腱病干预
阅读：718发布：2020-05-11
专利汇可以提供腱病干预专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了用于 治疗 腱 病和腱炎的方法和用于 预防 腱病的方法。，下面是腱病干预专利的具体信息内容。
1.治疗受试者的软组织退行性病理的方法，包括向受试者施用治疗受试者的软组织退行性病理有效量的经转染以表达CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的间充质干细胞(MSC)或腱干细胞/腱祖细胞(TSPC)。
2.权利要求1的方法，其中软组织是软骨、韧带或腱。
3.治疗受试者腱病的方法，包括向受试者施用治疗受试者的腱病有效量的经转染以表达CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的间充质干细胞(MSC)或腱干细胞/腱祖细胞(TSPC)。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中MSC或TSPC在其转染以表达CITED2之前已经从人获得。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中MSC或TSPC已经从人肱二头肌腱获得。
6.权利要求3-5中任一项的方法，其中腱病是阿基里斯腱、膝腱或臂腱的腱病。
7.权利要求3-6中任一项的方法，其中腱病不包括破裂的腱。
8.权利要求3-7中任一项的方法，其中将一定量的MSC或TSPC直接施用于腱。
9.权利要求3-8中任一项的方法，其中将一定量的MSC或TSPC植入到腱中或直接与腱相邻。
10.权利要求3-9中任一项的方法，其中MSC或TSPC在其转染以表达CITED2之前从成人获得。
11.权利要求3-10中任一项的方法，其中腱病包括腱变性。
12.权利要求3-10中任一项的方法，其中腱病包括腱炎。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中受试者是人。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中施用MSC。
15.权利要求1-13中任一项的方法，其中施用TSPC。
16.确定腱由于老化而遭受损伤或破裂的可能性的方法，包括获得腱样品并定量样品中的CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的水平，并针对样品大小将该水平与预定对照水平进行比较，并且确定腱由于老化而遭受损伤或破裂的可能性，其中，经定量的CITED2水平超过预定对照水平时表明腱不太可能由于老化而遭受损伤或破裂，并且经定量的CITED 2水平低于预定对照水平时表明腱可能由于老化而遭受损伤或破裂。
17.确定腱中CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)水平的方法，包括：
获得腱样品，以及
定量样品中CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的水平，并针对样品大小将该水平与预定对照水平进行比较，并确定经定量的CITED2的水平是否超过预定对照水平或者经定量的CITED 2的水平是否低于预定对照水平。
18.权利要求16或17的方法，其中通过定量而确定包含有当接触样品即与之结合的抗CITED2结合位点的多肽试剂，量化样品中的CITED2的水平。
19.权利要求18的方法，其中包含抗CITED2结合位点的所述多肽试剂是抗体或包含抗体的抗原结合位点。
20.权利要求18的方法，其中包含抗CITED2结合位点的试剂用可检测标记分子标记。
21.用于(i)改善腱中修复组织和天然组织之间的整合，(ii)改善腱中的基质结构，(iii)促进腱中的teno-分化表型的方法，(iv)减少腱中老化的植入细胞和来自邻接宿主组织的细胞的与年龄有关的衰老标志物，(v)提高经修复的腱组织中TGF-β和CTGF，或(vi)治疗腱中的破裂的方法，
