经过一液晶偏振转换器42转换为径向偏振光或切向偏振光，获得的径向偏振光或切向偏振光通过后面的偏振旋转器43可得到具有任意初始偏振方位角的柱矢量光束，然后该柱矢量光束再经过一涡旋相位片44转换为柱偏振涡旋光束。其中，偏振旋转器由两个半波片45和46组成，若两波片快轴的夹角为 则光束偏振旋转角为 而且这种旋转与入射光束初始偏振方位无关。
[0029] 图4(b)是基于4f相干滤波系统和空间光调制器生成柱偏振涡旋光束的方法。准直的线偏振光束照明一个计算机控制的位相型空间光调制器(SLM)51,然后进入由两个共焦透镜52和54组成的4f系统；在SLM上加载一个预设的二维全息光栅，光透过二维全息光栅后分别在x方向和y方向上分成多级次的衍射光波，频谱面上x轴和y轴的+1级次光通过双孔滤波器53提取出，经过紧贴每个孔的1/4波片56被分别转换成左旋圆偏振光和右旋圆偏振光，再经过透镜后焦面与x轴夹角为45°的位相型Ronchi光栅55，使得左旋和右旋的两束圆偏振光重新共线叠加。通过调整SLM上二维全息光栅的周期，使其与Ronchi光栅的频率相匹配，便可获得所需的特定形式的柱偏振涡旋光束。具体可参考Hao Chen等人的文献“偏振和相位空间变化的矢量光束的生成（Generation of vector beam with space-variant distribution of both polarization and phase.Optics Letters,36(16),3179-3181,2011）”。
[0030] 另外，在图3(a)所示的共焦显微成像系统中，为了进一步提高轴向分辨率，可采用3(b)所示的差动共焦检测系统，具体可参考J B Tan等人的文献“基于差动共焦显微技术的光学聚焦检测的理论分析和特性研究（Theoretical analysis and property study of optical focus detection based on differential confocal microscopy.Measurement Science and Technology,13(88):1289-1293,2002）”。
[0031] 同时，为了保证光束经过分束镜反射、透射后依然保持柱对称偏振分布，可在系统中引入一种“保偏分束系统”，具体参考Q Zhan等人文献“,J R Leger.Microellipsometer with radial symmetry.Applled Optics,41(22):4630-4637,2002”。
[0032] 基于矢量衍射理论，推导出柱偏振涡旋光束的聚焦场在柱
坐标系下的数学表达式为，
[0033]
[0034]
[0035] 其中， 分别是在柱坐标系中沿径向、切向和轴向的三个
正交聚焦场分量；θ是某一聚焦光束的会聚角，即会聚光束波矢与光轴的夹角，其中最大的会聚角-1α与透镜数值孔径的关系为α=sin (NA/n)，其中n为聚焦光束所在空间的媒质折射率；
P(θ)为入射光束的光瞳函数，表征入射光束的相对振幅及相位分布；A(θ)透镜切趾函
1/2
数，与透镜类型有关，例如当透镜满足正弦条件时，A(θ)=cos θ，当透镜满足赫姆霍斯条-3/2
件时，A(θ)=cos θ；T(θ)为光瞳滤波函数，表征了光瞳滤波器对光束的振幅及相位调制；φ0为柱矢量光束的初始偏振方位角，m为涡旋相位的拓扑电荷数；J0(·)和J1(·)分别是级数为0和1的第一类贝塞尔函数。很显然，当m=0时，上式简化为柱矢量光束聚焦场的数学表达式；而且，当φ0=0时对应径向偏振的情况，φ0=π/2对应切向偏振的情况。
[0036] 需要特别说明的是，柱偏振涡旋光束聚焦场的强度分布与入射光束的光瞳函数、聚焦透镜的切趾函数、滤波器的滤波函数以及聚焦透镜的数值孔径等都有密切关系，不同的聚焦条件对应不同的聚焦场分布。
