用于具有线虫抗性的高产大豆的方法和组合物
阅读：38发布：2020-07-08
专利汇可以提供用于具有线虫抗性的高产大豆的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 植物 育种和 宿主植物 抗性领域。更具体地说，本发明提供评价和选择除产量等同和农艺学表型以外还显示对 线虫 多个小种的抗性的大豆植物的方法。本发明提供用于选择和渗入抗性等位基因以获得具有同等产量的线虫抗性大豆的方法和组合物。，下面是用于具有线虫抗性的高产大豆的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种大豆育种方法，包括以下步骤：
a.使具有Forrest-型SCN抗性的第一大豆与第二大豆杂交，以产生分离群体；和b.选择包含Forrest-型SCN抗性等位基因rhg1和Rhg4的后代植物，其中所述选择的后代植物在田间条件下能够具有SCN抗性，同时其产量至少等于SCN敏感性后代植物的产量，无论种植地的SCN侵扰水平如何。
2.权利要求1的方法，其中所述选择的后代植物能够具有比SCN敏感性后代植物至少高大约5％的产量，无论种植地的线虫侵扰水平如何。
3.权利要求1的方法，其中所述具有Forrest-型SCN抗性的第一大豆是来源于大豆品种Accomac或MV0045的植物。
4.权利要求1的方法，其中所述Forrest-型SCN抗性等位基因rhg1和Rhg4可通过查询后代植物的基因组DNA在序列SEQ ID NO：1和2中是否存在多态性而进行检测。
5.权利要求1的方法，其中所述选择的后代植物在rhg1基因座处包含SEQ ID NO：1的单元型1。
6.一种包含渗入的Forrest-型SCN抗性等位基因rhg1和Rhg4的大豆植物，其中所述大豆植物在田间条件下能够具有SCN抗性，同时保持至少与商业对照品种等同的产量，而无论种植地的线虫侵扰水平如何。
7.权利要求6的大豆植物，其中所述大豆植物在rhg1基因座处包含SEQ ID NO：1的单元型1。
8.权利要求6的大豆植物，其中所述大豆植物在无、低、中或高侵扰水平下能够具有比商业对照品种至少高约5％的产量。
9.权利要求6的大豆植物，其中所述商业对照品种是大豆品种AG2703或DKB23-51。
10.权利要求6的大豆植物，其中所述大豆植物进一步包含转基因性状。
11.权利要求10的大豆植物，其中所述转基因性状赋予大豆植物优选的性质，所述性质选自：除草剂耐受性、产量增加、昆虫控制、真菌病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌病抗性、支原体病抗性、脂肪酸组成改变、油产生改变、氨基酸组成改变、蛋白质产生改变、蛋白质产量提高、碳水化合物产生改变、发芽和幼苗生长的控制、动物和人类营养增强、低棉子糖、干旱和/或环境应激抗性、形态特征改变、可消化性提高、工业酶、药用蛋白质、肽和小分子、加工性状改善、风味改善、固氮、杂种种子的产生、变应原性降低、生物聚合物、生物燃料和上述的任意组合。
12.一种选择高产大豆植物的方法，包括：
a.提供大豆植物群体；
b.使所述大豆植物群体暴露于中到高水平的SCN侵扰；和
c.选择在rhg1基因座处包含SEQ ID NO：1的单元型1的SCN抗性植物，其中所述选择的SCN抗性植物的后代能够具有至少等于商业对照品种的产量，而无论种植地的线虫侵扰水平如何。
13.权利要求12的方法，其中所述选择的SCN抗性植物的后代能够具有比商业对照品种至少高5％的产量，而无论种植地的线虫侵扰水平如何。
14.权利要求12的方法，其中所述商业对照品种是大豆品种AG2703或DKB23-51。
15.一种评价线虫抗性和敏感性植物栽培种的产量反应的方法，包括以下步骤：
a.建立至少两个具有可变线虫侵扰压力的苗圃；
b.使每个苗圃在整个生长季节和季节与季节之间保持相对一致的侵扰压力；
c.在所述至少两个苗圃中种植测试栽培种；和
d.检测来自所述至少两个苗圃的所述测试种的产量表现。
16.权利要求15的方法，其中根据其在不同线虫侵扰压力下的产量表现选择至少一个测试种。
17.权利要求15的方法，其中根据其在不同线虫侵扰压力下的产量表现选择至少一个测试种。
18.权利要求15的方法，其中所述步骤b)是通过种植和清除靠近测试样地种植的线虫敏感性植物来实现的。
19.权利要求16的方法，其中所述线虫敏感性植物在生长季节中至少种植、栽培和清除三次。
20.权利要求15的方法，其中至少一个苗圃中的线虫侵扰压力是通过靠近测试样地种植线虫敏感性植物和非线虫宿主植物来维持的。
21.权利要求15的方法，其中所述线虫选自异皮线虫属(Heterodera)的种，
如大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)，刺线虫属(Belonolaimus)的种，如刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)，肾状线虫属(Rotylenchulus)的种，如肾形线虫(Rotylenchulus reniformis)，根结线虫属(Meloidogyne)的种，如南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)和日本根结线虫(Meloidogyne javanica)。
22.一种宣传大豆品种的方法，包括提供关于所述大豆品种能够具有线虫抗性和高产量的信息。
23.权利要求22的方法，其中所述信息进一步包括与线虫侵扰压力无关的高大豆产量。
24.权利要求22的方法，其中所述信息进一步包括所述大豆品种中线虫抗性的来源，其中所述线虫抗性的来源是“Forrest”、“Peking”或“Accomac”。
25.权利要求22的方法，其中所述信息是通过口头或视觉媒介传播的，所述媒介选自电视、电影、录像、收音机、广泛展示、口头演讲、印刷品、报纸、杂志、技术通报、公报、包装、种子袋、袋标签、小册子、照片、电子形式、互联网、博客和电子邮件。
用于具有线虫抗性的高产大豆的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2007年10月12日提交的美国临时申请60/979422的优先权。该申请的全部内容在此引入作为参考。
[0004] 包含2008年9月23日创建的、10664字节(在Microsoft 中统计)的名为“pa_55015B.txt”的文件的序列表包括18个核苷酸序列。该电子序列表在此以电子形式提交，并且引入本文作为参考。
[0005] 发明背景
[0006] 1.发明领域
[0007] 本发明属于植物育种领域。更具体地说，本发明提供用于选择和产生除了产量等同(yield parity)和农艺学优良表型以外还显示对线虫多个小种(race)的抗性的大豆植物的方法和组合物。
[0008] 2.相关技术描述
[0009] 大豆胞囊线虫(SCN)(Heterodera glycines Ichinohe)是破坏性最强的大豆[Glycine max(L.)Merrill]害虫。仅在美国，2002年由SCN引起的产量损失据估计为360万兆克，造成大约78380万美元的损失(Wrather等人.Plant Health Progress doi：
10.1094/PHP-2003-0325-01-RV，2003)。但是，宿主植物抗性是一种节约成本的和低投入的控制SCN的方法。大豆胞囊线虫抗性栽培种在SCN侵扰的地点产量较好，但是在无侵扰的地点则丧失了相对于敏感大豆栽培种的优势(Donald等人.Journal of Nematology.38：
76-82，2006)。由于在低SCN压力下SCN抗性品种与敏感品种相比产量较低，阻碍了广泛采用SCN抗性品种。
10.1094/PHP-2003-0325-01-RV，2003)。但是，宿主植物抗性是一种节约成本的和低投入的控制SCN的方法。大豆胞囊线虫抗性栽培种在SCN侵扰的地点产量较好，但是在无侵扰的地点则丧失了相对于敏感大豆栽培种的优势(Donald等人.Journal of Nematology.38：
76-82，2006)。由于在低SCN压力下SCN抗性品种与敏感品种相比产量较低，阻碍了广泛采用SCN抗性品种。
[0010] 当前已知118个植物引入种(PI)和野生种对SCN有抗性。在美国开发的SCN抗性栽培种中，抗性可以追溯到5个来源：大豆′Peking′、PI88788、PI 90763、PI 437654或PI 209332。美国中西部SCN抗性的主要来源是PI 88788，尽管少数栽培种具有来自PI90763、PI 437654和PI 209332的抗性。在北美洲，所有SCN抗性品种中有超过90％携带来源于PI 88788的抗性。这是由于广泛使用栽培种“Fayette”作为PI 88788的来源引起的，该栽培种的普遍使用是由于其良好的农艺学特征。
[0011] 分子标记技术促进了决定SCN抗性的数量性状基因座(QTL)的鉴定和表征。在几乎所有QTL作图研究中，两个基因座-连锁群(LG)G上的rhg1和LG A2上的Rhg4-似乎是各个抗性来源之间最重要的和最常见的。PI 437654、PI 209332、PI 88788、PI 90763、PI89772和Peking全都具有主要SCN抗性基因——连锁群G上的rhg1(Cregan等人，TAG 99：
811-818，1999)。该基因座控制抗性全部变异中的大部分，并且对SCN的几个不同的群体类型是有效的。另外，Peking、PI 209332和PI 437654具有定位于连锁群A2上靠近I基因座(黑色种皮色素沉着)的抗性基因Rhg4(Cregan等人.TAG 99：811-818，1999)。在PI88788中，抗性似乎主要由rhg1控制，另外的效应是由针对其它SCN群体的Rhg4和Rhg5引起的。