其中所述腱在受试者体内，所述方法包括在受试者的腱中向受试者施用有效量的经转染以表达CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的间充质干细胞(MSC)或腱干细胞/腱祖细胞(TSPC)，以在受试者的腱中分别(i)改善腱中修复组织和天然组织之间的整合，(ii)改善腱中的基质结构，(iii)促进腱中的teno-分化表型，(iv)减少腱中老化的植入细胞和来自邻接宿主组织的细胞的与年龄有关的衰老标志物，(v)提高经修复的腱组织中TGF-β和CTGF，或(vi)治疗破裂。
腱病干预
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2015年6月11日提交的美国临时申请号62/174,005的权益，其内容通过引用并入本文。
[0004] 本发明是在美国国立卫生研究院授予的资助号AG039561的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
[0005] 发明背景
[0006] 在整个申请中括号中提到了各种出版物。这些参考文献的完整引用可以在说明书的最后找到。本文提及的这些出版物以及所有专利、专利申请公开和书籍的公开内容通过引用整体并入本申请，以更全面地描述本发明所属领域。
[0007] 腱破裂最常见的治疗是手术。对于腱病(tendinopathy)，临床治疗不太成熟。可能的治疗包括冰敷，按摩疗法，离心运动，NSAID，超声波治疗，LIPUS，电疗法，贴扎，硬化剂注射，血液注射，三硝酸甘油贴剂和体外冲击波治疗(ESWT)。如果不治疗，腱病可能会导致腱破裂。
[0008] 本文公开了使用表达CITED2的细胞来治疗腱病和腱炎的方法。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明提供了治疗受试者的软组织退行性病理的方法，包括向受试者施用治疗受试者的软组织退行性病理有效量的、经转染以表达CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的间充质干细胞(MSC)或腱干细胞/腱祖细胞(TSPC)。
[0011] 还提供了治疗受试者腱病的方法，包括向受试者施用治疗受试者的腱病有效量的经转染以表达CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的间充质干细胞(MSC)或腱干细胞/腱祖细胞(TSPC)
[0012] 还提供了确定腱由于衰老而遭受损伤或破裂的可能性的方法，包括获得腱样品并定量样品中的CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的水平，并针对样品大小将该水平与预定对照水平进行比较，并且确定腱由于衰老而遭受损伤或破裂的可能性，其中，经定量的CITED2水平超过预定对照水平时表明腱不太可能由于衰老而遭受损伤或破裂，经定量的CITED 2水平低于预定对照水平时表明腱可能由于衰老而遭受损伤或破裂。
[0013] 确定腱中CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)水平的方法，包括：
[0014] 获得腱样品，以及
[0015] 定量样品中CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的水平，并针对样品大小将该水平与预定对照水平进行比较，并确定经定量的CITED2的水平是否超过预定对照水平或者经定量的CITED 2的水平是否低于预定对照水平。
[0016] 提供了用于以下的方法：(i)改善腱中修复组织和天然(native)组织之间的整合，(ii)改善腱中的基质结构，(iii)促进腱中的teno-分化表型，(iv)减少腱中衰老的植入细胞和来自邻接宿主组织的细胞的与年龄有关的衰老标志物，(v)提高经修复的腱组织中TGF-β和CTGF，或(vi)治疗腱内的破裂，
[0017] 其中腱在受试者体内，包括在受试者的腱中向受试者施用有效量的经转染表达CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的间充质干细胞(MSC)或腱干细胞/腱祖细胞(TSPC)，以在受试者的腱中分别(i)改善腱中修复组织和天然组织之间的整合，(ii)改善腱中的基质结构，(iii)促进腱中的teno-分化表型，(iv)减少腱中衰老的植入细胞和来自邻接宿主组织细胞的与年龄有关的衰老标志物，(v)提高经修复的腱组织中TGF-β和CTGF，或(vi)治疗破裂。
