包含检测细胞角蛋白7的mRNA用引物的试剂专利检索-受理局第I章专利合作条约专利权专利检索查询-专利查询网

包含检测细胞角蛋白7的mRNA用引物的 试剂

阅读：170发布：2020-11-11

专利汇可以提供包含检测细胞角蛋白7的mRNA用引物的试剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明是一种用于检测细胞角蛋白7(CK7)mRNA的引物。该引物在其5′端有第一序列，在3′端有第二序列。其第一序列长为10～30个核苷酸，可与序列号为1的序列的第一区域相对的互补链杂交，其第二序列长为10～30个核苷酸，在序列号为1的序列中，可与相对上述第一区域的位于3′端的第二区域杂交。，下面是包含检测细胞角蛋白7的mRNA用引物的试剂专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种含有细胞角蛋白7的mRNA检测用引物的试剂，其特征在于：该试剂包含第一引物、第二引物、第三引物以及第四引物；
1)所述第一引物在5′端包含第一序列，在3′端包含第二序列，
所述第一序列，
(a)有10～30个核苷酸长度，
(b)可与序列号1的序列所包含的区域——第一区域的互补链杂交，
所述第二序列，
(c)有10～30个核苷酸长度，
(d)可与在序列号1的序列上位于比所述第一区域更靠近3′端的第二区域杂交，所述第二区域含有：
i.序列号1的724以及725位的核苷酸、
ii.序列号1的985以及986位的核苷酸、
iii.序列号1的1111以及1112位的核苷酸、
iv.序列号1的1332以及1333位的核苷酸、或
v.序列号1的1367以及1368位的核苷酸
2)所述第二引物在5′端含有第三序列，在3′端含有第四序列，
所述第三序列，
(e)有10～30个核苷酸长度，
(f)可与序列号1的序列上位于比所述第一区域更靠近5′端的第三区域杂交，所述第四序列，
(g)有10～30个核苷酸长度，
(h)可与在序列号1的序列上位于比所述第三区域更靠近5′端的第四区域杂交，
3)所述第三引物可与在序列号1的序列上位于比所述第四区域更靠近5′端的第五区域杂交，
4)所述第四引物可与在序列号1的序列上位于比所述第二区域更靠近3′端的第六区域杂交。
2.一种细胞角蛋白7的mRNA的检测用引物，其特征在于：其在5′端含有第一序列，在
3′端含有第二序列；
所述第一序列，
(a)有10～30个核苷酸长度，
(b)可与序列号1的序列所包含的区域一第一区域的互补链杂交
所述第二序列，
(c)有10～30个核苷酸长度，
(d)可与在序列号1的序列上位于比所述第一区域更靠近3′端的第二区域杂交，所述第二区域含有：
i.序列号1的724以及725位的核苷酸，
ii.序列号1的985以及986位的核苷酸，
iii.序列号1的1111以及1112位的核苷酸，
iv.序列号1的1332以及1333位的核苷酸，或
v.序列号1的1367以及1368位的核苷酸。
3.根据权利要求2所述引物，其特征在于：其选自包括以下(a)和(b)的组：
(a)序列号33～45以及序列号109～115中任意一项所述的多核苷酸，
(b)在所述(a)的多核苷酸中，有一个或多个核苷酸被置换、缺失、插入或附加的核苷酸序列、且在核酸扩增反应中发挥引物功能的多核苷酸。
4.根据权利要求2或3所述引物，其特征在于：该引物与选自包括以下区域的组中的区域杂交：
序列号1的721～739位的区域，
序列号1的974～999位的区域，
序列号1的976～995位的区域，
序列号1的978～993位的区域，
序列号1的978～997位的区域，
序列号1的981～1000位的区域，
序列号1的1095～1115位的区域，
序列号1的1100～1117位的区域，
序列号1的1101～1117位的区域，
序列号1的1353～1376位的区域，
序列号1的1353～1379位的区域，以及
序列号1的1354～1376位的区域。
5.根据权利要求2所述引物，其特征在于：所述第二序列的3′末端的3个核苷酸与所述第二区域的序列完全互补。
6.检测细胞角蛋白7的mRNA用的引物组，其包含第一引物、第二引物、第三引物以及第四引物；
1)所述第一引物是权利要求2中所述的引物，
2)所述第二引物在5′端含有第三序列，在3′端含有第四序列，
所述第三序列，
i.有10～30个核苷酸长度，
ii.可与在序列号1的序列上位于比所述第一区域更靠近5′端的第三区域杂交，所述第四序列，
iii.有10～30个核苷酸长度，
iv.可与在序列号1的序列上位于比所述第三区域更靠近5′端的第四区域杂交，
3)所述第三引物，可与在序列号1的序列上位于比所述第四区域更靠近5′端的第五区域杂交，
4)所述第四引物，可与在序列号1的序列上位于比所述第二区域更靠近3′端的第六区域杂交。
7.根据权利要求6所述引物组，其特征在于：所述第二引物选自包括以下(a)以及(b)的组：
(a)序列号14～32以及106～108任意一项所述的多核苷酸；
(b)在所述(a)的多核苷酸中，有一个或多个核苷酸被置换、缺失、插入或附加的核苷酸序列、并在核酸扩增反应中发挥引物功能的多核苷酸，
所述第三序列，选自包括以下(c)以及(d)的组：
(c)序列号2～13以及105任意一项所述的多核苷酸；
(d)在所述(c)的多核苷酸中，有一个或多个核苷酸被置换、缺失、插入或附加的核苷酸序列并在核酸扩增反应中发挥引物功能的多核苷酸。
8.根据权利要求6所述引物组，其特征在于：所述第二引物与选自包括以下区域的组中的区域的互补区域杂交：
序列号1的574～590位的区域，
序列号1的813～834位的区域，
序列号1的813～882位的区域，
序列号1的816～834位的区域，
序列号1的837～856位的区域，
序列号1的840～857位的区域，
序列号1的851～869位的区域，
序列号1的851～871位的区域，
序列号1的861～882位的区域，
序列号1的863～883位的区域，
序列号1的963～982位的区域，
序列号1的964～982位的区域，
序列号1的1165～1182位的区域，
序列号1的1235～1252位的区域，以及
序列号1的1236～1252位的区域。
9.根据权利要求6所述引物组，其特征在于：所述第三引物与选自包括以下区域的组中的区域杂交：
序列号1的538～556位的区域，
序列号1的542～561位的区域，
序列号1的546～564位的区域，
序列号1的775～794位的区域，
序列号1的796～815位的区域，
序列号1的816～834位的区域，
序列号1的827～843位的区域，
序列号1的828～845位的区域，
序列号1的840～859位的区域，
序列号1的932～950位的区域，
序列号1的1134～1149位的区域，以及
序列号1的1213～1228位的区域。
10.根据权利要求6所述引物组，其特征在于：所述第四引物选自以下(a)以及(b)组成的组：
(a)序列号46～60以及116～120任意一个所述的多核苷酸；
(b)在所述(a)的多核苷酸中，有一个或多个核苷酸被置换、缺失、插入或附加的核苷酸序列并在核酸扩增反应发挥引物功能的多核苷酸。
11.根据权利要求6所述引物组，其特征在于，所述第四引物与选自以下区域组成的组的区域杂交：
序列号1的741～759位的区域，
序列号1的742～760位的区域，
序列号1的1007～1023位的区域
序列号1的1009～1025位的区域，
序列号1的1011～1028位的区域，
序列号1的1012～1028位的区域，
序列号1的1012～1029位的区域，
序列号1的1012～1030位的区域，
序列号1的1117～1032位的区域，
序列号1的1117～1133位的区域，
序列号1的1118～1133位的区域，
序列号1的1118～1134位的区域，
序列号1的1118～1135位的区域，
序列号1的1131～1147位的区域，
序列号1的1132～1148位的区域，
序列号1的1356～1339位的区域，
序列号1的1383～1400位的区域，
序列号1的1384～1401位的区域，以及
序列号1的1390～1406位的区域。
12.根据权利要求6所述引物组，其特征在于：该引物组还包含与所述序列号1的序列所包含的、位于所述第三区域与第四区域之间的第七区域进行杂交的第五引物。
13.根据权利要求12所述引物组，其特征在于：所述第五引物选自以下(a)以及(b)所构成的组：
(a)序列号61～84其中之一所述的多核苷酸，
(b)在所述(a)的多核苷酸中，有一个或多个核苷酸被置换、缺失、插入或附加的核苷酸序列并在核酸扩增反应中发挥引物功能的多核苷酸。
14.根据权利要求12所述引物组，其特征在于：所述第五引物与选自包括以下区域的组中的区域杂交：
序列号1的983～1002位的区域，
序列号1的983～1003位的区域，
序列号1的984～1002位的区域，
序列号1的984～1003位的区域，
序列号1的984～1004位的区域，
序列号1的985～1004位的区域，
序列号1的986～1004位的区域，
序列号1的986～1005位的区域，
序列号1的987～1005位的区域，
序列号1的987～1006位的区域，
序列号1的1251～1271位的区域，
序列号1的1251～1273位的区域，
序列号1的1251～1274位的区域，
序列号1的1252～1273位的区域，
序列号1的1252～1274位的区域，
序列号1的1253～1274位的区域，
序列号1的1256～1277位的区域，
序列号1的1256～1278位的区域，
序列号1的1257～1278位的区域，
序列号1的1258～1278位的区域，
序列号1的1259～1278位的区域，
序列号1的1259～1279位的区域，以及
序列号1的1260～1279位的区域。
15.根据权利要求6所述引物组，其特征在于：该引物组还包含与所述序列号1的序列所包含的、位于所述第一区域与第二区域之间的第八区域的互补区域进行杂交的第六引物。
16.根据权利要求15所述引物组，其特征在于：所述第六引物选自以下(a)以及(b)构成的组：
(a)序列号85～104其中之一所述的多核苷酸，
(b)在所述(a)的多核苷酸中，有一个或多个核苷酸被置换、缺失、插入或附加的核苷酸序列、并在核酸扩增反应中发挥引物功能的多核苷酸。
17.根据权利要求15所述引物组，其特征在于：所述第六引物与选自包括以下区域的组中的区域的互补区域杂交：
序列号1的1073～1089位的区域，
序列号1的1073～1091位的区域，
序列号1的1073～1093位的区域，
序列号1的1074～1093位的区域，
序列号1的1075～1094位的区域，
序列号1的1076～1093位的区域，
序列号1的1076～1094位的区域，
序列号1的1077～1096位的区域，
序列号1的1078～1097位的区域，
序列号1的1078～1098位的区域，
序列号1的1078～1099位的区域，
序列号1的1081～1100位的区域，
序列号1的1328～1345位的区域，
序列号1的1330～1348位的区域，
