用于快速植物转化的方法和组合物
阅读：215发布：2021-06-11
专利汇可以提供用于快速植物转化的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本披露涉及用于快速和有效转化 植物 的方法和组合物。本披露进一步提供用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。本 摘要 旨在作为扫描工具用于在特定领域中进行搜索的目的，而不旨在限制本披露。，下面是用于快速植物转化的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：
(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：
(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或
(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或
(iii)(i)和(ii)的组合；并且
(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且
(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。
2.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：
(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含
(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或
(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或
(iii)其组合；
(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且
(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物；
其中所述WUS/WOX同源框多肽包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14或16中的任一个的氨基酸序列；或其中所述WUS/WOX同源框多肽由SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13或15中的任一个的核苷酸序列编码；并且
其中所述包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65或67中的任一个的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：17、19、21、
62、64、66或68中的任一个的核苷酸序列编码。
3.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：
(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含
(i)编码WUS2多肽的核苷酸序列；或
(ii)编码ODP2多肽的核苷酸序列；或
(iii)其组合；
(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且
(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物；
其中所述WUS2多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；或其中所述WUS2多肽由SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码；并且
其中所述ODP2多肽包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：17或21中的任一个的核苷酸序列编码。
4.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：
(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；
(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且
(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。
5.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：
(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；
(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且
(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。
6.一种用于生产转化的植物的方法，所述方法包括：
(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含
(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；并且
(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；
(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且
(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。
7.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：
(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含
(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或
(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或
(iii)(i)和(ii)的组合；
(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且
(c)在约14天至约60天内使(b)的所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。
8.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：
(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含
(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或
(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列：或
(iii)(i)和(ii)的组合；
(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成，并且其中所述可再生植物结构在转化所述细胞的约0-7天或约0-14天内形成；并且
(c)在转化所述细胞的约14天至约60天内使(b)的所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。
9.如权利要求1-3或6-8中任一项所述的方法，其中所述表达构建体包含编码所述WUS/WOX同源框多肽的所述核苷酸序列和编码所述包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的所述核苷酸序列两者。
10.如权利要求1-4或6-9中任一项所述的方法，其中所述表达构建体包含编码所述WUS/WOX同源框多肽的所述核苷酸序列。
11.如权利要求1-3或5-9中任一项所述的方法，其中所述表达构建体包含编码所述包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的所述核苷酸序列。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中编码所述WUS/WOX同源框多肽的所述核苷酸序列和/或编码所述包含两个AP2结合结构域的多肽的所述核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1或U153。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。