已经假设了另外两个基因Rhg2和Rhg3，但是没有得到证实和表征。但是，在Peking中，SCN抗性是双基因的，需要rhg1和Rhg4才能具有对小种3的完全抗性(HG 0，HG 7)。单独使用任一基因在提供针对SCN的植物保护方面无效，无论小种或分离种如何。
811-818，1999)。该基因座控制抗性全部变异中的大部分，并且对SCN的几个不同的群体类型是有效的。另外，Peking、PI 209332和PI 437654具有定位于连锁群A2上靠近I基因座(黑色种皮色素沉着)的抗性基因Rhg4(Cregan等人.TAG 99：811-818，1999)。在PI88788中，抗性似乎主要由rhg1控制，另外的效应是由针对其它SCN群体的Rhg4和Rhg5引起的。
已经假设了另外两个基因Rhg2和Rhg3，但是没有得到证实和表征。但是，在Peking中，SCN抗性是双基因的，需要rhg1和Rhg4才能具有对小种3的完全抗性(HG 0，HG 7)。单独使用任一基因在提供针对SCN的植物保护方面无效，无论小种或分离种如何。
[0012] 与大豆中SCN抗性的渗入相关的产量不足已得到很好地证明。在具有低SCN压力的环境中生长时，SCN抗性大豆栽培种的产量比敏感栽培种低5-10％(Noel，Biology and management of the soybean cystnematode，APS Press，St.Paul，Minn.p.1-13，1992)。在非侵扰田间试验中，具有来源于PI 88788的SCN抗性等位基因的栽培种的产量不足比敏感-1栽培种平均低161kg[ha ](Chen等人.Plant Dis Vol.85：760-777，1999)。
[0013] Mudge等人(Soybean Genet Newsl 23：175-178，1996)也报道了SCN抗性与产量降低之间的连锁。在他们的研究中，来源于大豆PI209332的SCN抗性分离的群体揭示降低产量的数量性状基因座(QTL)等位基因与SCN抗性基因rhg1偶联连锁。这些降低产量的等位基因彼此相距大约10cM，当比较纯合抗性和敏感系时，测到位于rhg1远侧的QTL导致相差296kg/ha，而位于rhg1近侧的QTL导致相差632kg/ha。该区域也与高度增加和倒伏、成熟较晚和种子蛋白质和含油量降低有关。
[0014] Kopisch-Obuch等人(Crop Sci 45：956-965，2005)测试了在由具有来源于大豆PI 88788的抗性的大豆栽培种开发的近等基因系(NIL)群体中，SCN抗性与产量降低之间的连锁。5个NIL群体在rhg1处抗性分离，两个群体在LG J上的cqSCN-003基因座处抗性分离。在具有低SCN压力的地点进行的多项田间研究中，携带SCN抗性等位基因的NIL的产量显著(P＜0.05)低于(118kg/ha)在一个rhg1分离的群体中和一个cqSCN-003基因座分离的群体中(76kg/ha)携带敏感等位基因的NIL。对位于抗性基因侧翼的区域进行的分子标记分析提示在rhg1远侧存在降低产量的等位基因并且可能存在另一个与cq SCN-003基因座连锁的或多效性的降低产量的等位基因。在几个群体中，检测了SCN抗性与成熟度、高度和倒伏之间的相关性，但是差异的幅度较小。
[0015] 无侵扰或低SCN压力环境中与SCN抗性有关的产量不足可能归因于SCN抗性基因对产量的多效性效应或影响产量的基因的连锁和共同继承。本领域中需要一种系统来控制SCN害虫压力，而不引起产量损失。
[0016] 本发明提供一种在田间条件下在低和高SCN侵扰区域评价大豆的方法。SCN群体的密度在一系列作物轮作和填闲作物中随时间推移而保持。现有技术不能提供对产量以及SCN抗性一起进行评价的田间试验。
[0017] 本发明通过提供用于选择和产生当在低侵扰至无侵扰的SCN田间种植时显示产量等同的大豆植物的方法和组合物，克服了现有技术的缺陷。更具体地，本发明提供了用于选择和渗入来源于Peking的、来自‘Forrest’的rhg1和Rhg4的等位基因的方法和组合物，以产生无论SCN侵扰压力如何均为高产的SCN抗性大豆。现有技术不能提供当在低侵扰至无侵扰条件下种植时显示产量等同的SCN抗性大豆品种。但是，十分需要这样的大豆植物。
发明内容
[0018] 本发明包括一种无论SCN侵扰水平如何均与敏感植物和SCN抗性植物具有同等产量的大豆的育种方法，包括：(A)使具有Forrest-型SCN抗性的第一大豆与第二大豆杂交，以产生分离群体；(B)选择至少一个包含Forrest-型SCN抗性等位基因rhg1和Rhg4的大豆植物。而且，本发明涉及产生至少显示产量等同的SCN抗性植物、群体、品系和品种。此外，本发明也涉及产生能够获得包括等于、5％高于、10％高于、15％高于敏感植物的产量的SCN抗性植物。
[0019] 更具体地，本发明包括一种将Forrest-型rhg1和Rgh4等位基因渗入大豆植物中的方法，包括：(A)使至少一个包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核酸分子的第一大豆植物与至少一个第二大豆植物杂交，以形成分离群体，(B)使用一种或多种核酸标记筛查该分离群体，以确定一个或多个来自该分离群体的大豆植物是否含有所述核酸分子，和(C)从所述分离群体中选择一个或多个包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核酸分子的大豆植物。
[0020] 本发明包括一种无论SCN侵扰水平如何均与商业对照品种和SCN抗性植物具有同等产量的大豆的育种方法，包括：(A)使具有Forrest-型SCN抗性的第一大豆与第二大豆杂交，以产生分离群体；(B)选择至少一个包含Forrest-型SCN抗性等位基因rhg1和Rhg4的大豆植物。而且，本发明涉及产生至少显示产量等同的SCN抗性植物、群体、品系和品种。此外，本发明也涉及产生能够获得等于、5％高于、10％高于、15％高于商业对照品种植物的产量的SCN抗性植物。
[0021] 更具体地，本发明包括一种将Forrest-型rhg1和Rgh4等位基因渗入大豆植物中的方法，包括：(A)使至少一个包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核酸分子的大豆植物与至少一个第二大豆植物杂交，以形成分离群体，(B)使用一种或多种核酸标记筛查该分离群体，以确定一个或多个来自该分离群体的大豆植物是否含有所述核酸分子，和(C)从所述分离群体中选择一个或多个包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核酸分子的大豆植物。
[0022] 在一个优选实施方案中，本发明还提供进一步包含转基因性状的大豆植物，其中该转基因性状可以赋予大豆植物优选的性质，所述性质选自除草剂耐受性、产量增加、昆虫控制、真菌病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌病抗性、支原体病抗性、脂肪酸组成改变、油产生改变、氨基酸组成改变、蛋白质产生改变、蛋白质产量提高、碳水化合物产生改变、发芽和幼苗生长的控制、动物和人类营养增强、低棉子糖、干旱和/或环境应激抗性、形态特征改变、可消化性提高、工业酶、药用蛋白质、肽和小分子、加工性状改善、风味改善、固氮、杂种种子的产生、变应原性降低、生物聚合物、生物燃料和上述的任意组合。
[0023] 本发明包括一种鉴定与产量等同和SCN抗性相关的来自‘Forrest’的rhg1的单元型的方法，包括：(A)对至少两个大豆植物中rhg1区的至少一个单核苷酸多态性(SNP)进行基因型分型；(B)确定该植物的产量和SCN抗性值；(C)鉴定与产量等同和SCN抗性相关的rhg1区中的至少两个单元型；(D)选择至少一个包含与产量等同和SCN抗性相关的单元型的大豆植物。而且，本发明涉及产生至少显示产量等同的SCN抗性植物、群体、品系和品种。更特别地，本发明包括一种将来自‘Forrest’的rhg1和Rgh4渗入大豆植物中的方法，包括：(A)使至少一个包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核酸分子的第一大豆植物与至少一个第二大豆植物杂交，以形成分离群体，(B)使用一种或多种核酸标记筛查该分离群体，以确定一个或多个来自分离群体的大豆植物是否含有所述核酸分子，和(C)从所述分离群体中选择一个或多个包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核酸分子的大豆植物。
[0024] 含有一个或多个所述SCN抗性基因座的植物可以是供体植物。例如，可以利用能够检测与抗性相关的标记多态性的核酸分子筛选含有抗性基因座的大豆植物。在一个方面，供体植物是MV00045(布达佩斯条约保藏号PTA-8740)。在一个优选方面，供体植物是SCN抗性基因座1和2的来源。在另一个优选方面，供体植物是SCN抗性基因座1的来源。供体植物可以是敏感系。一方面，供体植物也可以是受体大豆植物。