序列号1的1330～1349位的区域，
序列号1的1330～1351位的区域，
序列号1的1331～1350位的区域，
序列号1的1331～1351位的区域，
序列号1的1331～1352位的区域，以及
序列号1的1332～1352位的区域。
18.一种细胞角蛋白7的mRNA的检测用引物，含有序列号25的序列。
19.一种细胞角蛋白7的mRNA检测用试剂盒，包含权利要求6中所述的引物组、RNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性DNA聚合酶和dNTPs。
20.一种细胞角蛋白7的mRNA的检测方法，包括以下步骤：
1)让从生物体采集的试样、权利要求6中所述的引物组以及RNA依赖性DNA聚合酶发生反应，从所述试样中的细胞角蛋白7的mRNA合成cDNA；
2)让所述引物组、DNA依赖性DNA聚合酶以及所述步骤合成的cDNA发生反应，扩增cDNA；
3)通过检测扩增后的cDNA来检测所述试样中细胞角蛋白7的mRNA。
(2009年8月20日(20.08.2009)国际事务局受理)
1.一种含有细胞角蛋白7的mRNA的检测用引物的试剂，包含第一引物，第二引物，第三引物以及第四引物；
1)所述第一引物在5′端包含第一序列，在3′端包含第二序列，
所述第一序列，
(a)有10～30个核苷酸长度，
(b)可与序列号1的序列所包含的区域——第一区域的互补链杂交，
所述第二序列，
(c)有10～30个核苷酸长度，
(d)可与在序列号1的序列上位于比所述第一区域更靠近3′端的第二区域杂交，所述第二区域含有：
i.序列号1的724以及725位的核苷酸，
ii.序列号1的985以及986位的核苷酸，
iii.序列号1的1111以及1112位的核苷酸，
iv.序列号1的1332以及1333位的核苷酸，或
v.序列号1的1367以及1368位的核苷酸，
2)所述第二引物在5′端含有第三序列，在3′端含有第四序列，
所述第三序列，
(e)有10～30个核苷酸长度，
(f)可与在序列号1的序列上位于比所述第一区域更靠近5′端的第三区域杂交，所述第四序列，
(g)有10～30个核苷酸长度，
(h)可与在序列号1的序列上位于比所述第三区域更靠近5′端的第四区域的互补链杂交，
3)所述第三引物可与在序列号1的序列上位于比所述第四区域更靠近5′端的第五区域的互补链杂交，
4)所述第四引物，可与在序列号1的序列上位于比所述第二区域更靠近3′端的第六区域杂交。
2.一种细胞角蛋白7的mRNA的检测用引物，其特征在于：其在5′端含有第一序列，在
3′端含有第二序列，
所述第一序列，
(a)有10～30个核苷酸长度，
(b)可与序列号1的序列所包含的区域——第一区域的互补链杂交
所述第二序列，
(c)有10～30个核苷酸长度，
(d)可与在序列号1的序列上位于比所述第一区域更靠近3′端的第二区域杂交，所述第二区域含有：
i.序列号1的724以及725位的核苷酸，
ii.序列号1的985以及986位的核苷酸，
iii.序列号1的1111以及1112位的核苷酸，
iv.序列号1的1332以及1333位的核苷酸，或
v.序列号1的1367以及1368位的核苷酸。
3.根据权利要求2所述引物，其特征在于：其选自包括以下(a)和(b)的组：
(a)序列号33～45以及序列号109～115中任一项所述的多核苷酸，
(b)在于所述(a)的多核苷酸中，有一个或多个核苷酸被置换、缺失、插入或附加的核苷酸序列、且在核酸扩增反应中发挥引物功能的多核苷酸。
4.根据权利要求2或3所述引物，其特征在于：该引物与选自包括以下区域的组中的区域杂交：
序列号1的721～739位的区域，
序列号1的974～999位的区域，
序列号1的976～995位的区域，
序列号1的978～993位的区域，
序列号1的978～997位的区域，
序列号1的981～1000位的区域，
序列号1的1095～1115位的区域，
序列号1的1100～1117位的区域，
序列号1的1101～1117位的区域，
序列号1的1353～1376位的区域，
序列号1的1353～1379位的区域，以及
序列号1的1354～1376位的区域。
5.根据权利要求2所述引物，其特征在于：所述第二序列的3′末端的3个核苷酸与所述第二区域的序列完全互补。
6.检测细胞角蛋白7的mRNA用的引物组，其包括第一引物、第二引物、第三引物以及第四引物，
1)所述第一引物是权利要求2中所述的引物，
2)所述第二引物在5′端含有第三序列，在3′端含有第四序列，
所述第三序列，
i.有10～30个核苷酸长度，
ii.可与在序列号1的序列上位于比所述第一区域更靠近5′端的第三区域杂交，所述第四序列，
iii.有10～30个核苷酸长度，
iv.可与在序列号1的序列上位于比所述第三区域更靠近5′端的第四区域的互补链杂交，
3)所述第三引物可与在序列号1的序列上位于比所述第四区域更靠近5′端的第五区域的互补链杂交，
4)所述第四引物，可与在序列号1的序列上位于比所述第二区域更靠近3′端的第六区域杂交。
7.根据权利要求6所述引物组，其特征在于：所述第二引物选自包括以下(a)以及(b)的组：
(a)序列号14～32以及106～108任意一个所述的多核苷酸；
(b)在所述(c)的多核苷酸中，有一个或多个核苷酸被置换、缺失、插入或附加的核苷酸序列、并在核酸扩增反应中发挥引物功能的多核苷酸，
所述第三序列，选自包括以下(c)以及(d)的组：
(c)序列号2～13以及105任意一项所述的多核苷酸；
(d)在所述(c)的多核苷酸中，有一个或多个核苷酸被置换、缺失、插入或附加的核苷酸序列并在核酸扩增反应中发挥引物功能的多核苷酸。
8.根据权利要求6所述引物组，其特征在于：所述第二引物与选自包括以下区域的组中的区域的互补区域杂交：
序列号1的574～590位的区域，
序列号1的813～834位的区域，
序列号1的813～882位的区域，
序列号1的816～834位的区域，
序列号1的837～856位的区域，
序列号1的840～857位的区域，
序列号1的851～869位的区域，
序列号1的851～871位的区域，
序列号1的861～882位的区域，
序列号1的863～883位的区域，
序列号1的963～982位的区域，
序列号1的964～982位的区域，
序列号1的1165～1182位的区域，
序列号1的1235～1252位的区域，以及
序列号1的1236～1252位的区域。
9.根据权利要求6所述引物组，其特征在于：所述第三引物与选自以下区域组成的组中的区域的互补链杂交：
序列号1的538～556位的区域，
序列号1的542～561位的区域，
序列号1的546～564位的区域，
序列号1的775～794位的区域，
序列号1的796～815位的区域，
序列号1的816～834位的区域，
序列号1的827～843位的区域，
序列号1的828～845位的区域，
序列号1的840～859位的区域，
序列号1的932～950位的区域，
序列号1的1134～1149位的区域，以及
序列号1的1213～1228位的区域。
10.权利要求6所述引物组，其特征在于：所述第四引物选自以下(a)以及(b)组成的组：
(a)序列号46～60以及116～120任意一项所述的多核苷酸；
(b)在所述(a)的多核苷酸中，有一个或多个核苷酸被置换、缺失、插入或附加的核苷酸序列并在核酸扩增反应发挥引物功能的多核苷酸。
11.权利要求6所述引物组，其特征在于：所述第四引物与选自以下区域组成的组的区域杂交：
序列号1的741～759位的区域，
序列号1的742～760位的区域，
序列号1的1007～1023位的区域
序列号1的1009～1025位的区域，
序列号1的1011～1028位的区域，
序列号1的1012～1028位的区域，
序列号1的1012～1029位的区域，
序列号1的1012～1030位的区域，
序列号1的1117～1032位的区域，
序列号1的1117～1133位的区域，
序列号1的1118～1133位的区域，
序列号1的1118～1134位的区域，
序列号1的1118～1135位的区域，
序列号1的1131～1147位的区域，
序列号1的1132～1148位的区域，
序列号1的1356～1339位的区域，
序列号1的1383～1400位的区域，
序列号1的1384～1401位的区域，以及
序列号1的1390～1406位的区域。
12.根据权利要求6所述引物组，其特征在于：该引物组还包含与所述序列号1的序列所包含的、位于所述第三区域与第四区域之间的第七区域进行杂交的第五引物。
13.根据权利要求12所述引物组，其特征在于：所述第五引物选自以下的(a)以及(b)所构成的组：
(a)序列号61～84其中之一所述的多核苷酸；
(b)在所述(a)的多核苷酸中，有一个或多个核苷酸被置换、缺失、插入或附加的核苷酸序列并在核酸扩增反应中发挥引物功能的多核苷酸。
14.根据权利要求12所述引物组，其特征在于：所述第五引物与选自包括以下区域的组中的区域杂交：
序列号1的983～1002位的区域，
序列号1的983～1003位的区域，
序列号1的984～1002位的区域，
序列号1的984～1003位的区域，
序列号1的984～1004位的区域，
序列号1的985～1004位的区域，
序列号1的986～1004位的区域，
序列号1的986～1005位的区域，
序列号1的987～1005位的区域，
序列号1的987～1006位的区域，
序列号1的1251～1271位的区域，
序列号1的1251～1273位的区域，
序列号1的1251～1274位的区域，
序列号1的1252～1273位的区域，
序列号1的1252～1274位的区域，
序列号1的1253～1274位的区域，
序列号1的1256～1277位的区域，
序列号1的1256～1278位的区域，
序列号1的1257～1278位的区域，
序列号1的1258～1278位的区域，
序列号1的1259～1278位的区域，
序列号1的1259～1279位的区域，以及
序列号1的1260～1279位的区域。
15.根据权利要求6所述引物组，其特征在于：该引物组还包含与所述序列号1的序列所包含的、位于所述第一区域与第二区域之间的第八区域的互补区域进行杂交的第六引物。
16.根据权利要求15所述引物组，其特征在于：所述第六引物选自以下(a)以及(b)构成的组：
(a)序列号85～104其中之一所述的多核苷酸，
(b)在所述(a)的多核苷酸中，有一个或多个核苷酸被置换、缺失、插入或附加的核苷酸序列、并在核酸扩增反应中发挥引物功能的多核苷酸。
17.根据权利要求15所述引物组，其特征在于：所述第六引物与从包括以下区域的组中选择的区域的互补区域杂交：
序列号1的1073～1089位的区域，
序列号1的1073～1091位的区域，
序列号1的1073～1093位的区域，
序列号1的1074～1093位的区域，
序列号1的1075～1094位的区域，
序列号1的1076～1093位的区域，
序列号1的1076～1094位的区域，
序列号1的1077～1096位的区域，
序列号1的1078～1097位的区域，
序列号1的1078～1098位的区域，

