首页 / 专利库 / 专利权 / 国际局 / 抗双整联蛋白抗体、组合物、方法和用途

抗双整联蛋白抗体、组合物、方法和用途

阅读：298发布：2021-06-23

专利汇可以提供抗双整联蛋白抗体、组合物、方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及至少一种新颖的抗双整联蛋白 抗体 ，包括编码至少一种抗双整联蛋白抗体的分离核酸、双整联蛋白、载体、宿主细胞、转基因动物或 植物 、及其制备方法和用途。，下面是抗双整联蛋白抗体、组合物、方法和用途专利的具体信息内容。

1.至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体，包含至少一个 包含SEQ ID NO：7或8的可变区。
2.根据权利要求1的双整联蛋白抗体，其中所述抗体与双整联 蛋白以选自至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M或至少10-12M中的至 少一种的亲和性结合。
3.根据权利要求1的双整联蛋白抗体，其中所述抗体基本中和 至少一种双整联蛋白的至少一种活性。
4.一种编码至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体的分离 核酸，所述抗体具有至少一个包含SEQ ID NO：7或8的可变区。
5.一种包含根据权利要求4的分离核酸的分离核酸载体。
6.一种包含根据权利要求5的分离核酸的原核或真核宿主细胞。
7.根据权利要求6的宿主细胞，其中所述宿主细胞为至少一种 选自下组的细胞：COS-1，COS-7，HEK293，BHK21，CHO，BSC-1，Hep G2， 653，SP2/0，293，HeLa，骨髓瘤，或淋巴瘤细胞，或其任意衍生、永 生化或转化的细胞。
8.一种产生至少一种抗双整联蛋白抗体的方法，包括在体外、 体内或原位条件下翻译权利要求4的核酸，使得双整联蛋白抗体以可 检测或可回收的量表达。
9.一种包含至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体和至少 一种药学可接受载体或稀释剂的组合物，所述抗体具有至少一个包含 SEQ ID NO：7或8的可变区。
10.根据权利要求9的组合物，进一步包含至少一种包含有效量 的选自下组的至少一种化合物或蛋白的组合物：至少一种可检测标记 或报道分子、TNF拮抗剂、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、非甾 体类抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经 肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合成 类固醇、促红细胞生成素、疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激 素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、刺激剂、 抗哮喘药、β激动剂、吸入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子 或细胞因子拮抗剂。
11.一种特异性结合至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体 的抗独特型抗体或片段，所述抗双整联蛋白抗体具有至少一个包含SEQ ID NO：7或8的可变区。
12.一种诊断或治疗细胞、组织、器官、或动物中的双整联蛋白 相关状况的方法，包括(a)使所述细胞、组织、器官、或动物接触或 给药于所述细胞、组织、器官、或动物包含有效量的至少一种分离的 哺乳动物抗双整联蛋白抗体的组合物，所述抗体具有至少一个包含SEQ ID NO：7或8的可变区。
13.根据权利要求12的方法，其中所述有效量为0.001-50mg/kg 所述细胞、组织、器官、或动物。
14.根据权利要求12的方法，其中所述接触或给药是通过选自 下组的至少一种方式进行的：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、 支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、 结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、 腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱 内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴道、直肠、颊、 舌下、鼻内或经皮。
15.根据权利要求12的方法，进一步包括在所述(a)接触或给药 之前、同时或之后给予至少一种包含有效量的选自下组的至少一种化 合物或蛋白的组合物：至少一种可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、 抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、非甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛 药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、 抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、 疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性 药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、刺激剂、抗哮喘药、β激动剂、吸 入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
16.一种医学设备，包含至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白 抗体，所述抗体具有至少一个包含SEQ ID NO：7或8的可变区，其 中所述设备适于所述至少一种抗双整联蛋白抗体的接触或给药，该接 触或给药是通过选自下组的至少一种方式进行的：肠胃外、皮下、肌 内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔 内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨 内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、 肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注 射、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮。
(国际公开时缺页)
27.根据权利要求26的宿主细胞，其中所述宿主细胞为至少一 种选自下组的细胞：COS-1，COS-7，HEK293，BHK21，CHO，BSC-1，Hep G2，653，SP2/0，293，HeLa，骨髓瘤，或淋巴瘤细胞，或其任意衍生、 永生化或转化的细胞。
28.一种产生至少一种抗双整联蛋白抗体的方法，包括在体外、 体内或原位条件下翻译权利要求24的核酸，使得双整联蛋白抗体以 可检测或可回收的量表达。
29.一种包含至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体和至少 一种药学可接受载体或稀释剂的组合物，所述抗体具有(i)SEQ ID NOS： 1，2和3的所有重链CDR氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NOS：4，5和 6的所有轻链CDR氨基酸序列。
30.根据权利要求29的组合物，进一步包含至少一种包含有效 量的选自下组的至少一种化合物或蛋白的组合物：至少一种可检测标 记或报道分子、TNF拮抗剂、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、非 甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神 经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合 成类固醇、促红细胞生成素、疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长 激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、刺激 剂、抗哮喘药、β激动剂、吸入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞 因子或细胞因子拮抗剂。
31.一种特异性结合至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体 的抗独特型抗体或片段，所述抗双整联蛋白抗体具有(i)SEQ ID NOS： 1，2和3的所有重链CDR氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NOS：4，5和 6的所有轻链CDR氨基酸序列。
32.一种诊断或治疗细胞、组织、器官、或动物中的双整联蛋白 相关状况的方法，包括(a)使所述细胞、组织、器官、或动物接触或 给药于所述细胞、组织、器官、或动物包含有效量的至少一种分离的 哺乳动物抗双整联蛋白抗体的组合物，所述抗体具有(i)SEQ ID NOS： 1，2和3的所有重链CDR氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NOS：4，5和 6的所有轻链CDR氨基酸序列。
33.根据权利要求32的方法，其中所述有效量为0.001-50mg/kg 所述细胞、组织、器官、或动物。
34.根据权利要求32的方法，其中所述接触或给药是通过选自 下组的至少一种方式进行的：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、 支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、 结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、 腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱 内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴道、直肠、颊、 舌下、鼻内或经皮。
35.根据权利要求32的方法，进一步包括在所述(a)接触或给药 之前、同时或之后给予至少一种包含有效量的选自下组的至少一种化 合物或蛋白的组合物：至少一种可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、 抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、非甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛 药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、 抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、 疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性 药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、刺激剂、抗哮喘药、β激动剂、吸 入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
36.一种医学设备，包含至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白 抗体，所述抗体具有(i)SEQ ID NOS：1，2和3的所有重链CDR氨基 酸序列；或(ii)SEQ ID NOS：4，5和6的所有轻链CDR氨基酸序列， 其中所述设备适于所述至少一种抗双整联蛋白抗体的接触或给药，该 接触或给药是通过选自下组的至少一种方式进行的：肠胃外、皮下、 肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体 腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、 骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、 肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注 射、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮。
37.一种用于人药用或诊断用途的制品，包括包装材料和一个容 器，其中包含至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体的溶液或冷 冻干燥形式，所述抗体具有(i)SEQ ID NOS：1，2和3的所有重链CDR 氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NOS：4，5和6的所有轻链CDR氨基酸 序列。
38.权利要求37的制品，其中所述容器是肠胃外、皮下、肌内、 静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、 小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、 盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、 视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴 道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮递送设备或系统的成分。
39.一种产生至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体的方 法，所述抗体具有(i)SEQ ID NOS：1，2和3的所有重链CDR氨基酸 序列；或(ii)SEQ ID NOS：4，5和6的所有轻链CDR氨基酸序列， 该方法包括提供能够表达可回收量的所述抗体的宿主细胞或转基因动 物或转基因植物或植物细胞。
40.根据权利要求39的方法产生的至少一种抗双整联蛋白抗体。
41.至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体，包含具有SEQ ID NOS：1，2，3，4，5或6的至少一个的氨基酸序列的至少一个重链或 轻链CDR。
42.根据权利要求41的双整联蛋白抗体，其中所述抗体与双整 联蛋白以选自至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M或至少10-12M中的 至少一种的亲和性结合。
43.根据权利要求41的双整联蛋白抗体，其中所述抗体基本中 和至少一种双整联蛋白的至少一种活性。
44.一种编码至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体的分离 核酸，所述抗体含有具有SEQ ID NOS：1，2，3，4，5或6的至少一 个的氨基酸序列的至少一个重链或轻链CDR。
45.一种包含根据权利要求44的分离核酸的分离核酸载体。
46.一种包含根据权利要求45的分离核酸的原核或真核宿主细 胞。
47.根据权利要求46的宿主细胞，其中所述宿主细胞为至少一 种选自下组的细胞：COS-1，COS-7，HEK293，BHK21，CHO，BSC-1，Hep G2，653，SP2/0，293，HeLa，骨髓瘤，或淋巴瘤细胞，或其任意衍生、 永生化或转化的细胞。
48.一种产生至少一种抗双整联蛋白抗体的方法，包括在体外、 体内或原位条件下翻译权利要求44的核酸，使得双整联蛋白抗体以 可检测或可回收的量表达。
49.一种包含至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体和至少 一种药学可接受载体或稀释剂的组合物，所述抗体含有具有SEQ ID NOS： 1，2，3，4，5或6的至少一个的氨基酸序列的至少一个重链或轻链 CDR。
50.根据权利要求49的组合物，进一步包含至少一种包含有效 量的选自下组的至少一种化合物或蛋白的组合物：至少一种可检测标 记或报道分子、TNF拮抗剂、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、非 甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神 经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合 成类固醇、促红细胞生成素、疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长 激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、刺激 剂、抗哮喘药、β激动剂、吸入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞 因子或细胞因子拮抗剂。
51.一种特异性结合至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体 的抗独特型抗体或片段，所述抗双整联蛋白抗体含有具有SEQ ID NOS： 1，2，3，4，5或6的至少一个的氨基酸序列的至少一个重链或轻链 CDR。
52.一种诊断或治疗细胞、组织、器官、或动物中的双整联蛋白 相关状况的方法，包括(a)使所述细胞、组织、器官、或动物接触或 给药于所述细胞、组织、器官、或动物包含有效量的至少一种分离的 哺乳动物抗双整联蛋白抗体的组合物，所述抗体含有具有SEQ ID NOS： 1，2，3，4，5或6的至少一个的氨基酸序列的至少一个重链或轻链 CDR。
53.根据权利要求52的方法，其中所述有效量为0.001-50mg/kg 所述细胞、组织、器官、或动物。
54.根据权利要求52的方法，其中所述接触或给药是通过选自 下组的至少一种方式进行的：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、 支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、 结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、 腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱 内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴道、直肠、颊、 舌下、鼻内或经皮。
55.根据权利要求52的方法，进一步包括在所述(a)接触或给药 之前、同时或之后给予至少一种包含有效量的选自下组的至少一种化 合物或蛋白的组合物：至少一种可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、 抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、非甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛 药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、 抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、 疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性 药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、刺激剂、抗哮喘药、β激动剂、吸 入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
56.一种医学设备，包含至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白 抗体，所述抗体含有具有SEQ ID NOS：1，2，3，4，5或6的至少一 个的氨基酸序列的至少一个重链或轻链CDR，其中所述设备适于所述 至少一种抗双整联蛋白抗体的接触或给药，该接触或给药是通过选自 下组的至少一种方式进行的：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、 支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、 结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、 腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱 内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴道、直肠、颊、 舌下、鼻内或经皮。
57.一种用于人药用或诊断用途的制品，包括包装材料和一个容 器，其中包含至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体的溶液或冷 冻干燥形式，所述抗体包含具有SEQ ID NOS：1，2，3，4，5或6的 至少一个的氨基酸序列的至少一个重链或轻链CDR。
58.权利要求57的制品，其中所述容器是肠胃外、皮下、肌内、 静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、 小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、 盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、 视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴 道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮递送设备或系统的成分。
59.一种产生至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体的方 法，所述抗体含有具有SEQ ID NOS：1，2，3，4，5或6的至少一个 的氨基酸序列的至少一个重链或轻链CDR，该方法包括提供能够表达 可回收量的所述抗体的宿主细胞或转基因动物或转基因植物或植物细 胞。
60.根据权利要求59的方法产生的至少一种抗双整联蛋白抗体。
61.至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体，所述抗体与包 含具有SEQ ID NOS：1，2，3，4，5或6的至少一个的氨基酸序列的 至少一个重链或轻链CDR的抗体结合双整联蛋白的相同区域。
62.根据权利要求61的双整联蛋白抗体，其中所述抗体与双整 联蛋白以选自至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M或至少10-12M中的 至少一种的亲和性结合。
63.根据权利要求61的双整联蛋白抗体，其中所述抗体基本中 和至少一种双整联蛋白的至少一种活性。
64.一种编码至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体的分离 核酸，所述抗体与包含具有SEQ ID NOS：1，2，3，4，5或6的至少 一个的氨基酸序列的至少一个重链或轻链CDR的抗体结合双整联蛋白 的相同区域。
65.一种包含根据权利要求64的分离核酸的分离核酸载体。
66.一种包含根据权利要求65的分离核酸的原核或真核宿主细 胞。
67.根据权利要求66的宿主细胞，其中所述宿主细胞为至少一 种选自下组的细胞：COS-1，COS-7，HEK293，BHK21，CHO，BSC-1，Hep G2，653，SP2/0，293，HeLa，骨髓瘤，或淋巴瘤细胞，或其任意衍生、 永生化或转化的细胞。
68.一种产生至少一种抗双整联蛋白抗体的方法，包括在体外、 体内或原位条件下翻译权利要求64的核酸，使得双整联蛋白抗体以 可检测或可回收的量表达。
69.一种包含至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体和至少 一种药学可接受载体或稀释剂的组合物，所述抗体与包含具有SEQ ID NOS：1，2，3，4，5或6的至少一个的氨基酸序列的至少一个重链或 轻链CDR的抗体结合双整联蛋白的相同区域。
70.根据权利要求69的组合物，进一步包含至少一种包含有效 量的选自下组的至少一种化合物或蛋白的组合物：至少一种可检测标 记或报道分子、TNF拮抗剂、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、非 甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神 经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合 成类固醇、促红细胞生成素、疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长 激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、刺激 剂、抗哮喘药、β激动剂、吸入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞 因子或细胞因子拮抗剂。
71.一种特异性结合至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体 的抗独特型抗体或片段，所述抗双整联蛋白抗体与包含具有SEQ ID NOS： 1，2，3，4，5或6的至少一个的氨基酸序列的至少一个重链或轻链 CDR的抗体结合双整联蛋白的相同区域。
72.一种诊断或治疗细胞、组织、器官、或动物中的双整联蛋白 相关状况的方法，包括(a)使所述细胞、组织、器官、或动物接触或 给药于所述细胞、组织、器官、或动物包含有效量的至少一种分离的 哺乳动物抗双整联蛋白抗体的组合物，所述抗体与包含具有SEQ ID NOS： 1，2，3，4，5或6的至少一个的氨基酸序列的至少一个重链或轻链 CDR的抗体结合双整联蛋白的相同区域。
73.根据权利要求72的方法，其中所述有效量为0.001-50mg/kg 所述细胞、组织、器官、或动物。
74.根据权利要求72的方法，其中所述接触或给药是通过选自 下组的至少一种方式进行的：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、 支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、 结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、 腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱 内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴道、直肠、颊、 舌下、鼻内或经皮。
75.根据权利要求72的方法，进一步包括在所述(a)接触或给药 之前、同时或之后给予至少一种包含有效量的选自下组的至少一种化 合物或蛋白的组合物：至少一种可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、 抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、非甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛 药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、 抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、 疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性 药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、刺激剂、抗哮喘药、β激动剂、吸 入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
76.一种医学设备，包含至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白 抗体，所述抗体与包含具有SEQ ID NOS：1，2，3，4，5或6的至少 一个的氨基酸序列的至少一个重链或轻链CDR的抗体结合双整联蛋白 的相同区域，其中所述设备适于所述至少一种抗双整联蛋白抗体的接 触或给药，该接触或给药是通过选自下组的至少一种方式进行的：肠 胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨 内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝 内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、 肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、 膀胱内、快速注射、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮。
77.一种用于人药用或诊断用途的制品，包括包装材料和一个容 器，其中包含至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体的溶液或冷 冻干燥形式，所述抗体与包含具有SEQ ID NOS：1，2，3，4，5或6 的至少一个的氨基酸序列的至少一个重链或轻链CDR的抗体结合双整 联蛋白的相同区域。
78.权利要求77的制品，其中所述容器是肠胃外、皮下、肌内、 静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、 小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、 盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、 视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴 道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮递送设备或系统的成分。
79.一种产生至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体的方 法，所述抗体与包含具有SEQ ID NOS：1，2，3，4，5或6的至少一 个的氨基酸序列的至少一个重链或轻链CDR的抗体结合双整联蛋白的 相同区域，该方法包括提供能够表达可回收量的所述抗体的宿主细胞 或转基因动物或转基因植物或植物细胞。
80.根据权利要求79的方法产生的至少一种抗双整联蛋白抗体。
81.至少一种分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体，包含至少一种 人CDR，其中所述抗体特异性结合于包含SEQ ID NO：9的至少1-3 个氨基酸至完整氨基酸序列的至少一种表位。
82.根据权利要求81的双整联蛋白抗体，其中所述抗体与双整 联蛋白以选自至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M或至少10-12M中的 至少一种的亲和性结合。
83.根据权利要求81的双整联蛋白抗体，其中所述抗体基本中 和至少一种双整联蛋白的至少一种活性。
84.一种编码至少一种具有至少一种人CDR的分离的哺乳动物抗 双整联蛋白抗体的分离核酸，其中所述抗体特异性结合于包含SEQ ID NO：9的至少1-3个氨基酸至完整氨基酸序列的至少一种表位。
85.一种包含根据权利要求84的分离核酸的分离核酸载体。
86.一种包含根据权利要求85的分离核酸的原核或真核宿主细 胞。
87.根据权利要求86的宿主细胞，其中所述宿主细胞为至少一 种选自下组的细胞：COS-1，COS-7，HEK293，BHK21，CHO，BSC-1，Hep G2，653，SP2/0，293，HeLa，骨髓瘤，或淋巴瘤细胞，或其任意衍生、 永生化或转化的细胞。
88.一种产生至少一种抗双整联蛋白抗体的方法，包括在体外、 体内或原位条件下翻译权利要求84的核酸，使得双整联蛋白抗体以 可检测或可回收的量表达。
89.一种包含至少一种具有至少一种人CDR的分离的哺乳动物抗 双整联蛋白抗体和至少一种药学可接受载体或稀释剂的组合物，其中 所述抗体特异性结合于包含SEQ ID NO：9的至少1-3个氨基酸至完 整氨基酸序列的至少一种表位。
90.根据权利要求89的组合物，进一步包含至少一种包含有效 量的选自下组的至少一种化合物或蛋白的组合物：至少一种可检测标 记或报道分子、TNF拮抗剂、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、非 甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神 经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合 成类固醇、促红细胞生成素、疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长 激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、刺激 剂、抗哮喘药、β激动剂、吸入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞 因子或细胞因子拮抗剂。
91.一种特异性结合至少一种具有至少一种人CDR的分离的哺乳 动物抗双整联蛋白抗体的抗独特型抗体或片段，其中所述抗双整联蛋 白抗体特异性结合于包含SEQ ID NO：9的至少1-3个氨基酸至完整 氨基酸序列的至少一种表位。
92.一种诊断或治疗细胞、组织、器官、或动物中的双整联蛋白 相关状况的方法，包括(a)使所述细胞、组织、器官、或动物接触或 给药于所述细胞、组织、器官、或动物包含有效量的至少一种具有至 少一种人CDR的分离的哺乳动物抗双整联蛋白抗体的组合物，其中所 述抗体特异性结合于包含SEQ ID NO：9的至少1-3个氨基酸至完整 氨基酸序列的至少一种表位。
93.根据权利要求92的方法，其中所述有效量为0.001-50mg/kg 所述细胞、组织、器官、或动物。
94.根据权利要求92的方法，其中所述接触或给药是通过选自 下组的至少一种方式进行的：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、 支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、 结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、 腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱 内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴道、直肠、颊、 舌下、鼻内或经皮。
95.根据权利要求92的方法，进一步包括在所述(a)接触或给药 之前、同时或之后给予至少一种包含有效量的选自下组的至少一种化 合物或蛋白的组合物：至少一种可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、 抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、非甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛 药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、 抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、 疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性 药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、刺激剂、抗哮喘药、β激动剂、吸 入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