[0037] 柱偏振涡旋光束在高数值孔径透镜聚焦的情况下，会得到超小的聚焦光斑。这种聚焦光斑有可能是实心的，也有可能是空心的，其强度的具体分布与很多参数有关。首先，影响光斑大小的主要是透镜的数值孔径，数值孔径越大，光斑越小，而数值孔径越小则光斑越大。其次，决定实心还是空心的强度分布，则主要决定于初始偏振方位角和拓扑电荷数。具体而言，当拓扑电荷数大于1时，得到的聚焦光斑总是空心的，而且切向偏振涡旋光束的空心光斑尺寸比径向偏振涡旋光束的空心光斑尺寸要小，其它形式的则介于两者之间，是两者的一个比例组合；当拓扑电荷数为1时，柱偏振涡旋光束得到的是实心聚焦光斑，对于切向偏振涡旋光束，会得到一个实心聚焦光斑，而且数值孔径越大光斑越小，而对于径向偏振涡旋光束，当数值孔径比较小时，得到的是一个凹陷的聚焦光斑，光斑中心强度小，旁瓣强度大，但随着数值孔径的增强，中心光强越来越大，最后得到一个实心的聚焦光斑。通过灵活调控这些聚焦条件，可获得超分辨的聚焦光斑，从而可实现超分辨共焦显微成像。
[0038] 下面列举2个可实现超分辨共焦显微成像的例子。
[0039] 基于径向偏振光束(m=0,φ0=0)
[0040] 假设径向偏振光束的波长为λ，光瞳函数为一贝塞尔-高斯函数，[0041]
[0042] 聚焦透镜满足正弦条件时，则切趾函数A(θ)=cos1/2θ；采用油浸物镜，数值孔径为1.40，其中油的折射率为1.518。同时，采用一种圆环形结构的光瞳滤波器，如图5所示，其滤波函数表示为，
[0043]
[0044] 其中，aj和 分别对应第j个环带振幅透过率的振幅及相位值。
[0045] 图6(a)-图6(d)则给出了采用两种不同光瞳滤波器结构时得到的聚焦光斑强度分布。
[0046] 图6(a)-图6(b)对应第一个光瞳滤波器，其滤波函数为，
[0047]
[0048] 而图6(c)-图6(d)对应第2个光瞳滤波器，其滤波函数为，
[0049]
[0050] 由计算结果不难发现，当采用第一个光瞳滤波器时，其半高全宽度为0.46λ，而采用第2个光瞳滤波器时，其半高全宽度为0.42λ，都比衍射极限低。当应用于共焦显微成像时，可实现横向超分辨显微成像。结合差动共焦检测技术，可进一步实现轴向超分辨显微成像，最终实现三维超分辨成像。
[0051] 图6(a)-图6(d)采用两种不同光瞳滤波器情况下径向偏振光束在焦平面上的聚焦场强度分布，其中图6(a)-图6(b)对应第一个光瞳滤波器，图6(c)-图6(d)对应第二个光瞳滤波器。
[0052] 基于切向偏振涡旋光束(m=1,φ0=π/2)
[0053] 假设切向偏振涡旋光束的波长为λ，拓扑电荷数为m=1；光瞳函数依然选择如公式(3)所示的贝塞尔-高斯函数；聚焦透镜满足正弦条件时，则切趾函数A(θ)=cos1/2θ；采用油浸物镜，数值孔径为1.40，其中油的折射率为1.518；光瞳滤波器的滤波函数如公式(5)所示。则图7(a)-图7(b)给出了此时焦平面上聚焦场的强度分布，聚焦光斑的半高全宽度为0.48λ，低于衍射极限。
[0054] 本发明主要采用两种类型的柱偏振涡旋光束：拓扑电荷数为0的径向偏振光、拓扑电荷数为1的切向偏振涡旋光。这两种光束在高数值孔径透镜聚焦的情况下，都可以得到非常小的聚焦光斑，而且透镜数值孔径越高，光斑越小，而且会突破衍射极限，实现所谓的超分辨。
[0055] 同时，通过进一步优化光瞳滤波函数，选择特殊设计的聚焦透镜，例如抛物面透镜或菲涅
耳透镜等，可以进一步减小聚焦光斑的横向尺寸，从而进一步提高共焦显微成像的横向分辨率。另外，将柱偏振涡旋光束和4Pi共焦显微成像技术相结合，可以进一步提高共焦显微成像系统的分辨率。