[0019] 图1：评估老化的TSPC的CITED2重编程的治疗潜力的实验设计。
[0022] 图4：细胞纵横比(细胞的宽度/长度，顶图)和细胞角度取向(细胞与组织之间的排列差异，底图)。与其他组相比，老化的TSPC+CITED2和年轻的TSPC显示出更长的细胞结构和更好的细胞排列。*与没有TSPC组相比，p<0.05。单因素方差分析随Tukey事后检验。n＝3/组。
[0023] 图5：修复组织与宿主组织之间界面的H&E染色。在植入老化的TSPC+CITED2和年轻的TSPC的腱中，修复的组织和天然组织之间观察到更加无缝的整合。n＝3/组。
[0024] 图6：腱细胞标志物Scleraxis(Scx)和Tenomodulin(Tnmd)的免疫组织化学。与其他组相比，植入老化的TSPC+CITED2或年轻TPSC的损伤表现出更高水平的Scx和Tnmd。*与没有TSPC组相比，p<0.05。单因素方差分析随Tukey事后检验。n＝3/组。
[0025] 图7：修复组织中衰老标志物岩藻糖苷酶A1(FucA1)的免疫组织化学。植入老化的TSPC+CITED2或年轻的TSPC的损伤在修复的组织中表现出较低水平的FucA1。*与没有TSPC组相比，p<0.05。单因素方差分析随Tukey事后检验。n＝3/组。
[0026] 图8：宿主组织中衰老标志物岩藻糖苷酶A1的免疫组织化学。植入老化的TSPC+CITED2或年轻的TSPC的损伤在宿主大鼠组织中表现出较低水平的FucA1。*与没有TSPC组相比，p<0.05。单因素方差分析随Tukey事后检验。n＝3/组。
[0027] 图9A-9C：(9A)植入具有或不具有CITED2重编程的年轻的或老化的TSPC或没有植入TPSC的全厚度撕裂大鼠阿基里斯腱的最大负荷(牛顿，N)和(9B)最大应力(兆帕，MPa)。*与没有TSPC组相比，p<0.05。单因素方差分析随Holm-Sidak事后检验。n＝5/组。(9C)植入具有或不具有CITED2重编程的年轻的或老化的TSPC或没有植入TPSC的全厚度撕裂大鼠阿基里斯腱的最大负荷。*所示比较，p<0.05。Holm-Sidak post-hoc检验的单因素方差分析。
[0028] 图10：人和大鼠TGF-β和CTGF在大鼠宿主组织和源自植入的人TPSC的修复的组织中的mRNA表达。*所示比较，p<0.05。单因素方差分析随Tukey事后检验。n＝3/组。
[0029] 图11A-11E：在人中随着年龄的增加，TSPC中CITED2表达(11A)，克隆形成性(11B)，核纵横比(11C)，核心面积(11D)和衰老细胞的百分比(11E)之间的相关性。
[0030] 图12：CITED2的敲低降低了TSPC的集落形成能力。
[0031] 图13：CITED2的敲低降低了TSPC的增殖率和增加的细胞周期停滞。
[0032] 图14：CITED2的敲低改变了TSPC中的细胞周期相关基因表达。
[0033] 图15：CITED2的敲低削弱了在小鼠髌腱中的窗口横切创伤之后的腱愈合。
[0034] 图16A-C：(A)GAG的裂解胶原蛋白(Col1C1、C2，[参见箭头])的H&E、IHC和番红O染色(红色)。比例尺＝100μm。(B)Col1a1和Col3a1的IHC(细胞外基质的染色)。(C)Cited2、促炎细胞因子/介质、神经血管化相关因子和参与基质合成和降解的基因的基因表达分析。与假手术(虚线)相比或所示比较，*＝p<0.05。
[0036] 图18A-B：(A)最大负荷和(B)最大应力。*与假手术或指示相比，p<0.05。
[0037] 发明详述
[0038] 腱病是一种与腱老化相关的腱疾病，具有炎症和慢性损伤的特征。如本文所证明的(例如图3-11)，显示增加CITED2水平(例如通过基因转移，基于细胞的疗法，化学或物理诱导)具有用作腱病治疗的用途。
[0039] 提供了治疗受试者的软组织退行性病理的方法，包括向受试者施用治疗受试者的软组织退行性病理有效量的经转染表达CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的间充质干细胞(MSC)或腱干细胞/腱祖细胞(TSPC)。在实施方案中，软组织是软骨。在实施方案中，软组织是韧带。在实施方案中，软组织是腱。