96.一种医学设备，包含至少一种具有至少一种人CDR的分离的 哺乳动物抗双整联蛋白抗体，其中所述抗体特异性结合于包含SEQ ID NO：9的至少1-3个氨基酸至完整氨基酸序列的至少一种表位，其中 所述设备适于所述至少一种抗双整联蛋白抗体的接触或给药，该接触 或给药是通过选自下组的至少一种方式进行的：肠胃外、皮下、肌内、 静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、 小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、 盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、 视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴 道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮。
97.一种用于人药用或诊断用途的制品，包括包装材料和一个容 器，其中包含至少一种具有至少一种人CDR的分离的哺乳动物抗双整 联蛋白抗体的溶液或冷冻干燥形式，其中所述抗体特异性结合于包含 SEQ ID NO：9的至少1-3个氨基酸至完整氨基酸序列的至少一种表 位。
98.权利要求97的制品，其中所述容器是肠胃外、皮下、肌内、 静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、 小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、 盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、 视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴 道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮递送设备或系统的成分。
99.一种产生至少一种具有至少一种人CDR的分离的哺乳动物抗 双整联蛋白抗体的方法，其中所述抗体特异性结合于包含SEQ ID NO：9 的至少1-3个氨基酸至完整氨基酸序列的至少一种表位，该方法包 括提供能够表达可回收量的所述抗体的宿主细胞或转基因动物或转基 因植物或植物细胞。
100.根据权利要求99的方法产生的至少一种抗双整联蛋白抗 体。
101.此处描述的任意发明。

说明书全文

本发明涉及至少一种α-v-β3蛋白、α-v-β5双整联蛋白(双整联 蛋白)或其片段的特异性抗体，包括特定的部分或变体，以及编码所述 抗双整联蛋白抗体的核酸、其互补核酸、载体、宿主细胞及其准备方法 和用途，包括治疗制剂、给药和设备。

背景技术

现在已经有许多证据表明进展性肿瘤生长依赖于血管发生、新血管 的形成，它们提供给肿瘤以营养和氧气，带走废物和作为肿瘤向远处转 移的导管(Gastl et al.，Oncol.54：177-184)。最近的研究进一步确 定了整联蛋白在血管发生过程中的作用。整联蛋白是异二聚的跨膜蛋 白，它们在细胞与细胞外基质(ECM)的粘附中起关键作用，这接下来通 过细胞内信号传递介导细胞存活、增殖和迁移。在血管发生过程中，许 多在活化的内皮细胞表面表达的整联蛋白调节关键的粘附性相互作用， 许多ECM蛋白调节不同的生物学时间，如细胞迁移、增殖和分化。具体 地，已经证明关系最近但又是不同的整联蛋白αVβ3和αVβ5介导血管 发生过程中的独立途径。针对αVβ3的抗体阻断碱性成纤维细胞生长因 子(bFGF)诱导的血管发生，而αVβ5的特异性抗体抑制血管内皮生长因 子(VEGF)诱导的血管发生(Eliceiri，et al.，J.Clin.Invest.103： 1227-1230(1999)；Friedlander et al.，Science 270：1500-1502 (1995))。
非人哺乳动物抗体、嵌合抗体、多克隆抗体(如抗血清)和/或单 克隆抗体(Mabs)和抗体片段(如其蛋白水解消化产物或融合蛋白产物) 是被研究在某些情况下尝试用于治疗某些疾病的潜在治疗剂。然而，当 给予人类这些抗体或片段时可以引发免疫应答。这种免疫应答可以导致 免疫复合物介导的从循环中清除抗体或片段，使得重复给药不适用于治 疗，从而减少了对患者的治疗益处并且限制了再次给予抗体或片段。例 如，重复给予包含非人部分的抗体或片段可以导致血清病和/或过敏。 为了避免这些和其它问题，采用了许多方法减少这些抗体及其部分的免 疫原性，包括嵌合化和人源化，这是本领域所公知的。然而，这些和其 它方法仍然可以产生具有一些免疫原性、低亲和力的抗体和片段，或具 有细胞培养、大规模进行、生产和/或低产率的问题。因此，这些抗体 或片段对于生产或用作治疗蛋白仍然不够理想。
因此，需要提供能够克服这些问题中的一个或多个的抗双整联蛋白 抗体或片段，以及改进已知的抗体或其片段。
发明概述
本发明提供如这里所描述和实现的分离的人、灵长类、啮齿类、哺 乳动物、嵌合、人源化和/或CDR嫁接的抗双整联蛋白抗体、免疫球蛋 白、其裂解产物及特定的部分和变体，以及抗双整联蛋白抗体组合物、 其编码或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、制剂、设备、转基因动 物、转基因植物及其制备方法和用途，它们结合了本领域已知的成分。
本发明也提供了至少一种这里所描述的抗双整联蛋白抗体。本发明 的抗体包括任何包含含有免疫球蛋白分子的至少一部分的分子的蛋白或 肽，所述部分可以是，但不限于可以掺入本发明的抗体的至少一种重链 或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重 链或轻链恒定区、构架区、或其任意部分。本发明的抗体可以包括或来 源于任何哺乳动物，例如，但不限于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿类动物、 灵长类动物或其任意组合等。
本发明的一方面提供一种分离的核酸分子，它包含、互补于或杂交 于一种编码特异性抗双整联蛋白抗体的多核苷酸，该抗体包含至少一种 其特定序列、结构域、部分或变体。本发明进一步提供了包含所述抗双 整联蛋白抗体核酸分子的重组载体，含所述核酸和/或重组载体的宿主 细胞，以及这种抗体核酸、载体和/或宿主细胞的制备方法和/或用途。
本发明的至少一种抗体结合至少一种特异于至少一种双整联蛋白、 其亚基、片段、部分或其任意组合的特定表位。所述至少一种表位可以 包含至少一种抗体结合区，它包含所述蛋白的至少一部分，该表位优选 由其至少一部分的至少1-5个氨基酸组成，所述至少一部分例如，但 不限于，SEQ ID NO：9，16，和17的(a)29-48，58-63，69-79，82-85， 88-134，140-157，161-183，186-190，192-198，202-212，215-217， 223-237，240-244，248-255，259-268，287-301，313-322，326-328， 332-344，348-351，354-365，376-387，393-401，407-414，417-419， 422-4 33，443-451，458-461，465-469，472，(b)32-41，46-47，53-55， 58-69，72-74，77-79，85-88，91-94，96-105，110-113，117-125， 129-142，145-153，155-159，161-163，166-170，172-174，184-197， 200-209，215-218，221-225，184-197，200-209，215-218，221-225， 227-250，259-261，263-267，269-270，275-281；和(c)29-35，43-45， 48-63，67-69，72-74，80-82，84-87，95-105，108-113，117-142， 145-163，166-170，172-176，184-186，191-201，204-206，216-219， 224-226，229-251，260-262，264-268，276-282，286-288，294-299， 301-318，323-325，328-330，338-342，345-349，353-358，或例如， 但不限于所述双整联蛋白的至少一个功能性、细胞外、可溶的、亲水的、 外部或细胞质结构域、亚基或其任意部分。
所述至少一种抗体可以任选包含至少一种互补决定区(CDR)(如重 链或轻链可变区的CDR1，CDR2或CDR3)和/或至少一种恒定或可变构架 区或其任意部分的至少一种特定部分。所述至少一种抗体的氨基酸序列 可以进一步任选包含这里描述的或本领域公知的至少一种特定的取代、 插入或去除。
本发明也提供了这里所描述的至少一种分离的抗双整联蛋白抗体， 其中该抗体具有至少一种活性，例如，但不限于抑制玻连蛋白结合、抑 制α-vβ-3与至少一种α-vβ-3配体或受体的结合，抑制α-vβ-5与 至少一种α-vβ-5配体或受体的结合，血管生成调节、与表达双整联蛋 白或单整联蛋白的细胞结合。因此可以根据已知方法筛选一种抗双整联 蛋白抗体的相应活性，例如，但不限于对双整联蛋白的至少一种生物活 性。
本发明进一步提供了本发明的至少一种双整联蛋白抗体的至少一种 双整联蛋白抗独特型抗体。该抗独特型抗体包括任何含有包含免疫球蛋 白分子的至少一部分的分子的蛋白或肽，所述部分可以是，但不限于可 以掺入本发明的抗体的至少一种重链或轻链或其配体结合部分的互补决 定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区、或其任 意部分。本发明的抗体可以包括或来源于任何哺乳动物，例如，但不限 于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿类动物、灵长类动物或其任意组合等。
本发明的一方面提供一种分离的核酸分子，它包含、互补于或杂交 于一种编码至少一种双整联蛋白抗独特型抗体的多核苷酸，该抗体包含 至少一种其特定序列、结构域、部分或变体。本发明进一步提供了包含 所述双整联蛋白抗独特型抗体的编码核酸分子的重组载体，含所述核酸 和/或重组载体的宿主细胞，以及这种抗独特型抗体核酸、载体和/或宿 主细胞的制备方法和/或用途。
本发明也提供了至少一种在宿主细胞中表达至少一种抗双整联蛋白 抗体、或双整联蛋白抗独特型抗体的方法，包括按照此处的描述在其中 至少一种抗双整联蛋白抗体以可检测和/或可回收的量表达的条件下培 养宿主细胞。
本发明也提供了至少一种组合物，它包含(a)如此处描述的分离的 抗双整联蛋白抗体的编码核酸和/或抗体；和(b)合适的载体或稀释剂。 载体或稀释剂可以任选是可药用的已知载体或稀释剂。该组合物可以任 选进一步包含至少一种其它的化合物、蛋白或组合物。
本发明进一步提供了至少一种抗双整联蛋白抗体方法或组合物，用 于在本领域已知的和/或这里所描述的相关状况之前、之后或之时以治 疗有效量给药，以便调节或治疗细胞、组织、器官、动物或病人中的至 少一种双整联蛋白相关状况。
本发明也提供了至少一种递送治疗或预防有效量的至少一种本发明 的抗双整联蛋白抗体的组合物、设备和/或方法。
本发明进一步提供了至少一种抗双整联蛋白抗体方法或组合物，用 于在本领域已知的和/或这里所描述的相关状况之前、之后或之时诊断 细胞、组织、器官、动物或病人中的至少一种双整联蛋白相关状况。
本发明也提供了至少一种递送用于诊断至少一种本发明的抗双整联 蛋白抗体的组合物、设备和/或方法。
附图说明
图1表示RT下抗αVβ3Mab的双倍稀释液在αVβ3包被的板上孵 育1小时。洗涤板两次，用HRP标记的山羊抗人IgGκ特异性抗体在RT 下探测1小时。再次洗涤板，用OPD底物显影，并且在490nm测量OD 值。
图2表示在P1F6存在或不存在的条件下，用抗体样品，抗αVβ5 腹水预孵育calcein标记的M21细胞30分钟。用含钙的HBSS以150μL/ 孔洗涤两次，以去除未结合的M21细胞。在荧光计中以485-538nm对板 进行读数。
图3表示细胞粘附，收获并用各种浓度的GenO95预孵育MDAMB435L2 细胞10分钟。然后将肿瘤细胞加入玻连蛋白包被的Linbro板，并且在 37℃下孵育1小时。洗涤各个孔三次，向每个孔中加入基于MTT的Cell Titer AQ染料。在ELISA板读数器下测定细胞粘附，其中OD490nm与 细胞粘附成正比。与BSA包被的孔的细胞粘附作为阴性对照(数据未示 出)。每个数据点是三次测定的平均值。
图4A-D表示抗体与αVβ3的结合，其中该配体在双倍稀释液中在 37℃下预孵育30分钟，该稀释液是用含50mM EDTA的1％BSA-HBSS(无 Ca++)或1％BSA-HBSS(有Ca++)稀释得到的，从10μg/mL开始。向CNTO 95，C372，c7E3或LM609 IgG包被的板中加入混合物并且在37℃下孵育 1小时。在37℃下30分钟加入浓度为20μg/mL的适当缓冲液中(+/-Ca++) 的LM609或CNTO95。用山羊抗小鼠IgGFc，HRP或山羊抗人IgGFc，HRP 探测板。
图4E-G表示抗体与αVβ5的结合，其中该配体在双倍稀释液中在 37℃下预孵育30分钟，该稀释液是用含50mM EDTA的1％BSA-HBSS(无 Ca++)或1％BSA-HBSS(有Ca++)稀释得到的，从10μg/mL开始。向CNTO 95，C372，c7E3 IgG包被的板中加入混合物并且在37℃下孵育1小时。 在37℃下30分钟加入浓度为10μg/mL的溶于适当缓冲液中(+/-Ca++) 的LM609或VNR139。用山羊抗小鼠IgGFc，HRP探测板。
图5A-B表示GenO.95(图5A)和ReoPro(图5B)包被的板的饱和 结合曲线。
(国际公开时缺页)
免疫荧光和通过流式细胞术分析。左边的图代表同种型匹配的抗体 存在下的本底荧光。右边的图代表阳性染色。A，D，G，LM609(针对αV β3的mAb，10μg/ml)；B，E，H，PIF6(针对αVβ5的mAb，10μg/ml)； 以及C，F，I，(10μg/ml)。
图13.HUVECS与基质蛋白包被的板的粘附。粘附测定按实施例5 中描述的方法进行。在荧光计上在485-538nm下对板进行读数。与BSA 包被的孔的细胞粘附作为阴性对照。在图13中，用各种浓度抗体存在 下的细胞粘附程度作图，表示为细胞粘附百分比，无抗体时的细胞粘附 作为100％。每个数据点是三次测定的平均值(+/-SD)。
图14.人黑色素瘤细胞与基质蛋白包被的板的粘附。粘附测定按方 法部分的描述进行。与BSA包被的孔的细胞粘附作为阴性对照。在图14 中，用各种浓度抗体存在下的细胞粘附程度作图，表示为细胞粘附百分 比，无抗体时的细胞粘附作为100％。每个数据点是三次测定的平均值 (+/-SD)。
图15.人结肠癌HT29细胞与玻连蛋白的粘附。粘附测定按方法部 分的描述进行。与BSA包被的孔的细胞粘附作为阴性对照。图15的数 据作图为最大结合百分比(无抗体)，每个数据点是三次测定的平均值 (+/-SD)。
图16A-D.HUVECS向2μg/ml玻连蛋白的迁移。该测定按方法部分 的描述进行，允许细胞迁移6小时。显微照片是细胞迁移的代表性视野 (10倍物镜)。在图16A中，无抗体，(16B)，GenO95(5μg/ml)，(16C)， GenO95(40μg/ml)。图16D是在各种浓度的GenO95存在下的细胞迁移 图。数据标准化为对照(无抗体)的百分比，对照作为100％，每个数据 点是三个经孔滤膜的平均值(+/-SD)。
图17.αVβ3和αVβ5存在下HUVECS向2μg/ml玻连蛋白的迁移。 该迁移测定按方法部分的描述进行，允许细胞迁移6小时。LM609和P1F6 分别是针对αVβ3和αVβ5的单克隆抗体。图17的数据标准化为对照 (无抗体)的百分比，对照作为100％，每个柱是三个经孔滤膜的平均值 (+/-SD)。BSA、小鼠IgG和人IgG作为阴性对照。LM609-PIF6代表两种 抗体的组合。抗体和BSA在10μg/ml的浓度下使用。
图18A-E.HUVECS向2％FBS的迁移。迁移测定进行4小时，按方法 部分的描述采集数据。图18(A)是LM609，P1F6，LM609+P1F6的组合、 同种型匹配的对照抗体(人和小鼠)存在下细胞迁移的图示。抗体和蛋 白在10μg/ml的浓度下使用。图18(B)是ReoPro和GenO95存在下的 细胞迁移的示意图。显微照片是细胞迁移的代表性视野(10倍物镜)。 图18(C)，无抗体，图18(D)，GenO95(5μg/ml)，以及图18(E)，GenO95 (20μg/ml)。数据标准化为对照(无抗体)的百分比，对照作为100％， 每个数据点是三个经孔滤膜的平均值(+/-SD)。
图19A-E.A375S.2细胞向10％FBS的迁移。迁移测定进行4小时， 按方法部分的描述采集数据。抗体在10μg/ml的浓度下使用。图19(A) 是在各种浓度GenO95存在下的细胞迁移。图19(B)是LM609，P1F6， LM609+P1F6的组合、同种型匹配的对照抗体(人和小鼠)存在下细胞迁 移的图示。数据标准化为对照(无抗体)的百分比，对照作为100％，每 个数据点是三个经孔滤膜的平均值(+/-SD)。显微照片是细胞迁移的代 表性视野(10倍物镜)。图19(C)，无抗体，图19(D)，GenO95(5μ g/ml)，以及图19(E)，GenO95(20μg/ml)。
图20A-E.bFGF存在下HUVECS向玻连蛋白的迁移。迁移室滤膜的 内面用2μg/ml玻连蛋白包被，按方法部分的描述进行测定。允许细胞 迁移6小时。在图20A-E中，每个数据点是三个经孔滤膜的平均值(+/- SD)。图20(A)，bFGF；图20(B)，GenO95(5μg/ml)；图20(C)，GenO95 (40μg/ml)；图20(D)，无bFGF。图20(E)，图示了各种抗体存在下 细胞迁移的抑制。
图21A-D.A375S.2细胞通过纤维蛋白凝胶(5mg/ml)的侵入。允许侵 入测定进行24小时，按方法部分的描述采集数据。显微照片是细胞侵 入的代表性视野(4倍物镜)。图21(A)，无抗体，图21(B)，GenO95(10 μg/ml)，图21(C)和(D)是GenO95，10E5F(ab′)2，LM609，P1F6，LM-PIF6 (LM609+P1F6)，人和小鼠IgG(H-IgG和M-IgG)存在下细胞侵入的图示。 图21(D)：所有抗体和蛋白的浓度是10μg/ml。数据标准化为对照(无 抗体)的百分比，对照作为100％，每个数据点是三个经孔滤膜的平均值 (+/-SD)。
发明详述
本发明提供分离的、重组的和/或合成的人、灵长类、啮齿类、哺 乳动物、嵌合、人源化和/或CDR嫁接的抗双整联蛋白抗体和双整联蛋 白抗独特型抗体，以及包含至少一种编码至少一种抗双整联蛋白抗体或 双整联蛋白抗独特型抗体的多核苷酸的组合物和编码核酸分子。本发明 进一步包括，但不限于，所述核酸和抗体以及抗独特型抗体的制备方法 和用途，包括诊断和治疗组合物、方法和设备。
这里用到的“抗αvβ3，αvβ5双整联蛋白抗体”、“抗双整联蛋白 抗体”、“抗双整联蛋白抗体部分”或“抗双整联蛋白抗体片段”和/或“抗 双整联蛋白抗体变体”等包括任何含有一种分子的肽或多肽，该分子包 含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如，但不限于重链或轻链的互补决 定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、 构架区或其任意部分，或可以掺入到本发明的抗体中的双整联蛋白受体 或结合蛋白的至少一部分。这种抗体任选进一步影响特异性配体，例如， 但不限于，这些抗体调节、减少、增加、拮抗、激动、减轻、缓解、阻 断、抑制、消除和/或干扰至少一种双整联蛋白活性或结合，或在体外、 原位和/或体外具有双整联蛋白受体活性或结合。作为非限制性的例子， 本发明的适当抗双整联蛋白抗体、特定部分或变体可以结合至少一种双 整联蛋白、或其特定部分、变体或结构域。适当的抗双整联蛋白抗体、 特定部分或变体也可以任选影响至少一种双整联蛋白活性或功能，例 如，但不限于，RNA、DNA或蛋白合成，双整联蛋白释放，双整联蛋白受 体信号传递、膜双整联蛋白裂解、双整联蛋白活性、双整联蛋白产生和 /或合成。术语  “抗体”进一步包含抗体、其消化片段、特定部分和变 体，包括抗体模拟物或包括模拟抗体或其特定片段或部分的结构和/或 功能的抗体部分，包括单链抗体及其片段。功能性片段包括与哺乳动物 双整联蛋白结合的抗原结合片段。例如，本发明也包括能够与双整联蛋 白或其部分结合的抗体片段，包括但不限于Fab(例如通过木瓜蛋白酶 消化)，Fab′(如通过胃蛋白酶消化和部分还原)和F(ab′)2(如通过 胃蛋白酶消化)，facb(如通过纤溶酶消化)，pFc′(如通过胃蛋白酶或 纤溶酶消化)，Fd(如通过胃蛋白酶消化、部分还原和再聚集)，Fv或scFv (如通过分子生物学技术)片段(见例如，Colligan，Immunology，同 上)。
这些片段可以通过如本领域公知的和/或这里描述酶促裂解、合成 或重组技术而产生。也可以用抗体基因产生各种截短形式的抗体，在这 些基因中天然终止位点的上游导入了一个或多个终止密码子。例如可以 设计一种编码F(ab′)2重链部分的组合基因，使其包含编码重链CH1结构 域和/或铰链区的DNA序列。可以通过常规技术将抗体的各部分以化学 方式连接在一起，或用基因工程技术制备作为连续蛋白的抗体的各部 分。
这里用到的术语“人抗体”是指这样一种抗体，其中该蛋白的每个 部分(如CDR，构架区，CL，CH结构域(如CH1，CH2，CH3)，铰链区，(VL， VH))在人类中基本是非免疫原性的，仅仅有微小的序列改变或变异。 同样，称作灵长类(猴、狒狒、猩猩等)、啮齿类(小鼠、大鼠、兔、 豚鼠、仓鼠等)和其它哺乳动物抗体的抗体是指这种物种、亚属、属、 亚家族、家族特异性抗体。此外，嵌合抗体包括上述抗体的任意组合。 这种改变或变异相对于未修饰抗体任选并优选保留或减少人类在人或其 它物种中的免疫原性。因此，人抗体与嵌合或人源化抗体不同。已经指 出，人抗体可以由能够表达功能性重排的人免疫球蛋白(如重链和/或 轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生。此外，当人抗体是单链 抗体时，它可以包含在天然人抗体中不存在的连接肽。例如，Fv可以包 含连接肽，例如大约2-8个甘氨酸或其它氨基酸残基，它们连接重链 可变区和轻链可变区。这种连接肽被认为是来源于人的。
也可以使用双特异性、异特异性、异偶联或类似的抗体，它们是对 至少两个不同抗原具有结合特异性的抗体。在本申请中，一种结合特异 性是针对至少一种双整联蛋白，另一种是针对任意其它抗原。制备特异 性抗体的方法是本领域中公知的。一般地，双特异性抗体的重组产生是 基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的 特异性(Milstein and Cuello，Nature 305：537(1983))。由于免疫球 蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤产生10中不同抗体分子的可 能混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析 步骤进行的正确分子的纯化是繁杂的，产率很低。相似的程序公开于， 例如WO 93/08829，US Patent Nos，6210668，6193967，6132992，6106833， 6060285，6037453，6010902，5989530，5959084，5959083，5932448， 5833985，5821333，5807706，5643759，5601819，5582996，5496549， 4676980，WO 91/00360，WO 92/00373，EP 03089，Traunecker et al.，EMBO J.10：3655(1991)，Suresh et al.，Methods in Enzymology 121：210 (1986)，在此引入其完整内容作为参考。
用于本发明的方法和组合物中的抗双整联蛋白抗体(也称作双整联 蛋白抗体)的特征可以任选在于与双整联蛋白结合的高亲和性，并且任 选并优选具有低毒性。具体地，本发明中使用其中各个成分，如可变区、 恒定区和构架区的和/或其集合任选和优选具有低免疫原性的本发明的 抗体、特定片段或变体。本发明中使用的抗体的特征任选在于它们能够 在很长时间中治疗患者，具有可测量的症状缓解和/或可接受的毒性。 低或可接受的免疫原性和/或高亲和性，以及其它适当的特性可以用于 达到治疗结果。此处定义的“低免疫原性”是指在约75％以下或优选50％ 的受治疗患者中引起显著的HAHA，HACA或HAMA反应，和/或在受治疗 患者中产生低滴度(用双抗原酶免疫测定时小于约300，优选小于约100) (Elliott et al.，Lancet 344：1125-1127(1994)，在此引入其完整内 容作为参考)。 用途
本发明的分离核酸可以用于产生至少一种抗双整联蛋白抗体或其特 定变体，所述抗体或其特定变体可以用于在细胞、组织、器官或动物(包 括哺乳动物和人)中测量或起作用，用于诊断、监测、调节、治疗、缓 解至少一种双整联蛋白状况，帮助预防该状况的发生，或减轻其症状， 所述状况选自，但不限于，至少一种免疫紊乱或疾病、一种心血管紊乱 或疾病、感染性、恶性和/或神经紊乱或疾病，或其它已知或特定的双 整联蛋白相关状况。
这种方法包括将有效量的含有至少一种抗双整联蛋白抗体的组合物 或药物组合物给予需要这种调节、治疗、缓解、预防或减轻该症状、作 用或机制的细胞、组织、器官、动物或患者。有效量可以包括每单次(如 快速注射(bolus))、多次或连续给药时约0.001-500mg/kg，或每单次 (如团快速注射)、多次或连续给药时达到约0.01-5000μg/ml的血清浓 度，或用此处描述的或相关领域中已知的方法完成和测定的任意有效范 围或值。 引用文献
在此引入这里所引用的所有出版物或专利的完整内容作为参考，它 们显示了本发明时的技术状态和/或为本发明提供了说明并使本发明成 为可能。出版物是指任何科学或专利公开，或可以用任何媒体形式，包 括所有录音、电子或印刷形式获得的任何其它信息，在此全文引入以下 对比文献作为参考：Ausubel，et al.，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001)； Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow and Lane，antibodies， a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan，et al.，eds.，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.， NY(1994-2001)；Colligan et al.，Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，NY，(1997-2001)。 本发明的抗体
本发明的抗双整联蛋白抗体可以任选通过本领域公知的细胞系、混 合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群产生。见，例如，Ausubel， et al.，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001)；Sambrook，et al.，Molecular Cloning： A Labora tory Manual，2 Edition，Cold Spring Harbor，NY(1989)； Harlow and Lane，antibodies，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor， NY(1989)；Colligan，et al.，eds.，Current Protocols in Immunology， John Wiley&Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan et al.，Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，NY，(1997- 2001)，在此全文引入作为参考。
可以通过用适当的免疫原性抗原，如分离的和/或双整联蛋白或其 部分(包括合成分子，如合成肽)诱导产生人双整联蛋白或其片段的特 异性人抗体。可以用相似的方法产生其它特异性或普通哺乳动物抗体。 可以用适当的技术制备免疫原性抗原和产生单克隆抗体。
在一种方法中，可以通过融合适当的永生细胞系和抗体产生细胞而 产生。所述细胞系如骨髓瘤细胞系，例如，但不限于Sp2/0，Sp2/0-AG14， NS0，NS1，NS2，AE-1，L.5，＞243，P3X63Ag8.653，Sp2 SA3，Sp2 MAI， Sp2 SS1，Sp2 SA5，U9 37，MLA 144，ACT IV，MOLT4，DA-1，JURKAT，WEHI， K-562，COS，RAJI，NIH 3T3，HL-60，MLA 144，NAMAIWA，NEURO 2A等， 或异骨髓瘤，或本领域已知的其它细胞系。见，例如， www.atcc.org， www.lifetech.com等。所述抗体产生细胞例如，但不限于分离的或克隆 的脾细胞、外周血细胞、淋巴细胞、扁桃体或其它免疫细胞或B细胞， 或其它任何表达重链或轻链恒定区或可变区或构架区或CDR序列的细 胞，这些序列可以是内源性或异源核酸，重组或内源性的、病毒、细菌、 藻类、原核生物、两栖动物、昆虫、爬行动物、鱼类、哺乳动物、啮齿 类、马、山羊、绵羊、灵长类、真核生物的基因组DNA，cDNA，rDNA，线 粒体DNA或RNA，叶绿体DNA或RNA，hnRNA，mRNA，tRNA，单链、双链 或三链、杂交序列等或其组合。见，例如Ausubel，同上，和Colligan， Immunology，同上，第二章，在此引入作为参考。
抗体产生细胞也可以从用感兴趣的抗原免疫的人或其它适当动物的 外周血或优选脾或淋巴结获得。也可以用任何其它适当的宿主细胞表达 编码本发明的抗体、其特定片段或变体的异源或内源性核酸。可以用选 择性培养条件或其它适当的已知方法分离融合细胞(杂交瘤)或重组细 胞，并且用有限稀释或细胞分拣或其它公知方法进行克隆。产生具有所 需特异性的抗体的细胞可以通过适当的测定(如ELISA)进行选择。
可以使用其它适当的产生或分离具有所需特异性的抗体，包括，但 不限于本领域公知和/或此处描述的从能够产生人抗体所有组成成分的 肽或蛋白文库(所述文库例如，但不限于噬菌体、核糖体、寡核苷酸、 RNA、cDNA等、展示文库；如可以来自于Cambridge antibody Technologies， Cambridgeshire，UK；MorphoSys，Martinsreid/Planegg，DE；Biovation， Aberdeen，Scotland，UK；BioInvent，Lund，Sweden；Dyax Corp.，Enzon， Affymax/Biosite；Xoma，Berkeley，CA；Ixsys，见，例如EP 368,684, PCT/GB91/01134；PCT/GB92/01755；PCT/GB92/002240；PCT/GB92/00883； PCT/GB93/00605；US 08/350260(5/12/94)；PCT/GB94/01422； PCT/GB94/02662；PCT/GB97/01835；(CAT/MRC)；WO 90/14443；WO 90/14424； WO90/14430；PCT/US94/1234；WO 92/18619；WO 96/07754；(Scripps)；EP 614989(MorphoSys)；WO 95/16027(BioInvent)；WO 88/06630； WO 90/3809(Dyax)；US4,704,692(Enzon)；PCT/US91/02989(Affymax)； WO 89/06283；EP371 998；EP550 400；(Xoma)；EP229 046； PCT/US91/07149(Ixsys))；或随机产生的肽或蛋白-US 5723323，5763192， 5814476，5817483，5824514，5976862，WO 86/05803，EP 590 689(Ixsys， 目前应用的分子演变(AME)，在此全文引入作为参考)；或依赖于转基因 动物免疫的肽或蛋白(所述转基因动物如SCID小鼠，Nguyen et al.， Microbiol.Immunol.41：901-907(1997)；Sandhu et al.，Crit.Rev. Biotechnol.16：95-118(1996)；Eren et al.，Immunol.93：154-161 (1998)，每个文献或相关专利和申请均在此引入作为参考)选择重组抗 体的方法。这些技术包括但不限于，核糖体展示(Hanes et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，94：4937-4942(May 1997)；Hanes et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，95：14130-14135(Nov.1998))；单细胞抗体产生技 术(如选择的淋巴细胞抗体方法(″SLAM″)(美国专利5,627,052，Wen et al.，J.Immunol.17：887-892(1987)；Babcook et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 93：7843-7848(1996))；凝胶微滴和流式细胞术(Powell et al.，Biotechnol.8：333-337(1990)；One Cell Systems，Cambridge， MA；Gray et al.，J.Imm.Meth.182：155-163(1995)；Kennyetal.， Bio/Technol.13：787-790(1995))；B细胞选择(Steenbakkers et al.， Molec.Biol.Reports 19：125-134(1994)；Jonak et al.，Progress Biotech，Vol.5，In Vitro Immunization in Hybridoma Technology， Borrebaeck，ed.，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam， Netherlands(1988))。
也可以使用本领域公知的工程化或人源化非人或人抗体的得到。一 般地，人源化或工程化的抗体具有一个或多个非人来源的氨基酸，例如， 但不限于来源于小鼠、大鼠、非人灵长类或其它哺乳动物。这些人类氨