说明书全文

包含检测细胞角蛋白7的mRNA用引物的 试剂

技术领域：

[0001] 本发明涉及用于检测试样中细胞角蛋白7(以下称作“CK7”)mRNA的引物及引物组、以及含有这些引物及引物组的试剂。背景技术：

[0002] CK7是可见于上皮细胞的中间纤维结构蛋白质——细胞角蛋白的一种，最近有报告称其可作为检查肺癌、食道癌等淋巴结转移的分子标记使用。例如，非专利文献1表明：将从生物体上采集的淋巴结调制成测定试样，用核酸扩增(RT-PCR)法检测该测定试样中的CK7mRNA，可以以较高的特异性来判断非小细胞性肺癌的淋巴结转移情况。

[0003] 非专利文件1：Pulte等，癌症，2005，104 卷，N0.7，1453-61.(CANCER2005，vol.104，NO.7，1453-61.)发明内容：

[0004] 发明想要解决的问题：

[0005] 如上所述，CK7的mRNA可作为检测癌症的分子标记使用。以往的技术是用RT-PCR法来检测CK7的mRNA。该RT-PCR法是核酸扩增法，具有高敏感度，即使是癌细胞向淋巴结的微转移也可检测出来，但是，这种检测非常花时间(通常需2-4小时左右)。

[0006] 因此，本发明的目的是提供与以往的技术相比能够在短时间内检测出CK7的mRNA的引物以及引物组。

[0007] 解决该课题的方法：

[0008] 本发明提供可检测CK7的mRNA的引物。该引物在其5′端有第一序列，在3′端有第二序列。其第一序列长为10～30个核苷酸，可与序列号1的序列中所含区域——第一区域相对的互补链杂交，其第二序列长为10～30个核苷酸，在序列号1的序列中，可与比上述第一区域更靠近3′端的第二区域杂交。

[0009] 发明效果：

[0010] 本发明可以提供与以往的技术相比能够在短时间内检测出CK7的mRNA的引物以及引物组。附图说明：

[0011] 图1为检测CK7的mRNA用的引物以及引物组杂交的核酸区域的示意图。具体实施方式：

[0012] 本说明书中，所说的“检测”不仅是要判断试样中是否存在本发明的靶物质CK7的mRNA，还包括给试样中的CK7的mRNA定量。

[0013] “引物”是指，在LAMP(环介导等温扩增反应，loop-medicatedIsothermal Amplification)法(参照美国专利第6410278号公报以及美国专利第6974670号公报)等核酸扩增技术中，与扩增对象的核酸的特定区域进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸具有能成为由聚合酶引起的扩增反应起点的功能(以下，称为“引物功能”)。因为检测对象的核酸是CK7的mRNA，所以，可以通过包含逆转录反应的核酸扩增反应(例如：RT-LAMP法等等)将其检测出。

[0014] “杂交”是指在严格(stringent)条件下，基于多核苷酸碱基的互补性，某多核苷酸的部分或全部序列与其它多核苷酸的部分或全部序列，通过氢键结合。

[0015] “严格条件”是指进行多核苷酸杂交时，该行业者普遍使用的条件，本实施方式的引物只要满足能与CK7mRNA或其cDNA进行杂交这一条件，则无特殊限制。大家了解的杂交时的严格条件是指温度、盐浓度、引物长度、引物中GC含量以及杂交缓冲液中的离液剂浓度函数。例如严格条件，可以使用Sambrook，J.等，1998，分子克隆：实验手册(第2版)，冷泉港实验室，纽约(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2编)，Cold SpringHarb or Laboratory Press，New York)所记载的条件等。更具体一些可以是：“在含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠、pH7.6、5×丹哈特溶液(Denhardt’s溶液)、10％硫酸葡聚糖以及20μg/ml核酸的溶液中进行，杂交温度为42℃”，但并不限于此。

[0016] 本实施方式的引物，对于使用RT-LAMP法来进行的CK7的mRNA的检测特别适用。CK7的mRNA的核苷酸序列见序列号1。虽然mRNA中含有的是尿嘧啶而不是胸腺嘧啶，在序列号1上为易于标注，将尿嘧啶表示为胸腺嘧啶(t)。这个序列，在GenBank数据库中登记为序号NM_005556。

[0017] RT-LAMP法首先是通过逆转录反应(RT反应)由mRNA合成cDNA，合成的cDNA通过LAMP反应得到扩增。使用RT-LAMP法检测CK7的mRNA时，可以将多核苷酸作引物使用，该多核苷酸在5′末端侧有可与CK7的mRNA序列所包含的R1c区域的互补区域R1区杂交的第一序列，在3′末端侧有第二序列可与CK7的mRNA序列中位于R1c区域下游(3′端)的R2c区域杂交。