17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其中编码位点特异性重组酶的所述核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。
18.如权利要求1-4、6-10或12-17中任一项所述的方法，其中编码所述WUS/WOX同源框多肽的所述核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。
19.如权利要求1-3、5-9或11-17中任一项所述的方法，其中编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的所述核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。
21.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。
22.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A或LEA-D34。
23.如权利要求17-19或21中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子是化学诱导型启动子。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述化学诱导型启动子是XVE。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述化学诱导型启动子被TETR、ESR或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述阻抑物是TETR，并且所述四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述阻抑物是ESR，并且所述磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。
28.如权利要求17-19或21中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子是生长素诱导型启动子。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述生长素诱导型启动子是AXIG1。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。
31.如权利要求17-19、21或28-30中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子包含生长素响应元件。
32.如权利要求17-19、21、28或31中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。
33.如权利要求17-19、21或25-32中任一项所述的方法，其中所述启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。
36.如权利要求17-19、21、28或31-32中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。
37.如权利要求17-19、21或33中任一项所述的方法，其中所述启动子是去阻抑型启动子。
38.如权利要求17-19、21、25-27、33或37中任一项所述的方法，其中所述去阻抑型启动子是TETR、ESR或CR。
39.如权利要求17-19或22中任一项所述的方法，其中所述发育调节型启动子选自：
PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。
40.如权利要求22或39所述的方法，其中所述PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种(Setaria sp.)、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米、高粱或稻。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米。
45.如权利要求22或39所述的方法，其中所述PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥属(Arabidopsis)、或棉花。
47.如权利要求22或39所述的方法，其中所述PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个。
48.如权利要求22、39或47中任一项所述的方法，其中所述PLTP启动子包含SEQ ID NO：
1或2中的任一个。
49.如权利要求1-4、6-8、9-10、12-18、或20-48中任一项所述的方法，其中所述WUS/WOX同源框多肽选自：WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5或WOX9多肽。
50.如权利要求1-4、6-8、9-10、12-18或20-49中任一项所述的方法，其中编码所述WUS/WOX同源框多肽的所述核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。
52.如权利要求1-4、6-8、9-10、12-18或20-49中任一项所述的方法，其中编码所述WUS/WOX同源框多肽的所述核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。
54.如权利要求1-4、6-8、9-10、12-18或20-49中任一项所述的方法，其中编码WUS/WOX同源框多肽的所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14或16中的任一个的氨基酸序列。
55.如权利要求1-4、6-8、9-10、12-18或20-49中任一项所述的方法，其中编码WUS/WOX同源框多肽的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13或15中的任一个。
56.如权利要求1-4、6-8、9-10、12-18或20-49中任一项所述的方法，其中所述WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述WUS1多肽是玉米WUS1多肽。
60.如权利要求56或59所述的方法，其中所述WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
61.如权利要求56或59所述的方法，其中所述WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。
62.如权利要求1-4、6-8、9-10、12-18或20-49中任一项所述的方法，其中所述WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述WUS2多肽是玉米WUS2多肽。
66.如权利要求62或65所述的方法，其中所述WUS2多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：6。
67.如权利要求63或65所述的方法，其中所述WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。
68.如权利要求1-4、6-8、9-10、12-18或20-49中任一项所述的方法，其中所述WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述WUS3多肽是玉米WUS3多肽。
72.如权利要求68或71所述的方法，其中所述WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
73.如权利要求68或71所述的方法，其中所述WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。
74.如权利要求1-4、6-8、9-10、12-18或20-49中任一项所述的方法，其中所述WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述WOX5多肽是WOX5A多肽。
76.如权利要求74或75所述的方法，其中所述WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。
77.如权利要求74或75所述的方法，其中所述WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。