基酸残基一般称作“输入”残基。一般来自于已知人序列的“输入” 可变区、恒定区或其它结构域。已知的人IgG序列公开于，例如 www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/； www.abcam.com/；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html； www.public.iastate.edu/～pedro/research_tools.html；www.mgen.uni- heidelberg.de/SD/IT/IT.html；www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm； www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html； www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；www.path.cam.ac.uk/～mrc7/mikeimages.html； www.antibodyresource.com/； mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/； pathbox.wustl.edu/～hcenter/index.html；www.biotech.ufl.edu/～hcl/； www.pebio.com/pa/340913/340913.html；www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/； www.m.ehime-u.ac.jp/～yasuhito/Elisa.html；www.biodesign.com/table.asp； www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html；www.biotech.ufl.edu/～fccl/protocol.html；www.isac- net.org/sites_geo.html；aximtl.imt.uni-marburg.de/～rek/AEPStart.html； baserv.uci.kun.nl/～jraats/linksl.html；www.recab.uni-hd.de/immuno.brne.nwu.edu/； www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html；www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html； imgt.cnusc.fr：8104/；www.biochem.ucl.ac.uk/～martin/abs/index.html；antibody.bath.ac.uk/； abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html； www.unizh.ch/～honegger/AHOseminar/Slide01.html；www.cryst.bbk.ac.uk/～ubcg07s/； www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm； www. path.cam.ac.uk/～mrc7/humanisation/TAHHP.html； www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html； www.cryst.bioc.cam.ac.uk/～fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html； www.jerini.de/fr_products.htm；www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1983)，
在此全文引入作为参考。
这些输入序列可以用于减少免疫原性，或用于减少、增强或修饰结 合、亲和性、开率(on-rate)、闭率(off-rate)、亲和力、特异性、半 衰期或任意其它适当的特征，如本领域所公知的。保留非人或人CDR序 列的大部分或全部，用人氨基酸或其它氨基取代可变区和恒定区。任选 对抗体人源化，保留抗体对抗原的高亲和性和其它有利的生物学特性。 为了达到这一目的，通过采用母体和人源化序列的三维模型分析母体序 列和各种得到的人源化序列的过程任选制备人源化抗体。通常可以得到 三维免疫球蛋白模型，并且是本领域技术人员公知的。说明和演示所选 的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构计算机程序是可得到的。检 查这些演示结果可以分析候选免疫球蛋白序列功能中残基的可能作用， 即，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原的结合能力的残基。以这种方式， 可以选择FR残基，并且与共有序列和输入序列结合，从而得到需要的 抗体特征，如对靶抗原的亲和性增加。概言之，CDR残基直接并最大程 度参与抗原结合的影响。本发明抗体的人源化或工程化可以采用任意已 知的方法进行，例如，但不限于，以下文献中描述的方法，Winter(Jones et al.，Nature 321：522(1986)；Riechmann et al.Nature 332：323 (1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534(1988))，Sims et al.， J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196： 901(1987)，Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285 (1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993)，美国专利 5723323，5976862，5824514，5817483，5814476，5763192，5723323， 5,766886，5714352，6204023，6180370，5693762，5530101，5585089， 5225539；4816567，PCT/：US98/16280，US96/18978，US91/09630， US91/05939，US94/01234，GB89/01334，GB91/01134，GB92/01755； WO 90/14443，WO 90/14424，WO 90/14430，EP 229246，在此全文引入每一 篇文献作为参考。
抗双整联蛋白抗体也可以任选通过免疫能够产生人类抗体所有组成 成分的转基因动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类等)而产生，如 此处的描述和/或本领域所公知。产生人类抗双整联蛋白抗体的细胞可 以通过适当的方法从这些动物中分离并永生化，例如通过这里所描述的 方法。
可以产生与人抗原结合的人类抗体所有组成成分的转基因动物是通 过公知方法产生的(例如，但不限于授权于Lonberg等的美国专利 5,770,428，5,569,825，5,545,806，5,625,126，5,625,825，5,633,425， 5,661,016和5,789,650，Jakobovits等的WO 98/50433，Jakobovits等 的WO 98/24893，Lonberg等的WO 98/24884，Lonberg等的WO 97/13852， Lonberg等的WO 94/25585，Kucherlapate等的WO 96/34096，Kucherlapate 等的EP 0463 151 B1，Kucherlapate等的EP 0710 719 A1，Surani等 的美国专利5,545,807，Bruggemann等的WO 90/04036，Bruggemann等 的EP 0438 474 B1，Lonberg等的EP 0814 259 A2，Lonberg等的GB 2 272 440 A，Lonberg et al.Nature 368：856-859(1994)，Taylor et al.， Int.Immunol.6(4)579-591(1994)，Green et al，Nature Genetics 7：13-21(1994)，Mendez et al.，Nature Genetics 15：146-156(1997)， Taylor et al.，Nucleic Acids Research 20(23)：6287-6295(1992)， Tuaillon et al.，Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724(1993)， Lonberg et al.，Int Rev Immunol 13(1)：65-93(1995)和Fishwald et al.，Nat Biotechnol 14(7)：845-851(1996)，在此全文引入每一篇 文献作为参考。一般地，这些小鼠包含至少一种转基因，所述转基因包 含来自于至少一种人免疫球蛋白基因座的DNA，它进行了功能性重排， 或可以进行功能性重排。该小鼠中的内源性免疫球蛋白基因座可以被破 坏或去除，以便去除动物产生由内源性基因编码的抗体的能力。
可以通过肽展示文库方便地完成筛选特异性与相似蛋白或片段结合 的抗体。该方法包括筛选大量肽中具有所需功能或结构的各个成员。肽 展示文库的抗体筛选是本领域公知的。展示的肽序列长度可以为3-5000 或更多氨基酸，通常长度为5-100个氨基酸。除了产生肽文库的直接 化学合成方法，也描述了一些重组DNA法。一种类型包括在噬菌体或细 胞的表面展示肽序列。每种噬菌体或细胞含有具体展示的肽序列的编码 核苷酸序列。这些方法描述于PCT专利公开91/17271，91/18980， 91/19818和93/08278。用于产生肽文库的其它系统同时具有体外化学合 成和重组方法。见PCT专利公开92/05258，92/14843和96/19256。也 见美国专利5,658,754和5,643,768。肽展示文库、载体和筛选试剂盒 可以从Invitrogen(Carlsbad，CA)和Cambridge antibody Technologies (Cambridgeshire，UK)等供应商购得。见，例如Enzon的美国专利4704692， 4939666，4946778，5260203，5455030，5518889，5534621，5656730， 5763733，5767260，5856456；Dyax的美国专利5223409，5403484，5571698， 5837500；Affymax的美国专利5427908，5580717；Cambridge antibody Technologies的美国专利5885793；Genentech的美国专利5750373；Xoma 的美国专利5618920，5595898，5576195，5698435，5693493，5698417； Colligan，同上；Ausubel，同上；Sambrook，同上，在此全文引入上述 每个专利和出版物作为参考。
也可以使用至少一种编码抗双整联蛋白抗体的核酸提供转基因动物 或哺乳动物，从而制备本发明的抗体，所述动物如山羊、牛、马、绵羊 等，它们在其乳汁中产生这些抗体。这些动物可以通过已知的方法提供， 见，例如，但不限于美国专利5,827,690；5,849,992；4,873,316； 5,849,992；5,994,616；5,565,362；5,304,489等，在此全文引入作为 参考。
还可以使用至少一种编码抗双整联蛋白抗体的核酸提供在植物部分 或由其培养的细胞中产生所述抗体、特定部分或变体的转基因植物并培 养植物细胞(例如，但不限于烟草和玉米)，从而制备本发明的抗体。 作为非限制性的实例，已经成功使用表达重组蛋白的烟叶提供大量重组 蛋白，如，使用诱导型启动子。见，例如，Cramer et al.，Curr.Top. Mi crobol.Immunol.240：95-118(1999)及其中引用的文献。同样，已 经采用转基因玉米以商业生产水平表达哺乳动物蛋白，其生物活性等于 在其它重组系统产生或从天然来源纯化的蛋白。见，例如Hood et al.，Adv. Exp.Med.Biol.464：127-147(1999)及其中引用的文献。也已经从 转基因植物种子，包括烟草种子和马铃薯块根中大量产生了抗体，包括 抗体片段，例如单链抗体(scFv′s)。见，例如Conrad et al.，Plant Mol. Biol.38：101109(1998)及其中引用的文献。这样，也可以根据已知 方法采用转基因植物产生本发明的抗体。也见Fischer et al.， Biotechnol.Appl.Biochem.30：99-108(Oct.，1999)，Ma et al.， Trends Biotechnol.13：522-7(1995)；Ma et al.，Plant Physiol.109： 341-6(1995)；Whitelam et al.，Biochem.Soc.Trans.22：940-944 (1994)；及其中引用的文献。也见一般用于抗体的植物表达的方法，在 此全文引用上述每一篇文献作为参考。
本发明的抗体可以以宽范围的亲和性(KD)结合人双整联蛋白。在一 种优选实施方案中，本发明的至少一种人单克隆抗体可以任选以高亲和 性结合人双整联蛋白。例如，人单克隆抗体可以与人双整联蛋白结合， 其KD等于或小于约10-7M，例如，但不限于0.1-9.9(或其中的任意范围 或任意值)×10-7，10-8，10-9，10-10，10-11，10-12，10-13或其中的任意 范围或任意值。
抗体与抗原的亲和性或亲和力可以采用适当的方法进行实验室测 定。(见，例如，Berzofsky，et al.，″Antibody-Antigen Interactions，″In Fundamental Immunologv，Paul，W.E.，Ed.，Raven Press：New York， NY(1984)；Kuby，Janis Imszlunolo，gy，W.H.Freeman and Company： New York，NY(1992)；及此处描述的方法)。如果在不同的条件(如盐浓 度，pH)下测定，所测定的特定抗体-抗原相互作用的亲和性可以不同。 因此，优选用标准抗体和抗原溶液、标准缓冲液，如此处描述的缓冲液 测量亲和性和其它抗原-抗体结合参数(例如KD，Ka，Kd)。 核酸分子
采用这里提供的信息，如编码SEQ ID NOS：1，2，3，4，5，6，7，8中的 至少一种、其特定片段、变体或共有序列的至少70-100％的连续氨基酸 的核苷酸序列，或包含这些序列中的至少一种的保藏载体，可以根据此 处描述或本领域公知的方法获得编码至少一种抗双整联蛋白抗体的本发 明的核酸分子。
本发明的核酸分子可以是RNA形式，例如mRNA，hnRNA，tRNA或任 意其它形式，或可以是DNA形式，包括，但不限于通过克隆或合成产生， 或其任意组合而产生的cDNA和基因组DNA。DNA可以是三链、双链或单 链，或其任意组合。DNA或RNA的至少一条链的任意部分可以是编码链， 也称作有义链，或可以是非编码链，也称作反义链。
本发明的分离核酸分子可以包括含有开放读码框(ORF)，任选具有 一种或多种内合子的核酸分子，例如，但不限于至少一种重链(如SEQ ID NOS：1-3)或轻链(如SEQ ID NOS：4-6)的至少一种CDR，如CDR1，CDR2 和/或CDR3的至少一个特定部分；包含抗双整联蛋白抗体或可变区的编 码序列的核酸分子(如SEQ ID NOS：7，8)；以及包含基本不同于上述那 些的核苷酸序列的核酸分子，但由于遗传密码简并性，它们仍然编码此 处描述和/或本领域公知的至少一种抗双整联蛋白抗体。当然，遗传密 码是本领域公知的。因此，本领域技术人员制备这种编码本发明的特异 性抗双整联蛋白抗体的简并核酸变体是常规的。见，例如，Ausubel，et al.， 同上，这些核酸变体包括在本发明中。本发明的分离核酸分子的非限制 性例子包括SEQ ID NOS：10，11，12，13，14，15，它们分别对应于编 码HC CDR1，HC CDR2，HC CDR3，LC CDR1，LC CDR2，LC CDR3，HC可变 区和LC可变区的非限制性的核酸的例子。
另一方面，本发明提供了具有由包含在质粒中的核酸编码的氨基酸 序列的抗双整联蛋白抗体的编码分离核酸分子，所述质粒分别以克隆名 称＿＿和ATCC保藏号＿＿保藏，于＿＿保藏。
如此处指出的，包含编码抗双整联蛋白抗体的核酸的本发明的核酸 分子可以包括，但不限于自身编码抗体片段的氨基酸序列的核酸；完整 抗体或其部分的编码序列；抗体、片段或部分的编码序列，以及其它的 序列，例如至少一种信号前导肽或融合肽的编码序列，它具有或不具有 前面提到的其它编码序列，如至少一种内含子，同时具有其它的非编码 序列，包括，但不限于非编码5’和3’序列，如在转录、mRNA加工，包括 剪接和聚腺苷酸化信号中起作用(例如mRNA的核糖体结合和稳定性) 的转录的、未翻译的序列；编码其它氨基酸，如提供其它功能的氨基酸 的其它序列。因此，编码抗体的序列可以与标记序列融合，例如与促进 包含抗体片段或部分的融合抗体纯化的肽的编码序列融合。
选择性与此处描述的多核苷酸杂交的多核苷酸
本发明提供了在选择性杂交条件下与此处公开的多核苷酸杂交的分 离核酸。因此，该实施方案中的多核苷酸可以用于分离、检测和/或定 量包含所述多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可以用于在保藏 的文库中鉴定、分离或扩增部分或全长克隆。在一些实施方案中，多核 苷酸是分离的基因组或cDNA序列，或者互补于来自于人或哺乳动物核 酸文库的cDNA。
优选地，cDNA文库包含全长序列的至少80％，优选包含全长序列的 至少85％或90％，更优选包含全长序列的至少95％。可以对cDNA文库进 行标准化，以增加稀有序列的代表性。低或中度严格杂交条件一般、但 不是专门用于相对于互补序列的序列等同性较低的序列。中度和高度严 格性条件任选用于具有更高等同性的序列。低严格性杂交条件允许具有 约70％的序列等同性的序列的选择性杂交，并且可以用于鉴定直向同源 序列或共生同源序列。
本发明的多核苷酸任选编码由此处描述的多核苷酸编码的抗体的至 少一部分。本发明的多核苷酸包括可以用于与编码本发明的抗体的多核 苷酸选择性杂交的核酸序列。见，例如Ausubel，同上；Colligan，同上， 在此全文引入作为参考。 核酸的构建
本发明的分离核酸可以利用本领域公知的(a)重组方法，(b)合成技 术，(c)纯化技术或其组合进行制备。
核酸可以方便地包含除本发明的多核苷酸以外的序列。例如，可以 将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入核酸，以帮助 多核苷酸的分离。也可以插入可翻译的序列以帮助本发明的被翻译的多 核苷酸的分离。例如，一种六组氨酸标记序列提供了纯化本发明的蛋白 的方便方法。除编码序列外，本发明的核酸任选为用于克隆和/或表达 本发明的多核苷酸的载体、连接物或接头。
在这种克隆和/或表达序列中也可以加入其它序列，用于优化它们 在克隆和/或表达中的功能，用于帮助多核苷酸的分离，用于改进多核 苷酸向细胞中的导入。克隆载体、表达载体、连接物和接头的用途是本 领域中公知的。(See，e.g.，Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。 构建核酸的重组方法
本发明的分离核酸组合物，如RNA，cDNA，基因组DNA或其任意组 合可以用本领域技术人员公知的任何克隆方法从生物来源中获得。在一 些实施方案中，在严格条件下选择性与本发明的多核苷酸杂交的寡核苷 酸探针被用于鉴定cDNA或基因组DNA文库中的所需序列。RNA的分离和 cDNA以及基因组文库的构建是本领域普通技术人员所公知的。(见，例 如Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。
核酸筛选和分离方法
可以采用基于本发明的多核苷酸序列的探针筛选cDNA或基因组文 库，如此处所公开。可以用探针与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分 离相同或不同生物体中的同源基因。本领域技术人员将理解，在测定中 可以使用不同严格性程度的杂交，杂交或洗涤介质中的任意一个都可以 是严格的。当杂交条件更严格时，探针和靶序列之间的互补性必须更高， 这样才能形成双链体。严格性程度可以由温度、离子强度、pH和甲酰胺 等部分变性溶剂的存在中的一个或多个条件进行控制。例如，杂交的严 格性可以通过改变反应物溶液的极性而方便地改变，反应物溶液的极性 可以通过例如在0％-50％的范围内操作甲酰胺的浓度而改变。可检测的 结合所要求的互补性程度(序列等同性)将根据杂交介质和/或洗涤介 质的严格性而改变。互补性程度最佳为100％或70-100％，或其中的任意 范围或任意值。然而，应该理解，探针和引物中的小量序列变异可以通 过减少杂交和/或洗涤介质的严格性而补偿。
扩增RNA或DNA的方法是本领域公知的，可以根据此处的教导和指 导用于本发明，而不需要过多的实验。
已知的扩增RNA或DNA的方法包括，但不限于聚合酶链式反应(PCR) 和相关的扩增方法(见，例如，Mullis等的美国专利4,683,195，4,68 3,202， 4,800,159，4,965,188；Tabor等的4,795,699和4,921,794；Innis的 5,142,033；Wilson等的5,122,464；Innis的5,091,310；Gyllensten 等的5,066,584；Gelfand等的4,889,818；Silver等的4,994,370；Biswas 的4,766,067；Ringold的4,656,134)和RNA介导的扩增，该扩增中使 用靶序列的反义RNA作为模板用于双链DNA合成(Malek等的美国专利 5,130,238，商品名为NASBA)，在此全文引入所有参考文献作为参考。 (见，例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上。)
例如，可以用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组DNA或cDNA文库 直接扩增本发明的多核苷酸序列和相关基因。也可以用PCR和其它体外 扩增方法克隆需要表达的蛋白的编码核酸序列，制备用于检测样品中是 否存在所需mRNA的探针，对核酸测序，或其它目的。足够指导技术人 员使用体外扩增方法的技术的例子见，Berger，同上，Sambrook，同上， 和Ausubel，同上，以及Mullis等的美国专利4,683,202(1987)；以及 Innis等，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications，Eds.， Academic Press Inc.，San Diego，CA(1990)。用于基因组PCR扩增的 商品化试剂盒是本领域已知的。见，例如，Advantage-GC基因组PCR试 剂盒(Clontech)。此外，如T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可以 用于改进长PCR产物的产率。
构建核酸的合成方法
本发明的分离核酸也可以根据已知方法通过直接化学合成而制备 (见，例如Ausubel等，同上)。化学合成一般产生单链核苷酸，该单 链核苷酸可以通过与互补序列杂交或通过用单链作为模板，采用DNA聚 合酶进行聚合而转化为双链DNA。本领域技术人员了解，尽管DNA的化 学合成可以限制在约100或更多碱基的序列，也可以通过较短序列的连 接获得较长的序列。 重组表达盒
本发明进一步提供了包含本发明的核酸的重组表达盒。本发明的核 酸序列，例如，编码本发明的抗体的cDNA或基因组序列可以用于构建 重组表达盒，该表达盒可以被导入至少一种需要的宿主细胞。重组表达 盒一般包含本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作性连接于指导多核苷 酸在目的宿主中转录的转录起始调节序列。异源性和非异源性(即内源 性)启动子可以用于指导本发明的核酸分子的表达。
在一些实施方案中，作为启动子、增强子或其它元件的分离核酸可 以导入本发明的多核苷酸的非异源形式中的适当位置(位于内含子上 游、下游或内部)，以便上调或下调本发明的多核苷酸的表达。例如， 可以通过突变、去除和/或取代而体内或体外改变内源性启动子。 载体和宿主细胞
本发明也涉及包含本发明的分离核酸分子的载体，用重组载体基因 工程化的宿主细胞，以及通过本领域公知的重组技术产生至少一种抗双 整联蛋白抗体。见，例如，Sambrook等，同上；Ausubel等，同上，在 此全文引入作为参考。
多核苷酸可以任选与含有可选择标记的载体连接，用于在宿主中增 殖。一般地，将质粒载体导入一种沉淀物，例如磷酸钙沉淀，或导入具 有带电脂质的复合物。如果载体是病毒，可以用适当的包装细胞系将其 包装后转导至宿主细胞。
DNA插入物可以操作性与适当启动子连接。表达构建体进一步包含 转录起始位点、转录终止位点和转录区中的位点，以及用于翻译的核糖 体结合位点。由构建体表达的天然转录物的编码部分将优选包含位于起 始处的翻译起始密码子和位于被翻译的mRNA末端适当位置的终止密码 子(如UAA，UGA或UAG)，哺乳动物或真核细胞表达优选采用UAA和UAG。
表达载体优选但任选包含至少一种可选择标记。这些标记包括，例 如，但不限于真核细胞培养物的氨甲喋呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR， 美国专利4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288；5,149,636； 5,179,017)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS， 美国专利5,122,464；5,770,359；5,827,739)抗性基因，以及大肠杆 菌和其它细菌或原核生物的四环素或氨苄青霉素抗性基因(上述专利在 此全文引入作为参考)。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领 域公知的。适当的载体是本领域技术人员容易理解的。可以通过磷酸钙 转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、阴离子脂质介导的转染、电穿孔、 转导、感染或其它已知方法将载体构建体导入宿主细胞。这些方法在本 领域有描述，例如Sambrook，同上，1-4和16-18章；Ausubel，同上， 1，9，13，15，16章。
本发明的至少一种抗体可以以修饰的形式，例如以融合蛋白的形式 表达，并且可以包括分泌信号和其它异源功能区。例如，其它的氨基酸 区域，特别是带电氨基酸区域可以添加至抗体的N端以改进纯化或随后 的加工和储存过程中在宿主中的稳定性和耐受性。也可以将本发明的肽 部分添加至本发明的抗体，以促进纯化。这些区域可以在抗体或其至少 一个片段的最终制备之前去除。这些方法描述于许多实验室手册，例如 Sambrook，同上，17.29-17.42和18.1-18.74章；Ausubel，同上，16，17 和18章。
本领域普通技术人员了解，许多表达系统都可以用于表达编码本发 明的蛋白的核酸。
作为选择，本发明的核酸可以通过在包含编码本发明的抗体的内源 性DNA的宿主细胞中打开(turning on)(通过操作)而在宿主细胞中表 达。这些方法是本领域公知的，如描述于美国专利5,580,734，5,641,670， 5,733,746，和5,733,761，在此引入每一篇专利作为参考。
用于产生抗体、其特定部分或变体的示例性的细胞培养物为哺乳动 物细胞。哺乳动物细胞系统一般是单层细胞的形式，但也可以使用哺乳 动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域中已经开发了许多能够表达完整 糖基化蛋白的适当宿主细胞系，包括COS-1(如ATCC CRL 1650)，COS-7(如 ATCC CRL1651)，HEK293，BHK21(如ATCC CRL-10)，CHO(如ATCC CRL 1610) 和BSC-1(如ATCC CRL-26)细胞系，Cos-7细胞，CHO细胞，hep G2细 胞，P3X63Ag8.653，SP2/0-Ag14，293细胞，HeLa细胞等，它们可以容 易从例如美国典型培养物保藏中心Manassas，Va(www.atcc.org)获 得。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC保藏号CRL-1580) 和SP2/0-Ag14细胞(ATCC保藏号CRL-1851)。在一种特别优选的实施方 案中，重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。
这些细胞的表达载体可以包含一种或多种以下表达控制序列，例 如，但不限于复制起点；启动子(如晚期或早期SV40启动子，CMV启动 子(美国专利5,168,062；5,385,839)、HSV tk、pgk(磷酸甘油酯激 酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利5,266,491)、至少一种人类免疫 球蛋白启动子)；增强子和/或加工信号位点，例如核糖体结合位点，RNA 剪接位点、聚腺苷酸化位点(如SV40大TAg聚腺苷酸添加位点)和转 录终止子序列。见，例如Ausubel等，同上；Sambrook，等，同上。其 它用于产生本发明的核酸或蛋白的细胞是已知的和/或可得到的，例如 从美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(www.atcc.org)或商业 来源得到。
当使用真核宿主细胞时，一般将聚腺苷酸化或转录终止子序列掺入 载体。终止子序列的一个例子是来自于牛生长激素基因的聚腺苷酸化序 列。也可以包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列的一个例子是SV40 的VP1内含子(Sprague，et al.，J.Virol.45：773-781(1983))。此 外，用于控制宿主细胞中复制的基因序列可以掺入本领域公知的载体 中。 抗体的纯化
可以通过公知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化抗双整联蛋白 抗体，所述方法包括，但不限于，蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸 提取、阴离子或阴离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、 亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。也可以采用高效液相层析 (″HPLC″)进行纯化。见，例如，Colligan，Current Protocols in Immunology，或Current Protocols in Protein Science，John Wiley& Sons，NY，NY，(1997-2001)，例如1，4，6，8，9，10章，在此全文 引入作为参考。
本发明的抗体包括天然纯化产物，化学合成程序产物，以及通过重 组技术从酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞等真核宿主产生的产物。 根据在重组产生程序中使用的宿主，本发明的抗体可以本发明的抗体可 以被糖基化或可以未糖基化，优选被糖基化。这些方法描述于许多实验 室手册，例如Sambrook，同上，17.37-17.42部分；Ausubel，同上，10， 12，13，16，18和20章；Colligan，Protein Science，同上，12-14 章，在此全文引入所有这些文献作为参考。
抗双整联蛋白抗体
本发明的分离抗体包含由任意适当的多核苷酸编码的此处公开的抗 体氨基酸序列，或任意分离的或制备的抗体。人抗体或抗原结合片段优 选结合人双整联蛋白，并因此部分或基本上中和该蛋白的至少一种生物 活性。部分或基本上中和至少一种双整联蛋白或其片段的生物活性的抗 体或其特定部分或变体可以结合该蛋白或片段，从而抑制由双整联蛋白 与双整联蛋白受体的结合介导的或其它双整联蛋白依赖性或双整联蛋白 介导的机制。此处用到的术语“中和抗体”是指根据所采用的测定，可 以抑制约20-120％，优选至少约10，20，30，40，50，55，60，65，70，75， 80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100％的双整联蛋 白依赖性活性的抗体。抗双整联蛋白抗体抑制双整联蛋白依赖性活性的 能力优选通过至少一种适当的双整联蛋白或受体测定方法进行评估，如 此处的描述和/或本领域公知。本发明的人抗体可以是任意类型(IgG，IgA， IgM，IgE，IgD等)或同种型，可以包含κ或λ轻链。在一种实施方案中， 人抗体包含一个IgG重链或限定的片段，例如，同种型IgG1，IgG2，IgG3 或IgG4中的至少一种。这种类型的抗体可以通过使用含有至少一种人 轻链(如IgG，IgA和IgM(如γ1，γ2，γ3，γ4))转基因的转基因 小鼠或其它转基因非人哺乳动物制备，如此处的描述和/或本领域所公 知。在另一种实施方案中，抗人双整联蛋白人抗体包含一个IgG1重链 和一个IgG1轻链。
本发明的至少一种抗体结合至少一种特异于双整联蛋白、其亚基、 片段、部分或其任意组合的至少一种特定表位。所述至少一种表位包含 至少一个抗体结合区，该区包含所述蛋白的至少一部分，该表位优选由 所述蛋白的至少一个细胞外、可溶性、亲水性、外部或细胞质部分组成。 所述至少一种特定表位可以包含SEQ ID NOs：9，16或17的至少1-3个 氨基酸至SEQ ID NOs：9，16或17的连续氨基酸的完整特定部分的任意 组合。
本发明的人抗体或抗原结合片段一般将包含一个抗原结合区，该区 包含至少一个重链可变区的至少一个人互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3) 或变体和至少一个轻链可变区的至少一个人互补决定区(CDR1，CDR2和 CDR3)或至少变体。作为非限制性的实例，抗体或抗原结合部分或变体 可以包含至少一种具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链CDR3，和/或 具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链CDR3。在一种特定的实施方案 中，抗体或抗原结合片段可以具有一种抗原结合区，该区包含具有相应 CDR1，CDR2和/或CDR3的氨基酸序列(如SEQ ID NOS：1，2和/或3) 的至少一个重链CDR(即CDR1，CDR2和/或CDR3)的至少一部分。在另 一种特定实施方案中，抗体或抗原结合部分或变体可以具有一种抗原结 合区，该区包含具有相应CDR1，CDR2和/或CDR3的氨基酸序列(如SEQ ID NOS：4，5和/或6)的至少一个轻链CDR(即CDR1，CDR2和/或CDR3) 的至少一部分。在一种优选实施方案中，抗体或抗原结合片段的三种重 链CDR和三种轻链CDR具有单克隆抗体TNV148，TNV14，TNV15，TNV196， TNV15，TNV118，TNV32，TNV86中的至少一种的相应CRD的氨基酸序列， 如此处的描述。可以使用常规技术通过将抗体的各种部分(如CDR、构 架区)化学连接在一起而制备这些抗体，也可以通过常规重组DNA技术 或任何其它适当方法制备和表达一种(即一种或多种)编码抗体的核酸 分子而制备这些抗体。
抗双整联蛋白抗体可以包含至少一种具有确定氨基酸序列的重链或 轻链可变区。例如，在一种优选实施方案中，抗双整联蛋白抗体包含至 少一种任选具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变区和/或至少一 种任选具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区。结合于人双整联 蛋白的抗体和包含确定的重链和轻链可变区的抗体可以用适当方法制 备，例如噬菌体展示(Katsube，Y.，et al.，Int J Mol.Med，1(5)： 863-868(1998))或使用转基因动物的方法，如本领域所公知和/或此处 所描述。例如，可以用人双整联蛋白或其片段免疫转基因小鼠以诱导抗 体的产生，该转基因小鼠包含功能性重排的人免疫球蛋白重链转基因和 包含来源于能够进行功能性重排的人免疫球蛋白轻链基因座的转基因。 如果需要，可以采用此处描述的和/或本领域公知的方法分离抗体产生 细胞以及制备杂交瘤或其它永生化的抗体产生细胞。作为选择，可以在 适当宿主细胞中用其编码核酸或其部分表达抗体、其特定部分或变体。
本发明也涉及包含与此处描述的氨基酸序列基本相同的序列中的氨 基酸的抗体、抗原结合片段、免疫球蛋白链和CDR。这些抗体或抗原结 合片段和包含所述链或CDR的抗体可以以高亲和性(如KD小于或等于约 10-9M)与人双整联蛋白结合。与此处描述的序列基本相同的氨基酸序列 包括含有保守氨基酸取代和氨基酸去除和/或插入的序列。保守氨基酸 取代是指，用具有与第一种氨基酸相似的化学和/或物理特性(如电荷、 结构、极性、疏水性/亲水性)的第二种氨基酸代替第一种氨基酸。保 守氨基酸取代包括用下列各组中的一种氨基酸代替另一种氨基酸：赖氨 酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)， 谷氨酰胺(Q)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，酪氨酸(Y)，K，R，H，D和E； 丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，脯氨酸(P)，苯丙 氨酸(F)，色氨酸(W)，甲硫氨酸(M)，半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)F，W和 Y；C，S和T。 氨基酸代码