[0018] 上述第一序列，既可与上述第二序列直接连接，也可通过间插序列进行连接。该间插序列，最好是与CK7的mRNA或其cDNA相同性低的序列。例如，可举出5′-tttt-3′等例。该间插序列长度最好是1～50个核苷酸，如果是1～40个核苷酸则更好。

[0019] 上述引物在上述RT-LAMP法所使用的引物当中，可以作为反向内引物(以下，称为“RIP”)发挥功效。在上述RT-LAMP法中除使用该RIP外，还使用包括正向内引物(以下，称作“FIP”)以及F3引物的引物组。下面，将对照图1对该FIP以及F3引物进行说明。

[0020] 图1是表示各引物以及各引物杂交的核酸区域的示意图。另外，在图1中，F1、F2、L、F1、R1c、R2c以及R3c各区域是CK7的mRNA序列所包含的区域，F3c、F2c、F1c、R1、M、R2以及R3各区域是CK7的mRNA的互补链CK7的cDNA序列所包含的区域。F1、F2、F3、R1、R2以及R3分别与F1c、F2c、F3c、R1c、R2c以及R3c呈互补性。这些区域是考虑CK7的mRNA的检测效率和检测的再现性等来选择。

[0021] 上述FIP是多核苷酸，其在5′端有可与F1区域(F1c区域的互补区域)杂交的第三序列，并且在其3′端有可与F2c区域杂交的第四序列。该第三序列既可直接与第四序列相连接，也可通过上述间插序列进行连接。

[0022] 上述F3引物是多核苷酸，其可与在CK7的cDNA序列中位于比F2c区域更靠近下游(3′端)的F3c区域杂交。

[0023] 而且上述引物组中，除了FIP、RIP以及F3引物外，还可含有R3引物。这个R3引物是多核苷酸，可与CK7的mDNA序列中位于比R2c区域更靠近下游(3′端)的R3c区域杂交。

[0024] 上述引物组还可含有环状引物。该环状引物如有可与位于CK7的mRNA序列所包含的F2区域与F1区域之间的L区域进行杂交的多核苷酸环状引物F，以及可与位于CK7的cDNA序列所包含的R1区域和R2区域之间的M区域进行杂交的多核苷酸环状引物R。通过使用这些环状引物中的一种或两种，可以加快LAMP反应扩增cDNA的速度。

[0025] 第一序列、第二序列、第三序列、第四序列、F3引物、R3引物、环状引物F以及环状引物R的长度，只要是可满足引物性能的长度即可，没有特别限制。众所周知的催化核酸合成反应的聚合酶所识别的引物长度约为5个核苷酸，因此引物的长度最好是5～100个核苷酸。另外，从引物的核苷酸序列与引物杂交的区域之间的特异性来考虑，该引物的长度最好有10个以上核苷酸，从引物杂交的温度来考虑，在30个核苷酸以下更好。也就是说，FIP以及RIP的长度，最好是10～200个核苷酸，如果是20～60个核苷酸则更好。

[0026] 上述引物中，最好至少有一个引物与CK7的mRNA序列所包含的含有外显子连接区的区域进行杂交。CK7基因是由9个外显子组成，外显子与外显子之间由内含子连接。从细胞中CK7基因合成其mRNA时，剪接作用切掉了内含子，外显子与外显子直接连接起来。外显子与外显子之间连接处的部分称为外显子连接区。例如，在基因组中外显子1与外显子2被内含子分离，但是在mRNA合成过程中切掉了内含子，所以该mRNA中，外显子1的3′端与外显子2的5′端邻接在一起。因为序列号1的序列是由9个外显子组成，所以有以下8个外显子连接区(外显子连接区1～8)。

[0027] 外显子1与2之间的外显子连接区1：451位与452位的连接部分

[0028] 外显子2与3之间的外显子连接区2：663位与664位的连接部分

[0029] 外显子3与4之间的外显子连接区3：724位与725位的连接部分

[0030] 外显子4与5之间的外显子连接区4：820位与821位的连接部分

[0031] 外显子5与6之间的外显子连接区5：985位与986位的连接部分

[0032] 外显子6与7之间的外显子连接区6：1111位与1112位连接部分

[0033] 外显子7与8之间的外显子连接区7：1332位与1333位连接部分

[0034] 外显子8与9之间的外显子连接区8：1367位与1368位连接部分

[0035] 可与上述包含外显子连接区的区域进行杂交的引物可与mRNA杂交，但是其与基因组中CK7基因杂交的可能性极低。通过使用这样的引物，由上述RT-LAMP反应检测mRNA时，能够防止CK7基因被非特异性扩增。

[0036] 根据RT-LAMP反应的反应机理(参照美国专利第6410278号公报以及美国专利第6974670号公报)，RIP的第二序列最先与试样中的CK7的mRNA进行杂交。由此可见，上述引物中，RIP的第二序列最好与CK7mRNA序列中含有外显子连接区的区域进行杂交。(即R2c区中最好含有外显子连接区)。这样在初期反应阶段就能够防止CK7基因被非特异性扩增。

[0037] 从与其它细胞角蛋白类(例如，细胞角蛋白6、细胞角蛋白8等)mRNA的相同性、检测速度、检测再现性等方面来看，最好使用在上述外显子连接区中与含有外显子连接区3、5、6和8其中任意一个的区域杂交的引物。另外，与含有外显子连接区1、2、4和7其中任意一个的区域杂交的引物也可以在考虑与其他细胞角蛋白类(细胞角蛋白5、细胞角蛋白6、细胞角蛋白8等)mRNA的相同性、检测速率、检测再现性等基础上设计。

[0038] 本实施方式的引物与该引物杂交的CK7的mRNA的特定区域，不要求完全互补，只要具有可进行杂交的互补性即可(这一点美国专利第4800159号公报上有所记载)。即只要是有引物功能的多核苷酸，上述引物也可以是在与上述特定区域完全互补的序列中导入了置换、缺失、插入、附加等中的一种或多种变异的多核苷酸。这种核苷酸的变异最好在4种以下。被引入这种变异的多核苷酸，与引入变异前的相比，最好具有80％以上的相同性，如果具有90％以上的相同性则更好。最佳的是能具有95％以上的相同性。

[0039] 上述引物在与靶核酸CK7mRNA杂交后，通过聚合酶的作用，以引物3′末端为起始点进行核酸合成反应。为此，当引物3′末端部分与CK7的mRNA的互补性较低时，核酸合成反应过程会变得很慢。所以，最好引物的3′末端的3个碱基与引物杂交的区域完全互补，如果引物的3′末端5个碱基完全互补就更好了。

[0040] F3、F2、F1、R1c、R2c、R3c、L以及M各区域，可设定在序列号1所显示的CK7的mRNA序列中。以下例举这些区域实例。

[0041] (F1)

[0042] 619～636位区域

[0043] 631～652位区域

[0044] 858～879位区域

[0045] 873～892位区域

[0046] 878～898位区域

[0047] 879～898位区域

[0048] 893～913位区域

[0049] 909～928位区域

[0050] 910～928位区域

[0051] 1006～1025位区域

[0052] 1007～1025位区域

[0053] 1007～1026位区域

[0054] 1219～1240位区域

[0055] 1275～1095位区域

[0056] 1276～1296位区域

[0057] 1280～1300位区域

[0058] (F2)

[0059] 574～590位区域

[0060] 813～834位区域

[0061] 813～882位区域

[0062] 816～834位区域

[0063] 837～856位区域

[0064] 840～857位区域

[0065] 851～869位区域

[0066] 851～871位区域

[0067] 861～882位区域

[0068] 863～883位区域

[0069] 963～982位区域

[0070] 964～982位区域

[0071] 1165～1182位区域

[0072] 1235～1252位区域

[0073] 1236～1252位区域

[0074] (F3)

[0075] 538～556位区域

[0076] 542～561位区域

[0077] 546～564位区域

[0078] 775～794位区域

[0079] 796～815位区域

[0080] 816～834位区域

[0081] 827～843位区域

[0082] 828～845位区域

[0083] 840～859位区域

[0084] 932～950位区域

[0085] 1134～1149位区域

[0086] 1213～1228位区域

[0087] (R1c)

[0088] 680～697位区域

[0089] 680～699位区域

[0090] 898～917位区域

[0091] 916～937位区域

[0092] 923～943位区域

[0093] 924～945位区域

[0094] 941～958位区域

[0095] 1051～1072位区域

[0096] 1052～1073位区域

[0097] 1058～1078位区域

[0098] 1268～1286位区域

[0099] 1297～1316位区域

[0100] 1297～1317位区域

[0101] 1303～1320位区域

[0102] (R2c)