[0040] 还提供了治疗受试者腱病的方法，包括向受试者施用治疗受试者的腱病有效量的经转染表达CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的间充质干细胞(MSC)或腱干细胞/腱祖细胞(TSPC)。
[0041] 在本文所述方法的实施方案中，MSC或TSPC在其转染表达CITED2之前已经从人获得。在实施方案中，施用TSPC。在实施方案中，施用MSC。
[0042] 在本文所述方法的实施方案中，MSC或TSPC已经从人肱二头肌腱获得。人体内的任何其他腱也是细胞的可接受来源。
[0043] 腱病可以是阿基里斯腱、膝腱或臂腱的腱病。
[0044] 在本文所述方法的实施方案中，腱病不包括破裂的腱。在实施方案中，受试者不具有破裂的腱。
[0045] 在本文所述方法的实施方案中，将一定量的MSC或TSPC直接施用于腱。在本文所述方法的实施方案中，将一定量的MSC或TSPC植入到腱中或直接与腱相邻。
[0046] 在本文所述方法的实施方案中，MSC或TSPC在其转染以表达CITED2之前从成人获得。
[0047] 在本文所述方法的实施方案中，腱病包括腱变性。在本文所述方法的实施方案中，腱病包括腱炎。
[0048] 在本文所述方法的实施方案中，受试者是人。
[0049] 还提供了确定腱由于老化而遭受损伤或破裂的可能性的方法，包括获得腱样品并定量样品中的CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的水平，并针对样品大小将该水平与预定对照水平进行比较，并且确定腱由于老化而遭受损伤或破裂的可能性，其中，经定量的CITED2水平超过预定对照水平时表明腱不太可能由于老化而遭受损伤或破裂，并且经定量的CITED2水平低于预定对照水平时表明腱可能由于衰老而遭受损伤或破裂。
[0050] 确定腱中CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)水平的方法，包括：
[0051] 获得腱样品，以及
[0052] 定量样品中CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的水平，并针对样品大小将该水平与预定对照水平进行比较，并确定经定量的CITED2的水平是否超过预定对照水平或者经定量的CITED 2的水平是否低于预定对照水平。
[0053] 在所述方法中，样品中CITED2的水平可以通过测定以下来定量：定量包含与样品接触时与之结合的抗CITED2结合位点的多肽试剂的量。在实施方案中，包含抗CITED2结合位点的多肽试剂是抗体或包含抗体的抗原结合位点。在实施方案中，包含抗CITED2结合位点的药剂用可检测标记分子标记。这样的标记在本领域是众所周知的，并且包括诸如放射性核素，荧光染料，化学发光剂，微粒，纳米颗粒，酶，比色标记，磁性标记，半抗原，分子信标和适体信标等部分。这样的可检测试剂还可以包含抗体或抗体片段。
[0054] 提供了用于以下的方法：(i)改善腱中修复组织和天然组织之间的整合，(ii)改善腱中的基质结构，(iii)促进腱中的teno-分化表型，(iv)减少腱中老化的植入细胞和来自邻接宿主组织细胞的与年龄有关的衰老标志物，(v)提高经修复的腱组织中TGF-β和CTGF，或(vi)治疗腱中的破裂，
[0055] 其中腱在受试者体内，包括在受试者的腱中向受试者施用有效量的经转染以表达CREB结合蛋白/p300相互作用蛋白2(CITED2)的间充质干细胞(MSC)或腱干细胞/腱祖细胞(TSPC)，以在受试者的腱中分别(i)改善腱中修复组织和天然组织之间的整合，(ii)改善腱中的基质结构，(iii)促进腱中的teno-分化表型，(iv)减少腱中老化的植入细胞和来自邻接宿主组织细胞的与年龄有关的衰老标志物，(v)提高经修复的腱组织中TGF-β和CTGF，或(vi)治疗破裂。(i)至(v)中的每一个都是该方法可分开的个体实施方案。