[0025] 此外，本发明提供一种检测至少一个大豆植物的产量和对SCN的敏感性、部分抗性或抗性的方法，包括以下步骤：(A)使一个苗圃维持低SCN密度，(B)使一个苗圃维持高SCN密度，(C)在低和高SCN苗圃中种植该植物，(D)评价植物对SCN的敏感性、部分抗性或抗性，和(E)评价该植物的产量。在一个优选实施方案中，本发明进一步提供在选自无侵扰、低、中和高线虫压力的条件下种植时显示产量等同、具有线虫抗性的大豆植物，所述线虫包括但不限于异皮线虫属(Heterodera)的种，如大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)，刺线虫属(Belonolaimus)的种，如刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)，肾状线虫属(Rotylenchulus)的种，如肾形线虫(Rotylenchulus reniformis)，根结线虫属(Meloidogyne)的种，如南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)和日本根结线虫(Meloidogyne javanica)。
[0026] 而且，本发明涉及一种宣传能够具有线虫抗性和高产量的大豆品种的方法。该方法包括提供无论线虫侵扰压力如何线虫抗性大豆都能够具有高产量的信息。此外，该方法提供包括线虫抗性来源的信息，其中所述来源是“Forrest”、“Peking”或“Accomac”。另外，该方法通过口头或视觉媒介传播信息，所述媒介选自电视、电影、录像、收音机、广泛展示、口头演讲、印刷品、报纸、杂志、技术通报、公报、包装、种子袋、袋标签、小册子、照片、电子形式、互联网、博客和电子邮件。
[0027] 核酸序列的简要说明
[0028] SEQ ID NO：1是来源于大豆(Glycine max(L.)Merrill)的、对应于rhg1的基因组序列。
[0029] SEQ ID NO：2是来源于大豆(Glycine max(L.)Merrill)的、对应于Rhg4的基因组序列。
[0030] SEQ ID NO：3是用于扩增SEQ ID NO：1的PCR引物。
[0031] SEQ ID NO：4是用于扩增SEQ ID NO：1的PCR引物。
[0032] SEQ ID NO：5是对应于SEQ ID NO：1的PCR引物。
[0033] SEQ ID NO：6是对应于SEQ ID NO：1的PCR引物。
[0034] SEQ ID NO：7是对应于SEQ ID NO：1的PCR引物。
[0035] SEQ ID NO：8是对应于SEQ ID NO：1的PCR引物。
[0036] SEQ ID NO：9是对应于SEQ ID NO：2的PCR引物。
[0037] SEQ ID NO：10是对应于SEQ ID NO：2的PCR引物。
[0038] SEQ ID NO：11是用于检测SEQ ID NO：1的线虫抗性等位基因的第一探针。
[0039] SEQ ID NO：12是用于检测SEQ ID NO：1的线虫抗性等位基因的第二探针。
[0040] SEQ ID NO：13是对应于SEQ ID NO：1的线虫抗性等位基因的第一探针。
[0041] SEQ ID NO：14是对应于SEQ ID NO：1的线虫抗性等位基因的第二探针。
[0042] SEQ ID NO：15是对应于SEQ ID NO：1的线虫抗性等位基因的第一探针。
[0043] SEQ ID NO：16是对应于SEQ ID NO：1的线虫抗性等位基因的第二探针。
[0044] SEQ ID NO：17是对应于SEQ ID NO：2的线虫抗性等位基因的第一探针。
[0046] 图1.苗圃维持高SCN密度。样地分为四个四分之一份，并且种植测试物、玉米，两份种植除草剂敏感的和SCN敏感的大豆。作物每一季在该地点内轮作。
[0047] 图2.苗圃维持低SCN密度。样地分为四个四分之一份，并且种植测试物、“填闲”大豆(除草剂和SCN敏感的大豆)，两份种植玉米。向“填闲作物”喷洒除草剂，以杀死大豆宿主并且降低SCN数。另外，具有“填闲作物”的四分之一份种植小麦、燕麦以减轻休耕综合征。作物每一季在该地点内轮作。
[0048] 图3：具有来源于‘Forrest’的rhg1和Rhg4的SCN抗性大豆与其它SCN抗性大豆相比具有产量增益。rhg1-8表示来源于PI 88788的rhg1。rhg1-P表示来源于‘Forrest’的rhg1。Rhg4-P表示来源于‘Forrest’的Rhg4。S表示不含Rhg4。
[0049] 图4：具有来源于‘Forrest’的rhg1和Rhg4的SCN抗性大豆与其它SCN敏感性大豆相比具有产量增益。通过MV0046与MV0045杂交开发了一个群体。MV0045是来自于‘Forrest’的抗性的来源。根据rhg1单元型和Rhg4的存在对后代进行基因型分型。
[0050] 发明详述
[0051] 本文提供的定义和方法限定本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，应当根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解术语。在分子生物学中的常用术语的定义也可以在以下文献中找到：Alberts等人，Molecular Biology of The Cell，第3版，Garland Publishing，Inc.：New York，1994；Rieger等人，Glossary ofGenetics：Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag：New York，1991；和Lewin，Genes IX，Oxford University Press：New York，2007。使用如37CFR§1.822所述的DNA碱基命名法。
[0052] 如本文所用的“标记”是指多态性序列。“多态性”是指个体之间序列特别是DNA序列的变异。有用的多态性包括单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)和DNA序列的简单序列重复(SSR)。
[0053] 如本文所用的“标记分析”指使用特定方法检测特定基因座处的多态性的方法，例如，表型(如种子颜色、花的颜色或其它视觉可检测的性状)、限制性片段长度多态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、RAPD等。
[0054] 如本文所用的术语“单核苷酸多态性”，也缩写为“SNP”，是指单个位点上的多态性，其中，所述多态性构成单碱基对改变、一个或多个碱基对的插入或一个或多个碱基对的缺失。
[0055] 如本文所用的术语“单元型”是指由至少一个多态性分子标记限定的单元型窗口内的染色体区域。每个单元型窗口中的独特的标记指纹组合限定了该窗口的各个单元型。此外，例如重组导致的单元型的变化可能导致单元型的修饰，使其只包含与性状可操作地连锁的初始(亲本)单元型的一部分，例如，通过与基因、QTL或转基因物理连锁。单元型中的任何这样的变化都包括在我们对于构成单元型的内容的定义中，只要该基因组区域的功能完整性不变或改善。
[0056] 如本文所用的术语“单元型窗口”是指通过本领域技术人员已知的统计分析建立的，且处于连锁不平衡的染色体区域。因此，将位于该区域内的一个或多个分子标记基因座处的两个近交个体(或两个配子)之间的状态同一性(identity by state)作为整个区域的谱系同一性(identity-by-descent)的证据。每个单元型窗口包含至少一个多态性分子标记。单元型窗口可以沿基因组中的每个染色体定位。单元型窗口本身不是固定不变的，且考虑到逐渐增加的分子标记密度，本发明预计单元型窗口的数目和大小将会发展，窗口数目逐渐增加，其各自的大小逐渐减小，从而导致在根据标记基因座的状态同一性确定谱系同一性方面的置信度逐渐增加。
[0057] 如本文所用的“基因型”是指表型的遗传部分，且可以使用标记间接表征，或通过核酸测序直接表征。基因型可以构成至少一个遗传标记基因座的等位基因或至少一个单元型窗口的单元型。在某些实施方案中，基因型可以代表单个基因座，而在其它实施方案中，它可以代表整个基因组宽的一组基因座。在另一种实施方案中，基因型可以反映染色体的一部分、整个染色体、基因组的一部分和整个基因组的序列。
[0058] 如本文所用的“表型”是指作为基因表达的表现的细胞或生物体的可检测的特征。
[0059] 如本文所用的“连锁”是指杂交产生配子类型的相对频率。例如，如果基因座A具有基因“A”或“a”，基因座B具有基因“B”或“b”，具有AABB的亲本I与具有aabb的亲本B之间的杂交将产生4种可能的配子，其中基因分离为AB、Ab、aB和ab。空预期为独立相等地分离成4个可能的基因型中的每一个，即，如果没有连锁，每个基因型将会有1/4的配子。配子分离成基因型不等于1/4是由于连锁。
[0060] 如本文所用的“连锁不平衡”是针对一代的许多个体的群体中配子类型的相对频率而定义的。如果等位基因A的频率是p，a是p′，B是q，b是q′，那么基因型AB的预期频率(没有连锁不平衡)是pq，Ab是pq’，aB是p’q，ab是p’q’。相对于预期频率的任何偏差被称为连锁不平衡。当两个基因座处于连锁不平衡时，它们被称为是“遗传连锁的”。
[0061] 如本文所用的“数量性状基因座(QTL)”是指在一定程度上控制通常连续分布的、可用数字表示的性状的基因座。
[0062] 如本文所用的“抗性等位基因”是指包括与大豆胞囊线虫抗性相关的多态性等位基因的分离的核酸序列。
[0063] 如本文所用的术语“大豆”是指大豆(Glycine max)、野生大豆(Glycine soja)或任何与大豆性匹配的种。
[0064] 如本文所用的术语“优良品系”指通过针对优异的农艺学表现进行育种和选择而产生的任何品系。优良植物是来自优良品系的任何植物。
[0065] 如本文所用的术语“大豆胞囊线虫”或“SCN”是指大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)。