[0103] 721～739位区域

[0104] 974～999位区域

[0105] 976～995位区域

[0106] 978～993位区域

[0107] 978～997位区域

[0108] 981～1000位区域

[0109] 1095～1115位区域

[0110] 1100～1117位区域

[0111] 1101～1117位区域

[0112] 1353～1376位区域

[0113] 1353～1379位区域

[0114] 1354～1376位区域

[0115] (R3c)

[0116] 741～759位区域

[0117] 742～760位区域

[0118] 1007～1023位区域

[0119] 1009～1025位区域

[0120] 1011～1028位区域

[0121] 1012～1028位区域

[0122] 1012～1029位区域

[0123] 1012～1030位区域

[0124] 1117～1132位区域

[0125] 1117～1133位区域

[0126] 1118～1133位区域

[0127] 1118～1134位区域

[0128] 1118～1135位区域

[0129] 1131～1147位区域

[0130] 1132～1148位区域

[0131] 1356～1339位区域

[0132] 1383～1400位区域

[0133] 1384～1401位区域

[0134] 1390～1406位区域

[0135] (L)

[0136] 983～1002位区域

[0137] 983～1003位区域

[0138] 984～1002位区域

[0139] 984～1003位区域

[0140] 984～1004位区域

[0141] 985～1004位区域

[0142] 986～1004位区域

[0143] 986～1005位区域

[0144] 987～1005位区域

[0145] 987～1006位区域

[0146] 1251～1271位区域

[0147] 1251～1273位区域

[0148] 1251～1274位区域

[0149] 1252～1273位区域

[0150] 1252～1274位区域

[0151] 1253～1274位区域

[0152] 1256～1277位区域

[0153] 1256～1278位区域

[0154] 1257～1278位区域

[0155] 1258～1278位区域

[0156] 1259～1278位区域

[0157] 1259～1279位区域

[0158] 1260～1279位区域

[0159] (M)

[0160] 1073～1089位区域

[0161] 1073～1091位区域

[0162] 1073～1093位区域

[0163] 1074～1093位区域

[0164] 1075～1094位区域

[0165] 1076～1093位区域

[0166] 1076～1094位区域

[0167] 1077～1096位区域

[0168] 1078～1097位区域

[0169] 1078～1098位区域

[0170] 1078～1099位区域

[0171] 1081～1100位区域

[0172] 1328～1345位区域

[0173] 1330～1348位区域

[0174] 1330～1349位区域

[0175] 1330～1351位区域

[0176] 1331～1350位区域

[0177] 1331～1351位区域

[0178] 1331～1352位区域

[0179] 1332～1352位区域

[0180] 可以上述各区域为基准，设计本发明的引物。以下举例说明各引物。序列后括号内标注表示各引物与CK7的mRNA序列(序列号1)中的某一区域相同，或是互补。

[0181] (F3引物)

[0182] 序列号2：5′-GACATCTTTGAGGCCCAGAT-3′(与542～561位区域相同序列)[0183] 序列号3：5′-TCTTTGAGGCCCAGATTGC-3′(与546～564位区域相同序列)[0184] 序列号4：5′-CCCAGACATCTTTGAGGCC-3′(与538～556位区域相同序列)[0185] 序列号5：5′-AGACGGAGTTGACAGAGCT-3′(与816～834位区域相同序列)[0186] 序列号6：5′-CAGAGCTGCAGTCCCAGA-3′(与828～845位区域相同序列)[0187] 序列号7：5′-CTTCCTCAGGACCCTCAATG-3′(与796～815位区域相同序列)[0188] 序列号8：5′-GCGGGGCAAGCAGGAT-3′(与1213～1228位区域相同序列)[0189] 序列号9：5′-CCCAGATCTCCGACACATCT-3′(与840～859位区域相同序列)[0190] 序列号10： 5′-ACAGAGCTGCAGTCCCA-3′(与827～843位区域相同序列)[0191] 序列号11：5′-TGCCCTGAATGAGATCA-3′(与775～794位区域相同序列)[0192] 序列号12：5′-GAGGAGATGGCCAAATGCA-3′(与932～950位区域相同序列)[0193] 序列号13：5′-GCGGGGCAAGCAGGAT-3′(与1213～1228位区域相同序列)[0194] (FIP)

[0195] 序列号14：5′-TGCATGCTCCGCAGCTCCGGGTCAGCTTGAGGCAC-3′

[0196] (619～636位区域的互补序列和与574～590位区域相同的序列的连接序列)[0197] 序列号15：5′-GTCCTCCACCACATCCTGCATGGGGTCAGCTTGAGGCAC-3′[0198] (631～652位区域的互补序列和与574～590位区域相同的序列的连接序列)[0199] 序列号16：5′-CAGGTCCAGGGAGCGACTGTTCCCAGATCTCCGACACAT-3′[0200] (878～898位区域的互补序列和与840～857位区域相同的序列的连接序列)[0201] 序列号17：5′-AGCGATGATGCCGTCCAGGTCGACACATCTGTGGTGCTGT-3′[0202] (893～913位区域的互补序列和与851～869位区域相同的序列的连接序列)[0203] 序列号18：5′-TTGTCCATGGACAGCACCACAGAGACGGAGTTGACAGAGCT-3′[0204] (858～879位区域的互补序列和与816～834位区域相同的序列的连接序列)[0205] 序列号19：5′-GCGATCTCGATGTCCAGGGCCCGGCAGCTGCGTGAGTAC-3′[0206] (1276～1296位区域的互补序列和与1235～1252位区域相同的序列的连接序列)

[0207] 序列号20：5′-CAGGTCCAGGGAGCGACTGTAGTCCCAGATCTCCGACACA-3′[0208] (879～898位区域的互补序列和与837～856位区域相同的序列的连接序列)[0209] 序列号21：5′-CTGCGCCTTGACCTCAGCGATGGTGCTGTCCATGGACAACAG-3′[0210] (909～928位区域的互补序列和与861～882位区域相同的序列的连接序列)[0211] 序列号22：5′-CTGCGCCTTGACCTCAGCGGTGCTGTCCATGGACAACAGT-3′[0212] (910～928位区域的互补序列和与863～883位区域相同的序列的连接序列)[0213] 序列号23：5′-CTGCGCCTTGACCTCAGCGAGACACATCTGTGGTGCTGTCC-3′[0214] (909～928位区域的互补序列和与851～871位区域相同的序列的连接序列)[0215] 序列号24：5′-CAGGGAGCGACTGTTGTCCAATGAGACGGAGTTGACAGAGCT-3′[0216] (873～892位区域的互补序列和与813～834位区域相同的序列的连接序列)[0217] 序列号25：5′-CGTCCCCATGCTTCCCAGCCCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3′[0218] (1006～1025位区域的互补序列和与963～982位区域相同的序列的连接序列)[0219] 序列号26：5′-TCGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3′[0220] (1007～1026位区域的互补序列和与964～982位区域相同的序列的连接序列)[0221] 序列号27：5′-CGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3′[0222] (1007～1025位区域的互补序列和与963～982位区域相同的序列的连接序列)[0223] 序列号28：5′-TCGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3′[0224] (1007～1026位区域的互补序列和与962～982位区域相同的序列的连接序列)[0225] 序列号29：5′-CGATCTCGATGTCCAGGGCCACGGCAGCTGCGTGAGT-3′[0226] (1275～1295位区域的互补序列和与1235～1250位区域相同的序列的连接序列)

[0227] 序列号30：5′-CGATCTCGATGTCCAGGGCCAGGCAGCTGCGTGAGTAC-3’[0228] (1275～1295位区域的互补序列和与1236～1252位区域相同的序列的连接序列)

[0229] 序列号31：5′-GGTGGCGATCTCGATGTCCAGCGGCAGCTGCGTGAGTAC-3′[0230] (1280～1300位区域的互补序列和与1235～1252位区域相同的序列的连接序列)

[0231] 序列号32：5′-GGTGGCGATCTCGATGTCCAGCGGCAGCTGCGTGAGT-3′[0232] (1280～1300位区域的互补序列和与1235～1250位区域相同的序列的连接序列)

[0233] (RIP)

[0234] 序列号33：5′-AACCACCGCACAGCTGCTGAGGCAGCATCCACATCCTTC-3′[0235] (与680～699位区域相同的序列与721～739位区域的互补序列的连接序列)[0236] 序列号34：5′-AACCACCGCACAGCTGCTGGCAGCATCCACATCCTTC-3′[0237] (与680～697位区域相同的序列与721～739位区域的互补序列的连接序列)[0238] 序列号35：5′-GCGCAGTATGAGGAGATGGCCCTGGAGGGTCTCAAACTTGG-3′[0239] (与923～943位区域相同的序列与981～1000位区域的互补序列的连接序列)[0240] 序列号36：5′-GCGCAGTATGAGGAGATGGCCAGAGGGTCTCAAACTTGGTCT-3′[0241] (与923～943位区域相同的序列与978～997位区域的互补序列的连接序列)[0242] 序列号37：5′-GGTCAAGGCGCAGTATGAGGAGGGGTCTCAAACTTGGTCTGG-3′[0243] (与916～937位区域相同的序列与976～995位区域的互补序列的连接序列)[0244] 序列号38：5′-CACCTACCGCAAGCTGCTGGTCACAGAGATATTCACGGCT-3′[0245] (与1297～1316位区域相同的序列与1354～1376位区域的互补序列的连接序列)