[0056] 在实施方案中，CITED2是人CITED2。在实施方案中，如本文实施例中所用，CITED2由1797个核苷酸的cDNA(NM_001168388.2)编码。在实施方案中，CITED2包含以下序列：
[0057] 1 MADHMMAMNH GRFPDGTNGL HHHPAHRMGM GQFPSPHHHQ QQQPQHAFNA LMGEHIHYGA[0058] 61 GNMNATSGIR HAMGPGTVNG GHPPSALAPA ARFNNSQFMG PPVASQGGSL PASMQLQKLN[0059] 121 NQYFNHHPYP HNHYMPDLHP AAGHQMNGTN QHFRDCNPKH SGGSSTPGGS GGSSTPGGSG[0060] 181 SSSGGGAGSS NSGGGSGSGN MPASVAHVPA AMLPPNVIDT DFIDEEVLMS LVIEMGLDRI[0061] 241 KELPELWLGQ NEFDFMTDFV CKQQPSRVSC(SEQ ID NO：1)(NP_001161860.1).[0062] 在实施方案中，CITED2包含以下序列：
[0063] 1 MSGLEMADHM MAMNHGRPPD GTNGLHHHPA HRMGMGQFPS PHHHQQQQPQ HAFNALMGEH[0064] 61 IHYGAGNMNA TSGIRHAMGP GTVNGGHPPS ALAPAARFNN SQFMGPPVAS QGGSLPASMQ[0065] 121 LQKLNNQYFN HHPYPHNHYM PDLHPAAGHQ MNGTNQHFRD CNPKHSGGSS TPGGSGGSST[0066] 181 PGGSGSSSGG GAGSSNSGGG SGSGNMPASV AHVPAAMLPP NVIDTDFIDE EVLMSLVIEM[0067] 241 GLDRIKELPE LWLGQNEFDF MTDFVCKQQP SRVSC(SEQ ID NO：2)(NP_001161860.2)
[0068] 两种方法(腺病毒转导和质粒转染)用于增加TSPC中的CITED2表达。本文的初步工作主要使用腺病毒感染，其得到了高水平的CITED2(增加8-10倍)。质粒转染证实了该结果，其过表达水平稍低(2-4倍增加，结果相似)，并且更适合于将成年组织中的CITED2水平恢复至年轻/生理水平的目的。对于质粒转染，使用Lipofectamine 2000按照制造商的说明用带有GFP标签的CITED2cDNA(CMV-CITED2-GFP)转染TSPC。对于腺病毒感染，根据制造商的说明，通过AdEasy系统产生含有CITED2编码区的重组腺病毒。
[0069] 腱破裂是腱的撕裂，需要手术干预来恢复组织功能。这是一个重要的临床问题，因为腱是难以愈合的组织。在大多数情况下，经过长时间的愈合后，只会形成疤痕组织伴随功能和疼痛减少，并且常常需要修复手术。本文公开的干预能够提供这种急性损伤状况所需的干细胞来源。此外，CITED2重编程植入的干细胞将具有增强的修复能力，以缩短愈合时间并实现真正的腱修复，而不是生成疤痕组织。本文公开的技术能够治疗腱破裂。
[0070] 另一方面，如腱破裂中所看，腱病并不显示急性事件引起的明显的组织损伤。腱病被定义为慢性腱变性，在大多数情况下，由于腱超负荷，导致显微胶原纤维失败和愈合反应失败。越来越多的证据表明，腱病背后的病理学是腱干细胞的功能障碍。本文公开的方法能够通过CITED2重编程来调节腱病相关细胞病症的功能障碍。这种调节包括校正因老化引起的受损干细胞功能和改变对应力如超负荷和炎症的反应。干预将增加健康重编程干细胞的修复来源。此外，植入细胞能够通过减少炎症和应激微环境来改善腱病，促进细胞外基质合成。此外，证据还表明重编程干细胞能够通过旁分泌机制恢复功能失调的驻留(宿主)干细胞和其他细胞的功能。因此，本文公开的方法提供了新的腱病治疗。
[0071] 如本文所用，“治疗”腱病是指疾病的一种或多种症状，例如腱病变本身、腱强度、其炎症或表征疾病的其它参数得到减轻、改善、抑制、处于缓解状态或维持缓解状态。腱病可以大致分为腱炎和腱变性。
[0073] 实施例1
[0074] 老化的干细胞的CITED2重编程用于增强腱破裂修复：调查老化的TSPC的重编程是否会使其恢复活力并增强其修复能力。评估创伤愈合情况，修复和相邻宿主组织的老化相关的功能状态特征在于，通过在裸大鼠中用有或没有CITED2转染的老化人TSPC植入的裂伤产生的全厚度大鼠阿基里斯创伤(图1)。