[0066] 如本文所用的术语“生物型”或“分离种”是指基于小种测试或HG测试的SCN群体的分类。
[0067] 如本文所用的术语“无压力”或“无侵扰”是指0个SCN卵/100cc土壤。
[0068] 如本文所用的术语“低压力”或“低侵扰”是指1-500个SCN卵/100cc土壤。
[0069] 如本文所用的术语“中等压力”或“中等侵扰”是指500-2000个卵/100cc土壤。
[0070] 如本文所用的术语“高压力”或“高侵扰”是指多于2000个卵/100cc土壤。
[0071] 如本文所用的术语“高产线虫抗性植物”或“高产”是指当在低线虫压力下种植时在一个或多个特定苗圃中产生具有商业意义的产量的大豆植物。
[0072] 如本文所用的术语“具有商业意义的产量”或“农业艺学可接受的产量”是指至少为对照品种如AG2703或DKB23-51的100％的产量。
[0073] 如本文所用的术语“产量等同”是指当在一个以上的环境中种植时，产量与对照品种如AG2703或DKB23-51等同。
[0074] 如本文所用的术语“高产量”是指至少为对照品种如AG2703或DKB23-51的103％的产量。
[0075] 如本文所用的术语“休耕综合征”是指一种可以严重限制植物生长的状况。幼根系统被囊状丛枝菌根集群化，这有助于养分摄取。当轮作中在大豆之前为非宿主作物如甜菜或双低油菜(canola)或休耕时，菌根群体显著减少。宿主作物如燕麦或小麦的种植可以增加菌根群体和降低休耕综合征的影响。
[0076] 如本文所用的术语“Forrest-型”抗性是指来源于携带来自Peking的抗性的栽培种Forrest的抗性。
[0077] 如本文所用的术语“包括”指“包括但不限于”。
[0078] 本发明通过提供当在无、低、中或高线虫压力下种植时显示线虫抗性和产量等同的农艺学大豆品种，克服了现有技术的缺陷。本发明是有意义的，因为在无侵扰和低压力下种植时，SCN抗性大豆品种与敏感性商业对照品种相比通常产量不足。在中到高压力下种植时，与敏感性商业栽培种相比，SCN抗性大豆品种只具有产量增益。据估计，SCN抗性大豆的产量比在低SCN压力环境下种植的敏感性大豆低5-10％(Noel，Biology and management of the soybean cyst nematode，APS Press，St.Paul，Minn.p.1-13，1992)。本发明提供在无、低、中或高SCN压力下种植时至少显示产量等同的SCN抗性大豆植物。
[0079] 在低压力下具有线虫抗性以及希望的农艺学特征如产量等同提供了许多好处，并且为希望减轻病害危险而不造成产量损失的农民提供了理想的产品概念。SCN是大豆的一种破坏性害虫。宿主植物抗性是一种节约成本的和低投入的控制SCN的方法，但是，由于在低SCN压力下产量较低，阻碍了广泛采用SCN抗性品种。
[0080] 本发明提供在产生改良植物中使用的遗传标记和方法。Rhg4和rhg1已经测序(美国专利7,154,021)。由所述序列信息开发了诊断性的SNP标记，用于鉴定和辅助渗入来源于不同抗性来源(包括Peking和PI 88788)的rhg1，和来源于Peking的Rhg4。
[0081] rhg1基因座位于连锁群G上。在本发明中，用来监测rhg1的渗入的SNP标记包括SED ID NO：1。说明性的SNP标记DNA分子(SEQ IDNO：1)可以用如SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：8所示的引物扩增，使用如SEQ ID NO：11至SEQ ID：16所示的探针。在本发明中，Rhg4位于连锁群A2上。用来监测来源于Peking的rhg4的渗入的SNP标记为SEDID NO：2。说明性的SNP标记DNA分子(SEQ ID NO：2)可以用如SEQID NO：9至SEQ ID NO：10所示的引物扩增，使用如SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：18所示的探针。
[0082] 本发明还提供了包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID：NO：2及其互补序列的核酸分子的大豆植物。本发明还提供了包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID：NO：2及其互补序列的核酸分子的大豆植物。本发明还提供了包含选自SEQ ID NO：3至SEQ ID：NO：10、其片段及它们的互补序列的核酸分子的大豆植物。在一个方面，大豆植物包含1个或2个选自SEQ ID NO：1和SEQ ID：NO：2及其互补序列的核酸分子。在另一方面，大豆植物包含1个或2个选自SEQ ID NO：1和SEQ ID：NO：2、其片段及它们的互补序列的核酸分子。在进一步的方面中，大豆植物包含1、2、3或4个选自SEQ ID NO：3至SEQ ID：NO：18、其片段及它们的互补序列的核酸分子。
[0083] 本发明还提供一种包含1或2个SCN抗性基因座的大豆植物，其中一个或多个其基因座处的一个或多个等位基因选自rhg1和Rhg4。在一个方面，提供了包含rhg1的大豆植物。在另一方面，提供了包含Rhg4的大豆植物。在进一步的方面中，提供了包含rhg1和Rhg4的大豆植物。这些等位基因可以是纯合的或杂合的。
[0084] 本发明还提供一种由rhg1和Rhg4组成的大豆植物，其显示线虫抗性和在无、低、中或高线虫压力下种植时至少与敏感性品种的产量等同。
[0085] SCN的田间群体被表征为小种或HG-型。小种命名反映了特定田间群体在一组特定大豆种质上繁殖的能力，被称为大豆宿主差异。在监测的具有控制的温度和湿度条件的环境中进行测试。30天后，对指示大豆系的根上的雌性数目进行计数，并且与在标准敏感大豆系上形成的雌性数目进行比较。小种测试使用四个指示系：Pickett、Peking、PI88788和PI 907663，并且将SCN群体分类为16个小种(Riggs和Schmitt，J Nematol 20：
392-95，1998)。Peking在Pickett的谱系中，是Pickett的SCN抗性的来源。因此，Peking和Pickett在小种测试中通常具有相似的表现。发展了HG(″HG″指大豆胞囊线虫)型测试，通过消除Peking和Pickett的多余度和扩大大豆宿主差异的数量，克服了与小种测试有关的缺陷。HG型测试与小种测试具有相似的表现，但是包括更广的一组大豆宿主差异。
HG-测试使用7个指示系：Peking(指示系1)、PI 88788(指示系2)、PI 90763(指示系3)、PI 437654(指示系4)、PI 209332(指示系5)、PI 89772(指示系6)和Cloud(指示系7)(Niblack等人.J.Nematol 34：279-88，2002)。在其上发生SCN繁殖增高的HG型指示大豆系的数目是在HG型命名中的数字。例如，HG型2.4SCN群体分别在HG型指示系2和4——PI88788和PI437654上具有增高的繁殖。尽管HG型测试是病理学家、育种者和农学家进行SCN表征的优选方法，但是SCN群体继续根据小种和HG型分类进行分类。
392-95，1998)。Peking在Pickett的谱系中，是Pickett的SCN抗性的来源。因此，Peking和Pickett在小种测试中通常具有相似的表现。发展了HG(″HG″指大豆胞囊线虫)型测试，通过消除Peking和Pickett的多余度和扩大大豆宿主差异的数量，克服了与小种测试有关的缺陷。HG型测试与小种测试具有相似的表现，但是包括更广的一组大豆宿主差异。
HG-测试使用7个指示系：Peking(指示系1)、PI 88788(指示系2)、PI 90763(指示系3)、PI 437654(指示系4)、PI 209332(指示系5)、PI 89772(指示系6)和Cloud(指示系7)(Niblack等人.J.Nematol 34：279-88，2002)。在其上发生SCN繁殖增高的HG型指示大豆系的数目是在HG型命名中的数字。例如，HG型2.4SCN群体分别在HG型指示系2和4——PI88788和PI437654上具有增高的繁殖。尽管HG型测试是病理学家、育种者和农学家进行SCN表征的优选方法，但是SCN群体继续根据小种和HG型分类进行分类。
[0086] 在温室中基于对特定SCN分离种的应答评价大豆系的SCN抗性。SCN分离种根据小种测试或HG型测试分类。这两种测试相似地进行，但是在差异数上不同。在温室生物测定中，至少复制5次的大豆系接种线虫卵并且使其孵化28-35天。在该孵化期结束时，提取胞囊并且在显微镜下计数。将从大豆系回收的胞囊总数转变为雌性指数。雌性指数(％)是从给定系回收的胞囊数除以从敏感对照回收的胞囊数。如果雌性指数小于10％，则品系被称为抗性的，或者如果雌性指数等于或大于10％，则被称为敏感的。因此，仅基于温室试验，确定给定商业品种对任何给定SCN小种或生物型为抗性或敏感性的。
[0087] SCN的田间群体是多种多样的和不均一的。在田间的小块土地中通常可以发现许多生物型或小种，它们在田间的分布非常不均一。这是在田间评价SCN病害反应的诸多困难之一。田间测试将有助于标记开发(如检测产量抑制(yield drag))、证实和测试基本生态学假说，以进一步理解影响抗性表达的基本生物学参数。与温室或生长室实验相比，田间测试既有优点也有缺点。田间研究允许较大的样地、种子增多、不同的栽培实践和与其它在田间常见的微生物和土壤因素的天然相互作用。田间测试也需要理解植物寄生线虫存在于对宿主、天气和气候、土壤物理性质、其它微动物群和微生物群落持续响应的动态多特异性群体中。迄今为止，还没有建立在田间评价SCN的方法。