[0246] 序列号39：5′-GCCAAATGCAGCCGGGCTTGGAGGGTCTCAAACTTGGTCTGGTA-3′[0247] (与941～958位区域相同的序列与974～999位区域的互补序列的连接序列)[0248] 序列号40：5′-GGACGGCATCATCGCTGAGGGTCTCAAACTTGGTCTGGTA-3′[0249] (与898～917位区域相同的序列与978～993位区域的互补序列的连接序列)[0250] 序列号41：5′-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCCACGCTGGTTCTTGATGTTGT-3′[0251] (与1051～1072位区域相同的序列与1095～1115位区域的互补序列的连接序列)

[0252] 序列号42：5′-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCGGCACGCTGGTTCTTGA-3′[0253] (与1051～1072位区域相同的序列与1101～1117位区域的互补序列的连接序列)

[0254] 序列号43：5′-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCGGCACGCTGGTTCTTGAT-3′[0255] (与1051～1072位区域相同的序列与1100～11417位区域的互补序列的连接序列)

[0256] 序列号44：5′-CACCTACCGCAAGCTGCTGGATCATCACAGAGATATTCACGGCTC-3′[0257] (与1297～1317位区域相同的序列与1353～1376位区域的互补序列的连接序列)

[0258] 序列号45：5′-CCGCAAGCTGCTGGAGGGAATTCATCACAGAGATATTCACGGCTC-3′[0259] (与1303～1320位区域相同的序列与1353～1379位区域的互补序列的连接序列)

[0260] (R3引物)

[0261] 序列号46：5′-CAGCTCCACCTTGCTCATG-3′(742～760位区域的互补序列)[0262] 序列号47：5′-AGCTCCACCTTGCTCATGT-3′(741～759位区域的互补序列)[0263] 序列号48：5′-AGGTCGTCCCCATGCTTC-3′(1012～1029位区域的互补序列)[0264] 序列号49：5′-CGTCCCCATGCTTCCCA-3′(1009～1025位区域的互补序列)[0265] 序列号50：5′-TCCCCATGCTTCCCAGC-3′(1007～1023位区域的互补序列)[0266] 序列号51：5′-CACCGCCACTGCTACTG-3′(1390～1406位区域的互补序列)[0267] 序列号52：5′-CGTCCCCATGCTTCCCA-3′(1009～1025位区域的互补序列)[0268] 序列号53：5′-GGTCGTCCCCATGCTTCC-3′(1011～1028位区域的互补序列)[0269] 序列号54：5′-GGTCGTCCCCATGCTTC-3′(1012～1028位区域的互补序列)[0270] 序列号55：5′-GGCGGCCTCCAACTTG-3′(1117～1132位区域的互补序列)[0271] 序列号56：5′-TGGCGGCCTCCAACTT-3′(1118～1133位区域的互补序列)[0272] 序列号57：5′-AATGGCGGCCTCCAACTT-3′(1118～1135位区域的互补序列)[0273] 序列号58：5′-CCACTGCTACTGCCACCA-3′(1384～1401位区域的互补序列)[0274] 序列号59：5′-ATGGCGGCCTCCAACTT-3′(1118～1134位区域的互补序列)[0275] 序列号60：5′-CACTGCTACTGCCACCAG-3′(1383～1400位区域的互补序列)[0276] (环状引物F)

[0277] 序列号61：5′-GGGCCTGGAGGGTCTCAAA-3′(986～1004位区域的互补序列)[0278] 序列号62：5′-TGGGCCTGGAGGGTCTCAA-3′(987～1005位区域的互补序列)[0279] 序列号63：5′-GGGCCTGGAGGGTCTCAAACT-3′(984～1004位区域的互补序列)[0280] 序列号64：5′-GGCCTGGAGGGTCTCAAAC-3′(985～1004位区域的互补序列)[0281] 序列号65：5′-GGGCCTGGAGGGTCTCAAACT-3′(984～1003位区域的互补序列)[0282] 序列号66：5′-GGCCTGGAGGGTCTCAAACTT-3′(983～1003位区域的互补序列)[0283] 序列号67：5′-CTGGGCCTGGAGGGTCTCAA-3′(987～1006位区域的互补序列)[0284] 序列号68：5′-TGGGCCTGGAGGGTCTCAAA-3′(986～1005位区域的互补序列)[0285] 序列号69：5′-GCCTGGAGGGTCTCAAACT-3′(984～1002位区域的互补序列)[0286] 序列号70：5′-TGGGCCTGGAGGGTCTCAA-3′(987～1005位区域的互补序列)[0287] 序列号71：5′-GCCTGGAGGGTCTCAAACTT-3′(983～1002位区域的互补序列)[0288] 序列号72：5′-TCACGCTCATGAGTTCCTGGT-3′(1251～1271位区域的互补序列)[0289] 序列号73：5′-GCTTCACGCTCATGAGTTCCTG-3′(1253～1274位区域的互补序列)[0290] 序列号74：5′-GCTTCACGCTCATGAGTTCCTGGT-3′(1251～1274位区域的互补序列)

[0291] 序列号75：5′-CTTCACGCTCATGAGTTCCTGG-3′(1252～1273位区域的互补序列)[0292] 序列号76：5′-GCCAGCTTCACGCTCATGAG-3′(1259～1278位区域的互补序列)[0293] 序列号77：5′-GCCAGCTTCACGCTCATGAGTTC-3′(1256～1278位区域的互补序列)

[0294] 序列号78：5′-CTTCACGCTCATGAGTTCCTGGT-3′(1251～1273位区域的互补序列)

[0295] 序列号79：5′-GGCCAGCTTCACGCTCATGA-3′(1260～1279位区域的互补序列)[0296] 序列号80：5′-CCAGCTTCACGCTCATGAGTTC-3′(1256～1277位区域的互补序列)[0297] 序列号81：5′-GCCAGCTTCACGCTCATGAGTT-3′(1257～1278位区域的互补序列)[0298] 序列号82：5′-GCCAGCTTCACGCTCATGAGT-3′(1258～1278位区域的互补序列)[0299] 序列号83：5′-GCTTCACGCTCATGAGTTCCTGG-3′(1252～1274位区域的互补序列)

[0300] 序列号84：5′-GGCCAGCTTCACGCTCATGAG-3′(1259～1279位区域的互补序列)[0301] (环状引物R)

[0302] 序列号85：5′-AGGCTGCAGGCTGAGATCG-3′(与1076～1094位区域相同的序列)[0303] 序列号86：5′-GAGGCTGCAGGCTGAGATCG-3′(与1076～1093位区域相同的序列)

[0304] 序列号87：5′-AGAGGCTGCAGGCTGAGATC-3′(与1074～1093位区域相同的序列)

[0305] 序列号88：5′-GAGGCTGCAGGCTGAGATCG-3′(与1075～1094位区域相同的序列)

[0306] 序列号89：5′-CAGAGGCTGCAGGCTGA-3′(与1073～1089位区域相同的序列)[0307] 序列号90：5′-CAGAGGCTGCAGGCTGAGA-3′(与1073～1091位区域相同的序列)[0308] 序列号91：5′-CAGAGGCTGCAGGCTGAGATC-3′(与1073～1093位区域相同的序列)

[0309] 序列号92：5′-GCTGCAGGCTGAGATCGACAAC-3′(与1078～1099位区域相同的序列)

[0310] 序列号93：5′-GCAGGCTGAGATCGACAACA-3′(与1081～1100位区域相同的序列)

[0311] 序列号94：5′-GCTGCAGGCTGAGATCGACA-3′(与1078～1097位区域相同的序列)

[0312] 序列号95：5′-GCTGCAGGCTGAGATCGACAA-3′(与1078～1098位区域相同的序列)

[0313] 序列号96：5′-GGCTGCAGGCTGAGATCGAC-3′(与1077～1096位区域相同的序列)

[0314] 序列号97：5′-CCGGTTGGCTGGAGATGGAGTG-3′(与1330～1351位区域相同的序列)

[0315] 序列号98：5′-AGCCGGTTGGCTGGAGAT-3′(与1328～1345位区域相同的序列)[0316] 序列号99：5′-CGGTTGGCTGGAGATGGAGTGG-3′(与1331～1352位区域相同的序列)