[0075] CITED2重新编程的老化的人TSPC在植入后定位于创伤部位并与修复的腱整合(图2)。植入有CITED2重编程的老化的TSPC的腱：显示出改善的胶原原纤维结构(图3)，改善的细胞/基质结构(图4)，改善的天然和修复的组织之间的整合(图5)，腱细胞标志物的表达上调(图6)以及衰老标志物在修复组织中的表达减少(图7)。值得注意的是，植入CITED2重编程的人TSPC和年轻的TSPC的腱中，宿主组织的衰老水平也降低(图8)。此外，植入过表达CITED2的TSPC的腱表现出更强的机械性能(图9)。具体而言，与没有TSPC植入的组相比，所有处理组显示出更高的最大负荷(图9A)和最大应力(图9B)。此外，对于老的和年轻的细胞，CITED2重新编程的TSPC与非CITED2重新编程的TSPC相比均具有更高的最大负荷(图9C)，表明CITED2重编程通过改善腱机械性能来增强腱愈合。如在修复的组织中的人类和大鼠衍生的组分中TGF-β和CTGF升高所证实的，CITED2不仅通过直接(即物理微环境支持)而且还通过间接(自分泌/旁分泌)机制使老化的TSPC和老化的腱组织变年轻(图10)。
[0076] 这些数据显示，CITED2重编程增强了TSPC修复能力并促进老化的人TSPC和邻近大鼠组织的复原。基于最大负荷等力学性能测试，CITED2重编程增加了老的和年轻的TSPC二者的可修复性，导致具有更强力学性能的更好的创伤愈合结果。CITED2重编程的作用至少部分通过旁分泌机制介导。
[0077] 总之，CITED2重编程的TSPC是腱损伤修复和腱老化的解决方案。CITED2重新编程的人TSPC：
[0078] -改善了修复组织和天然组织之间的整合
[0079] -改进了基质结构
[0080] -促进了teno-分化表型
[0081] -减少了老化的植入细胞和来自邻接宿主组织的细胞的与年龄有关的衰老标志物[0082] -提高了人和大鼠来源的修复组织中TGF-β和CTGF。
[0083] 实施例2
[0084] CITED2作为腱病和破裂的状态和易感性的腱衰老标志物：确定TSPC中的CITED2表达水平是否可以用作腱老化标志物。建立TSPC中CITED2表达水平与人腱的腱老化的关系，然后确定Cited2的降低是否导致Cited2单倍型不足(Cited2+/-)小鼠的老化表型。
[0085] TSPC中mRNA和蛋白质水平二者形式的CITED2表达水平与人腱老化逆向相关(图11A)。此外，TSPC体外培养物的细胞/集落数(图11B)，核长宽比(图11C)，细胞面积(图11D)和衰老细胞的百分比(图11E)也与腱衰老逆向相关。
[0086] Cited2单倍型不足(Cited2+/-)小鼠表现出老化表型，其特征在于：集落形成能力的降低(图12)，增殖率降低和细胞周期停滞增加(图13)，细胞周期相关基因表达改变(图14)和腱愈合受损(图15)。
[0087] 这些数据表明TSPC中的CITED2表达与腱老化逆向相关。CITED2的降低导致衰老表型，包括创伤愈合受损，从而支持CITED2表达水平下降是老化的函数。由于衰老(老化)是腱创伤损伤发生的危险因素，CITED2作为腱衰老标志物也可以用作损伤如破裂和腱病易感性的指标。总之，CITED2表达与腱老化相关，其可作为腱损伤状态和腱损伤易感性的指标。
[0088] 方法
[0089] 如之前所述鉴定和分离腱干/祖细胞(TSPC)(Zhou et al.Aging Cell,Oct；9(5):911-5,2010)。简而言之，将新鲜腱组织样品切成小块(1mm×1mm×1mm或更小)。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的胶原酶/分散酶(Roche)在37℃消化组织2小时。将悬浮液在1500g离心15分钟，弃去上清液。将剩余的细胞沉淀重新悬浮于由补充有10％胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)组成的生长培养基中。通过稀释悬浮液获得单细胞悬浮液，然后在37℃、5％CO2的6孔板中培养。