组成本发明的抗双整联蛋白抗体的氨基酸通常以缩写表示，可以通 过单字母代码、三字母代码、名称或三核苷酸密码子表示氨基酸，这是 本领域公知的(见(see Alberts，B.，et al.，Molecular Biology of The Cell，Third Ed.，Garland Publishing，Inc.，New York，1994)： 单字母代码  三字母代码     名称   三核苷酸密码子     A     Ala   丙氨酸 GCA，GCC，GCG，GCU     C     Cys   半胱氨酸 UGC，UGU     D     Asp   天冬氨酸 GAC，GAU     E     Glu   谷氨酸 GAA，GAG     F     Phe   苯丙氨酸 UUC，UUU     G     Gly   谷氨酸 GGA，GGC，GGG，GGU     H     His   组氨酸 CAC，CAU     I     Ile   异亮氨酸 AUA，AUC，AUU     K     Lys   赖氨酸 AAA，AAG     L     Leu   亮氨酸 UUA，UUG，CUA，CUC， CUG，CUU     M     Met   甲硫氨酸 AUG     N     Asn   天冬酰胺 AAC，AAU     P     Pro   脯氨酸 CCA，CCC，CCG，CCU     Q     Gln   谷氨酰胺 CAA，CAG     R     Arg   精氨酸 AGA，AGG，CGA，CGC， CGG，CGU     S     Ser   丝氨酸 AGC，AGU，UCA，UCC， UCG，UCU     T     Thr   苏氨酸 ACA，ACC，ACG，ACU     V     Val   缬氨酸 GUA，GUC，GUG，GUU     W     Trp   色氨酸 UGG     Y     Tyr   酪氨酸 UAC，UAU
本发明的双整联蛋白抗体可以包括这里所指出的通过天然突变或人 工操作导致的一个或多个氨基酸取代、去除或添加。
当然，技术人员所进行的氨基酸取代的数目将取决于许多因素，包 括前面提到的那些。一般说来，任何给定的抗双整联蛋白抗体、片段或 变体的氨基酸取代、插入或去除的数目不超过40，30，20，19，18，17， 16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1，例如1-30 或其中的任意范围或任意值，如此处所规定。
可以通过本领域公知的方法鉴定对功能起关键作用的本发明的抗双 整联蛋白抗体中的氨基酸，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(如Ausubel， 同上，8，15章；Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989))。 后一种程序在分子中每个残基处导入单个丙氨酸突变。然后检测得到的 突变分子的生物活性，例如，但不限于至少一种双整联蛋白中和活性。 也可以通过结晶、核磁共振或光亲和性标记等结构分析鉴定抗体结合的 关键位点(Smith，et al.，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)and de Vos，et al.，Science 255：306-312(1992))。
本发明的抗双整联蛋白抗体可以包括，但不限于选自SEQ ID NOS：1， 2，3，4，5，6中至少一个的5个至所有连续氨基酸的至少一种部分、 序列或组合。
本发明的抗双整联蛋白抗体可以进一步任选包含一种具有SEQ ID NOS：7，8中的至少一个的70-100％的连续氨基酸的多肽。
在一种实施方案中，免疫球蛋白链的氨基酸序列或其部分(如可变 区、CDR)与SEQ ID NOS：7，8中的至少一个的相应链的氨基酸序列具有 约70-100％的等同性(如70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80， 81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97， 98，99，100或其中的任意范围或任意值)。例如，轻链可变区的氨基酸 序列可以与SEQ ID NO：8的序列相似，或重链CDR3的氨基酸序列可以 与SEQ ID NO：7相似。优选地，用本领域公知的适当计算机算法确定出 具有70-100％的氨基酸等同性(即90，91，92，93，94，95，96，97，98， 99，100或其中的任意范围或任意值)。
示例性的重链和轻链可变区序列见SEQ ID NOS：7，8。本发明的抗 体或其特定变体可以包含来源于本发明的一种抗体的任意数目的连续氨 基酸，其中该数目选自抗双整联蛋白抗体中连续残基数目的10-100％。 该连续氨基酸的亚序列长度为至少约10，20，30，40，50，60，70，80， 90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220， 230，240，250或更多，或其中的任意范围或任意值。此外，这些亚序 列的数目可以是选自1-20的任意整数，例如至少为2，3，4或5。
本领域技术人员可以理解，本发明包括本发明的至少一种生物活性 抗体。生物活性抗体具有天然(非合成)、内源性或相关和已知抗体的 至少20％，30％或40％的特异活性，优选至少50％，60％或70％，最优选具 有天然、内源性或相关和已知抗体的至少80％，90％或95％-1000％的特异 活性。测定和定量测定酶活性和底物特异性的方法是本领域技术人员公 知的。
另一方面，本发明涉及此处描述的人抗体和抗原结合片段，它们可 以通过共价连接有机部分而得到修饰。这种修饰可以产生具有改进的药 代动力学特性(如增加的体内血清半衰期)的抗体或抗原结合片段。有 机部分可以是线性或分支的疏水聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基 团。在特定实施方案中，亲水聚合物基团的分子量可以为约800- 120000Da，并且可以是聚链烷醇(如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、 碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯基吡咯烷酮，脂肪酸或脂肪 酸酯基团可以包含约8-40个碳原子。
本发明的修饰抗体和抗原结合结合片段可以包含与抗体直接或间接 共价结合的一种或多种有机部分。与本发明的抗体或抗原结合片段结合 的每一种有机部分可以独立是亲水聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯 基团。这里用到的“脂肪酸”包括单羧酸和二羧酸，这里用到的“亲水 聚合物基团”是指在水中比在辛烷中的溶解度更高的有机聚合物。例如， 聚赖氨酸在水中比在辛烷中的溶解度更高。因此，本发明包括通过共价 连接聚赖氨酸而被修饰的抗体。适于修饰本发明的抗体的亲水聚合物可 以是线性的或分支的，可以包括，例如聚链烷醇(如PEG、单甲氧基-聚 乙二醇(mPEG)、PPG等)，碳水化合物(如右旋糖苷、纤维素、寡糖、多 糖等)，亲水氨基酸的聚合物(如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)， 聚环氧烷(如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯基吡咯烷酮。修饰 本发明的抗体的亲水聚合物作为独立分子实体的分子量优选为约800- 150,000Da。例如，PEG5000和PEG20,000，其中下标是以Da为单位表示的可 以使用的聚合物的分子量。可以用1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯 基团取代亲水聚合物。可以采用适当的方法制备用脂肪酸或脂肪酸酯基 团取代的亲水聚合物。例如，包含胺基的聚合物可以与脂肪酸或脂肪酸 酯的羧基偶联，脂肪酸或脂肪酸酯的上的活化羧基(如用N，N-羰基二咪 唑活化)可以与聚合物上的羟基偶联。
适于修饰本发明的抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的或可以包 含一个或多个不饱和单元。适于修饰本发明的抗体的脂肪酸包括，例如 正十二烷酸(C12，月桂酸)，正十四烷酸(C14，肉豆蔻酸)，正十八烷酸(C18 硬脂酸)，正二十烷酸(C20，花生酸)，正二十二烷酸(C22，山嵛酸)，正 三十烷酸(C30)，正四十烷酸(C40)，顺式-Δ9-十八烷酸(C18，油酸)，全 顺式-Δ5，8，11，14-二十碳四烯酸(C20，花生四烯酸)，辛二酸，十四烷 二酸，十八烷二酸，二十二烷二酸等。适当的脂肪酸酯包括含有线性或 分支低级烷基的二羧酸单酯。低级烷基可以包含1个至约12个，优选1 个至约6个碳原子。
可以通过适当的方法，例如通过与一种或多种修饰剂反应而制备修 饰的人抗体和抗原结合片段。此处用到的“修饰剂”是指包括活化基团 的适当有机基团(如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是 指在适当条件下，可以与第二种化学基团反应，从而形成修饰剂与第二 种化学基团之间的共价键的化学部分或官能团。例如，胺反应性活化基 团包括亲电子基团，如甲苯磺酸酯、甲磺酰酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、 N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可以与硫醇反应的活化基团包括，例如， 马来酰亚胺、碘代乙酰基、丙烯酰基、二硫吡啶、5-硫羟-2-硝基苯甲 酸硫醇(TNB硫醇)等。可以将醛官能团与含有酰胺或酰肼的分子偶联， 可以使叠氮基与三价磷酸基反应形成氨基磷酸酯或亚氨代磷酸酯键。用 于将活化基团导入分子的适当方法是本领域公知的(见例如，Hermanson， G.T.，Bioconjugate Techniques.Academic Press：San Diego，CA (1996))。活化基团可以直接与有机基团(如亲水聚合物、脂肪酸、脂 肪酸酯)结合，或通过接头部分与其结合，所述接头部分例如为二价C1-C12 基团，其中一个或多个碳原子可以被氧、氮或硫等杂原子取代。适当的 接头部分包括，例如，四甘醇、-(CH2)3-，-NH-(CH2)6-NH-，-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。例如，可以在1-乙基-3-(3-二 甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)存在下使单-Boc-烷基二亚胺(如单-Boc- 乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应，在游离胺和脂肪酸羧基 之间形成酰胺键，以便产生包含接头部分的修饰剂。用四氟乙酸(TFA) 处理产物，从而使伯胺暴露，可以从产物去除Boc保护基，该伯胺可以 与上述另一羧基偶联，或可以与马来酸酐反应，将得到的产物环化可以 产生被活化的脂肪酸的马来酰亚胺衍生物。(见，例如。Thompson，et al.， WO 92/16 221，在此引入其完整教导作为参考。)
本发明的修饰抗体可以通过使人抗体或抗原结合片段与修饰剂反应 而产生。例如，通过采用胺反应性修饰剂，例如，PEG的NHS酯，有机 部分可以与抗体以非位点特异性方式结合。也可以通过还原抗体或抗原 结合片段的二硫键(如链内二硫键)而制备修饰的人抗体或抗原结合片 段。然后可以使被还原的抗体或抗原结合片段与硫醇反应性修饰剂反 应，以便产生本发明的修饰抗体。可以采用反向蛋白水解等适当方法制 备包含与本发明抗体的特异位点结合的有机部分的修饰人抗体和抗原结 合片段(Fisch et al.，Bioconjugate Chem.，3：147-153(1992)；Werlen et al.，Bioconjugate Chem.，5：411-417(1994)；Kumaran et al.， Protein Sci.6(10)：2233-2241(1997)；Itoh et al.，Bioorg.Chem.， 24(1)：59-68(1996)；Capellas et al.，Biotechnol.Bioeng.，56(4)： 456-463(1997))，也可以采用描述于Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996)中的方法。 抗双整联蛋白抗体成分的抗独特型抗体
除单克隆抗体或嵌合抗双整联蛋白抗体外，本发明还涉及特异于本 发明的这些抗体的抗独特型(抗Id)抗体。抗Id抗体是识别独特决定 簇的抗体，所述决定簇一般与另一种抗体的抗原结合区相关。可以用抗 体或其含CDR的区域免疫与作为Id抗体来源的动物相同物种和基因型 (如小鼠株)的动物，从而制备抗Id。被免疫的动物将识别免疫抗体的 独特型决定簇并对其产生应答，并且产生抗Id抗体。抗Id抗体也可以 用作“免疫原”以诱导另一动物的免疫应答，产生所谓的抗-抗独特型 抗体。 抗双整联蛋白抗体组合物
本发明也提供至少一种以天然存在的组合物、混合物或形式提供的 抗双整联蛋白抗体组合物，其中包含此处描述的和/或本领域公知的至 少一种、至少两种、至少四种、至少五种、至少六种或更多抗双整联蛋 白抗体。这些组合物包括天然存在的组分，包括抗双整联蛋白抗体氨基 酸序列的至少一种或两种全长的序列、C和/或N端去除的变体、结构域、 片段、或特定变体，该抗双整联蛋白抗体氨基酸序列选自SEQ ID NOS：1， 2，3，4，5，6，7，8的70-100％的连续氨基酸或其特定片段、结构域 或变体。优选的抗双整联蛋白抗体组合物包括抗双整联蛋白抗体氨基酸 序列的至少一种含CDR或LBR的部分的至少一种或两种全长的序列、片 段结构域或变体，该抗双整联蛋白抗体氨基酸序列选自SEQ ID NOS：1，2， 3，4，5，6的70-100％的连续氨基酸或其特定片段、结构域或变体。更 优选的组合物包含选自SEQ ID NOS：1，2，3，4，5，6的70-100％的 连续氨基酸或其特定片段、结构域或变体中的至少一种的40-99％。组分 百分比是液体或干溶液、混合物、悬浮液、乳状液或胶体的重量、体积、 浓度、体积克分子浓度或重量克分子浓度百分比，如本领域所公知或此 处的描述。
本发明的抗双整联蛋白抗体可以进一步包含任意适当的有效量的组 分或药物组分中的至少一种，所述组分包括需要这种调节、处理或治疗 的细胞、组织、器官、动物或病人的至少一种抗双整联蛋白抗体，该组 合物任选进一步包含至少一种选自以下物质的组分：至少一种TNF拮抗 剂(例如，但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或其片段、其融 合蛋白、或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药物(如氨甲喋呤、金诺芬、金 硫葡萄糖、硫唑嘌呤、etanercept、硫代苹果酸金钠、硫酸羟基氯喹、 来氟米特、柳氮磺胺吡啶)、肌肉松弛剂、麻醉药(narcotic)、非甾体 类抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂(anesthetic)、镇静剂、局部麻醉剂、 神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂(如氨基糖苷、抗真菌剂、抗寄生虫剂、 抗病毒剂、carbapenem、头孢菌素、flurorquinolone、大环内酯、青霉 素、磺胺、四环素、其它抗微生物剂)、抗牛皮癣药物、皮质类固醇、 促蛋白合成类固醇、糖尿病相关试剂、矿物质、营养剂、甲状腺制剂、 维生素、钙相关激素、抗腹泻药、止咳药、抗呕吐药、抗溃疡药、通便 药、抗凝剂、促红细胞生成素(如epoetinα)、非尔司啶(如G-CSF， Neupogen)、沙拉斯(GM-CSF，白细胞素)、疫苗、免疫球蛋白、免疫抑 制剂(如basiliximab、环孢霉素、daclizumab)、生长激素、激素替代 药物、雌激素受体调节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、 有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、抗躁狂药、 抗精神病药物、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药物、刺激剂、donepezil、 他克林、抗哮喘药、β激动剂、吸入性类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄 嘌呤、9-氨基四氢吖啶、肾上腺素或类似物、α链道酶(Pulmozyme)、 细胞因子或细胞因子拮抗剂。细胞因子的非限制性实例包括，但不限于 IL-1至IL-23中的任意一种。适当的剂量是本领域公知的。见，例如， Wells et al.，eds.，Pharmacotherapy Handbook，2nd Edition，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，Loma Linda， CA(2000)，在此全文引入作为参考。
这些抗癌或抗感染试剂也可以包括与本发明的至少一种抗体缔合、 结合、共同制剂化或共同给药的毒素分子。毒素可以任选选择性杀灭病 变细胞或组织。病变细胞可以癌或其它细胞。这些毒素可以是，但不限 于，纯化或重组毒素或毒素片段，它包含如选自蓖麻毒素、白喉毒素、 蛇毒毒素或细菌毒素中的至少一种的毒素的至少一种功能性细胞毒性结 构域。毒素也包括由任意天然存在的、突变或重组细菌或病毒的内毒素 和外毒素，它们可以导致人类或其它哺乳动物中的任意病理学状况，包 括致死的毒素休克。这些毒素可以包括，但不限于，产肠毒素的大肠杆 菌的热不稳定性肠毒素(LT)、热稳定性肠毒素(ST)、志贺氏菌细胞毒素、 Aeromonas肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌肠毒 素A(SEA)，B(SEB)或C(SEC)、链球菌肠毒素等。所述细菌包括，但不 限于，产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)、肠出血性大肠杆菌(如血清型0157：H7 的菌株)、葡萄球菌物种(如金黄色葡萄球菌、化脓性葡萄球菌)、志贺 氏菌物种(如痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和索氏志贺 氏菌)、沙门氏菌物种(如伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门 氏菌)、梭菌物种(如产气荚膜梭菌、艰难梭菌、肉毒梭菌)、弯曲杆菌 物种(如空肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌)、螺杆菌物种(如幽门螺杆菌)、 气单胞菌物种(如温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌)、类 志贺邻单孢菌、小肠结肠盐耶尔森氏菌、Vibrios物种(如霍乱弧菌、 副溶血弧菌)、克雷白氏菌物种、铜绿假单孢菌和链球菌。见，例如，Stein， ed.，INTERNAL MEDICINE，3rd ed.，pp 1-13，Little，Brown and Co.， Boston，(1990)；Evans et al.，eds.，Bacterial Infections of Humans： Epidemiology and Control，2d.Ed.，pp 239-254，Plenum Medical Book Co.，New York(1991)；Mandell et al，Principles and Pract ice of Infectious Diseases，3d.Ed.，Churchill Livingstone，New York (1990)；Berkow et al，eds.，The Merck Manual，16th edition，Merck and Co.，Rahway，N.J.，1992；Wood et al，FEMS Microbiology Immunology，76：121-134(1991)；Marrack et al，Science，248：705-711 (1990)，在此全文引入这些参考文献的完整内容作为参考。
本发明的抗双整联蛋白抗体化合物、组合物或其组合可以进一步包 含任意适当辅助物质，例如，但不限于稀释液、粘合剂、稳定剂、缓冲 剂、盐、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂等中的至少一种。优选药学可接受的 辅助物质。这些无菌溶液的非限制性的例子和制备方法是本领域公知 的，例如，但不限于Gennaro，Ed.，Remington′s Pharmaceutical Sciences， 18th Edition，Mack Publishing Co.(Easton，PA)1990。可以常规选 择药学可接受的载体，这些载体适于抗双整联蛋白抗体、片段或变体组 合物的给药方式、溶解度和/或稳定性，如本领域公知或此处的描述。
用于本发明的组合物的药物赋形剂和添加剂包括，但不限于蛋白、 肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(如糖，包括单糖、双糖、三糖、四糖 和寡糖；衍生糖，如醛醇、醛酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)， 可以单个或组合存在，单独或组合占重量或体积1-99.99％。示例性的蛋 白赋形剂包括血清白蛋白，如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、 明胶、酪蛋白等。可以起缓冲作用的代表性氨基酸/抗体成分包括丙氨 酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、 赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺 等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适用于本发明的碳水化合物赋形剂包括，例如单糖，如果糖、麦芽 糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；双糖，如乳糖、蔗糖、海 藻糖、纤维二糖等；；多糖，如棉籽糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖 苷、淀粉等；以及醛醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖 醇山梨糖醇(葡萄糖醇)、肌醇等。用于本发明的优选的碳水化合物赋 形剂是甘露醇、海藻糖和棉籽糖。
抗双整联蛋白抗体组合物也可以包含缓冲剂或pH调节剂；一般地， 缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性的缓冲剂包括有机酸盐，例如 柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二 甲酸的盐；Tris，盐酸tromethamine、或磷酸缓冲液。用于本发明的组 合物中的优选缓冲剂是有机酸盐如柠檬酸盐。
此外，本发明的抗双整联蛋白抗体组合物可以包含聚合物赋形剂/ 添加剂，如聚乙烯基吡咯烷酮、ficolls(一种聚合的糖)、dextrates(如 环糊精，例如2-羟基丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、矫味剂、抗微生物 剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(如聚山梨醇酯，例如 ″TWEEN 20″和″TWEEN 80″)、脂质(如磷脂、脂肪酸)、类固醇(如胆固 醇)和螯合剂(如EDTA)。
适用于抗双整联蛋白抗体、部分或变体组合物的这些和其它已知药 物赋形剂和/或添加剂是本领域公知的，例如，列于″Remington：The Science & Practice of Pharmacy″，19th ed.，Williams & Williams， (1995)，和″Physician′s Desk Reference″，52nd ed.，Medical Economics， Montvale，NJ(1998)，在此引入其完整公开内容作为参考。优选的载体 或赋形剂物质是碳水化合物(如糖和醛醇)和缓冲剂(如柠檬酸盐)或 聚合剂。 制剂
如前面所指出的，本发明提供了稳定的制剂，优选为含有盐或选择 的盐的磷酸缓冲液，以及含有防腐剂的储存溶液和制剂，适于药用或兽 医用途的多用途储存制剂，它包含置于药学可接受制剂中的至少一种抗 双整联蛋白抗体。储存制剂包含至少一种已知的防腐剂或任选选自至少 一种苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、 苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(如六水合物)、对羟基苯甲酸烷 基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苯索氯铵、脱氢乙酸 钠和乙基汞硫代水杨酸钠，或其在一种水性稀释液中的混合物。可以使 用本领域公知的任何适当浓度或混合物，例如0.001-5％，或其中的任意 范围或任意值，例如，但不限于，0.001，0.003，0.005，0.009，0.01，0.02， 0.03，0.05，0.09，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0， 1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3， 2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6， 3.7，3.8，3.9，4.0，4.3，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，或其中的任意 范围或任意值。非限制性实例包括，无防腐剂，0.1-2％间甲酚(如0.2，0.3， 0.4，0.5，0.9，1.0％)，0.1-3％苯甲醇(如0.5，0.9，1.1，1.5，1.9，2.0， 2.5％)，0.001-0.5％乙基汞硫代水杨酸钠(如0.005，0.01)，0.001-2.0％ 苯酚(如0.05，0.25，0.28，0.5，0.9，1.0％)，0.0005-1.0％对羟基苯 甲酸烷基酯(如0.00075，0.0009，0.001，0.002，0.005，0.0075，0.009， 0.01，0.02，0.05，0.075，0.09，0.1，0.2，0.3，0.5，0.75，0.9，1.0％) 等。
如前面所指出的，本发明提供了一种制品，包括包装材料和至少一 个管形瓶，其中包含至少一种抗双整联蛋白抗体的溶液和规定的缓冲剂 和/或防腐剂，任选溶于一种水性稀释液，其中所述包装材料包括一种 标签，它指出所述溶剂可以保留1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、 30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长的时间。本发明进一步 包括一种制品，包括包装材料和含有至少一种冷冷冻干燥燥的抗双整联 蛋白抗体的第一个管形瓶，和含有规定的缓冲剂或防腐剂的水性稀释液 的第二个管形瓶，其中包装材料包括一种标签，它指导患者在水性稀释 液中重构至少一种抗双整联蛋白抗体，以便形成可以保留24小时或更 长时间的溶液。
根据本发明而使用的至少一种抗双整联蛋白抗体可以通过重组方法 产生，包括从哺乳动物细胞或转基因制剂重组产生，或者从其它生物来 源纯化，如此处所描述或本领域公知。
在本发明的产品中的至少一种抗双整联蛋白抗体的范围包括在湿/ 干体系中重构时，产生约1.0μg/ml至约1000mg/ml的量，但更低和更 高的浓度也是可行的，并且依赖于准备使用的递送载体，例如，溶液制 剂将不同于经皮贴剂、肺、经粘膜或渗透或微泵方法。
优选地，水性稀释液任选进一步包含药学可接受的防腐剂，优选的 防腐剂包括选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对 羟基苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苯索氯 铵、脱氢乙酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠，或其混合物的那些。用于制剂 中的防腐剂的浓度为足以产生抗微生物作用的浓度。这些浓度取决于选 择的防腐剂，并且本领域技术人员很容易确定。
可以任选和优选将其它赋形剂，如等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、防 腐增强剂加入稀释液中。甘油等等渗剂通常以公知的浓度使用。优选加 入生理耐受的缓冲剂以改进pH控制。制剂可以有宽范围的pH值，例如 pH约4-10，优选pH约5-9，最优选约6.0-8.0。本发明的制剂的pH 优选为约6.8-7.8。优选的缓冲剂包括磷酸缓冲液，最优选为磷酸盐， 特别是磷酸缓冲盐水(PBS)。
也可以任选向制剂或组合物中加入其它添加剂，如药学可接受的增 溶剂，如Tween20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)、Tween40 (聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯)、Tween80(聚氧乙烯(20)山梨 糖醇酐单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG (聚乙二醇)或非离子型表面活性剂，例如聚山梨糖醇酯20或80、或 poloxamer 184或188、Pluronic多元醇其它共聚物，以及螯合剂如EDTA 和EGTA，以减少聚集。如果用泵或塑料容器给予制剂，则这些添加剂特 别有用。药学可接受的表面活性剂的存在减少了蛋白聚集的倾向。
可以通过以下方法制备本发明的制剂，包括将至少一种抗双整联蛋 白抗体和选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟 基苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苯索氯铵、 脱氢乙酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠，或其混合物在一种水性稀释液中混 合。采用常规的溶解和混合步骤在一种水性稀释液中混合所述至少一种 抗双整联蛋白抗体和防腐剂。为了制备适当的制剂，例如，可以将测得 量的溶于缓冲液中的至少一种抗双整联蛋白抗体在其量足以提供需要浓 度的蛋白和防腐剂的缓冲液中混合。本领域技术人员可以了解该方法的 变化。例如，加入各成分的顺序、是否使用其它添加剂、制备该制剂的 温度和pH都是可以对使用的浓度和给药方式进行优化的因素。
可以将本发明的制剂以澄清的溶液或作为双管形瓶的形式提供给患 者，双管形瓶包含一个装有至少一种冷冷冻干燥燥的抗双整联蛋白抗体 的管形瓶，将其用含有水、防腐剂和/或赋形剂，优选磷酸缓冲剂和/或 盐水和溶于水性稀释液中的选择的盐的第二个管形瓶重构。单一溶液的 管形瓶或要求重构的双管形瓶可以重复使用多次，并且可以满足病人治 疗的单个或多个周期，因此比当前存在的方法提供更方便的治疗方案。
本发明的制品可用于在24小时左右或更长的时间内给药。因此， 本发明的制备为患者提供了显著的优势。本发明的制剂任选可以储存在 约2-40℃的温度下储存，并且在长时间保持蛋白的生物活性，因此， 包装标签指出，该溶液可以在超过6、12、18、24、36、48、72或96小 时的时间内保留和/或使用。如果使用了储存稀释液，该标签指出，该 溶液可以在1-12个月，半年，一年半和/或两年的时间内用完。
本发明中的至少一种抗双整联蛋白抗体溶液可以通过包括在水性稀 释液中混合至少一种抗体的方法而制备。采用常规的溶解和混合步骤进 行混合。为了制备适当的稀释液，例如，可以将测得量的溶于水或缓冲 液中的至少一种抗体以足以提供所需浓度的蛋白和任选的防腐剂或缓冲 液的量混合。本领域技术人员可以了解该方法的变化。例如，加入各成 分的顺序、是否使用其它添加剂、制备该制剂的温度和pH都是可以对 使用的浓度和给药方式进行优化的因素。
本发明的产品可以以澄清的溶液或作为双管形瓶的形式提供给患 者，双管形瓶包含一个装有至少一种冷冷冻干燥燥的抗双整联蛋白抗体 的管形瓶，将其用含有水性稀释液的第二个管形瓶重构。单一溶液的管 形瓶或要求重构的双管形瓶可以重复使用多次，并且可以满足病人治疗 的单个或多个周期，因此比当前存在的方法提供更方便的治疗方案。
本发明的产品可以以澄清的溶液或作为双管形瓶的形式提供给药 店、诊所、或其它机构和设施，从而直接提供给患者，其中双管形瓶包 含一个装有至少一种冷冷冻干燥燥的抗双整联蛋白抗体的管形瓶，将其 用含有水性稀释液的第二个管形瓶重构。此情况下的澄清溶液最多可达 1升或甚至更多，提供于大的储存容器，从中可以一次或多次取出至少 一种抗体溶液的更小部分，将其转移至更小的管形瓶中，由药店或诊所 提供给客户和/或病人。
公认的包括这些单个管形瓶体系的设备包括用于递送溶液的笔式注 射器，例如BD Pens，BD Autojector，Humaject，NovoPen，B-DPen， AutoPen，以及OptiPen，GenotropinPen，GenotronormPen，Humatro Pen，Reco-Peno，Roferon Pen，Biojector，iject，J-tip Needle-Free Injector，Intraject，Medi-Ject，如由以下公司生产： Becton Dickensen(Franklin，Lakes，NJ，www.bectondickenson.com)， Disetronic(Burgdorf，Switzerland，www.disetronic.com；Bioject， Portland，Oregon(www.bioject.com)；National Medical Products， Weston Medical(Peterborough，UK，www.weston-medical.com)， Medi-Ject Corp(Minneapolis，MN，www.mediject.com)。公认的包 括双管形瓶的设备包括用于在药筒中递送重构的冷冷冻干燥燥药物的笔 式注射器系统，例如HumatroPen。
当前要求保护的产品包括包装材料。除了管理部门要求的信息，包 装材料提供了可以使用该产品的条件。本发明的包装材料为病人提供了 用两个管形瓶中的湿/干产品在水性稀释液中重构至少一种抗双整联蛋 白抗体，以形成溶液，并且在2-24小时或更长的时间内使用该溶液的 说明。对于单一管形瓶中的溶液产品，该标签说明该溶液可以在2-24 小时或更长的时间内使用。当前要求保护的产品可以用于人类药用产品 用途。
本发明的制剂可以通过以下方法制备，包括混合至少一种抗双整联 蛋白抗体和选定的缓冲液，优选含有盐水或选定的盐的磷酸缓冲液。用 常规溶解和混合步骤在水性缓冲液中混合至少一种抗体和缓冲剂。为了 制备适当的制剂，例如，可以将测得量的溶于水或缓冲液中的至少一种 抗体以足以提供所需浓度的蛋白和缓冲剂的量与所需缓冲剂在水中混 合。本领域技术人员可以了解该方法的变化。例如，加入各成分的顺序、 是否使用其它添加剂、制备该制剂的温度和pH都是可以对使用的浓度 和给药方式进行优化的因素。
要求保护的稳定或储存的制剂可以以澄清的溶液或作为双管形瓶的 形式提供给患者，双管形瓶包含一个装有至少一种冷冷冻干燥燥的抗双 整联蛋白抗体的管形瓶，将其用含有水性稀释液的第二个管形瓶重构。 单一溶液的管形瓶或要求重构的双管形瓶可以重复使用多次，并且可以 满足病人治疗的单个或多个周期，因此比当前存在的方法提供更方便的 治疗方案。
可以根据本发明通过各种递送方法给予患者此处描述的至少一种抗 双整联蛋白抗体的稳定或储存制剂或溶液；所述方法包括皮下或肌内注 射；经皮、肺部、经粘膜、植入、渗透泵、药筒、微泵，或其它本领域 公知的本领域技术人员了解的方法。 治疗用途
本发明也提供了使用本发明的至少一种双整联蛋白抗体调节或治疗 细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种本领域公知或此处描述的 双整联蛋白相关疾病的方法。
本发明也提供了一种调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中 的至少一种双整联蛋白相关疾病的方法，所述疾病包括，但不限于，肥 胖、免疫相关疾病、心血管疾病、感染性疾病、恶性疾病或神经疾病中 的至少一种。