[0317] 序列号100：5′-CCGGTTGGCTGGAGATGGAG-3′(与1330～1349位区域相同的序列)

[0318] 序列号101：5′-CGGTTGGCTGGAGATGGAGT-3′(与1331～1350位区域相同的序列)

[0319] 序列号102：5′-CGGTTGGCTGGAGATGGAGTG-3′(与1331～1351位区域相同的序列)

[0320] 序列号103：5′-GGTTGGCTGGAGATGGAGTGG-3′(与1332～1352位区域相同的序列)

[0321] 序列号104：5′-CCGGTTGGCTGGAGATGGA-3′(与1330～1348位区域相同的序列)

[0322] 除上述环状引物外，还可以使用以下例举出的引物。

[0323] (F3引物)

[0324] 序列号105：5′-TTGCCGAGGCTGAGGA-3′(与1134～1149位区域相同的序列)[0325] (FIP)

[0326] 序列号106：5′-CGTCCCCATGCTTCCCAGCCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3′[0327] (1006～1025位区域的互补序列与964～982位区域的相同序列的连接序列)[0328] 序列号107：5′-CGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3′[0329] (1007～1025位区域的互补序列与964～982位区域的相同序列的连接序列)[0330] 序列号108：5′-CTGCCGTGCCATATCCTGCTTGGCTCAAGGATGCTCGTGC-3′[0331] (1219～1240位区域的互补序列与1165～1182位区域的相同序列的连接序列)[0332] (PIR)

[0333] 序列号109：5′-CGCAGTATGAGGAGATGGCCAACTGGAGGGTCTCAAACTTGG-3′[0334] (924～945位区域的相同序列与981～1000位区域的互补序列的连接序列)[0335] 序列号110：5′-ATGAACCGGGCCATCCAGAGGCTTGGCACGCTGGTTCTTG-3′[0336] (1058～1078位区域的相同序列与1102～1120位区域的互补序列的连接序列)[0337] 序列号111：5′-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCACTTGGCACGCTGGTTCTTG-3′[0338] (1051～1072位区域的相同序列与1102～1121位区域的互补序列的连接序列)[0339] 序列号112：5′-TCAGAGATGAACCGGGCCATCCACTTGGCACGCTGGTTCTTG-3′[0340] (1052～1073位区域的相同序列与1102～1121位区域的互补序列的连接序列)[0341] 序列号113：5′-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCCACGCTGGTTCTTGATGTTGT-3′[0342] (1051～1072位区域的相同序列与1095～1115位区域的互补序列的连接序列)[0343] 序列号114：5′-TCAGAGATGAACCGGGCCATCCCACGCTGGTTCTTGATGTTGT-3′[0344] (1052～1073位区域的相同序列与1095～1115位区域的互补序列的连接序列)[0345] 序列号115：5′-GTGAAGCTGGCCCTGGACACCAACCGGCTCTCCTC-3′

[0346] (1268～1286位区域的相同序列与1322～1337位区域的互补序列的连接序列)[0347] (R3引物)

[0348] 序列号116：5′-GAGGTCGTCCCCATGCTTC-3′(1012～1030位区域的互补序列)[0349] 序列号117：5′-CTCAGCCTCGGCAATGG-3′(1131～1147位区域的互补序列)[0350] 序列号118：5′-CCTCAGCCTCGGCAATG-3′(1132～1148位区域的互补序列)[0351] 序列号119：5′-TGGCGGCCTCCAACTTG-3′(1117～1133位区域的互补序列)[0352] 序列号120：5′-GCTCCCACTCCATCTCCA-3′(1339～1356位区域的互补序列)[0353] 上述RIP引物中，序列号33及34的引物，可与含有上述外显子连接区3的区域杂交。

[0354] 序列号35～37，39、40及109的引物，可与含有上述外显子连接区5的区域杂交。

[0355] 序列号41～43以及110～114的引物，可以与含有上述外显子连接区6的区域杂交。

[0356] 序列号115的引物，可以与含有上述外显子连接区7的区域杂交。

[0357] 序列号38，44以及45所示的引物，可以与含有外显子连接区8的区域杂交。

[0358] 上述引物可对应不同的目标扩增区域适当组合成引物组使用。下面的表1中具体列举了含有F3引物、FIP、RIP以及R3引物这4种类型引物的引物组的例子。表中每个引物列中记录的数字为序列号。

[0359] [表1]

[0360]引物组 F3引物 FIP RIP R3引物
1 2 14 33 46
2 3 15 34 46
3 4 14 34 47
4 5 16 35 48
5 5 20 109 116
6 6 17 36 49
7 7 18 37 50
8 12 26 42 56
9 12 106 43 59
10 12 107 43 57
11 12 25 110 117
12 12 25 111 118
13 12 106 112 117
14 12 25 113 55
15 12 106 114 119
16 105 108 115 120
17 8 19 38 51
18 9 21 39 52
19 9 22 39 53
20 10 23 39 52
21 11 24 40 54

[0361]

[0362] 下面表2中具体列举了除F3引物、FIP、RIP以及R3引物之外，还含有环状引物F以及环状引物R的引物组的例子。表中各引物列中记录的数字为序列号。

[0363] [表2]

[0364]

[0365] 使用RT-LAMP法时是通过将试样与本实施方式的引物组、RNA依赖性DNA聚合酶(以下，称为“逆转录酶”)、具有链置换活性的DNA依赖性DNA聚合酶(以下，称为“链置换型DNA聚合酶”)以及dNTPs(含有dATP，dGTP，dTTP以及dCTP)混合并使其发生反应来检测试样中的CK7的mRNA。

[0366] 逆转录酶和链置换型DNA聚合酶，均可使用本领域中公认的东西。而且，作为逆转录酶和链置换型DNA聚合酶的替代物，也可使用兼具以RNA为模板合成DNA的功能和一边进行链置换一边以DNA为模板合成DNA功能的一种酶。

[0367] 如果能使用为上述酶反应创造最适当条件的缓冲剂则更好。

[0368] 本实施方式的引物组可以以冻结状或液态试剂的形态被提供。既可将不同种类的引物放在一个容器，也可将各种引物分别放在不同的容器中。

[0369] RT-LAMP法所使用的各种试剂，可以分别装在不同的容器中，但是也可以将逆转录酶和链置换型DNA聚合酶装在同一容器中。可以将dNTPs、缓冲剂以及各种引物中的至少两种物质放在同一个容器中。将这些试剂提供给用户时，可以提供含有上述试剂部分或全部的试剂盒。

[0370] 检测CK7的mRNA用的试样如有从生物体采集的组织(淋巴结、淋巴液、血液等)或大便等。

[0371] 使用RT-LAMP方法做的检测是通过扩增步骤以及检测步骤来进行的。把从生物体采集来的含有CK7的mRNA的试样与上述引物组、逆转录酶、dNTPs以及链置换型DNA聚合酶混合在一起。然后将这些混合液加热到一定的温度(例如65℃)，进行RT反应和LAMP反应，使CK7的cDNA扩增。

[0372] RT反应以及LAMP反应的机理如下。

[0373] 首先，在反应液中，RIP的第二序列与CK7的mRNA序列所包含的R2c区域杂交。然后，通过逆转录酶，从该RIP的3′末端开始，以CK7的mRNA为模板合成CK7的cDNA。通过这一反应，合成由CK7的mRNA与从该PIR延长出的CK7的cDNA(RIP延伸链)组成的双链核酸。

[0374] 接着，R3引物与CK7的mRNA序列所包含的R3c区域杂交。然后通过链置换型DNA聚合酶从该R3引物的3′末端开始，以CK7的mRNA为模板，一边剥离(一边置换)已与CK7的mRNA结合的上述RIP延伸链，一边合成CK7的cDNA。

[0375] 上述RIP延伸链因为具有与CK7的mRNA序列呈互补性的序列，所以在该RIP延伸链中包含有F2c区域。另外，该RIP延伸链通过上述反应变成单链状态，FIP的第四序列与其杂交。

[0376] 然后，通过链置换型聚合酶的作用，开始从FIP的3′末端，以上述RIP延伸链为模板合成DNA。因为该合成DNA在其5′末端有第三序列(与F1区域杂交的序列)，该第三序列与上述合成DNA序列所包含的F1区域杂交，形成茎环结构。另外，因为上述合成DNA在3′末端有第一序列的互补序列(与R1c区域杂交的序列)，该第一序列的互补序列与上述合成DNA序列所包含的R1c区域杂交，形成茎环结构。由此，上述合成DNA在5′末端以及
3′末端两端均形成了具有茎环结构的哑铃结构。