[0088] 在另一方面，本发明提供一种检测大豆植物的产量以及线虫抗性、免疫性或敏感性的方法，包括：(a)确定线虫群体的生物型，(b)测定田地中线虫的密度，(c)耕作田地以维持一致的线虫压力，其中线虫压力可以低(少于500个卵/100cc土壤)或高(多于500个卵/100cc土壤)，(d)在低和高线虫压力下种植大豆植物，和(d)评价植物的线虫抗性和产量。
[0089] 在另一方面，本发明提供一种根据产量和线虫敏感性、对线虫的部分抗性或抗性培育大豆植物的方法，包括：(a)在低和高侵扰线虫苗圃中种植大豆植物；(b)评价该植物对线虫的敏感性、部分抗性或抗性；(d)评价该植物的产量；和(d)基于产量表现和线虫抗性选择至少一个大豆植物。
[0090] 本发明的植物可以是具有非常高的抗性、抗性、基本抗性、中度抗性、相当的抗性、部分抗性、中度敏感或敏感的植物。
[0091] 在一个优选方面，本发明提供了将要通过任何方法测定其对线虫的抗性或敏感性的线虫抗性植物，以确定植物是否具有非常高的抗性、抗性、基本抗性、中度抗性、相当的抗性、部分抗性、中度敏感性或敏感性。
[0092] 另一方面，本发明提供可以显示与非抗性对照大豆植物相当的抗性的大豆植物。在该方面，除了一个或多个所述来源于‘Forrest’的线虫抗性等位基因以外，对照大豆植物优选地是遗传相似的。这些植物可以在相同或接近相同地接触线虫的相似条件下生长。在该方面，与非抗性对照大豆植物相比，一个或多个抗性植物具有少于25％、15％、10％、5％、
2％或1％的胞囊。
2％或1％的胞囊。
[0093] 本发明的Rhg4和rhg1等位基因可以被引入SCN抗性系中。“优良品系”是通过针对优异的农艺学表现进行育种和选择而产生的任何品系。
[0094] 本发明的Rhg4和rhg1等位基因也可以被引入包含一种或多种转基因的优良大豆植物中，该转基因赋予除草剂耐受性、产量增加、昆虫控制、真菌病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌病抗性、支原体病抗性、油产生改变、高产油量、高蛋白质产量、发芽和幼苗生长的控制、动物和人类营养增强、低棉子糖、环境应激抗性、可消化性提高、工业酶、药用蛋白质、肽和小分子、加工性状改善、风味改善、固氮、杂种种子的产生、变应原性降低、生物聚合物和生物燃料等。一方面，除草剂耐受性选自草甘膦、麦草畏、草丁膦、磺脲、溴苯腈和达草灭除草剂。
[0095] Rhg4和rhg1等位基因可以从任何包含该等位基因的植物(供体)引入到任何接受体大豆植物中。一方面，接受体大豆植物可以包含另外的SCN抗性基因座。另一方面，接受体大豆植物可以包含转基因。另一方面，在保持引入的Rhg4和rhg1的同时，可以通过回交或其它合适的方法来减少提供Rhg4和rhg1的植物的遗传贡献。一方面，大豆植物中来自供体材料的核遗传物质可能少于或等于大约50％、少于或等于大约25％、少于或等于大约13％、少于或等于大约5％、3％、2％或1％，但该遗传物质包含Rhg4和rhg1。
[0096] 进一步可以理解，本发明的大豆植物可以显示任何相对成熟组的特征。一方面，成熟组选自MG 000、MG 00、MG 0、MG I、MGII、MG III、MG IV、MG V、MG VI、MG VII、MG VIII、MG IX和MG X。
[0097] QTL的等位基因当然可以包含多个基因或其它遗传因素，甚至在连续基因组区域或连锁群如单元型内。如本文所用的，抗病性基因座的等位基因可以包含一个以上的基因或其它遗传因素，其中，每个单独的基因或遗传组分也能够显示等位基因变异，并且其中每个基因或遗传因素也能够引发对所述数量性状的表型效应。在本发明的一方面，QTL的等位基因包含也能够显示等位基因变异的一个或多个基因或其它遗传因素。因此术语“QTL的等位基因”的使用并不排除包含一个以上的基因或其它遗传因素的QTL。特别是，本发明中的“QTL的等位基因”可以表示单元型窗口中的单元型，其中表型可以是抗病性。单元型窗口是可以用一组一个或多个多态性标记限定和示踪的连续的基因组区域，其中，多态性指示谱系同一性。该窗口中的单元型可以通过每个标记处的等位基因的独特指纹确定。如本文所用的，等位基因是占据染色体上给定基因座的基因的几种替代形式之一。当染色体上的给定基因座处存在的所有等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果染色体上的给定基因座处存在的等位基因不同，该植物在该基因座处是杂合的。本发明的植物在任何特定的rhg1或Rhg4处或对于特定的多态性标记，可能是纯合或杂合的。
[0098] 本发明也提供了本发明的植物的部分。植物部分包括但不限于，种子、胚乳、胚珠和花粉。在本发明的特别优选的方面，植物部分是种子。
[0099] 本发明也提供了显示SCN抗性和与商业对照品种至少等同的产量的种子的容器，该容器中超过50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的种子包含rhg1和Rhg4。
[0100] 显示SCN抗性和与商业对照品种至少等同的产量的种子的容器可以含有任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可以含有至少或超过大约10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、80、90、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000个或更多的种子。另一方面，容器可以含有大约或超过大约1克、5克、10克、15克、20克、25克、50克、100克、250克、500克或1000克种子。此外，容器可以含有至少或超过大约0盎司、1盎司、5盎司、10盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅、10磅、15磅、20磅、25磅或50磅或更多的种子。
[0101] 显示SCN抗性和与商业对照品种至少等同的产量的种子的容器可以是本领域中可以获得的任何容器。例如，容器可以是盒子、袋子、罐、包、囊、卷带、桶或管。
[0102] 另一方面，显示SCN抗性和与商业对照品种至少等同的产量的种子的容器中含有的种子可以是处理过的或未处理的种子。一方面，种子可以经过处理以改善发芽，例如通过引发种子或者通过消毒以防御种子携带的病原体。另一方面，种子可以用任何可以使用的涂层涂覆，以改善例如可种植性、种子发芽和防御种子携带的病原体。种子涂层可以是任何形式的种子涂层，包括但不限于粒化、薄膜涂层和硬外层。
[0103] 本发明的植物或其部分可以通过培养生长和再生。从各种组织类型再生大豆植物的方法和大豆的组织培养方法是本领域已知的(参见，例如，Widholm等人，In Vitro Selection and Culture-induced Variationin Soybean，In Soybean：Genetics，Molecular Biology andBiotechnology，Verma 和 Shoemaker 编，CAB International，Wallingford，Oxon，England(1996))。如大豆的植物的再生技术可以使用多种组织或细胞类型作为起始原料。尤其是对于大豆，已经开发了再生方法，其开始于某些分化的组织类型，如，分生组织(Cartha等人，Can.J.Bot.59：1671-1679(1981))、下胚轴节(Cameya等人，Plant ScienceLetters 21：289-294(1981))和茎节点段(Saka等人，Plant Science Letters，19：193-201(1980)；Cheng等人，Plant Science Letters，19：91-99(1980))。已报道了由未成熟大豆胚的外植体产生的体细胞胚再生完整的性成熟的大豆植物(Ranch等人，In Vitro Cellular & DevelopmentalBiology 21：653-658(1985))。也已报道了通过器官发生和胚发生从组织培养物再生成熟大豆植物(Barwale等人，Planta 167：473-481(1986)；Wright等人，Plant Cell Reports 5：150-154(1986))。
[0104] 本发明也提供一种通过针对大豆植物中的抗病性或敏感性进行筛查而选择的显示与商业对照品种至少类似的产量的SCN抗性大豆植物，所述选择包括渗入基因组核酸，以存在与大豆植物中的抗病性相关的rhgl和Rhg4等位基因遗传连锁的标记分子。
[0105] 核酸分子或其片段在特定情况下能够与其它核酸分子特异性杂交。如本文所用，如果两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，那么这两个分子能够彼此特异性地杂交。如果一个核酸分子与另一核酸分子表现出完全的互补性，则它们“互补”。如本文所用，当一个分子的每个核苷酸都与另一分子的核苷酸互补时，这两个分子显示“完全互补”。如果两个分子在至少常规的“低严格”的条件下能互相杂交，具有足够的稳定性，从而允许它们保持彼此退火，那么这两个分子是“最低限度互补的”。类似地，如果两个分子在常规的“高严格”的条件下能互相杂交，具有足够的稳定性，从而允许它们保持彼此退火，那么这两个分子是“互补的”。Sambrook等人，In：Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，New York(1989)与Haymes等人，In：Nucleic AcidHybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985)描述了常规的严格条件。因而偏离完全互补性是允许的，只要这种偏离没有完全消除该分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子作为引物或探针，只需要在序列上充分互补，以在所采用的特定的溶剂和盐浓度下能够形成稳定的双链结构。