本发明也提供了一种调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中 的至少一种免疫相关疾病的方法，所述疾病包括，但不限于，以下疾病 中的至少一种：类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、全身发病的幼 年类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强制性脊柱炎、胃溃疡、血清阴性 关节病、骨关节炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、抗磷 脂综合征、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、特发性肺纤维化、系统 性血管炎/wegener′s肉芽肿、肉样瘤病、睾丸炎/输精管切除逆转程序、 过敏性/特应性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、过敏性接触性皮炎、 过敏性结膜炎、过敏性肺炎、移植、器官移植排斥、移植物抗宿主疾病、 全身炎症反应综合征、脓毒症综合征、革兰氏阳性菌脓毒症、革兰氏阴 性菌脓毒症、培养阴性菌脓毒症、真菌脓毒症、中性粒细胞减少性发热、 尿脓毒症、脑膜炎球菌血症、创伤/出血、烧伤、离子辐射暴露、急性 胰腺炎、成人呼吸窘迫综合征、类风湿性关节炎、酒精诱导的肝炎、慢 性炎性病变、肉样瘤病、克隆氏病、镰状细胞贫血、糖尿病、肾病、特 应性疾病、过敏反应、过敏性鼻炎、枯草热、终年性肺炎、结膜炎、子 宫内膜异位、哮喘、风疹、全身过敏、皮炎、恶性贫血、溶血性疾病、 血小板减少症、任何器官或组织的移植排斥、肾移植排斥、心脏移植排 斥、肝移植排斥、胰腺移植排斥、肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、 皮肤同种异体移植排斥、软骨移植排斥、骨移植排斥、小肠移植排斥、 胎儿胸腺移植排斥、甲状旁腺移植排斥、任何器官或组织的异种移植排 斥、同种异体排斥、抗受体过敏反应、格雷夫斯病、雷诺氏病、B型胰 岛素抵抗糖尿病、哮喘、重症肌无力、抗体介导的细胞毒性、III型过 敏反应、系统性红斑狼疮、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大、 内分泌病、单克隆γ球蛋白病和皮肤改变综合征)、多发性神经病、器 官巨大、内分泌病、单克隆γ球蛋白病和皮肤改变综合征、抗磷脂综合 征、天疱疮、硬皮病、混合性结缔组织病、特发性阿狄森氏病、糖尿病、 慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、白癜风、血管炎、MI心脏切开 后综合征、IV型过敏、接触性皮炎、过敏性肺炎、同种异体排斥、细胞 内生物引起的肉芽肿、药物过敏、代谢性/特发性威尔逊氏病、血色素 沉着病、α-1-抗胰岛素缺陷、糖尿病肾病、桥本氏甲状腺炎、骨质疏 松症、下丘脑-垂体-肾上腺轴评估、原发性胆汁性肝硬化、甲状腺炎、 脑脊髓炎、恶液质、囊性纤维化、新生儿慢性肺疾病、慢性阻塞性肺疾 病(COPD)、家族性血巨噬细胞淋巴细胞组织细胞增多症、皮肤病学状况、 牛皮癣、斑秃、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎、急性肾衰竭、血液透 析、尿毒症、中毒、惊厥前状态、okt3治疗、抗cd3治疗、细胞因子治 疗、化疗、放疗(如包括，但不限于toasthenia、贫血、恶液质等)、 慢性水杨酸盐中毒等。见，例如the Merck Manual，12th-17th Editions， Merck&Company，Rahway，NJ(1972，1977，1982，1987，1992，1999)， Pharmacotherapy Handbook，Wells et al.，eds.，Second Edition， Appleton and Lange，Stamford，Conn.(1998，2000)，在此引入作为 参考。
本发明也提供了一种调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中 的至少一种心血管疾病的方法，所述疾病包括，但不限于，以下疾病中 的至少一种：心脏性晕厥综合征、心肌梗塞、充血性心衰、卒中、缺血 性卒中、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、再狭窄、糖尿病动脉硬化疾 病、高血压、动脉性高血压、肾动脉性高血压、晕厥、休克、心血管系 统梅毒、心衰、肺心病、原发性肺高血压、心律失常、心房异位搏动、 心房扑动、心房纤颤(持续或发作性)、灌注后综合征、心肺旁路炎症 反应、混乱性或多灶性房性心动过速、规律性窄QRS心动过速、特异性 心律失常、心室纤颤、希氏束心律失常、房室传导阻滞、束支传导阻滞、 心肌缺血性紊乱、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心肌病、扩张性心肌病、 限制性心肌病、瓣膜性心脏病、心内膜炎、心包疾病、心脏肿瘤、主动 脉和外周动脉瘤、主动脉分割性动脉瘤、主动脉炎症、腹主动脉及其分 支阻塞、外周血管病、阻塞性动脉疾病、外周动脉硬化性疾病、血栓性 脉管炎、功能性外周动脉疾病、雷诺氏现象和疾病、手足发绀、红斑性 肢痛病、静脉疾病、静脉血栓、静脉曲张、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪 水肿、不稳定性心绞痛、再灌注损伤、泵后综合征、缺血再灌注损伤等。 该方法任选包括，给予需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、 动物、病人有效量的包含至少一种抗双整联蛋白抗体的组合物或药物组 合物。
本发明也提供了一种调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中 的至少一种感染疾病的方法，所述疾病包括，但不限于，以下疾病中的 至少一种：急性和慢性细菌感染、急性和慢性寄生或感染过程，包括细 菌、病毒和真菌感染、HIV感染/HIV神经病、脑膜炎、肝炎(甲型、乙 型或丙型等)、脓毒性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌0157：h7、 溶血性尿毒症综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、疟疾、登革热、 利什曼病、麻风病、中毒性休克综合征、链球菌肌炎、气性坏疽、分支 杆菌结核、分支杆菌avium intracellulare、间质性浆细胞肺炎、盆腔 炎性疾病、睾丸酮/附睾炎、军团菌病、莱姆病、甲型流感、epstein-barr 病毒、生命体征相关的血巨噬细胞综合征、致命性脑炎/无菌性脑膜炎 等。
本发明也提供了一种调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中 的至少一种恶性疾病的方法，所述疾病包括，但不限于，以下疾病中的 至少一种：白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞、 T细胞或FAB ALL、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病 (CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓发育不良综合 征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、布 加氏淋巴瘤、多发性硬化、卡波西肉瘤、结直肠癌、胰腺癌、鼻咽癌、 恶性组织细胞增多症、副癌综合征/恶性高钙血症、实体瘤、腺癌、肉 瘤、恶性黑素瘤、血管瘤、转移性疾病、癌相关骨重吸收、癌相关骨重 吸收、癌相关骨痛等。
本发明也提供了一种调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中 的至少一种神经疾病的方法，所述疾病包括，但不限于，以下疾病中的 至少一种：神经退化性疾病、多发性硬化、偏头痛、AIDS病痴呆合并症、 脱髓鞘性疾病，如多发性硬化和急性横贯性脊髓炎；外锥体束和小脑疾 病如皮质脊髓系统病变；基底节或小脑疾病；运动机能亢进疾病如亨廷 顿氏舞蹈病和老年性舞蹈病；药物诱导的运动失调，如阻断CNS多巴胺 受体的药物诱导的运动失调；运动机能减退疾病，如帕金森氏病；进展 性核上性麻痹；小脑结构病变；脊髓小脑退化，如脊髓共济失调、 Friedreich′s共济失调、小脑皮质退化、多系统退化(Mencel， Dejerihe-Thomas，Shi Drager和Machado-Joseph)；全身疾病(Refsum′s 病、Aβ脂蛋白血症、共济失调、毛细血管扩张和线粒体多系统疾病)； 脱髓鞘核疾病，例如多发性硬化、急性横贯性脊髓炎；以及运动单位疾 病，如神经原性肌萎缩(前角细胞退化，如肌萎缩性侧索硬化、婴儿脊 肌萎缩和幼年脊肌萎缩)；阿尔茨海默病；中年唐氏综合征；弥散性路 易斯小体病；路易斯小体型老年痴呆；Wemicke-Korsakoff综合征；慢 性酒精中度；Creutzfeldt-Jakob病；亚急性硬化性全脑炎、 Hallerrorden-Spatz病和Dementia pugilistica等。该方法任选包括， 给予需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物、病人有效 量的包含至少一种双整联蛋白抗体或其特定部分或变体的组合物或药物 组合物。见，例如，the Merck Manual，16th Edition，Merck & Company， Rahway，NJ(1992)。
本发明的任何方法可以包括，给予需要这种调节、处理或治疗的细 胞、组织、器官、动物、病人有效量的包含至少一种抗双整联蛋白抗体 的组合物或药物组合物。所述方法可以任选进一步包括用于治疗这些免 疫疾病的共同给药或联合治疗，其中给予所述至少一种抗双整联蛋白抗 体、其特定部分或变体，进一步包括在之前、同时和/或之后，给予至 少一种选自下组的药物：至少一种TNF拮抗剂(例如，但不限于TNF抗 体或片段、可溶性TNF受体或其片段、其融合蛋白、或小分子TNF拮抗 剂)、抗风湿药物(如氨甲喋呤、金诺芬、金硫葡萄糖、硫唑嘌呤、 etanercept、硫代苹果酸金钠、硫酸羟基氯喹、来氟米特、柳氮磺胺吡 啶)、肌肉松弛剂、麻醉药、非甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、 镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂(如氨基糖苷、抗 真菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、carbapenem、头孢菌素、 flurorquinolone、大环内酯、青霉素、磺胺、四环素、其它抗微生物剂)、 抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、糖尿病相关试剂、矿 物质、营养剂、甲状腺制剂、维生素、钙相关激素、抗腹泻药、止咳药、 抗呕吐药、抗溃疡药、通便药、抗凝剂、促红细胞生成素(如epoetin α)、非尔司啶(如G-CSF，Neupogen)、沙拉斯(GM-CSF，白细胞素)、 疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂(如basiximab、环孢霉素、 daclizumab)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节剂、散瞳剂、 睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗 抑郁剂、抗精神病药物、抗躁狂药、抗精神病药物、抗焦虑药、催眠药、 拟交感神经药物、刺激剂、donepezil、他克林、抗哮喘药、β激动剂、 吸入性类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、9-氨基四氢吖啶、肾上腺 素或类似物、α链道酶(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。细 胞因子的非限制性实例包括，但不限于IL-1至IL-23中的任意一种。 适当的剂量是本领域公知的。见，例如，Wells et al.，eds.， Pharmacotherapy Handbook，2nd Edition，Appleton and Lange，Stamford， CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000， Deluxe Edition，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，在 此全文引入作为参考。
适用于本发明的组合物、联合治疗、共同给药、设备和/或方法的TNF 拮抗剂(进一步包括本发明的至少一种抗体、其特定片段和变体)包括， 但不限于，抗TNF抗体、其抗原结合片段、以及与TNF特异性结合的受 体分子；防止和/或抑制TNF合成、TNF释放或TNF作用于靶细胞的化合 物，如酞胺哌啶酮、替尼达普、磷酸二酯酶抑制剂(如己酮可可碱、环 戊苯吡酮)、A2b腺苷受体激动剂和A2b腺苷受体增强剂；防止和/或抑 制TNF受体信号传递的化合物，如有丝分裂原激活的蛋白(MAP)激酶 抑制剂；阻断和/或抑制膜TNF裂解的化合物，如金属蛋白酶抑制剂； 阻断和/或抑制TNF活性的化合物，如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂 (如卡托普利)；和阻断和/或抑制TNF活性产生和/或合成的化合物， 如MAP激酶抑制剂。
这里用到的“肿瘤坏死因子抗体”、“TNF抗体”、“TNFα抗体”或片 段等在体外、原位和/或优选体内减少、阻断、抑制、消除或干扰TNFα 活性。例如，本发明的适当TNF人抗体可以结合TNFα并且包括特异性 与TNFα结合的抗TNF抗体、其抗原结合片段、及其特定突变体或结构 域。适当的TNF抗体或片段也可以减少、阻断、抑制、消除、干扰、防 止和/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白合成、TNF释放、TNF受体信号传递、 膜TNF裂解、TNF活性、TNF产生和/或合成。
嵌合抗体cA2由称作A2的高亲和性中和性小鼠抗人TNFαIgG1抗 体的抗原结合可变区和人IgG1κ免疫球蛋白的恒定区组成。人IgG1 Fc 区改进同种异体基因抗体效应功能，增加血清循环半衰期和减少抗体的 免疫原性。嵌合抗体cA2的亲和力和表位特异性来源于鼠抗体A2的可 变区。在特定实施方案中，编码鼠抗体A2可变区的核酸的优选来源是A2 杂交瘤细胞系。
嵌合A2(cA2)以剂量依赖性方式中和天然和重组人TNFα的细胞毒 作用。从嵌合抗体cA2和重组人TNFα的结合测定可以计算出，嵌合抗 体cA2的亲和常数为1.04×1010M-1。通过竞争性抑制测定单克隆抗体特 异性和亲和性的优选方法可以参见，Harlow，et al.，antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1988；Colligan et al.，eds.，Current Protocols in Irramunology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience， New York，(1992-2000)；Kozbor et al.，linintinol Today，4：72- 79(1983)；Ausubel et al.，eds.Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，New York(1987-2000)；和Muller，Meth. Enzymol.，92：589-601(1983)，在此全文引入每一篇作为参考。
在特定实施方案中，鼠单克隆抗体由称作c134A的细胞系产生。 嵌合抗体cA2由称作c168A的细胞系产生。
其它可以用于本发明的单克隆抗TNF抗体的例子在本领域中有描述 (见，例如，美国专利No.5,231,024；Moller，A.et al.，Cytokine 2 (3)：162-169(1990)；美国申请No.07/943,852(1992年9月11日提 交)；Rathjen et al.，国际公开No.WO 91/02078(1991年2月11日 公开)；Rubin et al.，欧洲专利申请No.0 218 868(1987年4月22日 公开)；Yone et al.，欧洲专利申请No.0 288 088(1988年10月26 日)；Liang，et al.，Biochem.Biophys.Res.Coma.137：847-854(1986)； Meager，et al.，Hybridoma 6：305-311(1987)；Fendly et al.， Hybridoma 6：359-369(1987)；Bringman，et al.，Hybridoma 6：489-507 (1987)；和Hirai，et al.，J.Immunol.Meth.96：57-62(1987)，在 此全文引入作为参考。 TNF受体分子
用于本发明的优选TNF受体分子是以高亲和性与TNFα结合(见， 例如Feldmann et al.，国际公开No.WO 92/07076(1992年4月30日 公开)；Schall et al.，Cell 61：361-370(1990)；和Loetscher et al.， Cell 61：351-359(1990)，在此全文引入作为参考)并且任选具有低免 疫原性的受体。具体地，55 kDa(p55 TNF-R)和75 kDa(p75 TNF-R)TNF 细胞表面受体可以用于本发明。这些受体的截短形式，包括受体的细胞 外结构域(ECD)或其功能部分(见，例如Corcoran et al.，Emir.J. Biochem.223：831-840(1994))也可以用于本发明。已经在尿和血清 中检测到了作为30 kDa和40 kDa的TNFα抑制性结合蛋白的截短形式 的TNF受体，其中包含ECD(Engelmann，H.et al.，J.Biol.Chem.265： 1531-1536(1990))。TNF受体多聚分子和TNF免疫受体融合分子，及其 衍生物和片段或部分是本发明的方法和组合物中可以使用的TNF受体分 子的其它例子。可以用于本发明的TNF受体分子的特征在于可以在延长 的时间中治疗患者，具有良好至极佳的症状缓解作用，以及低毒性。低 免疫原性和/或高亲和性，以及其它未确定的特性，都可以对达到治疗 结果起作用。
用于本发明的TNF受体多聚分子包含两种或多种TNF受体的ECD的 所有或功能性部分，它们通过一种或多种多肽接头或其它非肽接头，例 如聚乙二醇(PEG)连接。多聚分子可以进一步包含指导多聚分子表达的 被分泌蛋白的信号肽。这些多聚分子和产生它们的方法描述于美国申请 No.08/437,533(1995年5月9日提交)，在此引入其完整内容作用参 考。
用于本发明的方法和组合物中的TNF免疫受体融合分子包含一种或 多种免疫球蛋白分子的至少一部分和一种或多种TNF受体的全部或功能 性部分。这些免疫受体融合分子可以组装为单体、或异或同多聚体。免 疫受体融合分子也可以是单价或多价的。这种TNF免疫受体融合分子的 一个例子是TNF受体/IgG融合蛋白。TNF免疫受体融合分子和产生它们 的方法在本领域中已有描述(Lesslauer et al.，Eur.J.Immunol.21： 2883-2886(1991)；Ashkenazi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88： 10535-10539(1991)；Peppel et al.，J.Exp.Med.174：1483-1489 (1991)；Kolls et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219(1994)； Butler et al.，Cytokine 6(6)：616623(1994)；Baker et al.，Eur. J.Immunol.24：2040-2048(1994)；Beutler et al.，美国专利No. 5,447,851；和美国申请No.08/442,133(1995年5月16日提交)，在此 全文引入每一篇作为参考)。产生免疫受体融合分子的方法也参见Capon et al.，美国专利No.5,116,964；Capon et al.，美国专利No.5,225,538； 和Capon et al.，Nature 337：525-531(1989)，在此全文引入作为 参考。
TNF受体的功能等价物、衍生物、片段或区域是指TNF受体分子的 部分，或编码TNF受体分子的TNF受体分子序列的部分，它们的大小和 序列足以在功能上类似于可以用于本发明的TNF受体分子(如，以高亲 和性结合TNFα并且具有低免疫原性)。TNF受体分子的功能等价物也包 括修饰的TNF受体分子——该分子在功能上类似于可以用于本发明的TNF 受体分子(如，以高亲和性结合TNFα并且具有低免疫原性)。例如，TNF 受体分子的功能等价物可以包含“沉默”密码子或一种或多种氨基酸取 代、去除或添加(如用一种氨基酸取代另一种氨基酸；或用编码相同或 不同疏水性氨基酸的密码子取代另一种编码疏水性氨基酸的密码子)。 参见，Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，New York(1987-2000)。
细胞因子包括任何已知的细胞因子。见，例如 CopewithCytokines.com。细胞因子拮抗剂包括，但不限于，任何抗体、 其片段或模拟物、任何可溶性受体、其片段或模拟物、任何小分子拮抗 剂或任何其组合。
治疗处理。本发明的任何方法可以包括治疗双整联蛋白介导的疾 病，包括给予需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物、 病人有效量的包含至少一种双整联蛋白抗体的组合物或药物组合物。所 述方法可以任选进一步包括用于治疗这些免疫疾病的共同给药或联合治 疗，其中给予所述至少一种抗TNF抗体、其特定部分或变体，进一步包 括在之前、同时和/或之后，给予至少一种选自下组的药物：至少一种TNF 拮抗剂(例如，但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或其片段、 其融合蛋白、或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药物(如氨甲喋呤、金诺 芬、金硫葡萄糖、硫唑嘌呤、etanercept、硫代苹果酸金钠、硫酸羟 基氯喹、来氟米特、柳氮磺胺吡啶)、肌肉松弛剂、麻醉药、非甾体类 抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻 滞剂、抗微生物剂(如氨基糖苷、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、 carbapenem、头孢菌素、flurorquinolone、大环内酯、青霉素、磺胺、 四环素、其它抗微生物剂)、抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合成 类固醇、糖尿病相关试剂、矿物质、营养剂、甲状腺制剂、维生素、钙 相关激素、抗腹泻药、止咳药、抗呕吐药、抗溃疡药、通便药、抗凝剂、 促红细胞生成素(如epoetinα)、非尔司啶(如G-CSF，Neupogen)、沙 拉斯(GM-CSF，白细胞素)、疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂(如 basiliximab、环孢霉素、daclizumab)、生长激素、激素替代药物、雌 激素受体调节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝分 裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、抗躁狂药、抗精神 病药物、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药物、刺激剂、donepezil、 他克林、抗哮喘药、β激动剂、吸入性类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄 嘌呤、9-氨基四氢吖啶、肾上腺素或类似物、α链道酶(Pulmozyme)、 细胞因子或细胞因子拮抗剂。
一般地，病理学状况的治疗是通过给予有效量或剂量的至少一种抗 双整联蛋白抗体组合物而实现的，该组合物中平均总共含有至少约0.01 -500mg至少一种抗双整联蛋白抗体/千克患者体重/剂，优选每单次或 多次给药约0.01-100mg抗体/千克患者体重，这取决于组合物中含有 的比活性。作为选择，有效血清浓度可以包括每单次或多次给药0.1-5000 μg/ml的血清浓度。适当的剂量是医学从业者已知的，当然，取决于特 定的疾病状态、给予的组合物的比活性、以及患者正在进行的具体治疗。 在一些情况下，为获得需要的治疗量，必须提供重复给药，即重复特定 监测或计量剂量的各次给药，其中重复各次给药，直到达到需要的每日 剂量或效果。
优选的剂量可以任选包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、 0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99和/或100-500 mg/kg/给药，或其中的任意范围、任意值或任意分数， 或每单次或多次给药达到0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、 2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、 6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、 10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、 4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、 9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、 13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、 17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、 900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、和/或5000 μg/ml血清浓度，或其中的任意范围、任意值或任意分数。
此外，给药剂量可以根据已知因素而改变，例如具体试剂的药代动 力学特征，以及其给药模式和途径；接受者的年龄、健康和体重；症状 的性质和范围；同时进行的治疗的类型、频率，以及需要的效果。活性 成分的剂量通常为约0.1-100mg/kg体重。通常为0.1-50，优选0.1- 10mg/kg/给药，或以有效获得需要的结果的持续释放形式。
作为非限制性实例，人或动物的治疗可以通过一次或周期剂量的至 少一种本发明的抗体而提供，其剂量为0.1-100mg/kg，例如0.5、0.9、 1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、 45、50、60、70、80、90或100mg/kg/日，在第1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、3 3、34、35、36、37、38、39、或 40天中的至少一天给药，或作为选择或额外地在第1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、或52周的至少一 周给药，或作为选择或额外地在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、或20年中的至少一年中给药，或其 任意组合，采用单次输注或重复给药。
适于内部给药的剂型(组合物)一般包含约0.1mg-约500mg活性 成分/单位或容器。在这些药物组合物中，活性成分的量一般为组合物 总重量的约0.5-99.999wt％。
对于肠胃外给药，可以将抗体配制为与药学可接受的肠胃外载体结 合或分别提供的溶液、悬浮液、乳状液或冷冷冻干燥燥的粉末。这些载 体的例子为水、盐水、林格氏液、右旋糖溶液、和1-10％的人血清白蛋 白。也可以使用脂质体和非水性载体如固定的油。载体或冷冻干燥的粉 末可以含有维持等渗性(如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(如缓冲剂 和防腐剂)。该制剂可以通过已知或适当技术灭菌。
适当的药物载体描述于本领域的标准参考文献Remington′s Pharmaceutical Sciences，A.Osol的最新版本。 作为选择的给药
可以根据本发明采用许多公知的和开发的方式给予药学有效量的本 发明的至少一种抗双整联蛋白抗体，尽管在以下说明书中使用了肺部给 药，根据本发明可以使用其它给药方式，得到适当的结果。
本发明的双整联蛋白抗体在载体中递送，作为溶液、乳状液、胶体 或悬浮液、或作为干粉末递送，采用适于通过此处描述的或本领域公知 的吸入或其它方式进行给药的任何设备和方法。 肠胃外制剂和给药
肠胃外给药的制剂可以包含作为常规赋形剂的无菌水或盐水、聚链 烷醇如聚乙二醇、植物油、氢化萘等。可以通过适当的乳化剂或润湿剂 和悬浮剂根据已知方法制备用于注射的水性或油性悬浮液。用于注射的 试剂可以是无毒的、非口服给药的稀释剂，如水溶液或无菌可注射溶液 或溶剂中的悬浮液。作为可使用的载体或溶剂，可以使用水、林格氏液、 等渗盐水等；作为普通溶剂或悬浮溶剂，可以使用无菌的不挥发油。对 于这些目的，可以使用任意类型的不挥发油和脂肪酸，包括天然或合成 的或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成的或半合成的甘油单酯或二 酯或三酯。肠胃外给药是本领域公知的，包括，但不限于，常规注射工 具、描述于美国专利No.5,851,198的气加压的无针头注射设备，和描 述于美国专利No.5,839,446的激光穿孔器设备，在此全文引入上述专 利作为参考。 作为选择的递送
本发明进一步涉及通过肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支 气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠 内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、 胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、 胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经 皮设备而给予至少一种抗双整联蛋白抗体。可以制备至少一种抗双整联 蛋白抗体的组合物，用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)或任意其它给 药，特别是以液体溶液或悬浮液给药；用于阴道或直肠给药，特别是以 半固体形式给药，例如，但不限于以霜和栓剂形式给药；用于颊部或舌 下给药，例如，但不限于以片剂或胶囊形式给药；或用于鼻内给药，例 如，但不限于以粉末、鼻滴液或气溶胶或某些制剂形式给药；或用于经 皮给药，例如，但不限于以凝胶、油膏、洗液、悬浮液或贴剂递送系统 给药，同时用化学增强剂如二甲基亚砜修饰皮肤结构或增加经皮贴剂的 药物浓度(Junginger，et al.In″Drug Permeation Enhancement”；Hsieh， D.S.，Eds.，pp.59-90(Marcel Dekker，Inc.New York 1994，)在 此全文引入作为参考)，或使用氧化剂以便将含有蛋白和肽的制剂应用 于皮肤上(WO 98/53847)，或施加电场以便产生电穿孔等瞬时转运途径， 或增加带电药物通过皮肤的迁移率，如离子电渗疗法，或应用超声，如 超声电渗疗法(美国专利Nos.4,309,989和4,767,402)(上述文献和 专利在此全文引入作为参考)。 肺部/鼻部给药
对于肺部给药，至少一种抗双整联蛋白抗体组合物优选以优选到达 肺的下气道或鼻窦的颗粒大小进行递送。根据本发明，至少一种抗双整 联蛋白抗体可以通过本领域公知的各种吸入或鼻设备递送，用于通过吸 入进行治疗剂的给药。这些设备可以将气溶胶化的制剂沉积在患者的鼻 窦腔或肺泡中，所述设备包括计量吸入器、喷洒器、干粉产生器、喷雾 器等。其它适于指导抗体的肺或鼻给药的设备是本领域公知的。所有这 些设备可以使用适于以气溶胶形式给予分散抗体的制剂。这些气溶胶可 以由溶液(水性和非水性)或固体颗粒组成。Ventolin等计量吸入器一 般使用推进气体并且在吸入时要求激活(见，例如WO 94/16970，WO 98/35888)。由Inhale Therapeutics出售的TurbuhalerTM(Astra)、 Rotahaler(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)等干粉吸 入器以及Spinhaler粉末吸入器使用呼吸激活的混合粉末(US 4668218 Astra，EP 237507 Astra，WO 97/25086 Glaxo，WO 94/08552 Dura，US 5458135 Inhale，WO 94/06498 Fisons，在此全文引入作为参考)。AERxTM Aradigm、Ultravent喷洒器(Mallinckrodt)和Acorn II喷洒器 (Marquest Medical Products)((US 5404871 Aradigm，WO 97/22376)， 上述参考文献在此全文引入作为参考)从溶液产生气溶胶，而计量吸入 器、干粉吸入器等产生小颗粒气溶胶。这些商购吸入设备的具体例子是 用于代表适于本发明的实施的具体设备，不准备限制本发明的范围。包 含至少一种抗双整联蛋白抗体的组合物优选通过干粉吸入器或喷雾器递 送。用于本发明的至少一种抗体的给药的吸入设备具有一些需要的特 征。例如，通过吸入设备递送是有利的，它可靠、可重复并且准确。吸 入设备可以任选递送小的干颗粒，例如小于约10μm，优选约1-5μm， 以便能够较好地呼吸。 作为喷雾给予双整联蛋白抗体组合物
可以迫使至少一种抗双整联蛋白抗体的悬浮液和溶液在压力下通过 喷嘴，从而产生包括双整联蛋白抗体组合物的喷雾。可以选择喷嘴大小 和构型、施加的压力和填入液体的速度而达到需要的输出量和颗粒大 小。可以通过连接于毛细管或喷嘴的电场产生电喷雾。有利的是，由喷 雾递送的至少一种抗双整联蛋白抗体组合物蛋白的颗粒大小小于约10μ m，优选约1-5μm，最优选约2-3μm。
适用于喷雾器的至少一种抗双整联蛋白抗体组合物蛋白的制剂一般 包含溶于水溶液中的抗体组合物蛋白，其浓度为约每毫升溶液约0.1- 100mg至少一种抗双整联蛋白抗体组合物蛋白或mg/gm，或其中的任意 范围或任意值，例如，但不限于1、.2、.3、.4、.5、.6、.7、.8、.9、 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、 70、80、90或100mg/ml或mg/gm。该制剂可以包含赋形剂、缓冲剂、 等渗试剂、防腐剂、表面活性剂和优选锌等试剂。该制剂也可以包含赋 形剂或用于稳定组合物蛋白的试剂，例如缓冲剂、还原剂、大分子蛋白 或碳水化合物。用于配制抗体组合物蛋白的大分子蛋白包括白蛋白、鱼 精蛋白等。用于配制抗体组合物蛋白的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露 醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。抗体组合物蛋白制剂也可以包含表面活 性剂，它可以减少或防止由于溶液形成气溶胶时的雾化导致的表面诱导 的抗体组合物蛋白的聚集。可以使用各种常规的表面活性剂，例如聚氧 乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。其含量一般为制 剂重量的约0.001-14％。用于本发明的特别优选的表面活性剂为聚氧乙 烯失水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨糖醇酯80、聚山梨糖醇酯20等。用 于双整联蛋白抗体或其特定部分或变体的蛋白制剂的其它试剂是本领域 公知的，也可以包含在制剂中。 通过喷洒器给予双整联蛋白抗体组合物