[0377] 这个哑铃结构的DNA(哑铃DNA)从其3′末端开始，以自身序列为模板，在解开5′末端茎环结构的同时，通过链置换型DNA聚合酶进行延伸。这个延伸链在其5′末端、
3′末端以及它们的中间部分分别具有相互呈互补性的序列，因此，在该延伸链中形成了三个茎环结构。而且，该延伸链从其3′末端开始，以自身序列为模板，一边解开上述茎环结构，一边通过链置换型DNA聚合酶进行延伸。由于这个反应实际上是在恒温下反复进行的，分子中合成了含多个特定序列的DNA(该反应的具体内容望能参阅美国专利第6410278号公报以及美国专利第6974670号公报)。

[0378] 通过上述方法扩增的核酸中，大部分是dsDNA(双链DNA：double strandDNA)，将这些扩增产物用像溴化乙锭、SYBR GREEN 1、Pico Green等荧光嵌入剂进行荧光染色后，即可通过紫外线照射检测荧光。该荧光染色也可通过在扩增反应后的反应液中添加荧光色素来实施。或者是，可以预先在上述反应液中添加荧光色素，在有荧光色素存在的情况下进行核酸扩增。通过是否能检测出荧光来判断试样中CK7的mRNA是否存在。另外，还可以通过测定反应后的反应液的荧光强度来对扩增产物进行定量。也可以此定量结果为基础，对试样中含有的CK7的mRNA进行定量。特别是在荧光色素存在的情况下，进行核酸扩增时，通过实时测定反应液中荧光强度的增大，测定达到一定荧光强度所需的时间，可以换算出试样中含有的CK7的mRNA量(实时RT-PCR法，实时RT-LAMP法等等)。

[0379] 此外，作为附加产物，LAMP反应生成了不溶于水的焦磷酸镁。焦磷酸镁随着核酸的扩增而增多，反应液随着焦磷酸镁的增多而变白且浑浊。这里，可以通过目测来判断反应液浑浊度，或者对反应液的吸光度、散射光度进行测定，来判断其浑浊度，还可以使用有色过滤器过滤反应液，通过确认过滤器上的残渣，也可以检测出目标核酸(国际公开WO第01/83817号)。通过测定反应液的吸光度或散射光度来判断浑浊度时，和上述使用荧光色素的情况一样，实时监测浑浊度的变化，可以在封闭系统中追踪DNA扩增以及浑浊度增加情况。根据反应液是否变白变浑浊，可以判断出试样中是否存在CK7的mRNA。此外，通过测定扩增产物的浑浊度，可以对该扩增产物定量。而且，根据该定量的结果，也可以对试样中含有的CK7的mRNA进行定量。在实时测定浑浊度增加的时候，也可以测定到达一定浑浊度所需的时间(以下，称为“扩增上升时间”)，再将该时间换算成试样中CK7的mRNA量。

[0380] 实施例

[0381] (实施例1)

[0382] 对使用表1中列出的引物组1～21，通过RT-LAMP法能否测出CK7的mRNA进行如下了验证。

[0383] (1)制备试样

[0384] 将5×1010拷贝/μL的RNA用无RNA酶的酵母RNA(Yeast RNA)溶液(含有50ng/3
μL的酵母RNA(Ambion))进行系列稀释，制备出5×10 拷贝/μL的RNA(以下，称为“RNA试样A”)

[0385] (2)制备反应液

[0386] 将F3引物、FIP、RIP以及R3引物，按如下配比加入缓冲液中，制备混合引物(引物MIX)。

[0387] 32μM FIP

[0388] 32μM RIP

[0389] 2μM F3引物

[0390] 2μM R3引物

[0391] 10mM三羟甲基氨基甲烷HCl(Tris-HCl)(pH8.0)

[0392] 首先将以下试剂进行混合，制备出RT-LAMP反应用缓冲液。

[0393] 53mM三羟甲基氨基甲烷HCl(pH8.8)

[0394] 1.8×Thermopol缓冲液(New England Biolabs)

[0395] 1.43mM dNTPs(Invitrogen)

[0396] 5.36mM MgSO4(AKALA I TESQUE)

[0397] 8.93mM DTT(和光纯药)

[0398] 2％Tergitol(Sigma)

[0399] 接下来将下列试剂混合，制备酶溶液。

[0400] 10U/μL AMV逆转录酶(Promega)

[0401] 8U/μL BstDNA聚合酶(New England Biolabs)

[0402] RNA酶抑制剂(Promega)

[0403] 混合下列试剂，制备出25μL的反应液。

[0404] RT-LAMP反应用缓冲液14.0μL

[0405] 酶溶液3.0μL

[0406] 混合引物2.5μL

[0407] 1OmM三羟甲基氨基甲烷HCl(pH8.0)3.5μL

[0408] RNA试样A 2.0μL

[0409] 此外，作为阴性对照(NC)，代替2.0μL的RNA试样A，制备添加了2.0μL酵母RNA(Yeast RNA)溶液(含50ng/μL的酵母RNA(YeastRNA)(Ambion))的反应液。

[0410] (3)检测及检测结果

[0411] 将装有包含21种引物组中任意一种引物组的反应液的试管放置到预先加温至65℃的浑浊度实时测定装置LA-200(TERAMECS公司)中，再在65℃温度下，进行反应液培养。测定从反应开始到反应液浑浊度变为0.1时所需的时间。进行一次阴性对照测定和三次RNA试样A测定(n＝3)。阴性对照结果和RNA试样A测定结果的平均值如表3所示。

[0412] [表3]

[0413]引物组 NC(分) 测定结果(分)
1 - 31.1
2 - 35.2
3 - 27.9
4 - 38.4
5 - 53.7
6 - 48.8
7 - 50.0
8 - 29.9
9 - 35.6
10 - 27.8
11 - 39.4
12 - 28.4
13 - 41.8
14 - 26.3
15 - 41.2
16 - 48.7
17 - 55.3
18 - 30.5
19 - 30.6
20 - 34.3
21 - 36.9

[0414]

[0415] 表中的-(连字符)表示在60分钟以内，浑浊度未达到0.1。如表3所示，虽然阴性对照时，60分钟内未检测到浑浊出现(未发生非特异性扩增)，但是使用RNA试样A进行的三次测定中，核酸扩增均在60分钟内得到了确认(表中仅列出了平均值)。根据上述内容可知：使用引物组1～21中任意一个，均能在60分钟内检测出CK7的mRNA。

[0416] (实施例2)

[0417] 对使用表2中列出的引物组22～61，通过RT-LAMP法能否测出CK7的mRNA，如下进行了验证。

[0418] (1)制备试样

[0419] 将5×1010拷贝/μL的RNA用无RN酶的酵母RNA溶液(含有50ng/μL的酵母3
RNA(Yeast RNA)(Ambion))进行系列稀释，制备出2.5×10 拷贝/μL的RNA(以下，称为“RNA试样B”)

[0420] (2)制备反应液

[0421] 将F3引物、FIP、RIP、R3引物、环状引物F以及环状引物R按如下配比加入缓冲液中，制备混合引物(引物MIX)。

[0422] 16μM FIP

[0423] 16μM RIP

[0424] 1μM F3引物

[0425] 1μM R3引物

[0426] 12μM环状引物F

[0427] 12μM环状引物R

[0428] 10mM三羟甲基氨基甲烷HCl(pH8.0)

[0429] 将以下试剂混合，制备出25μL的反应液。

[0430] 实施例1中制备的RT-LAMP反应用缓冲液14.0μL

[0431] 实施例1中制备的酶溶液3.0μL

[0432] 混合引物5μL

[0433] 10mM三羟甲基氨基甲烷HCl(pH8.0)1.0μL

[0434] RNA试样B 2.0μL

[0435] (3)检测及检测结果

[0436] 将装有包含40种引物组中任意一些引物组的反应液的试管放置到预先加温至65℃的浑浊度实时测定装置LA-200(TERAMECS公司)中，再在65℃温度下，进行反应液培养。测定从反应开始到反应液浑浊度变为0.1时所需的时间。进行一次阴性对照测定和三次RNA试样B测定(n＝3)。阴性对照结果和RNA试样B测定结果的平均值如表4所示。

[0437] [表4]

[0438]

[0439] 表中的-(连字符)表示在60分钟以内，浑浊度未达到0.1。如表3所示，虽然阴性对照时，60分钟内未检测到浑浊出现(未发生非特异性扩增)，但是使用RNA试样B进行的三次测定中，核酸扩增均在40分钟内得到了确认(表中仅列出了平均值)。根据上述内容可知：使用引物组22～61中任意一个，均能在40分钟内检测出CK7的mRNA。

[0440] 本申请涉及2008年3月28日申请的日本专利申请2008-088188号，该专利申请权利要求范围、说明书、图、表、序列表以及概要书等作为参照，均编入本说明书中。

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