[0106] 如本文所用，基本上同源的序列是在高严格条件下与所比较的核酸序列的互补序列特异性杂交的核酸序列。本发明的核酸探针和引物可以在严格条件下与靶DNA序列杂交。术语“严格的杂交条件”是指在该条件下，探针或引物特异性地与靶序列杂交而不与非靶序列杂交，这可以根据经验确定。术语“严格的条件”是功能上的定义，涉及通过Sambrook等人，1989，9.52-9.55所述的具体的杂交程序，核酸探针与靶核酸(即，与目的特定核酸序列)的杂交。也参见Sambrook等人，19899.47-9.52，9.56-9.58；Kanehisa 1984 Nucl.Acids Res.12：203-213；Wetmur等人1968J.Mol.Biol.31：349-370。促进DNA杂交的合适的严格条件是，例如，大约45℃、6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着50℃、2.0x SSC洗涤，这是本领域的技术人员已知的，或可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从大约2.0xSSC、50℃的低严格条件到大约0.2x SSC、50℃的高严格条件中选择。另外，洗涤步骤中的温度可以从低严格条件的室温大约22℃增加到高严格条件的大约65℃。温度和盐都可以变化，或者，温度或盐浓度可以保持不变，而另一个变量发生变化。
[0107] 例如，可以在高严格条件下，在65℃和6x SSC、0.5％SDS、5xDenhardt’s、100μg/mL非特异性DNA(例如，超声处理的鲑精DNA)下，经0.5x SSC、0.5％SDS在65℃下洗涤，进行利用DNA或RNA探针或引物的杂交。
[0108] 本发明考虑：如果保持探针或引物与靶序列结合的特异性，可以使用较低的严格杂交条件，如较低的杂交和/或洗涤温度，来确认具有较低的序列相似性的相关的序列。因此，本发明的核苷酸序列可用于选择性地与DNA、RNA或cDNA片段的互补延伸形成双链分子的能力。
[0109] 核酸分子片段可以是任何大小的片段，且示例性的片段包括如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18所示的核酸序列及其互补序列的片段。一方面，片段可以是15-25、15-30、15-40、15-50、15-100、20-25、20-30、20-40、20-50、20-100、25-30、25-40、25-50、25-100、30-40、
30-50及30-100。另一方面，片段可以是大于10、15、20、25、30、35、40、50、100或250个核苷酸。
30-50及30-100。另一方面，片段可以是大于10、15、20、25、30、35、40、50、100或250个核苷酸。
[0110] 另外的遗传标记可以用来选择具有与本发明的SCN抗性相关的QTL的等位基因的植物。公共标记数据库的例子包括，例如：Soybase，美国农业部农业研究局(Agricultural Research Service，UnitedStates Department of Agriculture)。
[0111] 本发明的遗传标记包括“显性”或“共显性”标记。“共显性标记”揭示了存在两个或更多个等位基因(每个二倍体个体有两个)。“显性标记”揭示了仅存在一个等位基因。显性标记表型的存在(例如DNA带)指示一个等位基因在纯合或杂合条件下存在。不存在显性标记表型(例如不存在DNA带)仅证明了存在“某些其它”未限定的等位基因。在其中个体主要为纯合的且基因座主要为二态性的群体中，显性和共显性标记可能具有相同的价值。当群体变得更加杂合和多等位基因时，共显性标记通常比显性标记更能提供关于基因型的信息。
[0112] 在另一实施方案中，可以使用与本发明的QTL的等位基因遗传连锁或相关的标记，例如单序列重复标记(SSR)、AFLP标记、RFLP标记、RAPD标记、表型标记、同工酶标记、单核苷酸多态性(SNP)、插入或缺失(Indel)、单特征多态性(SFP，例如，如Borevitz等人2003Gen.Res.13：513-523所述)、微阵列转录谱、DNA衍生序列和RNA衍生序列。
[0113] 在一个实施方案中，用于判断是否存在遗传多态性的基于核酸的分析可用于在育种群体中选择种子。用于分析遗传多态性的多种遗传标记是可获得的，也是本领域技术人员公知的。该分析可用于选择包含遗传标记或与遗传标记连锁的基因、QTL、等位基因或基因组区域(单元型)。
[0114] 在此，核酸分析方法是本领域已知的，包括但不限于基于PCR的检测方法(例如TaqMan分析)、微阵列方法和核酸测序方法。在一个实施方案中，使用核酸扩增方法可有利于DNA、RNA或cDNA样品中多态性位点的检测。这些方法特异性地增加了横跨多态性位点或者包括该位点和位于其远侧或近侧的序列的多核苷酸的浓度。这些扩增的分子可以很容易地通过凝胶电泳、荧光检测方法或其它方式进行检测。
[0115] 一种实现这种扩增的方法利用了聚合酶链反应(PCR)(Mullis等人1986Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263-273；欧洲专利50,424；欧洲专利84,796；欧洲专利258,017；欧洲专利237,362；欧洲专利201,184；美国专利4,683,202；美国专利4,582,788；和美国专利4,683,194)，使用能够与以其双链形式限定多态性的近侧序列杂交的引物对。
[0116] 为了QTL作图，包括的标记应当是来源特征性的，以对随后的群体作出推断。SNP标记对于作图是理想的，因为特定的SNP等位基因源自特定物种的现存群体中的独立来源的可能性非常低。因此，SNP标记可用于示踪和协助QTL的渗入，特别是在单元型的情况下。
[0117] 可以通过基因作图模型建立另外的标记分子的遗传连锁，所述基因作图模型例如，但不限于，Lander等人(Lander等人，Genetics，121：185-199(1989))报道的侧翼标记模型，和区间作图(intervalmapping)，其基于其中所述的最大似然法，并用软件包MAPMAKER/QTL执行(Lincoln和Lander，Mapping Genes ControllingQuantitative Traits Using MAPMAKER/QTL，Whitehead Institute forBiomedical Research，Massachusetts，(1990))。另外的软件包括Qgene，Version 2.23(1996)，Department of Plant Breeding and Biometry，266Emerson Hall，Cornell University，Ithaca，NY。使用Qgene软件是一种特别优选的方法。
[0118] 计算存在标记的最大似然估计值(MLE)，以及假设没有QTL效应的MLE，以避免假阳性。然后计算优势率的log10(LOD)∶LOD＝log10(存在QTL的MLE/假定没有连锁QTL的MLE)。LOD得分基本上指示，假定存在QTL，相对于不存在QTL，数据增大的可能性有多大。对于给定的置信度，比如95％，为了避免假阳性的LOD阈值取决于标记的数量和基因组的长度。Lander等人(1989)说明了显示LOD阈值的曲线图，且Arús和Moreno-González，Plant Breeding，Hayward，Bosemark，Romagosa(编)Chapman & Hall，London，第314-331页(1993)有进一步的描述。
[0119] 可以使用另外的模型。已经报导了对于区间作图的许多修改和可供选择的方法，包括使用非参数法(Kruglyak等人，1995 Genetics，139：1421-1428)。也可以使用多元回归方法或模型，其中，在大量标记上对性状进行回归(Jansen，Biometrics in Plant Breed，van Oijen，Jansen(编)Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia SectionBiometrics in Plant Breeding，The Netherlands，第116-124页(1994)；Weber和 Wricke，Advances in Plant Breeding，Blackwell，Berlin，16(1994))。Jansen 等人 (Jansen 等 人，1994Genetics，136：1447-1455) 和 Zeng(Zeng，1994Genetics 136：1457-1468)报道了组合了区间作图与回归分析的程序，由此将表型回归到给定的标记区间的单个假定的QTL上，且同时回归到作为′辅助因素′的标记数量上。一般来说，辅助因素的使用减少了估计的QTL位置的偏差和抽样误差(Utz和Melchinger，Biometrics in Plant Breeding，van Oijen，Jansen( 编 )Proceedings of theNinth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding，TheNetherlands，第195-204页(1994))，从而提高QTL作图的精度和效率(Zeng 1994)。这些模型可以扩展到多环境实验，以分析基因型-环境的相互作用(Jansen等人，1995 Theor.Appl.Genet.91：33-3)。