可以通过喷洒器给予抗体组合物，例如喷射喷洒器或超声喷洒器。 一般地，在喷射喷洒器中，用压缩气体源通过一个孔而产生高速气体喷 射。当其它膨胀超过喷嘴时，产生低压区，该区将抗体组合物蛋白溶液 拉拽通过与液体储存器连接的毛细管。通过毛细管的液体流出管时被剪 切成不稳定的细丝和微滴，产生气溶胶。可以使用各种构型、流速和挡 板类型一般从给定的喷射喷洒去达到需要的性能特征。在超声喷洒器 中，采用高频电能产生振动、机械能，一般采用压电式换能器。该能量 被直接或通过耦合流体转移至抗体组合物制剂，产生包含抗体组合物蛋 白的气溶胶。有利地，由喷洒器递送的抗体组合物蛋白的颗粒大小小于 约10μm，优选约1-5μm，最优选约2-3μm。
喷射喷洒器或超声喷洒器中适用的至少一种抗双整联蛋白抗体制剂 的浓度一般为每毫升溶液约0.1-100mg至少一种抗双整联蛋白抗体蛋 白。该制剂可以包含赋形剂、缓冲剂、等渗试剂、防腐剂、表面活性剂 和优选锌等试剂。该制剂也可以包含赋形剂或用于稳定至少一种抗双整 联蛋白抗体组合物蛋白的试剂，例如缓冲剂、还原剂、大分子蛋白或碳 水化合物。用于配制至少一种抗双整联蛋白抗体的大分子蛋白包括白蛋 白、鱼精蛋白等。用于配制至少一种抗双整联蛋白抗体的典型碳水化合 物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。至少一种抗双整联蛋 白抗体制剂也可以包含表面活性剂，它可以减少或防止由于溶液形成气 溶胶时的雾化导致的表面诱导的至少一种抗双整联蛋白抗体的聚集。可 以使用各种常规的表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧 乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。其含量一般为制剂重量的约0.001-4％。用于 本发明的特别优选的表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯、聚 山梨糖醇酯80、聚山梨糖醇酯20等。用于抗体蛋白等蛋白制剂的其它 试剂是本领域公知的，也可以包含在制剂中。 通过计量吸入器给予双整联蛋白抗体组合物
在计量吸入器(MDI)中，在一个小罐中装有作为包含液化的压缩气 体的混合物的推进剂、至少一种抗双整联蛋白抗体和任意赋形剂或其它 添加剂。计量阀的激活释放作为气溶胶的混合物，优选含有大小小于约 10μm，优选约1-5μm，最优选约2-3μm的可以。需要的气溶胶颗粒 大小可以通过使用由本领域技术人员公知的各种方法，包括喷射研磨、 喷雾干燥、临界点浓缩等方法产生的抗体组合物蛋白制剂而获得。优选 的计量吸入器包括由3M或Glaxo制造并且使用氢氟碳推进剂的那些。
计量吸入器设备中使用的至少一种抗双整联蛋白抗体一般包含精细 分割的粉末，其中含有作为非水介质中的悬浮物的至少一种抗双整联蛋 白抗体，例如，在表面活性剂的帮助下悬浮于一种推进剂中。用于此目 的的推进剂可以是任何常规材料，如氯氟碳、氢氯氟碳、氢氟碳或烃， 包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、 HFA-134a(氢氟链烷-134a)、HFA-227(氢氟链烷-227)等。推进剂优选 是氢氟碳。可以选择表面活性剂以稳定作为推进剂中的悬浮物的至少一 种抗双整联蛋白抗体，从而保护活性试剂免受化学降解等。适当的表面 活性剂包括山梨糖醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在一些情况下， 溶液气溶胶优选使用乙醇等溶剂。本领域已知的用于蛋白制剂的其它试 剂，如蛋白，也可以包含在制剂中。
本领域的普通技术人员将认识到，本发明的方法可以通过此处没有 描述的设备对至少一种抗双整联蛋白抗体组合物进行肺部给药而达到。 口服制剂和给药
口服制剂依赖于佐剂(如间苯二酚和非离子型表面活性剂如聚氧乙 烯油酯和正十六烷基聚乙烯酯)的共同给药而人工增加肠壁的通透性， 并且依赖于酶抑制剂(如胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟代硫酸酯(DFF) 和抑肽酶)的共同给药而抑制酶促降解。用于口服给药的固态剂型的活 性组成化合物可以与至少一种添加剂混合，所述添加剂包括蔗糖、乳糖、 纤维素、甘露醇、海藻糖、棉籽糖、麦芽糖醇、右旋糖苷、淀粉、琼脂、 arginates、几丁质、脱乙酰壳聚糖、果胶、黄芪树胶、阿拉伯树胶、 明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯。这些剂 型也可以包含其它类型的添加剂，如非活性稀释剂、润滑剂如硬脂酸镁、 对羟基苯甲酸酯、防腐剂如山梨酸、抗坏血酸、α生育酚、抗氧化剂如 半胱氨酸、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、增甜剂、矫味剂、芳香 剂等。
片剂和丸剂可以进一步加工成肠衣制剂。用于口服给药的液体制剂 包括允许医学应用的乳状液、糖浆、酏剂、悬浮液和溶液制剂。这些制 剂可以含有所述领域常用的非活性稀释剂，如水。也已经描述将脂质体 用作胰岛素和肝素的药物递送系统(美国专利No.4,239,754)。最近， 已经使用混合氨基酸(类蛋白)的人工聚合物微球体来递送药物(美国 专利No.4,925,673)。此外，美国专利No.5,879,681和美国专利No. 5,5,871,753中描述的载体化合物也已经用于口服递送生物活性试剂， 这是本领域公知的。 粘膜制剂和给药
对于通过粘膜表面吸收，给予至少一种抗双整联蛋白抗体的组合物 和方法包括含有多种亚微米颗粒、粘膜吸附性大分子、生物活性肽和水 性连续相的乳状液，它通过达到乳状液颗粒的粘膜吸附而促进通过粘膜 表面的吸收(美国专利Nos.5,514,670)。适于施加本发明的乳状液的 粘膜表面可以包括角膜、结膜、颊、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直 肠给药途径。用于阴道或直肠给药的制剂，如栓剂，可以包含赋形剂， 例如聚链烷醇、凡士林、可可油等。用于鼻内给药的制剂可以是固体， 包含赋形剂，例如乳糖，或可以是水性或油性的鼻滴液。对于颊部给药， 赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等(美国专利Nos. 5,849,695)。 经皮制剂和给药
对于经皮给药，将至少一种抗双整联蛋白抗体包被于递送载体，如 脂质体或聚合纳米颗粒、微颗粒、微胶囊或微球体中(除非特别指出， 统一称作微颗粒)。已知有许多适当的设备，包括由以下成分组成的微 颗粒：合成聚合物如多羟基酸，如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物、聚原 酸酯、聚酐和聚磷腈，以及天然聚合物如胶原、聚氨基酸、铝和其它蛋 白、藻酸盐和其它多糖、及其组合(美国专利Nos.5,814,599)。 延长的给药和制剂
有时可能需要在延长的时间内向受试者递送本发明的化合物，例 如，单次给药在一周至一年的时间。可以使用各种缓释、储存或植入剂 型。例如，该剂型可以包含化合物的药学可接受的无毒盐，该化合物在 体液中具有低溶解度，例如，(a)多价酸的酸加成盐，所述酸例如磷酸、 硫酸、柠檬酸、酒石酸、鞣酸、pamoic酸、藻酸、聚谷氨酸、萘单或二 磺酸、聚半乳糖醛酸等；多价金属阳离子的盐，所述阳离子如锌、钙、 铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等，或与有机阳离子如N，N′-二苄基 -乙二胺或乙二胺形成的盐；或(c)，(a)和(b)的组合物，如鞣酸锌。此 外，本发明的化合物或优选相对不溶的盐，如前面描述的化合物和盐， 可以与芝麻油等适于注射的物质一起配制于单硬脂酸铝凝胶等凝胶中。 特别优选的盐是锌盐、鞣酸锌盐、pamoate盐等。用于注射的缓释储存 制剂的另一种类型包含用于包被于胶囊中的分散的化合物或盐，所述化 合物或盐位于缓慢降解、无毒、非抗原性的聚合物中，如描述于美国专 利No.3,773,919的聚乳酸/聚乙醇酸聚合物。该化合物或优选相对不溶 的盐，如前面描述的化合物和盐，也可以配制于胆固醇基质硅橡胶丸， 特别是用于动物。其它缓释、储存或植入制剂，如气体或液体脂质体是 本领域公知的(美国专利Nos.5,770,222和″Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems″，J.R.Robinson ed.，Marcel Dekker， Inc.，N.Y.，1978)。
前面已经一般性地描述了本发明，参考以下实施例可以更容易理解 本发明，实施例是用于举例说明，而不是限制性的。 实施例1：在哺乳动物细胞中克隆和表达双整联蛋白抗体
典型的哺乳动物表达载体含有至少一种启动子元件，它介导mRNA、 抗体编码序列以及转录终止和转录物的聚腺苷酸化所需信号的转录起 始。其它元件包括增强子、Kozak序列和间插序列，其侧翼具有RNA剪 接的供体和受体位点。可以通过SV40的早期和晚期启动子、逆转录病 毒的长末端重复(LTRS)，如SV，HTLVI，HIVI和巨细胞病毒(CMV)的早期 启动子完成高度有效的转录。然而，也可以使用细胞元件(如人肌动蛋 白启动子)。用于实施本发明的适当表达载体包括，例如，pIRES1neo， pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN或pLNCX(Clonetech Labs，Palo Alto， CA)，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-) (Invitrogen)，PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，pRSVcat (ATCC 37152)，pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)等载体。 可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela 293，H9和Jurkat细胞，小 鼠NIH3T3和C127细胞，Cos1，Cos7和CV1，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠 L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
作为选择，可以在含有整合到染色体中的基因的稳定细胞系中表达 基因。用dhfr，gpt，新霉素或潮霉素等选择性标记共转染，可以鉴定 和分离被转染的细胞。
也可以扩增经转染的基因，使其表达大量被编码的抗体。用DHFR(二 氢叶酸还原酶)标记开发携带几百或甚至几千拷贝目的基因的细胞系。 另一种有用的选择标记是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy，et al.，Biochem. J.227：277-279(1991)；Bebbington，et al.，Bio/Technology 10： 169-175(1992))。采用这些标记，在选择性性培养基中培养哺乳动物细 胞，选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合到染色体中的被扩 增的基因。通常用中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞产生抗体。
表达载体pC1和pC4含有劳斯肉瘤病毒强启动子(LTR)(Cullen，et al.，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))和CMV增强子的片段 (Boshart，et al.，Cell 41：521-530(1985))。多个克隆位点，如具 有限制酶裂解位点BamHI，XbaI和Asp718的那些，促进了目的基因的 克隆。这些载体除3’内含子外，还含有大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸 化和终止信号。 在CHO细胞中克隆和表达
用载体pC4表达双整联蛋白抗体表达。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr (ATCC保藏号No.37146)的衍生物。该质粒含有SV40早期启动子控制下 的小鼠DHFR基因。可以通过在选择性培养基(如α-MEM，Life Technologies，Gaithersburg，MD)中培养细胞而选择用这些质粒转染 的中国仓鼠卵巢细胞或其它缺乏二氢叶酸活性的细胞，该培养基中补加 了化疗剂氨甲喋呤。抗氨甲喋呤(MTX)的细胞中的DHFR基因的扩增已经 有记载(见，例如F.W.Alt，et al.，J.Biol.Chem.253：1357-1370 (1978)；J.L.Hamlin and C.Ma，Biochem.et Biophys.Acta 1097： 107-143(1990)；和M.J.Page and M.A.Sydenham，Biotechnology 9： 64-68(1991)。在不断增加的MTX浓度下培养的细胞通过靶酶DHFR的 过量产生发生了对药物的抗性，这是因为DHFR基因的扩增。如果将第 二种基因连接于DHFR基因，它通常被共扩增并且过度表达。本领域公 知该方法可以用于开发携带多于1000拷贝的被扩增基因的细胞系。因 此，当撤去氨甲喋呤时，获得了含有整合到宿主细胞的一个或多个染色 体的被扩增基因。
质粒pC4含有用于表达目的基因的劳斯肉瘤病毒长末端重复(LTR) 的强启动子(Cullen，et al.，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985)) 和从人巨细胞病毒(CMV)的立即早期基因的增强子分离的片段(Boshart， et al.，Cell 41：521-530(1985))。启动子下游是允许基因整合的BamHI， XbaI，和Asp718限制酶裂解位点。该质粒在这些克隆位点之后含有3’内 含子和大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也可以 用于表达，例如人β肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或来自于 其它逆转录病毒，如HIV和HTLVI的长末端重复。Clontech的Tet-Off和 Tet-On基因表达系统和相似的系统可以用于在哺乳动物细胞中以经调节 的途径表达双整联蛋白(M.Gos sen，and H.Bujard，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 89：5547-5551(1992))。对于mRNA的聚腺苷酸化，也可以使 用例如人生长激素或球蛋白基因的其它信号。携带整合到染色体中的目 的基因的稳定细胞系也可以通过用可选择标记如gpt，G418或潮霉素共 转染而进行选择。在开始时使用G418加氨甲喋呤等一种以上的可选择 标记是有利的。
用限制酶消化pC4质粒，然后通过本领域公知的程序用小牛肠磷酸 酶去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶分离载体。
根据已知的方法步骤使用编码完整双整联蛋白抗体的DNA序列，其 相当于本发明的双整联蛋白抗体的HC和LC可变区。也使用了编码适当 人恒定区(即HC和LC区)的分离核酸。
然后用T4 DNA连接酶连接分离的可变区和恒定区编码DNA和去磷 酸化的载体。然后转化大肠杆菌HB 101或XL-1 Blue细胞，并且例如用 限制酶分析鉴定含插入pC4质粒的片段的细菌。
用缺乏DHFR基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行转染。用0.5g pSV2-neo质粒采用脂质转染共转染5g表达质粒pC4。pSV2-neo质粒含 有显性可选择标记，即来自于Tn5的neo基因，它编码一种酶，该酶赋 予对包括G418的一组抗生素的抗性。将这些细胞种植在补加1g/ml G418 的α-MEM中。两天后，用胰蛋白酶消化细胞并且种植在杂交瘤克隆板上 (Greiner，Germany)，置于补加10、25或50ng/ml氨甲喋呤的α-MEM 中。大约10-14天后，用胰蛋白酶消化单个克隆，然后种植在6孔培养 皿或10ml烧瓶中，使用不同浓度的氨甲喋呤(50nM，100nM，200nM，400 nM，800nM)。然后将在最高浓度氨甲喋呤下生长的细胞转染到新的6孔 板中，该板含有更高浓度的氨甲喋呤(1mM，2mM，5mM，10mM，20mM)。 重复同样的程序，直到获得在100-200mM的浓度下生长的克隆。例如， 通过SDS-PAGE和蛋白印迹或反相HPLC分析所需基因产物的表达。 实施例2：制备和鉴定完全的人双整联蛋白抗体的非限制性实例的方法
概要.用人胎盘αVβ3免疫含重链和轻链的人可变区和恒定区抗体 转基因的(CBA/J×C57/BL6/J)F2杂交小鼠(Taylor et al.， International Immunology 6：579-591(1993)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)； Fishwild et al.，Nature Biotechnology 14：845-851(1996))。一次 融合产生了2个完全的人αVβ3反应性IgG1κ单克隆抗体，即GenO.95 和GenO.101。进一步鉴定了完全的人抗αVβ3抗体，发现两种抗体都对 αVβ3和αVβ5异二聚体有反应性，这表明了对两种分子对共有的α链 的特异性。一种Mab，即CNTO95，在基于细胞的测定中抑制αVβ3和α Vβ5与玻联蛋白的结合。
缩写
BSA-牛血清白蛋白
CO2-二氧化碳
DMSO-二甲基亚砜
EIA-酶免疫测定
FBS-胎牛血清
H2O2-过氧化氢
HC-重链
HRP-辣根过氧化物酶
Ig-免疫球蛋白
IP-腹膜内
IV-静脉内
Mab-单克隆抗体
OD-光密度
OPD-邻苯二胺二盐酸盐
PEG-聚乙二醇
PSA-青霉素，链霉素，两性霉素
RT-室温
SQ-皮下
TBS-Tris缓冲盐水
v/v-体积/体积
w/v-重量/体积
引言：
我们用含人重链和轻链免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生了对αV 整联蛋白具有特异性的完全的人单克隆抗体。这些新抗体可以通过阻断 αV整联蛋白与其各自ECM配体的结合而在治疗上用于抑制血管发生过 程，并且为各种癌症的治疗提供了额外的工具。 材料和方法 动物
表达人免疫球蛋白而不是小鼠IgM或Igκ的转基因小鼠由GenPharm International公司开发。这些小鼠含有进行了V(D)J连接、重链类转 换和体细胞突变，以产生人序列免疫球蛋白所有组成成分(Taylor et al.， International Immunology 6：579-591(1993))。轻链转基因部分来源 于酵母人工染色体克隆，该克隆包括近一半的种系人Vκ区。除一些VH 基因，重链(HC)转基因编码人μ和人γ1(Lonberg et al.，Nature 368： 856-859(1994))和/或γ3恒定区。在免疫和融合过程中使用来源于HC012 基因系的小鼠，以产生这些单克隆抗体。 纯化人αVβ3
用含20mM Tris pH7.5，1mM CaCl2，1mM MnCl2，100mM辛基硫代葡糖 苷(来自于Pierce的OTG)，0.05％叠氮化钠和1mM苯甲基磺酰基氟化物 (Sigma)的盐水提取表达αVβ3整联蛋白的人胎盘(用肉研磨器破坏) 或M21人黑色素瘤细胞。室温下将混合物搅拌1小时，以10,000xg离心 使其澄清。将来自胎盘提取物的上清液加入由偶联于琼脂糖(Pharmacia) 的Mab10E5组成的亲和柱中，以去除GPIIb/IIIa，并且将流过的级分 加入由偶联于琼脂糖(Pharmacia)的Mab c7E3 Fab组成的亲和柱中，以 结合αVβ3。用含1mM CaCl2，1mM MnCl2和0.1％OTG的PBS洗涤c7E3柱， 然后用0.1M醋酸钠，pH4.5，1mM CaCl2，1mM MnCl2和0.1％OTG，pH3.0 洗涤。用0.1M甘氨酸，2％乙酸，1mM CaCl2，1mM MnCl2和0.1％OTG洗脱 柱。用2M Tris pH8.5中和含纯化αVβ3的洗脱液。通过SDS-PAGE分 析和ELISA排除GPIIb/IIIa污染而鉴定制备物的纯化产物(Wayner，et al.，J.Cell Biol.113：919-929(1991))。 免疫
用等体积的氟氏完全佐剂乳化的总共20μg胎盘αVβ3(prep V级 分，JG21197)IP(200μl)和在两个位点SQ(每个位点100μl)免疫从 GenPharm获得的15-17周龄的手术去势雄性小鼠(第0天)。两周后以 相同方式用等体积的氟氏不完全佐剂乳化的αVβ3免疫小鼠。随后在第 28，42和56天与氟氏不完全佐剂一起以10μgIP/10μgSQ注射。在第 42和56天可以通过不抗凝条件下的眶后穿刺而从小鼠取血。然后使血 液在RT下凝固1小时，收集血清，根据已知的方法采用αVβ3固相EIA 测定滴度。当重复注射不导致滴度增加时进行融合，称作GenO。此时抗 αVβ3的特异性人IgG滴度为1∶1280的小鼠然后接受稀释于100μL生 理盐水的10μgαVβ3的最后一次IV加强注射。3天后，通过断颈椎 处死小鼠，在无菌条件下去除脾，浸入含有100U/mL青霉素、100μg/mL 链霉素、和0.25μg/mL两性霉素B(PSA)的10mL冰冷盐酸缓冲盐水 (PBS)。通过用PSA-PBS无菌灌注脾而收获脾细胞，用台昐蓝染色排除法 计数，并且重悬于含25mM Hepes的RPMI 1640培养基。 细胞系
在93年9月1日将与非分泌性小鼠骨髓瘤融合的SP2/0接受至细 胞生物服务(CBS)组。在补加了10％(v/v)FBS(Cell Culture Labs)，1mM 丙酮酸钠，0.1mM NEAA，2mM L-谷氨酰胺(均来自JRH Biosciences) 的αMEM(改良的)培养基(JRH Biosciences)中扩增细胞系，并且冷冻 保存在95％FBS和5％DMSO(Sigma)中，然后在CBS中的气相液氮冷藏 器中储存。细胞库是无菌的(Quality Control Centocor，Malvern)并且 不含支原体(Bionique Laboratories)。将细胞维持于对数相，直到融合。 在PBS中洗涤细胞，计数，在融合前通过台昐蓝排除测定存活率(＞95％)。
扩增表达αVβ3和αVβ5整联蛋白的人骨髓瘤细胞，即M21细胞 系。将10个管型瓶的研究细胞库接受至细胞生物服务组并且储存在液 氮中。细胞库是无菌的并且不含支原体(Bionique Laboratories)。 MDAMB435L2细胞系，即表达整联蛋白αVβ3的人乳腺癌细胞，是由Janet Price博士(MD Anderson，Houston TX)赠送的。将细胞系冷冻保存在细 胞生物服务组。细胞库是无菌的并且不含支原体(Bionique Laboratories)。将M21和MDAMB435L2细胞解冻，在适当的培养基中增 殖并且在生物测定前几天内将细胞维持于对数相，或使其达到汇合，用 于纯化αVβ3蛋白(M21细胞)。 细胞融合
采用比例为1∶1的鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与存活脾细胞进行细胞融 合。简言之，将脾细胞和骨髓瘤细胞一起沉淀。然后在37℃下，在1mL50％ (w/v)PEG/PBS溶液(PEG分子量1450，Sigma)中重悬沉淀30秒以上。 然后通过缓慢加入1mL Dulbecco′s PBS(JRH)(37℃)1分钟以上，以便 终止融合。在接下来的90秒中加入19mL PBS。以750rpm将融合细胞离 心5分钟。然后将细胞重悬于HAT培养基(αMEM培养基，含有20％胎牛 血清(JRH)，1mM丙酮酸钠，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸，10 μg/mL庆大霉素，2.5％Origen培养补充物(Fisher)，50μM 2-巯基乙 醇，100μM次黄嘌呤，0.4μM氨喋呤和16μM胸苷)，并且以200μL/ 孔平铺于13个96孔平底组织培养板。然后将板置于含有5％CO2和95％ 空气的潮湿的37℃孵育器中7-10天。 检测小鼠血清中的人IgG抗αVβ3抗体
可以用固相EIA从小鼠血清中筛选人αVβ3的特异性人IgG抗体。 简言之，用PBS中的1μg/mLαVβ3包被平板过夜。在含有0.02％(v/v) Tween 20的0.15M盐水中洗涤后，用HBSS中的1％(w/v)BSA，以200 μL/孔在RT下封闭各个孔1小时。立即使用平板或在-20℃下冷冻，以 便将来使用。在αVβ3包被的板上以50μL/孔在RT下孵育小鼠血清的 2倍系列稀释液1小时。洗涤平板，然后用在1％BSA-PBS中1∶30000特 异性(准确)稀释的50μL/孔HRP标记的山羊抗人IgG Fc在RT下探测 1小时。再次洗涤平板，在RT下加入100μL/孔柠檬酸盐-磷酸盐底物溶 液(0.1M柠檬酸和0.2M硫酸钠，0.01％H2O2和1mg/mL OPD)15分钟。然 后加入25μL/孔终止溶液(4N硫酸)，在490nm下通过自动平板分光光 度计读出OD值。 在杂交瘤上清液中检测完全的人免疫球蛋白
由于GenPharm小鼠能够产生小鼠和人免疫球蛋白链，使用两个独 立的EIA检测生长阳性杂交瘤克隆中人轻链和人重链的存在。按上述方 法包被板，37℃下在板上孵育未稀释的杂交瘤上清液。洗涤平板，然后 用HRP标记的山羊抗人IgG1在室温下探测1小时。洗涤平板，然后用在 1％BSA-HBSS中1∶10000稀释的HRP偶联的山羊抗人κ(Southern Biotech)抗体或在1％BSA-PBS中1∶30000稀释的HRP偶联的山羊抗人 IgG Fc特异性抗体在37℃下探测1小时。然后按上述方法用底物溶液孵 育板。 同种型分析
使用EIA，采用类似于在小鼠免疫血清中筛选特异性滴度的形式完 成抗体的同种型测定。按上述方法将αVβ3包被在96孔板上，将2μg/mL 的纯化抗体在板上RT下孵育1小时。洗涤平板，用HRP标记的山羊抗 人IgG1(结合位点)或在1％BSA-HBSS中1∶4000稀释的HRP标记的山羊 抗人IgG3(zymed)在RT下探测1小时。然后按上述方法再次洗涤板，并 且用底物溶液孵育板。 通过EIA测定的人单克隆抗体的结合特征
用αVβ3捕获EIA评估抗体的结合特征。4℃下用溶于含2mM钙的 TBS的1μg/mLαVβ3包被Linbro板过夜。洗涤板，室温下用TBS/1％BSA/ 钙封闭至少1小时。在起始浓度为2μg/mL的加倍稀释液中孵育纯化抗 体。洗涤板，加入偶联的抗体(1∶30,000的HRP标记的山羊抗人IgG Fc)， 在室温下孵育1小时。洗涤板，将OPD底物加入各孔，通过自动平板分 光光度计读出OD值。
通过各种商购抗整联蛋白Mabs竞争GenO95与M21细胞的结合
用胰蛋白酶从培养烧瓶消化M21细胞，洗涤并重悬于HBSS/钙至2 ×106细胞/mL。RT下用FITC-山羊抗人Fc(Jackson)预标记GenO95 30 分钟。用250μg/mL FITC山羊抗人IgG孵育10×浓度的200μg/mL或20 μg/mL GenO95。37℃下用高(最终20μg/mL)和低(最终2μg/mL)浓度的 12μL10×GenO95±12μL以下鼠抗体孵育100μLM21细胞(2×105细胞) 的等分物45分钟：m7E3 IgG，抗αVβ3(克隆LM609，Chemicon)，或抗 αVβ5(克隆P1F6，Gibco)，抗β3(Chemicon，AMAC)，或抗αV(克隆VNR139， Gibco)抗体(20μg/mL)。从每一试管取出一份等分物(进行两色分析)， 剩余者与1％低聚甲醛混合，在流式细胞仪上分析。为进行两色分析，在 RT下用PE-山羊抗小鼠IgG孵育等分物(50μL)30分钟，以标记鼠抗 αVβ3，抗αVβ5，抗β3，或抗αV抗体。用1％低聚甲醛固定所有试管。
通过αVβ3/αVβ5特异性Mabs抑制αVβ3或αVβ5依赖性的M21 细胞或MDAMB435L2细胞与玻连蛋白包被的板的粘附
在室温下用溶于含2mM钙的TBS的5μg/mL玻连蛋白以50μL/孔包 被Linbro板1小时。用HBSS/钙洗涤板，RT下用溶于含2mM钙的TBS和 1％BSA封闭30分钟。用胰蛋白酶消化M21细胞，用含FCS的培养基洗 涤并重悬于3mL无钙的HBSS。所有的洗涤通过在Sorvall台式离心机 中以1000rpm旋转10分钟而完成。为对细胞进行荧光标记，将calcein (Molecular Probes)(5mg/mL，溶于DMSO)加至细胞，以便在50mL锥形 试管(用锡箔包裹)中达到100μg/mL的浓度。将细胞在37℃孵育10 -15分钟。用HBSS洗涤Calcein包被的细胞1次，重悬于补加0.1％BSA 和1mM MgCl2的HBSS。在HBSS/0.1％BSA/2mM钙中以10×的终浓度滴 定抗体(14倍系列稀释)。用抗体滴定液(37μL10×溶液)±抗αVβ 5(P1F6)腹水(Chemicon)(37μL1∶600(10×))在37℃预孵育细胞(300 μL，7.5×106/mL)15分钟。将细胞-抗体混合物以100μL/孔(约6× 106细胞/孔)加入玻连蛋白包被的板，共使用三份。将板在37℃孵育45 分钟。通过两次HBSS/钙(150μL/孔)洗涤去除未结合细胞。向每孔中加 入10μL HBSS/钙，在485-538nm下在Fluoroskan上对板进行读数。
在一项独立的测定中，用乙二胺四乙酸收获MDAMB435L2人乳腺癌 细胞，并且以500,000细胞/mL重悬于无血清培养基中，用各种浓度的 GenO95孵育。孵育10分钟后，将肿瘤细胞悬浮液(100μL)加入玻连蛋 白(10μg/mL)包被的Linbro板，在37℃孵育。1小时后，用无血清培 养基洗涤各孔3次(200μL/洗涤)，向每孔中加入基于MTT的细胞滴度 AQ染料(Promega)。在ELISA板中测定细胞粘附程度，其中OD490nm 与细胞粘附成正比。对BSA包被的孔的细胞粘附作为阴性对照。
测定αVβ3/αVβ5 Mabs与其配体的Ca++依赖性结合
为测定CNTO95和C372与αVβ3或αVβ5结合的阳离子依赖性，使 用液相EIA。4℃下用溶于碳酸盐包被缓冲液的10μg/mL的CNTO95，C372， c7E3或LM609 IgG Mabs包被EIA板(Corning)过夜。用稀释于含或不含 2mMCa++的HBSS的1％BSA封闭板至少1小时。浓度从10μg/mL开始的α Vβ3(log JG52599)或αVβ5(Chemicon)的加倍稀释液用溶于1％BSA/无 钙HBSS或1％BSA/含钙HBSS的50mM EDTA(Sigma)37℃下预孵育30分 钟。然后将混合物加入板，在37℃下孵育30分钟。然后洗涤板，将非 竞争性Mabs加入板：加入CNTO95，C372，c7E3包被的板中以检测αVβ3 结合，Mab CNTO95在1％BSA/HBSS Ca++中以20μg/mL加入；加入LM609 包被的板中以检测αVβ3结合，Mab LM609在1％BSA/HBSS Ca++中以20 μg/mL加入；加入CNTO95，C372，c7E3包被的板中以检测αVβ5结合， Mab VNR139(Gibco)在1％BSA/HBSS Ca++中以10μg/mL加入；在37℃下 孵育30分钟。再次洗涤板，用HRP标记的山羊抗小鼠IgG Fc或HRP标 记的山羊抗人IgG Fc在适当的缓冲液中探测，在37℃下孵育30分钟。 洗涤板，加入OPD底物，按上文的描述测量OD490。 结果和讨论 完全的人类抗人αVβ3单克隆抗体的产生
用αVβ3蛋白免疫的GenPharm小鼠进行一种称作GenO的融合。通 过该融合筛选了129种生长阳性杂交体。鉴定了分泌与人αVβ3反应的 完全的人IgG抗体的两种杂交瘤细胞系。这两种细胞系，GenO.95.9.12 和GenO.101.17.22的每一种都分泌人IgG1κ同种型的免疫球蛋白，并 且每一种都通过有限稀释进行两次亚克隆，以获得稳定的细胞系(＞90％ 均质)。细胞系GenO.95.9.12的C代码为#CNTO 95，GenO.101.17.22的 C代码为#C372A。每一种细胞系冷冻于储存于液氮中的12-管形瓶研究 细胞库。 通过EIA测定的人单克隆抗体的结合特征
ELISA分析证明从两种杂交瘤CNTO95和C372A得到的纯化抗体以 浓度依赖性方式结合αVβ3。图1表示抗体的相对结合效率。C372A和CNTO 95分别在0.07和0.7μg/mL的浓度下达到50％的结合。在同样的测定中， c7E3 IgG在0.7μg/mL表现出50％最大结合。
通过各种商购抗整联蛋白Mabs竞争GenO95与M21细胞的结合
通过单色分析，鼠抗αVβ3，抗αVβ5，抗β3，或抗αV抗体都不与 CNTO95竞争结合M21细胞(表1)。该实验也证明GenO95与M21细胞以 剂量依赖性方式结合。两色分析证明鼠抗αVβ3，抗αVβ5，抗β3，或 抗αV抗体能够结合M21细胞(数据未示出)。
表1：鼠抗整联蛋白Mabs对GenO95结合M21细胞的竞争     竞争性抗体     FITC-山羊抗人    FC-标记的    GenO95     2μg/mL       20μg/mL   MCF  ％阳性   MCF   ％阳性 阴性(无Gen 95) 阳性(盐水) m7E3 IgG LM609(抗-αvβ3) 抗-β3(Chemicon) 抗-β3(AMAC) P1F6(抗-αvβ5) VNR139(抗-αv)   2.69   4.33   5.73   4.78   5.42   4.61   4.87   4.61   100％   132％   110％   125％   106％   112％   106％   2.69   14.33   14.72   13.34   13.10   13.10   14.46   14.86     100％     103％     93％     91％     91％     101％     104％ MCF＝中间通道荧光 通过αVβ3/αVβ5特异性Mabs抑制αVβ3或αVβ5依赖性的M21 细胞或MDAMB435L2细胞与玻连蛋白包被的板的粘附
M21细胞以αVβ3和αVβ5依赖性方式粘附于玻连蛋白包被的板。 因此，要求αVβ3和αVβ5的阻断以完全抑制M21细胞与玻连蛋白包被 的板的结合。C372A在P1F6，抗αVβ5腹水存在或不存在下不抑制M21 细胞粘附(图2)。GenO95(CNTO95)在抗αVβ5(P1F6)腹水存在或不 存在下都完全抑制M21细胞与玻连蛋白包被的板结合，这表明抗体阻断 αVβ3和αVβ5。作为测定参数的对照，引入了阻断αVβ3的ReoPro (c7E3 Fab)(除GPIIb/IIIa外)。单独的ReoPro仅仅部分抑制M21细 胞粘附，抗αVβ5(P1F6)腹水存在下的ReoPro完全抑制粘附，这证明 M21细胞通过αVβ3或αVβ5整联蛋白结合玻连蛋白。将数据标准化为 拮抗剂不存在下+/-抗αVβ5(P1F6)腹水时的最大M21细胞结合的百分 比。对于没有P1F6的拮抗剂滴度，将数据标准化为不存在拮抗剂或P1F6 时的最大M21细胞结合。对于P1F6存在下的拮抗剂滴度，将数据标准 化为不存在拮抗剂但存在P1F6时的最大结合。将数据作图为最大结合 (无抗体)百分比，用GraphPad Prism进行非线性回归。
也证明了GenO95 Mab在1.5μg/mL的最低浓度下完全抑制 MDAMB435L2细胞与玻连蛋白粘附(图3)。这些数据的结合表明M21细胞 粘附的抑制，证明GenO95功能性抑制αVβ3和/或αVβ5受体与玻连蛋 白相互作用的能力。 测定αVβ3/αVβ5Mabs与其配体的Ca++依赖性结合
已知钙阳离子的存在是Mabc7E3与αVβ3结合所必须的，而对Mab LM609与αVβ3的结合则不是必须的，这是分别由图4c和4d证明的。 进行该实验以评估钙依赖性是否适用于CNTO95或C372对αVβ3或αV β5整联蛋白的结合特征。将过量浓度的EDTA引入测定中以螯合存在于 整联蛋白异二聚体的结合袋中的Ca，因此，结合是在不存在阳离子的条 件下评估的。发现CNTO95和C372与αVβ3的结合不依赖于Ca的存在 (图4a，4b)。CNTO95与αVβ5的结合也是如此，然而，对于C372与 αVβ5的结合(图4e，4f)则并非如此，其结合似乎在Ca存在下增加。 结论
用来自于人αVβ3免疫的含人可变区和恒定区抗体转基因的杂交小 鼠的脾细胞进行GenO融合。产生了两种完全的人αVβ3反应性IgG单 克隆抗体，它们属于IgG1κ同种型。对这些Mabs进一步鉴定，发现这 两种抗体都结合αVβ3和αVβ5整联蛋白。证明了这两种Mabs与αVβ 3的结合是不依赖于钙的，而只有C372与αVβ5的结合依赖于钙。而且， 一种Mab，GenO95(CNTO95)在基于细胞的测定中能够完全抑制αVβ3 和αVβ5与配体玻连蛋白的结合。可以证明该Mab可用于抗血管生成和 其它癌相关应用。
参考文献：
1.Taylor et al.，International Immunology 6：579-591(1993).