培养基每2天更换一次新鲜培养基。培养8-10天后，培养板表面形成细胞集落。表现出鹅卵石形状的细胞是TSPC，并被指定为第0代(P0)。如通过在mRNA水平的逆转录实时PCR或蛋白质水平的免疫细胞化学染色或蛋白质印迹测定的，TSPC可表现出形态学特征并表达干细胞标志物如八聚体结合转录因子4(Oct-4)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)和核干细胞因子。TSPC表现典型的间充质表型，流式细胞仪检测CD73、CD90和CD105高表达，CD34和CD45无表达。TSPC可表现出形态学特征并在至少10代(p10)的培养物中表达干细胞标志物。P2和P3用于本申请中的治疗。
[0090] 按照标准方法(Soleimani and Nadri.Nature Protocols 2009；4(1):102-6)鉴定和分离间充质干细胞(MSC)，如骨髓衍生的MSC。简而言之，用DMEM+10％FBS将骨髓冲出具有切开末端的骨。细胞悬液通过70mm筛网过滤。将MSC置于1ml中的100mm培养皿中，密度为25×106个细胞/ml，并在37℃和5％CO2的湿润室中培养。3小时后，去除非贴壁细胞，用新鲜的DMEM+10％FBS替换培养基。培养基每8小时更换一次，最多72小时的培养，之后每3天更换一次。贴壁细胞在第0代被指定为MSC，并会呈现纺锤状形态。基于流式细胞术，MSC将表达Stro-1、CD271、SSEA-4、CD146、CD105、CD73和CD90，而CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a为阴性[Kohler et al.Aging Cell,12(6):988-999]。
[0091] 实施例3
[0092] CITED2重编程干细胞减缓疾病进展，缓解腱病的疼痛：使用完善的阿基里斯腱病模型[5]，检查CITED2调节的TSPC对改善腱病的发病机制和症状以及腱力学性能和功能的作用。
[0093] 方法：从经历总肩关节置换(n＝6)的患者(62-68岁)的肱二头腱中分离人TSPC(hTSPC)，并在第3代或以下使用。根据IACUC操作方案，在胶原酶诱导的腱病(Sprague Dawley大鼠，5-6个月，雄性)后3天，将TSPC(5×105)用含有CITED2cDNA的质粒或载体对照转染并注射到阿基里斯的腱病变部位。腱病诱导后4周，von Frey测试检查了机械性异常疼痛从而来评估疼痛[6]。在处死时，收获样品用于促炎细胞因子以及与腱病中基质退行和神经血管生成有关的介质的基因的组织学(H&E)和免疫组织化学(n＝3/组)，力学测试(n＝6/组)和RT-qPCR分析(n＝6/组)。使用单因素方差分析随Tukey事后检验确定统计学显著性。
[0094] 结果：与媒介物对照相比，用TSPC注射的腱组织表现出疾病和症状改善，而用CITED2过表达的TSPC处理表现出与假手术对照相似的改善的组织学、免疫组织化学和机械性质，伴随疼痛/功能行为降低。具体而言，TSPC+CITED2组的疾病部位具有：1)细胞性降低的细胞形态改善，细胞和基质纤维更好的一致，胶原切割减少(Col1C1，C2)，GAG含量降低(图16A)，Col1a1增加和Col3al染色降低(图16B)，以及诸如Tnfa、Mmp9和13(促炎细胞因子/介质)、Hifla、Vegf(血管化)以及Ngf、Bdnf、mglur2和mglur7(神经长入)等基因的基因表达的显著降低；2)疼痛缓解，如以下所示：对机械损伤(机械性异常性疼痛)的敏感性降低，以及背根神经节(DRG)中神经性相关的神经递质表达降低，背根神经节(DRG)含有支配阿基里斯腱的感觉神经元体；(图17；18)改善阿基里斯腱机械性能，如较高的最大负荷(图18A)和最大应力(图18B)所示。
[0095] 因此证明，CITED2-调节的干细胞治疗不仅显著改善了腱病的病状，而且显著改善了腱的机械特性，并且缓解了大鼠阿基里斯腱病模型中的疼痛症状。CITED2调节与腱病进展和症状发展高度相关的一组基因，从而支持了腱病的治疗效果。
[0096] 参考文献
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