[0120] 合适的作图群体的选择对于图谱的构建是重要的。合适的作图群体的选择取决于所用的标记系统的类型(Tanksley等人，Molecularmapping in plant chromosomes.chromosome structure and function：Impact of new concepts J.P.Gustafson 和R.Appels(编).Plenum Press，New York，第157-173页(1988))。必须考虑在作图群体中所用的亲本的来源(适应的相对于外来的)。染色体配对和重组率在远缘杂交(适应的×外来的)中会受到严重干扰(抑制)，且一般产生大大降低的连锁距离。与近缘杂交(适应的×适应的)的后代相比，远缘杂交通常会提供具有相对较大的多态性阵列的分离群体。
[0121] F2群体是自交的第一代。通常一个F1植物自交，产生所有基因都以孟德尔(1∶2∶1)方式分离的群体。使用共显性标记系统从完全分类的F2群体中获得最大遗传信息(Mather，Measurement of Linkage inHeredity：Methuen and Co.，(1938))。在显性标记的情况中，需要后代测试(例如F3，BCF2)来确定杂合子，从而使其等同于完全分类的F2群体。但是由于后代测试的成本和时间原因，这一程序通常是不可行的。F2个体的后代测试通常在其中表型不能一贯地反映基因型(例如抗病性)或性状表达受QTL控制的图谱构建中使用。来自后代测试群体(例如F3或BCF2)的分离数据可以在图谱构建中使用。然后可以基于标记-性状图谱关联(F2，F3)，对杂交后代进行标记辅助的选择，其中连锁群没有被重组事件完全分离(即最大不平衡)。
[0122] 重组近交系(RIL)(遗传相关的系，通常是＞F5，从继续自交的F2系向纯合性发展)可以作为作图群体使用。通过使用RIL可以将从显性标记获得的信息最大化，因为所有的基因座都是纯合的或接近纯合。在紧密连锁的条件下(即，大约＜10％的重组)，对于每个个体，在RIL群体中评估的显性和共显性标记比在回交群体中的每个标记类型提供更多的信息(Reiter等人，1992Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89：1477-1481)。然而，由于标记之间的距离增大(即，基因座变得更加独立)，RIL群体中的信息明显减少。
[0123] 回交群体(例如，通过成功的品种(轮回亲本)和携带前者不具有的性状的另一品种(供体亲本)之间杂交产生)可作为作图群体来使用。可以与轮回亲本进行一系列回交，以恢复大部分其需要的性状。因此，产生由几乎类似于轮回亲本的个体组成的群体，但每个个体携带不同量的或嵌合的来自供体亲本的基因组区域。如果轮回亲本中的所有基因座都是纯合的，且供体亲本和轮回亲本具有截然不同的多态性标记等位基因，回交群体可以用于对显性标记作图(Reiter等人1992)。使用共显性或显性标记从回交群体获得的信息少于从F2群体获得的信息，因为从每株植物采集一个而不是两个重组配子。然而，与RIL相比，回交群体提供更多的信息(在低标记饱和度时)，因为RIL群体中的连锁的基因座之间的距离增加(即，大约0.15％的重组)。增加的重组对于紧密连锁的分析是有益的，但在构建具有低标记饱和度的图谱时可能是不需要的。
[0124] 为了产生除了渗入的性状或基因组区域之外在遗传组成上几乎相同的个体的阵列，通过多次回交产生的近等基因系(NIL)可用作作图群体。在用NIL作图时，预计仅有一部分多态性基因座将定位于选定的区域。
[0125] 集群分离分析法(BSA)是为快速鉴定标记和目的性状之间的连锁而开发的方法(Michelmore等人1991 Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：9828-9832)。在BSA中，从一次杂交产生的分离群体中抽取两个集群DNA样品。这些集群包含特定性状(对特定病害具有抗性或敏感性)或基因组区域相同但在非连锁的区域是任意的(即，杂合的)个体。与靶区域不连锁的区域在BSA中的许多个体的集群样品之间没有差异。
[0126] 本发明的植物可以是育种程序的部分或从育种程序产生。育种方法的选择取决于植物繁殖的模式、被改进的性状的遗传性和商业使用的栽培种的类型(例如F1杂种栽培种、纯系栽培种等)。栽培种是有意建立或选择并通过选育维持的植物物种的品种或变种。
[0127] 选择的用于选育本发明植物的非限定性方法如下所述。可对任何杂交的后代使用标记辅助选择(MAS)来提高育种程序。应当理解本发明的核酸标记可在MAS(育种)程序中使用。应当进一步理解任何商业和非商业栽培种可在育种程序中使用。例如发芽活力、生长活力、应激耐受性、抗病性、分枝、开花、结籽、种子大小、种子密度、可直立性和脱粒性(threshability)等因素通常将会决定其选择。
[0128] 对于高遗传性的性状而言，在单个位点评价的优良个体植物的选择将是有效的，而对于低遗传性的性状而言，选择应该基于对相关植物家族的重复评价中获得的平均值。普遍的选择方法通常包括谱系选择、改良的谱系选择、混合选择(mass selection)和轮回选择。在一个优选方面，采用回交或轮回育种程序。
[0129] 遗传的复杂性影响了育种方法的选择。可以使用回交育种将高遗传性性状的一个或几个有利的基因转入理想的栽培种中。该方法已经广泛用于选育抗病性栽培种。利用不同的轮回选择技术改良由多个基因控制的数量遗传性状。
[0130] 可以测试育种系，并将其与代表商业目标地区的环境中的适当的标准比较两代或更多代。最佳品系是新的商业栽培种的候选系；那些缺乏性状的品系可用作亲本来产生用于进一步选择的新群体。
[0131] 谱系育种和轮回选择育种方法可用于从育种群体发展栽培种。育种程序将来自两个或更多个栽培种或不同的广泛来源的理想性状组合成育种库，通过自交和选择理想的表型从该育种库发展栽培种。可以评价新的栽培种以确定哪些具有商业潜力。
[0132] 回交育种已被用于将简单遗传的、高度遗传性的性状的基因转入作为轮回亲本的理想的纯合栽培种或近交系中。待转移的性状的来源被称为供体亲本。最初的杂交之后，选择具有供体亲本的表型的个体，并与轮回亲本反复杂交(回交)。得到的植物预期具有轮回亲本(例如栽培种)的大多数属性并且另外还具有从供体亲本转移来的希望的性状。
[0133] 单粒传法严格意义上来说是指种植分离群体，每个植物收获一个种子样品，并且使用单种子样品来种植下一代。当群体已从F2发展到希望的近交水平时，品系所来源的植物将会分别追溯到不同的F2个体。由于某些种子不能发芽或者某些植物不能产生至少一个种子，所以群体中植物的数目逐代减少。因此，当世代进化完成时，并不是群体中最初取样的所有F2植物都有后代代表。
[0134] 通常用于不同的性状和农作物的其它育种方法的描述可见于以下几本 参 考 书 的 一 种 中 (Allard，“Principles of Plant Breeding，”John Wiley& Sons，NY，U.of CA，Davis，CA，50-98，1960；Simmonds，“Principlesof crop improvement，”Longman，Inc.，NY，369-399，1979；Sneep andHendriksen，“Plant Breeding perspectives，”Wageningen(ed)，Center forAgricultural Publishing and Documentation，1979；Fehr，In：Soybeans：Improvement，Production and Uses，2nd Edition，Manograph.，16：249，1987；Fehr，“Principles of variety development，”Theory and Technique，(Vol.1)和Crop Species Soybean(Vol.2)，Iowa State Univ.，MacmillanPub.Co.，NY，360-376，1987)。
[0135] 传统的QTL作图的替代方法包括通过相对于个体标记对单元型作图来达到更高的分辨率(Fan等人2006Genetics 172：663-686)。这种方法跟踪被称为单元型的DNA模块，其由多态性标记所定义，它被假定为在作图群体中是谱系相同的。这一假设导致较大的有效样本量，提供更大的QTL的分辨率。用于确定表型与基因型(在这种情况下为单元型)之间的相关性的统计学显著性的方法可以通过本领域已知的任何统计学检验并且使用任何公认的需要的统计学显著性阈值来确定。特定的方法和显著性阈值的应用是本领域的普通技术人员所熟知的。
[0137] 如本文所用的“核酸分子”，无论是自然产生的分子还是以其它方式“基本上纯化的”分子，如果需要的话，指的是与基本上全部其它与其天然状态正常相关的分子分离的分子。更优选地，基本上纯化的分子是制剂中存在的主要的种类。基本上纯化的分子可以超过60％、优选75％、更优选90％且最优选95％不含天然混合物中存在的其它分子(不包括溶剂)。术语“基本上纯化的”并非意在包括以其天然状态存在的分子。