2.Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994).
3.Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996).
4.Fishwild et al.，Nature Biotechnology 14：845-851(X996).
5.Gastl et al.，Oncology 54：177-184(1997).
6.Eliceiri，et al.，J.Clin.Invest.103：1227-1230(1999).
7.Friedlander et al.，Science 270：1500-1502(1995).
8.Wayner，et al.，J.Cell Biol.113：919-929(1991). 实施例3：双整联蛋白抗体的结合亲和性 引言
GenO.95，也称为CNTO95，是一种由用纯化自人胎盘的αVβ3整联 蛋白免疫的F2杂交小鼠(CBA/J×C57/BL6/J，GenPharm International) 产生的人单克隆抗体。该抗体由人可变区和IgG1κ恒定区组成，发现它 与αVβ3和αVβ5都反应，这表明两种整联蛋白分子具有相同的α链特 异性。 目的
本研究的目的是鉴定GenO.95对αVβ3和αVβ5纯化整联蛋白的结 合亲和性和对β整联蛋白表达细胞系的结合亲和性。为进一步鉴定，将 比较GenO.95和ReoPro之间的结合值。 缩写
Kd，平衡解离常数，表达为M
Bmax＝结合位点的最大数目 材料和方法 细胞系
A375S2细胞，即一种表达αVβ3和αVβ5整联蛋白的人黑色素瘤细 胞系，在含10％胎牛血清(FBS，Cell Culture Labs)，1mM丙酮酸钠，0.1 mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺(均来自于JRH Biosciences)的 Dulbelcco′s最小培养基(DMEM)中培养。
HT29细胞，即一种表达αVβ5和极少αVβ3的人结肠癌细胞系(NB 4546，p207)，在含10％FBS，1mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的Dulbelcco′s DMEM中培养。
M21细胞，即来自于J.Jakubowski博士(Eli Lilly，Inc.)的一种 表达αVβ3和αVβ5整联蛋白的人黑色素瘤，在含10％FBS，1mM丙酮酸 钠，0.1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基(JRH Biosciences)中培养。 整联蛋白
在Centocor从胎盘纯化αVβ3批号JG22499。另一批αVβ3整联蛋 白(辛基制剂，批号19100991)购自Chemicon。αVβ5(Triton制剂，批号 20030055，批号1910990和辛基制剂，批号19060747)购自Chemicon。 抗体
GenO.95通过蛋白A层析纯化自细胞培养物上清液。ReoPro由 Centocor公司生产。一种鼠抗人αVβ3抗体LM609，(1976ZK，批号20020559 和批号1910329)和一种鼠抗人αVβ5抗体P1F6(1961P-K，批号17110560) 购自Chemicon。 放射性标记
用碘珠(Pierce Chemicals，IL)对抗体进行125INa(Amersham，IL) 放射性标记，使其比活性为1-2μCi/μg。用280nm的吸收(OD/ml)除 以1.4，测定抗体浓度(mg/ml)。稀释抗体并在γ计数器或Topcounter (Packard)中对等分物进行计数，以便测定碘标记抗体的比活性。 整联蛋白包被的板的结合测定
在含2mM氯化钙(TBS/Ca++)Tris缓冲盐水(TBS，10mMTris，100mM NaCI，pH7.5)中将αVβ3或αVβ5整联蛋白稀释至1μg/ml，4℃下以50 μl/孔包被至96孔聚苯乙烯Linbro板(Flow/ICN)过夜。用TBS/Ca++洗 涤板，用溶于TBS/Ca++的1％牛血清白蛋白(BSA)室温下包被1小时。将 三份50μl的稀释抗体加入包被的孔中，在37℃孵育2小时。用TBS-Tween 缓冲液(TBS+0.1％Tween20)洗涤3次后，加入在1％BSA-TBS中1∶40∶000 稀释的过氧化酶偶联的山羊抗人IgG F(ab′)2(H+L，Jackson批号 16869)，在室温下孵育1小时。将板洗涤3次，用由0.1M柠檬酸、0.2M 磷酸钠、0.01％H2O2和1mg/ml OPD组成的邻苯二胺二盐酸盐底物溶液(OPD， Sigma)显色。室温下15分钟后用0.3N H2SO4终止显色，在Molecular Dynamics板读数器中OD490nm下对板进行读数。
用GraphPad PRISM(版本3，GraphPad Software)产生结合曲线。 结果表示为饱和值的％最大结合。通过用PRISM对数据进行非线性回归 拟合而测定平衡解离结合常数Kd(表示为M)。 细胞结合测定
将三份溶于含2％牛血清白蛋白(JRHBiosciences)的2％RPMI中的50 μl加入在96孔培养板(Packard)上培养的汇合细胞。37℃孵育细胞1.5 小时。用含钙和镁的Hanks缓冲盐水(HBSS++，JRH Biosciences)轻柔洗 涤三次，然后吸出。每孔加入100μlMycosinct 20(Packard，在 TopCounter(Packard)中对细胞结合放射性进行定量。
为测定非特异性结合，在100倍过量的未标记抗体存在下用相似系 列的稀释液进行实验。
为测定铺于每孔的细胞数目，用胰蛋白酶将细胞重从每孔中取出， 合并，并且在显微镜下计数。每细胞的受体数目计算如下：
用PRISM对数据进行非线性回归拟合，以测定每细胞的最大结合位 点数目Bmax，和Kd。 结果和讨论
通过测量各种浓度的GenO.95(和ReoPro)与纯化αVβ3和αVβ5和细 胞表面受体在平衡状态下的结合而进行亲和性值的测定。饱和结合曲线 为直角双曲线，表明对GenO.95和ReoPro的单受体结合位点(图5-6； Motulsky H，1999)。用PRISM进行单点双曲线非线性回归拟合进行这些 饱和结合数据的分析(有时称作Scatchard实验)，以获得亲和性Kd和 受体数目，Bmax(Motulsky H，1999)。
用一些批号的GenO.95，ReoPro和纯化的整联蛋白确保结合亲和性 值的准确测定。GenO.95在αVβ3包被的板上的饱和结合曲线(图5A) 和ReoPro在αVβ3包被的板上的结合曲线(图5B)表示6次独立实验的 平均值和标准差。发现用αVβ3的Triton制剂获得的结果比用辛基制剂 获得的结果的可重复性强。在αVβ3包被的板上，GenO.95平均Kd为2.1 ±1.33×10-10M；ReoPro平均Kd为2.5+1.46×10-10M。
GenO.95在αVβ5包被的板上的饱和结合曲线(图6A)和ReoPro在 αVβ5包被的板上的结合曲线(图6B)表示6次独立实验的平均值和标 准差。用辛基制剂获得的结果比从Triton制剂获得的结果一致性强。 GenO.95在αVβ5包被的板上的平均Kd为2.5±1.04×10-11M。发现ReoPro 对αVβ5包被的板无结合和无剂量反应。
纯化整联蛋白的结合亲和性值与结合在各种细胞系上表达的受体相 似。图7A-C表示125-I GenO.95与表达αVβ3和αVβ5的A375S2细胞的 结合(图7A)。A375S2上的平均亲和性值为Kd＝5.2+2.04×10-9M；以 及120,000±37,000受体/细胞。HT-29细胞表达αVβ5。125-I GenO.95 与HT-29细胞结合的亲和性值为Kd＝1.3±3.76×10-10M；以及81,000± 24,000受体/细胞(图7B)。M21表达αVβ3和αVβ5。125-I GenO.95与M21 细胞结合的亲和性值为Kd＝8.5±3.03×10-9M；以及200,000±80,000 受体/细胞(图7C)。
用125-I ReoPro对各种细胞系进行了相似的细胞结合研究。图8A- C表示125-I GenO.95与A375S2细胞的结合，获得的平均值为Kd＝33± 3.7×10-9M；以及370,000±190,000受体/细胞(图8A)。在HT-29上，125-I ReoPro表现出极少的结合(图8B)。125-1 ReoPro与细胞的结合表现为： Kd＝10±2.00×10-9M；以及660,000±120,000受体/细胞(图8C)。125-I ReoPro在M21细胞上的值与以前公开的值一致Tam et al，1998)。
结合结果的概括总结于表2-3。
表2.GenO.95和ReoPro与纯化整联蛋白的亲和性的概括     αvβ3包被的板(n＝6)     αvβ5包被的板(n＝6)     Kd(M)     Kd(M)   GenO.95     2.1±1.33×10-10     2.5±1.04×10-11   ReoPro     2.5±1.46×10-10     可忽略
表3.GenO.95和ReoPro与细胞的亲和性的概括   A375S2细胞   A37552    细胞   HT-29细胞   HT-29   细胞   M21细胞   M21   细胞   Kd(M)  受体/细胞   Kd(M)  受体/细胞    Kd(M)  受体/细胞 GenO.95   5.2±2.04   ×10-9   (n＝5)   120,000   ±37,000   (n＝7)   1.3±0.38   ×10-9(n＝5)   81.000   ±24,000   (n＝7)    8.5±3.03    ×10-9    (n＝4)   200,000   ±80,000   (n＝8) ReoPro   22±3.7   ×10-9   370,000   ±190,000   (n＝6)   可忽略   (n＝4)   可忽略   (n＝4)    10±2.00    ×10-9    (n＝3)   660,000   ±120,000   (n＝7) (国际公开时缺页)
在三维纤维蛋白基质中培养，从而证明该抗体可能具有潜在的抗血 管发生特性。 引言
目前有足够的证据证明进展性的肿瘤生长依赖于血管发生，即新血 管的形成。这些血管为肿瘤提供了营养和氧气，带走废物，并且作为肿 瘤细胞转移至远处位点的导管(1)。最近的研究进一步证明了整联蛋白 在血管发生过程中的各种作用。整联蛋白是在介导细胞粘附、迁移、存 活和增殖中起重要作用的异二聚体跨膜蛋白(2)。整联蛋白αVβ3的表达 在静止或正常血管中极少，但在血管发生中的血管细胞上显著上调(1- 3)。也证明了密切相关但不同的整联蛋白αVβ5介导血管发生过程。抗 αVβ3抗体阻断碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管发生，而αV β5的特异性抗体抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管发生(1-5)。
通过内皮出芽测定体外模拟血管发生。该系统包括内皮细胞迁移和 增殖。GenO95是一种识别整联蛋白αVβ3和αVβ5的人单克隆抗体，这 些整联蛋白调节内皮西细胞迁移和增殖。因此，我们判断了GenO95是 否能够抑制内皮细胞出芽。该实施例描述的实验证明GenO95抑制在纤 维蛋白基质中生长的人上皮细胞出芽。 材料
从R&D Systems(Minneapolis，MN)获得人碱性成纤维细胞生长因 子(bFGF)和人血管内皮生长因子165(VEGF165)。一种抗αVβ3的单克隆 抗体1976Z/(LM609)、一种抗αVβ5的单克隆抗体MAB 1961(PIF6)购 自于Chemicon(Temecula，CA)。ReoPro和GenO95从Centocor的临床 药理和抗体技术系获得。人纤维蛋白原(无纤溶酶原，＞95％可凝蛋白) 和牛皮肤明胶购自Sigma(Saint Louis，MI)。 细胞系
人脐带静脉内皮细胞Huvecs购自Clonetics (Walkersville，MA)。 在含10％FBS，长R胰岛素样生长因子1，抗坏血酸，氢化可的松，人上 皮生长因子，人血管内皮生长因子，hFGF-b，硫酸庆大霉素和两性霉素B 的内皮基本培养基(EBM)试剂盒(Clonetics)中。在37℃和CO2中孵育细 胞，每2-3天更换培养基。只有3-8代用于所有实验中。 基于纤维蛋白微载体的出芽测定
用Nehls和Drenckhahn的改进方法(6)在基于三维纤维蛋白的基质 中测定毛细血管的形成。根据供应商的推荐制备明胶包被的cytodex-3 微载体(MCs，Sigma)。将新高压灭菌的MCs悬浮于EBM-2+20％FBS中， 并且以终浓度40细胞/MC加入细胞。37℃孵育4小时，允许细胞附着于 MCs。然后将MCs悬浮于大体积培养基中，在37℃和CO2中孵育2-4天。 偶尔搅拌MCs以防止细胞包被珠的聚集。将MCs包埋于按以下方法制备 的纤维蛋白凝胶中：将人纤维蛋白原(2mg/ml)溶于普通的或含bFGF或 血清的EBM-2培养基。该溶液也含有各种抗体。为防止由纤维蛋白包埋 细胞进行的过度纤维蛋白裂解，向纤维蛋白原溶液中和生长培养基中加 入200U/ml的抑肽酶。向纤维蛋白原溶液中加入密度为100-200MCs/ml (50-100个珠/每孔-48孔板)的细胞包被的微载体，通过加入凝血酶(0.5 U/ml)而诱导凝血。完成凝血后，向纤维蛋白基质中加入0.5ml溶液(含 上述所有成分，除去纤维蛋白原和凝血酶)。在37℃和CO2中孵育板1- 3天。1-3天后，用溶于PBS的3％低聚甲醛固定凝胶，对长度超过MC 珠直径(150μm)的毛细血管芽的数目进行定量。 结果和讨论
在纤维蛋白凝胶中培养时Huvecs可以形成毛细血管样芽(图9)。 内皮细胞迁移出凝胶包被的珠并延伸成线足。长芽由一些形成腔的细胞 组成。该过程类似于体内微毛细血管形成，因为它涉及内皮细胞迁移、 侵入和细胞增殖。芽形成的定量显示，GenO95在bFGF或完全培养基中 抑制内皮细胞芽形成(图10)。LM609和P1F6的组合一般比GenO95更有 效抑制出芽(图11)。 结论
从存在的血管形成新血管是血管发生的标志。可以通过内皮出芽测 定体外模拟该过程。这些芽代表反应于bFGF等血管发生刺激或存在于 血清中的各种刺激而形成的微毛细血管。GenO95剂量依赖性地抑制bFGF 和完全培养基刺激的内皮细胞出芽，这表示该抗体可以有效抑制αVβ3 和αVβ5功能。目前还不知道为什么GenO95不如LM609和P1F6的组合 有效，但可能GenO95分别与LM609和P1F6相比以更低的亲和性识别αV β3和αVβ5。这些数据集中起来证明GenO95可以抑制体外微毛细血管 形成的复杂过程。 参考文献 1.Gastl G，Hermann T. Steurer M，Zmija J，Gunsilius E，Unger C，and Kraft   A.1997.Angiogenesis as a Target for Tumor Treatment. Oncology 54：177-   184. 2.Eliceiri BP，and Cheresh DA.1999.The role ofαV integrins during   angiogenesis：insights into potential mechanisms of action and clinical   evelopment. The Journal of Clinical Investigation 103：1227-1230. 3.Brooks PC，Montgomery AM，Rosenfeld M，Reisfeld RA，1994.Integrin   αvβ3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of   angiogenic blood vessels. Cell 79：1157-1164. 4.Enenstein J，Walweh NS，and Kramer RH.1992.Basic FGF and TGF-β   differentially modulate integrin expression of human microvascular   endothelial cells. Exp. Cell Res. 203：499-503. 5.Friedlander M，Brooks PC，Shaffer RW，Kincaid CM，Varner JA，and   Cheresh DA.1995.Definition of two angiogenic pathways by distinct αV   integrins. Science 270：1500-1502. 6.Nehls，V and Drenckhahn，D.1995.A novel，microcarrier-based in vitro   assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell   migration and angiogenesis. Microvascular Res. 50：311-322. 实施例5：双整联蛋白抗体对内皮和肿瘤细胞粘附、迁移和侵入的作用
概要
用人胎盘αVβ3免疫含重链和轻链的人可变区和恒定区抗体转基因 的(CBA/JxC57/BL6/J)F2杂交小鼠(1-4)。一次融合产生了完全的人 αVβ3反应性IgG1κ单克隆抗体，即GenO.95。发现完全的人抗体都对 αVβ3和αVβ5有反应性(5)。这些整联蛋白参与内皮和肿瘤细胞粘附、 迁移和侵入。因此，我们鉴定了GenO.95对整联蛋白介导的细胞死亡率 的作用。GenO95抑制人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)和人黑色素瘤细胞 与玻连蛋白、变性胶原、纤维蛋白原和纤维蛋白的结合，但它不阻断细 胞与纤连蛋白和I型胶原的粘附。GenO95也抑制由碱性成纤维细胞生长 因子和的剂量血清刺激的内皮细胞迁移。GenO95抑制肿瘤细胞通过纤维 蛋白凝胶侵入。总之，GenO95在各种基于细胞的体外测定中功能性阻断 αVβ3和αVβ5。 缩写
BSA-牛血清白蛋白
CO2-二氧化碳
DMSO-二甲基亚砜
FBS-胎牛血清
Mab-单克隆抗体
OD-光密度
RT-室温
HUVEC-人脐带静脉内皮细胞
BFGF-牛碱性成纤维细胞生长因子 引言：
目前有足够的证据证明进展性的肿瘤生长依赖于血管发生，即新血 管的形成。这些新血管的形成为肿瘤提供了营养和氧气，带走废物，并 且作为肿瘤细胞转移至远处位点的导管。一些研究限定了整联蛋白在血 管发生过程中的作用。整联蛋白是在细胞与细胞外基质(ECM)的粘附 中起关键作用和介导细胞存活、迁移、和增殖中起重要作用的异二聚体 跨膜蛋白(6)。在血管发生过程中，αVβ3和αVβ5在激活的内皮细胞 表面上调，这有助于这些细胞的迁移和增殖(6)。抗αVβ3抗体阻断碱 性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管发生，而αVβ5的特异性抗体 抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管发生(6，7)。除调节血管发生 外，αVβ3和αVβ5调节肿瘤细胞粘附、迁移和侵入，这些是肿瘤细胞 转移所需要的过程。以前的研究表明，GenO95结合于纯化的αVβ3和α Vβ5整联蛋白，因此，我们确定了该抗体是否从功能上阻断αVβ3和α Vβ5介导的内皮和肿瘤细胞粘附、迁移和侵入。 材料和方法 材料
从R&D Systems(Minneapolis，MN)获得人碱性成纤维细胞生长因 子(bFGF)和人血管内皮生长因子165(VEGF165)。一种抗αVβ3的单克 隆抗体1976Z/(LM609)、一种抗αVβ5的单克隆抗体MAB 1961(PIF6) 购自于Chemicon(Temecula，CA)。ReoPro(批号：94A04ZE)和GenO95 (批号：JG100899)从Centocor的临床药理和抗体技术系获得。BIOCOAT 细胞培养插入物(孔径：8μm)购自Becton Dickinson(Bedford，MA)。 VybrantTM细胞粘附测定试剂盒(V-13181)购自Molecular Probes (Eugene，OR)。不含纤溶酶原的纤维蛋白酶(VWF/去除Fn)购自Enzyme Research Labs(South Bend，IN)。牛皮肤明胶购自Sigma(Saint Louis， MI)。人玻连蛋白购自Promega(Madison，WI)，I型胶原购自GIBCO BRL (Gaithersburg，MD)。 细胞系
人脐带静脉内皮细胞Huvecs购自Clonetics(Walkersville，MA)。 在含10％FBS，长R胰岛素样生长因子1，抗坏血酸，氢化可的松，人上 皮生长因子，人血管内皮生长因子，hFGF-b，硫酸庆大霉素和两性霉素B 的内皮基本培养基(EBM)试剂盒(Clonetics)中。在37℃和CO2中孵育细 胞，每2-3天更换培养基。当细胞达到80％汇合时进行传代。只有3- 8代用于所有实验中。
A375S2细胞，即一种表达αVβ3和αVβ5整联蛋白的人黑色素瘤细 胞系获得自Centocor细胞库，其中该细胞系视为不含支原体和细菌污 染。在补加10％FBS，2mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和0.1mM非必需 氨基酸的DMEM中培养这些细胞。
HT29细胞获得自Centocor细胞生物服务系，其中该细胞系视为不 含支原体和细菌污染。在补加10％FBS，2mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠 和0.1mM非必需氨基酸的DMEM中培养这些细胞。 流式细胞术
为检测表面整联蛋白，收获细胞，洗涤，悬浮于未补充的RPMI培 养基，然后用抗整联蛋白mAb(10μg/ml)和FITC标记的山羊抗小鼠抗 体(1∶100)或FITC标记的抗整联蛋白抗体(10μg/ml)系列孵育60分钟。 无第一抗体或用同种型匹配的抗体取代的第一抗体作为阴性对照。立即 用FACS Scan II流式细胞仪(Becton Dickinson，Mountain View，CA) 分析细胞。 粘附分析
用玻连蛋白(1μg/ml)，明胶(0.1％)，纤维蛋白原(100μg/ml)，I型 胶原(10μg/ml)或纤连蛋白(10μg/ml)在4℃下包被微量滴定板 (Linbro-Titertek，ICN Biomedicals，Inc)。使用前用PBS冲洗，用1％ BSA/PBS(pH7.4)封闭1小时。纤维蛋白包被的微量滴定孔通过用凝血 酶(1U/ml)处理纤维蛋白原而形成。根据生产商的说明用Calcein AM荧 光染料(Molecular Probes，Eugene，OR)标记粘附的细胞(HUVECS HT29 和A375S.2)，收获，洗涤两次，重悬于含0.1％BSA的DMEM培养基。将 细胞密度调节至5×105/ml后，用各种浓度的抗体将细胞在37℃孵育15 分钟。将细胞-抗体混合物加入孔(100μl/孔)，在37℃孵育1小时。 用PBS冲洗板两次，以去除未结合细胞，在485-538nm下，在荧光板读 数器(Fluoroskan)中测量粘附。细胞与BSA包被的板的粘附作为阴性对 照。 趋化性迁移测定
在24-Transwell室中用聚苯乙烯膜(直径6.5mm，厚10μm，孔径 8μm)中进行细胞迁移测定。用胰蛋白酶-EDTA收获亚汇合的24小时细 胞培养物(HUVECS或A375S.2)，洗涤两次，重悬于其各自的含0.1％BSA 的无血清培养基中。在抗体存在或不存在时将细胞(100,000/500μl)加 入上面的室。为促进趋化性细胞迁移，将750μl含0.1％BSA和玻连蛋 白(2μg/ml)或血清(对于HUVECS为2％，对于A375S2细胞为10％)的 培养基加入底部的室，将板置于组织培养孵育器中。4-8小时后通过用 棉线去除顶部的细胞而终止迁移，然后用3％低聚甲醛固定滤膜，用结晶 紫染色。通过光学显微镜测定细胞迁移程度，用Phase3图像分析软件 (Glen Mills，PA)分析图像。该软件分析被染色细胞在滤膜底侧所占据 的总面积，它与细胞迁移程度成正比。 趋触性迁移测定
用进行了微小改变的上述transwell室进行细胞迁移测定。简言之， 用玻连蛋白(2μg/ml)将膜的下面室温下包被60分钟，然后在室温下 用1％BSA/PBS溶液封闭60分钟。随后，用PBS洗涤膜并且空气中干燥。 将含0.1％BSA和bFGF(2μg/ml)的无血清培养基(750μl)加入下面 的室。用胰蛋白酶-EDTA收获亚汇合的24小时细胞培养物，洗涤两次， 重悬于无血清培养基中。在抗体存在或不存在时将细胞(100,000/500μl) 加入上面的室。将室置于组织培养孵育器中，允许迁移进行6小时。按 前述方法测定细胞迁移程度。 侵入测定
将纤维蛋白原(不含纤溶酶原，10mg/ml，100μl)和100μl的IU/ml 凝血酶混合，立即加入24孔transwell板(直径6.5mm，厚10μm，孔 径8μm，Costar)的顶部室。将板在37℃孵育30分钟以形成纤维蛋白 凝胶。用胰蛋白酶消化汇合的肿瘤细胞(A375S.2)，离心，重悬于补加 0.1％BSA和10g/ml纤溶酶原(Enzyme Research Labs，South Bend，IN) 和各种浓度抗体的基本培养基中，在室温下孵育15分钟。在抗体存在 或不存在时将细胞(100,000/500μl)加入上面的室。侵入室的下隔室中 充满0.75ml10％FBS-DMEM，作为化学引诱物，将板转移至组织培养孵 育器。24小时后，通过用棉线去除顶部的细胞而终止迁移，然后用3％ 低聚甲醛固定滤膜，用结晶紫染色。通过光学显微镜测定细胞迁移程度， 用上述Phase3图像分析软件分析图像。 结果和讨论 GenO95抑制αVβ3和αVβ5介导的细胞粘附
由于GenO95与αVβ3和αVβ5整联蛋白结合，我们测定了我们的 肿瘤细胞(A375S.2和HT29)和内皮细胞是否表达这些整联蛋白。流式细 胞术表明，A375S.2和HUVEC表达αVβ3和αVβ5整联蛋白，但HT29 细胞表达αVβ5，而不表达αVβ3整联蛋白(图12A-I)。
HT29细胞(12A，B和C)在其表面表达αVβ5整联蛋白，而不表达α Vβ3整联蛋白。HUVEC(12D，E和F和A375S.2(12G，H和I)在其表面 表达αVβ3和αVβ5整联蛋白。通过免疫荧光对肿瘤细胞和内皮细胞进 行染色，通过流式细胞术进行分析。左侧的柱状图表示同种型匹配的抗 体存在下的本底荧光。右侧的柱状图表示阳性染色。A，D，G，LM609(针 对mAb的αVβ3，10μg/ml)；B，E，H，PIF6(针对mAb的αVβ5，10 μg/ml)；和C，F，I，GenO95(10μg/ml)。
详细测定了GenO95对HUVEC，A375S.2和HT 29细胞与各种基质蛋 白粘附的作用。GenO95完全抑制HUVEC和A375S.2细胞与玻连蛋白包被 的板的粘附，部分抑制与纤维蛋白原、明胶和纤维蛋白包被的板的粘附， 表明该抗体可以阻断αVβ3和αVβ5(图2和3，表1和2)。
(国际公开时缺页)
表5.A375S.2细胞与玻连蛋白、明胶、纤维蛋白原、纤维蛋白、 纤连蛋白和I型胶原的粘附。各种浓度抗体存在下的细胞粘附程度表示 为抗体不存在下细胞粘附的百分比，抗体不存在下的细胞粘附作为 100％。每个数据点是三次测定的平均值(+/-SD)。使用的抗体浓度是10 μg/ml。
                    粘附(％)+/-SD
      玻连蛋白      明胶         纤维蛋白原    纤维蛋白    纤连蛋白     I型
                                                                        胶原 人IgG     104.0±5.3    94.6±12.4   102.5±5.9    99.5±4.0   100.0±5.5   99.1±3.3 LM609     42.1±6.1     25.2±7.1    14.0±1.8     50.0±1.9   104.0±8.1   100.0±1.5 PIF6      28.5±3.8     87.4±7.8    99.4±3.6     92.9±4.7   101.0±5.7   101.0±7.3 LM609-    0.9±0.3      1.1±1.5     10.3±2.6     47.6±3.2   109.0±4.1   102.0±4.6 PIF6 GenO95    1.4±0.4      23.2±7.2    11.4±2.8     43.3±3.5   103.0±4.5   104.0±5.9 ReoPro    38.1±0.7     6.0±1.0     6.5±2.1      12.9±3.8   104.0±5.6   93.1±3.1
人结肠癌HT29细胞与玻连蛋白的粘附。按上述方法进行粘附测定。 与BSA包被的孔的细胞粘附作为阴性对照。图15的数据表示为最大结 合(不存在抗体)的百分比，是三次测定的平均值(+/-SD)。 GenO95阻断人黑色素瘤和内皮细胞迁移
整联蛋白αVβ3和αVβ5参与细胞迁移，因此我们测定了GenO95 是否能够阻断玻连蛋白刺激的细胞迁移。玻连蛋白刺激的细胞迁移涉及 αVβ3和αVβ5。当玻连蛋白作为化学引诱物时，GenO95剂量依赖性抑 制内皮细胞迁移(图5和6)。有趣的是，GenO95也抑制HUVECS和A375S.2 细胞对血清的迁移(图7-8)。这些发现对血管发生和肿瘤治疗可能是 重要的，因为它们提示GenO95的靶，αVβ3和αVβ5是由血清中的各 种迁移因子激活的中枢受体。
HUVECS向2μg/ml玻连蛋白的迁移。按方法中的描述进行测定，允 许细胞迁移6小时。光学显微镜照片是图16A无抗体，(16B)，GenO95(5 μg/ml)，(16C)，GenO95(40μg/ml)的细胞迁移的代表性视野(10倍物 镜)。图16D是各种浓度GenO95存在下的细胞迁移的表示图。数据标准 化为对照(无抗体)的百分比，对照认为是100％，每个点是三个transwell 滤膜的平均值(+/-SD)。
在αVβ3和αVβ5的抗体存在下，HUVECS向2μg/ml玻连蛋白迁 移。按方法中的描述进行测定，允许细胞迁移6小时。LM609和P1F6分 别针对αVβ3和αVβ5。图17的数据标准化为对照(无抗体)的百分 比，对照认为是100％，每个柱是三个transwell滤膜的平均值(+/-SD)。 BSA、小鼠IgG和人IgG作为阴性对照。LM609-PIF6表示两种抗体的组 合。抗体和BSA的浓度为10μg/ml。
HUVECS向2％FBS的迁移。进行迁移测定4小时，按方法中的描述 获得数据。图18(A)表示LM609，P1F6，LM609+P1F6的组合，同种型匹 配的对照(人和小鼠)存在下的细胞迁移。抗体和蛋白的浓度为10μ g/ml。图8(B)表示ReoPro和GenO95存在下的细胞迁移。光学显微镜 照片是图18(C)无抗体，18(D)，GenO95(5μg/ml)，图18(E)，GenO95(20 μg/ml)的细胞迁移的代表性视野(10倍物镜)。数据标准化为对照(无 抗体)的百分比，对照认为是100％，每个点是三个transwell滤膜的平 均值(+/-SD)。
A375S.2向10％FBS的迁移。进行迁移测定4小时，按方法中的描 述获得数据。抗体的浓度为10μg/ml。图19(A)是各种浓度GenO95存 在下细胞迁移的表示图。图19(B)表示LM609，P1F6，LM609+P1F6的组合， 同种型匹配的对照(人和小鼠)存在下的细胞迁移。数据标准化为对照(无 抗体)的百分比，对照认为是100％，每个点是三个transwell滤膜的平 均值(+/-SD)。光学显微镜照片是图19(C)无抗体，18(D)，GenO95(5 μg/ml)，图18(E)，GenO95(20μg/ml)的细胞迁移的代表性视野(10倍 物镜)。
上述结果表示，GenO95阻断肿瘤和内皮细胞向玻连蛋白和血清迁 移。接下来，我们确定该抗体是否可以抑制bFGF刺激的细胞迁移。如 图9所示，bFGF刺激HUVEC细胞向玻连蛋白迁移，GenO95显著阻断该被 刺激的细胞迁移。
BFGF存在下HUVECS向玻连蛋白的迁移。用2μg/ml玻连蛋白包被 迁移室滤膜的下面，按方法中的描述进行测定。允许细胞迁移6小时。 在图20A-E中，每个数据点是三个transwell滤膜的平均值(+/-SD)。图 20(A)，bFGF；图20(B)，GenO95(5μg/ml)；图20(C)，GenO95(40μ g/ml)；图20(D)，无bFGF。图20(E)，图示了各种抗体存在下的细胞迁 移的抑制。 GenO95阻断人黑色素瘤细胞侵入
上述结果表示，GenO95可以抑制细胞粘附和迁移。因此，我们考虑 了该抗体是否阻断肿瘤细胞侵入，即一个包括细胞粘附的多步过程，基 质的降解和细胞通过降解基质的迁移。我们选择了纤维蛋白作为肿瘤细 胞的基质，因为GenO95可以阻断肿瘤细胞与纤维蛋白粘附(图3)。如 图10所示，LM609可以抑制A375S侵入，这表示至少αVβ3参与此过程。 GenO95剂量依赖性抑制肿瘤细胞通过纤维蛋白。针对血小板GPIIb/IIIa (10E5)的不相关IgG和mAb作为阴性对照。综上所述，这些数据表明， GenO95有效阻断人黑色素瘤细胞侵入。
A375S.2细胞通过纤维蛋白凝胶(5mg/ml)的侵入。允许侵入测定进 行24小时，按方法中的描述获取数据。光学显微镜照片是图21(A)无 抗体，21(B)，GenO95(10μg/ml)的细胞侵入的代表性视野(4倍物镜)， 图21(C)和(D)是GenO95，10E5 F(ab’)2，LM609，P1F6，LM-PIF6 (LM609+P1F6)，人和小鼠IgGs(H-IgG和M-IgG)存在下的细胞侵入的表 示图。图21(D)：所有抗体和蛋白的浓度是10μg/ml。数据标准化为对照 (无抗体)的百分比，对照认为是100％，每个点是三个transwell滤膜 的平均值(+/-SD)。 结论
细胞粘附、迁移和侵入要求整联蛋白如αVβ3和αVβ5。GenO95能 够功能性阻断由内皮细胞和肿瘤细胞表达的αVβ3和αVβ5。GenO95能 够阻断由bFGF或血清刺激的迁移和侵入。这些结果表示，GenO95是肿 瘤和内皮细胞表达的αVβ3和αVβ5的强抑制剂。
发明背景 发明领域
本申请部分基于并要求2000年8月7日提交的美国临时申请 60/223,363的优先权，在此引入其全部内容作为参考。
参考文献 1.Taylor，L.D.，C.E.Carmack，D.Huszar，K.M.Higgins，R.Mashayekh，G.Sequar，S.   R.Schramm，C-C.Kuo，S.L.O′Donnell，R.M.Kay，C.S.Woodhouse，and N.   Lonberg.1993. Human immunoglobulin transgenes undergo rearrangement，somatic   mutation and class switching in mice that lack endogenous IgM.International   Immunology 6：579-591. 2.Lonberg，N.，L.D.Taylor，F.A.Harding，M.Trounstine，K.M.Higgins，S.R.   Schramm，C-C.Kuo.R.Mashayekh，K.Wymore，J.G.McCabe，D.Munoz-O′Regan，   S.L.O′Donnell，E.S.G.Lapachet.T.Bengoechea，D.M.Fishwild，C.E.Carmack，R.   M.Kay，and D.Huszar.1994.Antigen-specific human antibodies from mice   comprising four distinct genetic modifications. Nature 368：856-859. 3.Neuberger，M.1996.Generating high-avidity human Mabs in mice.Nature   Biotechnology 14：826. 4.Fishwild，D.M.，S.L.O′Donnell，T.Bengoechea，D.V.Hudson，F.Harding，S.L.   Bernhard，D.Jones，R.M.Kay，K.M.Higgins，S.R.Schramm，and N.Lonberg.   1996.High-avidity human IgG monoclonal antibodies from a novel strain of   minilocus transgenic mice.Nature Biotechnology 14：845-851. 5.Gastl，G.，T.Hermann，M.Steurer，J.Zmija，E.Gunsilius，C.Unger，and A.Kraft.   1997. Angiogenesis as a Target for Tumor Treatment.Oncology 54：177-184. 6.Eliceiri，B.P.，and D.A.Cheresh.1999.The role ofαV integrins during   angiogenesis：insights into potential mechanisms of action and clinical development.   The Journal of Clinical Investigation 103：1227-1230. 7.Friedlander M.，P.C. Brooks，R..W.Shaffer，C.M.Kincaid，J.A.Varner，and D.A.   Cheresh.1995.Definition of two angiogenic pathways by distinct αV integrins.   Science 270：1500-1502.