[0138] 本发明的材料优选地是“生物活性的”，无论是在结构属性方面，如核酸与另一种核酸分子杂交的能力，还是在蛋白质被抗体结合(或与另一种分子竞争这种结合)的能力方面。或者，这种属性可以是催化性的，因此涉及该材料介导化学反应或应答的能力。
[0139] 本发明的材料也可以是重组的。如本文所用的术语重组是指通过核酸分子的人工操作间接产生的任何材料(例如，DNA、肽等)。
[0140] 本发明的材料可以用便于检测该材料的试剂标记，例如荧光标记(Prober等人，1987Science 238：336-340；Albarella等人，欧洲专利144914)、化学标记(Sheldon等人，美国专利4,582,789；Albarella等人，美国专利4,563,417)、修饰的碱基(Miyoshi等人，欧洲专利119448)。
[0141] 现已一般性地描述了本发明，通过参考以下实施例会更容易理解本发明，该实施例以举例方式提供，并且除非另外指出，不限制本发明。实施例
[0142] 实施例1：评价SCN抗性和产量的方法
[0143] 在温室中基于对特定SCN分离种的应答评价大豆系的SCN抗性。SCN小种根据4种不同的系Peking、Pickett、PI88788和PI90763被命名为小种1至16，其中3个是最常见的小种。因此，仅根据温室实验，确定给定的商业品种对任何给定的SCN小种或生物型具有抗性或敏感性。SCN的田间群体是多种多样的和不均一的。在田间的小块土地中通常可以发现许多生物型或小种，它们在田间的分布非常不均一。这是在田间评价SCN病害的诸多困难之一。迄今为止，还没有建立在田间评价SCN的方法。现发展了田间筛选试验来评价SCN抗性以及产量。
[0144] 开发了产生高及低SCN压力环境并在整个季节中和年与年之间保持一致的压力的方法。确定适合建立明显不同的高和低SCN压力的样地的地点。这些地点是基于SCN病害压力、大豆耕种史和大豆成熟带而确定的。在每个地点，确定两块样地，并根据已有的SCN病害压力指定为高和低侵扰样地。SCN群体密度通过从土壤中提取胞囊来确定。SCN卵在显微镜下计数。高侵扰样地具有中到高SCN侵扰，多于500个卵/100cc土壤。低侵扰样地具有低SCN侵扰，小于500个卵/100cc土壤。该地点的SCN的生物型使用任何标准测试如小种或大豆胞囊线虫(HG)型测试来分析。例如，HG测试检测具有SCN抗性基因的SCN群体“HG型指示”大豆系的繁殖。该指示系为Peking(指示系1)、PI 88788(指示系2)、PI90763(指示系3)、PI 437654(指示系4)、PI209332(指示系5)、PI 89772(指示系6)和Cloud(指示系7)。在其上发生SCN繁殖升高的HG型指示大豆系的数目是HG型命名中的数字。例如，HG型2.4SCN群体分别在HG型指示系2和4一PI88788和PI437654上具有升高的繁殖。该测试在监测的具有控制的温度和湿度条件的环境下进行。30天后，对7个HG型指示大豆系的根上的雌性数目进行计数，并且与在标准敏感大豆系上形成的雌性数目进行比较。
[0145] 在确定一个地点的SCN密度和生物型后，将样地再分为四个四分之一份。每年仔细监测每个地点每个田地的每个四分之一份，以防止热点和冷点的形成。
[0146] 在高侵扰田地中(图1)，第1个四分之一份用作第一年的测试样地，并且种植测试株。除草剂和SCN-敏感的大豆用作填闲植物，种植到其余的不用于测试的样地上。这样，SCN病害压力得以保持。第2和第3个四分之一份(维持样地)种植除草剂和SCN-敏感的大豆，以维持高SCN病害压力。第4个四分之一份种植非宿主作物如玉米，以防止可能由于连续种植SCN-敏感的大豆而发生的SCN群体崩溃。第4个四分之一份是下一个季节的测试样地，重要的是维持SCN病害压力和连续种植SCN-敏感的大豆引起的崩溃或SCN压力突然下降。图1显示了各四分之一份的轮种。
[0147] 在低侵扰田地中(图2)，第1个四分之一份用作第一年的测试样地，第3-4个四分之一份(维持样地)用于“播种和喷洒”法，以减少这些样地中的SCN群体。除草剂和SCN-敏感的品种用作这些四分之一份的填闲作物和填充作物。大豆“填闲作物”法促进了胞囊的孵化并恰好在它们达到成熟前清除线虫，从而消耗土壤中的原有SCN群体。为了清除和维持低SCN水平，种植一系列除草剂敏感的和SCN敏感的大豆“填闲作物”。耕作田地并种植高密度的种子(除草剂和SCN敏感性品种)。在出芽后大约10天(DAE)喷洒除草剂，这时大致处于v1-V2期。喷洒后大约8天或者当植物完全死亡时耕作土壤，以避免对下一轮敏感性大豆品种种植的影响。应用除草剂后立即种植由于根接触和除草剂转移减少了直立数。该循环在该季节中重复3-4次，以使SCN减少达到最大。在生长季节结果时，耕作土壤并种植另一作物，如燕麦或冬小麦，以克服“休耕综合征”。休耕综合征是由于土壤中有益的菌根真菌被消耗而引起的。低或高的SCN压力在整个生长季节和下一个春季在样地中一致(表1-3)。
[0148] 表1：整个生长季节中的SCN卵密度
[0149]
[0150] 表2：整个生长季节中的SCN卵密度
[0151]
[0152] 表3：整个生长季节和下一个春季的SCN卵密度
[0153]
[0154] 实施例2：利用高和低侵扰SCN苗圃评价产量抑制和增益
[0155] 随着连续强调开发和改良用于商业大豆种子计划的防御性状，越来越需要田间测试来评价植物对SCN和其它线虫的应答。田间测试可以帮助标记开发、证实和测试基本生态学假说，以进一步理解影响抗性表达的基本生物学参数。田间研究允许较大的样地、种子增多、不同的栽培实践和与其它在田间常见的微生物和土壤因素的天然相互作用。田间测试也需要理解植物寄生线虫存在于对宿主、天气和气候、土壤物理性质、其它微动物群和微生物群落持续响应的动态多特异性群体中。具有高和低SCN压力的明显不同的苗圃(即高和低侵扰田地)有利于鉴定SCN抗性种质中的产量不足和增益。
[0156] 开发了三个NIL群体：Accomac x MV0013、Accomac x MV0014和Accomac x MV0024。Accomac是SCN抗性的来源。Accomac在其谱系中具有抗性来源‘Forrest’。根据是否存在来自PI88788的rhg1、来自Forrest的rhg1、和来自Forrest的Rhg4筛查分离群体。rhg1的单元型在表5中描述。通过确定rhg1内的多态性开发SNP标记。使用SNP标记根据抗性的来源将后代分为四个类别。R8具有来自于PI88788的rhg1而没有Rhg4。R8RP具有来源于PI88788的rhg1和来源于Forrest的Rhg4。RP具有来源于Forrest的rhg1而没有Rhg4。RPRP具有来源于Forrest的rhg1和来源于Forrest的Rhg4。在温室试验中评价对小种1、3、5、16的抗性(表4)。进行温室试验来证实基因型的抗性水平。该研究评价各种基因组合的抗性。RPRP具有最广泛的抗性和最强的抗性。只具有来源于Forrest的rhg1的RP对小种1和3敏感，而对小种5具有中度抗性。
[0157] 表4：SCN抗性品种的四个类别(R8、R8RP、RP和RPRP)对小种1、3、4和16的抗性反应
[0158]
[0159] *N/A＝不适用，MR＝中度抗性，MS＝中度敏感的，R＝抗性，S＝敏感的
[0160] 表5：rhg1的单元型
[0161]
[0162] *R＝抗性，S＝敏感的
[0163] 在具有来源于Peking的rhg1和Rhg4的植物中观察到最强的SCN抗性。高和低侵扰苗圃用来评价产量影响和SCN抗性。具有来源于Peking的‘Forrest’的rhg1和Rhg4的植物比只具有来源于Peking的植物rhg1或来源于PI88788的rhg1的植物系具有更高的产量(图3)。商业上可以购到的SCN抗性品种比在高SCN压力条件下耕种的SCN敏感性品种具有更高的产量，但是比在低SCN压力条件下耕种的敏感性品种具有通常较低的产量。
[0164] 实施例3：使用Forrest-型SCN抗性证实产量等同和/或增加
[0165] 通过MV0046与MV0045杂交开发了一个群体。MV0045是来自于‘Forrest’的抗性的来源。针对rhg1单元型和Rhg4的存在对后代进行基因型分型。将后代种植在高侵扰和低侵扰田地中，评价产量和SCN抗性。具有来自Peking的Forrest-型的rhg1和Rhg4的后代植物比在高或低SCN压力下种植的敏感性品种具有更高的产量，提示具有Forrest-型SCN抗性的大豆与SCN敏感性大豆相比具有等同或增加的产量(表6；图4)。在低侵扰条件下，具有Forrest-型SCN抗性的大豆具有相对于敏感性大豆为117％的产量。在高侵扰条件下，具有Forrest-型SCN抗性的大豆具有相对于敏感性大豆为114％的产量。
[0166] 表6：在低侵扰和高侵扰田地中，具有Forrest-型rhg1和Rhg4的SCN抗性大豆与其它SCN敏感性大豆相比具有产量优势
[0167]
[0168]
[0169] *MR＝中度抗性，R＝抗性，S＝敏感的。
[0170] 实施例4：利用与线虫抗性和产量相关的分子标记促进性状的渗入
[0171] 如果一个品种具有理想的性状，如线虫抗性和产量，则可以通过杂交将它容易地转移到其它品种中。与线虫抗性和与线虫侵扰水平无关的至少与敏感性植物产量等同相关的分子标记，允许育种者使用具有农艺学优良表型的亲本进行杂交，基于该性状的存在选择该杂交的种子，随后根据农艺学优良表型进行选择。本发明的范围内包括利用方法和组合物进行线虫抗性和与线虫侵扰水平无关的产量的优选性状整合。本发明人可以想到，本发明可用于开发具有线虫抗性和与线虫侵扰水平无关的高产量的商业品种。
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