应该明确的是，本发明的实施可以不限于前面说明书和实施例的具 体描述。
根据前面的教导，可以对本发明进行各种修饰和变化，它们都属于 所附权利要求的范围。
               序列表 <110>J.吉勒斯-科马尔；G.希夫纳；L.斯奈德；M.特里克哈 <120>抗双整联蛋白抗体、组合物、方法和用途 <130>CEN 249 <160>17 <170>PatentIn Ver 2.0 <210>1 <211>5 <212>PRT <213>人(Homo sapiens) <400>1
 Arg Tyr Thr Met His
                 5 <210>2 <211>17 <212>PRT <213>人 <400>2
Val Ile Ser Phe Asp G1y Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15 <210>3 <211>10 <212>PRT <213>人 <400>3
 Glu Ala Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp Ile
 1                   5               10 <210>4 <211>10 <212>PRT <213>人 <400>4
 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
 1                   5                   10 <210>5 <211>6 <212>PRT <213>人 <400>5
 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
 1                   5 <210>6 <211>7 <212>PRT <213>人 <400>6
 Gln Gln Arg Ser Asn Trp pro Pro
 1                   5 <210>7 <211>119 <212>pRT <213>人 <400>7 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1               5                   10                  15 Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
        20                  25                  30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35                  40                  45 Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr 65                  70                  75                   80 Leu Gln Val Asn Ile Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95 Ala Arg Glu Ala Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
        100                 105                 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser
    115 <210>8 <211>108 <212>PRT <213>人 <400>8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1               5                   10                  15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
        20                  25                  30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
    35                  40                  45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65                  70                  75                  80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
            85                  90                  95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
      100                  105 <210>9 <211>1048 <212>pRT <213>人 <400>9 Met Ala Phe Pro Pro Arg Arg Arg Leu Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu 1               5                   10                  15 Pro Leu Leu Leu Ser Gly Leu Leu Leu Pro Leu Cys Arg Ala Phe Asn
        20                  25                   30 Leu Asp Val Asp Ser Pro Ala Glu Tyr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Tyr
    35                  40                  45 Phe Gly Phe Ala Val Asp Phe Phe Val Pro Ser Ala Ser Ser Arg Met
50                  55                  60 Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro Gly Ile 65                  70                  75                  80 Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Asp Trp Ser Ser Thr Arg Arg
            85                  90                  95 Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ala Thr Gly Asn Arg Asp Tyr Ala Lys
        100                 105                 110 Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala Ser Val
    115                 120                 125 Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr His Trp
130                 135                 140 Arg Thr Glu Met Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys Phe Leu 145                 150                 155                 160 Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser Gln Asp
            165                 170                 175 Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ile Asp
        180                 185                 190 Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser Phe Tyr
    195                 200                 205 Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Val Ser Lys
210                 215                 220 Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu Ala Thr 225                 230                 235                 240 Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val
            245                 250                 255 Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Asp Asp Phe Val Ser Gly
        260                 265                 270 Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr Asp Gly
    275                 280                 285 Lys Asn Met Ser Ser Leu Tyr Asn Phe Thr Gly Glu Gln Met Ala Ala
290                 295                 300 Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp Asp Tyr 305                 310                 315                 320 Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly Ser Asp
            325                 330                 335 Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln Arg Ala
        340                 345                 350 Ser Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val Phe Ala
    355                 360                 365 Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln Asp Gly
370                 375                 380 Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp Lys Lys 385                 390                 395                 400 Gly Ile Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn Ala Val
            405                 410                 415 Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Arg Ser Met Pro Pro
        420                 425                 430 Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Ile Asp Lys Asn Gly
    435                 440                 445 Tyr Pro Asp Leu Ile Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala Ile Leu
450                 455                 460 Tyr Arg Ala Arg Pro Val Ile Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu Val Tyr 465                 470                 475                 480 Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr Cys Ser Leu Pro Gly Thr
            485                 490                 495 Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys Ala Asp
        500                 505                 510 Gly Lys Gly Val Leu Pro Arg Lys Leu Asn Phe Gln Val Glu Leu Leu
    515                 520                 525 Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu Phe Leu
530                 535                 540 Tyr Ser Arg Ser Pro Ser His Ser Lys Asn Met Thr Ile Ser Arg Gly 545                 550                 555                 560 Gly Leu Met Gln Cys Glu Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Ser
            565                 570                 575 Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu Tyr Arg
        580                585                 590 Leu Asp Tyr Arg Thr Ala Ala Asp Thr Thr Gly Leu Gln Pro Ile Leu
    595                 600                 605 Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Ile Ser Arg Gln Ala His Ile Leu Leu
610                 615                 620 Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val Ser Val 625                 630                 635                 640 Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro Leu Thr
            645                 650                 655 Leu Ile Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu Ala Glu
        660                 665                 670 Leu Ile Val Ser Ile Pro Leu Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val Val Arg
    675                 680                 685 Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr Glu Asn
690                     695             700 Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys Ala Gly 705                 710                 715                 720 Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln Ser Glu
            725                 730                 735 Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Gln Ile Gln Ser Ser Asn Leu
        740                 745                 750 Phe Asp Lys Val Ser Pro Val Val Ser His Lys Val Asp Leu Ala Val
    755                 760                 765 Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His Ile Phe
770                 775                 780 Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu His Lys Glu Asn Pro Glu Thr Glu Glu 785                 790                 795                 800 Asp Val Gly Pro Val Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn Asn Gly
            805                 810                 815 Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Met Leu His Leu Gln Trp Pro Tyr Lys
        820                 825                 830 Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile Asp Gly
    835                 840                 845 Pro Met Asn Cys Thr Ser Asp Met Glu Ile Asn Pro Leu Arg Ile Lys
850                 855                 860 Ile Ser Ser Leu Gln Thr Thr Glu Lys Asn Asp Thr Val Ala Gly Gln 865                 870                 875                 880 Gly Glu Arg Asp His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Ala Leu Ser Glu
            885                 890                 895 Gly Asp Ile His Thr Leu Gly Cys Gly Va1 Ala Gln Cys Leu Lys Ile
        900                 905                 910 Val Cys Gln Val Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile Leu Tyr
    915                 920                 925 Val Lys Ser Leu Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu Asn Gln
930                 935                 940 Asn His Ser Tyr Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Val Ile Glu 945                 950                 955                 960 Phe Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Ile Glu Asp Ile Thr Asn Ser Thr Leu
            965                 970                 975 Val Thr Thr Asn Val Thr Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met Pro Val
        980                 985                 990 Pro Val Trp Val Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu
    995                 1000                1005 Ala Val Leu Val Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys Arg Val
1010                1015               1020 Arg Pro Pro Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro His Glu 1025               1030                1035                 1040 Asn Gly Glu Gly Asn Ser Glu Thr
            1045 <210>10 <211>15 <212>DNA <213>人 <400>10
 agatatacta tgcac                                               15 <210>11 <211>51 <212>DNA <213>人 <400>11
 gttatatcat ttgatggaag caataaatac tacgtagact ccgtgaaggg c       51 <210>12 <211>30 <212>DNA <213>人 <400>12
 gaggcccggg gatcgtatgc ttttgatatc                               30 <210>13 <211>33 <212>DNA <213>人 <400>13
 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cc                 33 <210>14 <211>18 <212>DNA <213>人 <400>14
 gatgcatcca acagggcc                                  18 <210>15 <211>21 <212>DNA <213>人 <400>15
 cagcagcgta gcaactggcc t                              21 <210>16 <211>788 <212>PRT <213>人 <400>16 Met Arg Ala Arg Pro Arg Pro Arg Pro Leu Trp Ala Thr Val Leu Ala 1               5                   10                  15 Leu Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly Gly Pro Asn Ile Cys Thr
        20                  25                  30 Thr Arg Gly Val Ser Ser Cys Gln Gln Cys Leu Ala Val Ser Pro Met
    35                  40                  45 Cys Ala Trp Cys Ser Asp Glu Ala Leu Pro Leu Gly Ser Pro Arg Cys
50                  55                  60 Asp Leu Lys Glu Asn Leu Leu Lys Asp Asn Cys Ala Pro Glu Ser Ile 65                  70                  75                  80 Glu Phe Pro Val Ser Glu Ala Arg Val Leu Glu Asp Arg Pro Leu Ser
            85                  90                  95 Asp Lys Gly Ser Gly Asp Ser Ser Gln Val Thr Gln Val Ser Pro Gln
        100                 105                 110 Arg Ile Ala Leu Arg Leu Arg Pro Asp Asp Ser Lys Asn Phe Ser Ile
    115                 120                 125 Gln Val Arg Gln Val Glu Asp Tyr Pro Val Asp Ile Tyr Tyr Leu Met
130                 135                 140 Asp Leu Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu Trp Ser Ile Gln Asn Leu 145                 150                 155                 160 Gly Thr Lys Leu Ala Thr Gln Met Arg Lys Leu Thr Ser Asn Leu Arg
            165                 170                 175 Ile Gly Phe Gly Ala Phe Val Asp Lys Pro Val Ser Pro Tyr Met Tyr
        180                 185                 190 Ile Ser Pro Pro Glu Ala Leu Glu Asn Pro Cys Tyr Asp Met Lys Thr
    195                 200                 205 Thr Cys Leu Pro Met Phe Gly Tyr Lys His Val Leu Thr Leu Thr Asp
210                 215                 220 Gln Val Thr Arg Phe Asn Glu Glu Val Lys Lys Gln Ser Val Ser Arg 225                 230                 235                 240 Asn Arg Asp Ala Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Ile Met Gln Ala Thr
            245                 250                     255 Val Cys Asp Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn Asp Ala Ser His Leu Leu
        260                 265                 270 Val Phe Thr Thr Asp Ala Lys Thr His Ile Ala Leu Asp Gly Arg Leu
    275                 280                 285 Ala Gly Ile Val Gln Pro Asn Asp Gly Gln Cys His Val Gly Ser Asp
290                 295                 300 Asn His Tyr Ser Ala Ser Thr Thr Met Asp Tyr Pro Ser Leu Gly Leu 305                 310                 315                 320 Met Thr Glu Lys Leu Ser Gln Lys Asn Ile Asn Leu Ile Phe Ala Val
            325                 330                 335 Thr Glu Asn Val Val Asn Leu Tyr Gln Asn Tyr Ser Glu Leu Ile Pro
        340                 345                 350 Gly Thr Thr Val Gly Val Leu Ser Met Asp Ser Ser Asn Val Leu Gln
    355                 360                 365 Leu Ile Val Asp Ala Tyr Gly Lys Ile Arg Ser Lys Val Glu Leu Glu
370                 375                 380 Val Arg Asp Leu Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Phe Asn Ala Thr Cys 385                 390                 395                 400 Leu Asn Asn Glu Val Ile Pro Gly Leu Lys Ser Cys Met Gly Leu Lys
            405                 410                 415 Ile Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Ile Glu Ala Lys Val Arg Gly Cys
        420                 425                 430 Pro Gln Glu Lys Glu Lys Ser Phe Thr Ile Lys Pro Val Gly Phe Lys
    435                 440                 445 Asp Ser Leu Ile Val Gln Val Thr Phe Asp Cys Asp Cys Ala Cys Gln
450                 455                 460 Ala Gln Ala Glu Pro Asn Ser His Arg Cys Asn Asn Gly Asn Gly Thr 465                 470                 475                 480 Phe Glu Cys Gly Val Cys Arg Cys Gly Pro Gly Trp Leu Gly Ser Gln
            485                 490                 495 Cys Glu Cys Ser Glu Glu Asp Tyr Arg Pro Ser Gln Gln Asp Glu Cys
        500                 505                 510 Ser Pro Arg Glu Gly Gln Pro Val Cys Ser Gln Arg Gly Glu Cys Leu
    515                 520                 525 Cys Gly Gln Cys Val Cys His Ser Ser Asp Phe Gly Lys Ile Thr Gly
530                 535                 540 Lys Tyr Cys Glu Cys Asp Asp Phe Ser Cys Val Arg Tyr Lys Gly Glu 545                 550                 555                 560 Met Cys Ser Gly His Gly Gln Cys Ser Cys Gly Asp Cys Leu Cys Asp
            565                 570                 575 Ser Asp Trp Thr Gly Tyr Tyr Cys Asn Cys Thr Thr Arg Thr Asp Thr
        580                 585                 590 Cys Met Ser Ser Asn Gly Leu Leu Cys Ser Gly Arg Gly Lys Cys Glu
    595                 600                 605 Cys Gly Ser Cys Val Cys Ile Gln Pro Gly Ser Tyr Gly Asp Thr Cys
610                 615                 620 Glu Lys Cys Pro Thr Cys Pro Asp Ala Cys Thr Phe Lys Lys Glu Cys 625                 630                 635                 640 Val Glu Cys Lys Lys Phe Asp Arg Glu Pro Tyr Met Thr Glu Asn Thr
            645                 650                 655 Cys Asn Arg Tyr Cys Arg Asp Glu Ile Glu Ser Val Lys Glu Leu Lys
        660                 665                 670 Asp Thr Gly Lys Asp Ala Val Asn Cys Thr Tyr Lys Asn Glu Asp Asp
    675                 680                 685 Cys Val Val Arg Phe Gln Tyr Tyr Glu Asp Ser Ser Gly Lys Ser Ile
690                 695                 700 Leu Tyr Val Val Glu Glu Pro Glu Cys Pro Lys Gly Pro Asp Ile Leu 705                 710                 715                 720 Val Val Leu Leu Ser Val Met Gly Ala Ile Leu Leu Ile Gly Leu Ala
            725                 730                 735 Ala Leu Leu Ile Trp Lys Leu Leu Ile Thr Ile His Asp Arg Lys Glu
        740                 745                 750 Phe Ala Lys Phe Glu Glu Glu Arg Ala Arg Ala Lys Trp Asp Thr Ala
    755                 760                 765 Asn Asn Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Thr Ser Thr Phe Thr Asn Ile Thr
770                 775                 780 Tyr Arg Gly Thr 785 <210>17 <211>799 <212>PRT <213>人 <400>17 Met Pro Arg Ala Pro Ala Pro Leu Tyr Ala Cys Leu Leu Gly Leu Cys 1               5                   10                  15 Ala Leu Leu Pro Arg Leu Ala Gly Leu Asn Ile Cys Thr Ser Gly Ser
        20                  25                  30 Ala Thr Ser Cys Glu Glu Cys Leu Leu Ile His Pro Lys Cys Ala Trp
    35                  40                  45 Cys Ser Lys Glu Asp Phe Gly Ser Pro Arg Ser Ile Thr Ser Arg Cys
50                  55                  60 Asp Leu Arg Ala Asn Leu Val Lys Asn Gly Cys Gly Gly Glu Ile Glu 65                  70                  75                  80 Ser Pro Ala Ser Ser Phe His Val Leu Arg Ser Leu Pro Leu Ser Ser
            85                  90                  95 Lys Gly Ser Gly Ser Ala Gly Trp Asp Val Ile Gln Met Thr Pro Gln
        100                 105                 110 Glu Ile Ala Val Asn Leu Arg Pro Gly Asp Lye Thr Thr Phe Gln Leu
    115                 120                 125 Gln Val Arg Gln Val Glu Asp Tyr Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Met
130                 135                 140 Asp Leu Ser Leu Ser Met Lys Asp Asp Leu Asp Asn Ile Arg Ser Leu 145                 150                 155                                                160 Gly Thr Lys Leu Ala Glu Glu Met Arg Lys Leu Thr Ser Asn Phe Arg
            165                 170                 175 Leu Gly Phe Gly Ser Phe Val Asp Lys Asp Ile Ser Pro Phe Ser Tyr
        180                 185                 190 Thr Ala Pro Arg Tyr Gln Thr Asn Pro Cys Ile Gly Tyr Lys Leu Phe
    195                 200                 205 Pro Asn Cys Val Pro Ser Phe Gly Phe Arg His Leu Leu Pro Leu Thr
210                 215                 220 Asp Arg Val Asp Ser Phe Asn Glu Glu Val Arg Lys Gln Arg Val Ser 225                 230                 235                 240 Arg Asn Arg Asp Ala Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Val Leu Gln Ala
            245                 250                 255 Ala Val Cys Lys Glu Lys Ile Gly Trp Arg Lys Asp Ala Leu His Leu
        260                 265                 270 Leu Val Phe Thr Thr Asp Asp Val Pro His Ile Ala Leu Asp Gly Lys
    275                 280                 285 Leu Gly Gly Leu Val Gln Pro His Asp Gly Gln Cys His Leu Asn Glu
290                 295                 300 Ala Asn Glu Tyr Thr Ala Ser Asn Gln Met Asp Tyr Pro Ser Leu Ala 305                 310                 315                 320 Leu Leu Gly Glu Lys Leu Ala Glu Asn Asn Ile Asn Leu Ile Phe Ala
            325                 330                 335 Val Thr Lys Asn His Tyr Met Leu Tyr Lys Asn Phe Thr Ala Leu Ile
        340                 345                 350 Pro Gly Thr Thr Val Glu Ile Leu Asp Gly Asp Ser Lys Asn Ile Ile
    355                 360                 365 Gln Leu Ile Ile Asn Ala Tyr Asn Ser Ile Arg Ser Lys Val Glu Leu
370                 375                 380 Ser Val Trp Asp Gln Pro Glu Asp Leu Asn Leu Phe Phe Thr Ala Thr 385                 390                 395                 400 Cys Gln Asp Gly Val Ser Tyr Pro Gly Gln Arg Lys Cys Glu Gly Leu
            405                 410                 415 Lys Ile Gly Asp Thr Ala Ser Phe Glu Val Ser Leu Glu Ala Arg Ser
        420                 425                 430 Cys Pro Ser Arg His Thr Glu His Val Phe Ala Leu Arg Pro Val Gly
    435                 440                 445 Phe Arg Asp Ser Leu Glu Val Gly Val Thr Tyr Asn Cys Thr Cys Gly
450                 455                 460 Cys Ser Val Gly Leu Glu Pro Asn Ser Ala Arg Cys Asn Gly Ser Gly 465                 470                 475                 480 Thr Tyr Val Cys Gly Leu Cys Glu Cys Ser Pro Gly Tyr Leu Gly Thr
            485                 490                 495 Arg Cys Glu Cys Gln Asp Gly Glu Asn Gln Ser Val Tyr Gln Asn Leu
        500                 505                 510 Cys Arg Glu Ala Glu Gly Lys Pro Leu Cys Ser Gly Arg Gly Asp Cys
    515                 520                 525 Ser Cys Asn Gln Cys Ser Cys Phe Glu Ser Glu Phe Gly Lys Ile Tyr
530                 535                 540 Gly Pro Phe Cys Glu Cys Asp Asn Phe Ser Cys Ala Arg Asn Lys Gly 545                 550                 555                 560 Val Leu Cys Ser Gly His Gly Glu Cys His Cys Gly Glu Cys Lys Cys
            565                 570                 575 His Ala Gly Tyr Ile Gly Asp Asn Cys Asn Cys Ser Thr Asp Ile Ser
        580                 585                 590 Thr Cys Arg Gly Arg Asp Gly Gln Ile Cys Ser Glu Arg Gly His Cys
    595                 600                605 Leu Cys Gly Gln Cys Gln Cys Thr Glu Pro Gly Ala Phe Gly Glu Met
610                 615                 620 Cys Glu Lys Cys Pro Thr Cys Pro Asp Ala Cys Ser Thr Lys Arg Asp 625                 630                 635                 640 Cys Val Glu Cys Pro Leu Leu His Ser Gly Lys Pro Asp Asn Gln Thr
            645                 650                 655 Cys His Ser Leu Cys Arg Asp Glu Val Ile Thr Trp Val Asp Thr Ile
        660                 665                 670 Val Lys Asp Asp Gln Glu Ala Val Leu Cys Phe Tyr Lys Thr Ala Lys
    675                 680                 685 Asp Cys Val Met Met Phe Thr Tyr Val Glu Leu Pro Ser Gly Lys Ser
690                 695                 700 Ash Leu Thr Val Leu Arg Glu Pro Glu Cys Gly Asn Thr Pro Asn Ala 705                 710                 715                 720 Met Thr Ile Leu Leu Ala Val Val Gly Ser Ile Leu Leu Val Gly Leu
            725                 730                 735 Ala Leu Leu Ala Ile Trp Lys Leu Leu Val Thr Ile His Asp Arg Arg
        740                 745                 750 Glu Phe Ala Lys Phe Gln Ser Glu Arg Ser Arg Ala Arg Tyr Glu Met
    755                 760                 765 Ala Ser Asn Pro Leu Tyr Arg Lys Pro Ile Ser Thr His Thr Val Asp
770                 775                 780 Phe Thr Phe Asn Lys Phe Asn Lys Ser Tyr Asn Gly Thr Val Asp 785                 790                 795
相关专利内容
标题 发布/更新时间 阅读量
网络设备通信、与网络设备通信的方法及装置 2020-05-15 951
国际漫游通信方法、关口局、会话控制功能实体和通信系统 2020-05-11 1004
路由信息生成方法、主叫实现方法、网关、关口局、系统 2020-05-14 248
国际关口局服务器、区块链网络系统及其通信方法 2020-05-11 936
路由重选方法、系统、国际关口局和归属位置寄存器 2020-05-11 770
长话用户功能特征的管理方法和装置 2020-05-15 871
虚假国际漫游呼叫拦截方法、装置和系统 2020-05-17 260
预付费漫游用户拨号智能纠正的方法、设备与系统 2020-05-14 543
用于车载通信和娱乐系统的国际键盘 2020-05-16 314
一种反向代理系统 2020-05-13 840
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。

申请试用

国际局热门专利
热门分类
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈
提交反馈
使用该功能遇到问题

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：

购买VIP 申请VIP试用
您也可以联系官方QQ: 2157717237     电话: 13264338900
关于PatentHub
关于我们 使命宗旨 加入我们 联系我们 帮助中心
PatentHub产品
专利百科 专利交易 业务平台 专利交易大厅 专利需求大厅
 
API接口 数据定制 专利资讯 最新中国发明专利 最新美国发明专利 看视频学检索 技术领域 专利库 专利分类库 国际专利分类库
 
历年真题 模拟考试 资料库 问答专区 专栏文章 知识分享 求职 招聘 代理所排行榜 代理人排行榜 代理所地域排行榜 找代理所 找代理人
PatentHub联系方式
官方Q群：924368187 官方Q群：931673531 官方Q群：529775260 商务QQ：2157717237 运营QQ：3307693423 电话：13264338900