78.如权利要求74或75所述的方法，其中所述WOX5多肽是玉米WOX5多肽。
79.如权利要求74-75或78中任一项所述的方法，其中所述WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
80.如权利要求74-75或78所述的方法，其中所述WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。
81.如权利要求1-3、5-9、11-17或19-48中任一项所述的方法，其中包含所述两个AP2-DNA结合结构域的所述多肽是ODP2、BBM2、BMN2或BMN3多肽。
82.如权利要求1-3、5-9、11-17、19-48或81所述的方法，其中包含所述两个AP2-DNA结合结构域的所述多肽是单子叶植物多肽。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米或稻。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米。
87.如权利要求1-3、5-9、11-17、19-48或81所述的方法，其中包含所述两个AP2-DNA结合结构域的所述多肽是双子叶植物多肽。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。
89.如权利要求1-3、5-9、11-17或19-48中任一项所述的方法，其中包含所述两个AP2-DNA结合结构域的所述多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65或67中的任一个的氨基酸序列。
90.如权利要求1-3、5-9、11-17或19-48中任一项所述的方法，其中包含所述两个AP2-DNA结合结构域的所述多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66或68中的任一个的核苷酸序列编码。
91.如权利要求1-3、5-9、11-17或19-48中任一项所述的方法，其中包含所述两个AP2-DNA结合结构域的所述多肽是ODP2多肽。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述ODP2多肽是单子叶植物多肽。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米或稻。
96.如权利要求91所述的方法，其中所述ODP2是双子叶植物多肽。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。
98.如权利要求91或92所述的方法，其中所述ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65或67中的任一个的氨基酸序列。
99.如权利要求91或92所述的方法，其中所述ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、
64、66或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。
100.如权利要求1-3、5-9、11-17或19-48中任一项所述的方法，其中包含所述两个AP2-DNA结合结构域的所述多肽是BBM2多肽。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述BBM2多肽是单子叶植物多肽。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米或稻。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米。
106.如权利要求100所述的方法，其中所述BBM2多肽是双子叶植物多肽。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。
108.如权利要求100或101所述的方法，其中所述BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
109.如权利要求100或101所述的方法，其中所述BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。
110.如权利要求1-109中任一项所述的方法，其中所述可再生植物结构在转化所述细胞的约0至约7天内、或在转化所述细胞的约0至约14天内形成，并且所述转基因植物在转化所述细胞的约14天至转化所述细胞的约60天内形成。
111.如权利要求1-110中任一项所述的方法，其中所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。
112.如权利要求1-1110中任一项所述的方法，其中所述方法在存在生根培养基的情况下进行。
113.如权利要求1-112中任一项所述的方法，其中所述外植体是未成熟胚。
114.如权利要求113所述的方法，其中所述未成熟胚是1-5mm的未成熟胚。
115.如权利要求113所述的方法，其中所述未成熟胚是3.5-5mm的未成熟胚。
116.如权利要求1-115中任一项所述的方法，其中外源性细胞分裂素在转化所述细胞的约7天后或在转化所述细胞的约14天后在发芽期间使用。
117.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中(a)的多肽的所述表达是瞬时的。
118.如权利要求1-117中任一项所述的方法，其中发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
用于快速植物转化的方法和组合物
技术领域
[0001] 本披露总体上涉及植物分子生物学领域，包括植物的基因操作。更具体地，本披露涉及在不存在细胞分裂素并且没有愈伤组织形成的情况下用于生产转化的植物的快速、高效的方法和组合物。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2015年10月30日提交的美国临时申请号62/248578的优先权，该申请以其全文通过引用特此结合中。
[0005] 该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，该序列表文件名为“20160826_6752WOPCT_SeqList.txt”，创建于2016年8月17日，且具有1000KB大小，并与本说明书同时提交。包括在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用结合在此。
背景技术
[0006] 过去几年来在植物转化方面取得了的重要进展。多种农艺学上重要的植物(例如，玉米、大豆、低芥酸菜籽、小麦、籼稻、甘蔗和高粱、以及近交系)的转化依然是困难且耗时的。传统上，引起培养反应的唯一方法是通过优化培养基组分和/或外植体材料和来源。这导致了一些基因型的成功，但是许多重要的作物植物(包括优良近交系或品种)都未能产生有利的培养反应。尽管模式基因型的转化可能是有效的，但是将转基因渐渗入生产近交系的过程是费力、昂贵且耗时的。如果可以将基因引入并以更高的速度和效率进行评估，那将节省大量的时间和金钱。
[0007] 尽管有局限性，单子叶植物(例如玉米、稻、和小麦)的农杆菌(Agrobacterium)介导的转化仍然是一种广泛使用的实验方法，通常使用分生组织(例如未成熟胚)作为选择的外植体(例如Ishida等人，1996；Zhao等人，2001；Frame等人，2002)。对于稻，还报道了吸胀种子的转化(Toki等人，2006)。迄今为止，用于将细胞与农杆菌接触的最常用方法包括：培养外植体组织(例如，未成熟胚)(“共培养”)，其可能包括“延迟”或“静止”(非选择性)步骤，接着在选择培养基(含有一种或多种允许细胞脱分化形成愈伤组织的生长素)上进行培养。在该愈伤化阶段期间，在选择培养基上存在适当的选择剂的情况下选择转化的抗性愈伤组织。接着在再生和生根培养基中在促进愈伤组织分化和愈伤组织再生成植物的条件下使细胞生长。该过程通常需要至少10-12周来生产可以转移至土壤供进一步生长的植物。该过程还需要在整个转化过程中进行若干次组织的手动转移，并使用若干种不同类型的培养基。
[0008] 因此，使用标准转化和再生方案是耗时且低效的，并且负面地影响转基因产品开发时间表，考虑到通常存在季节性限制的“优先开发窗口(priority development window)”用于根据初步研究中获得的结果决定哪些遗传构建体优先用于更大规模的田间工作。可用的转化和再生的标准方法具有多种限制可以生产和筛选转基因植物的速度和效率的缺点。例如，许多转化和再生的标准方法需要使用高生长素或细胞分裂素水平，并且需要涉及胚性愈伤组织形成或器官发生的步骤，导致在转化后在生产用于在温室环境中生长的植物之前花费许多周的程序。据报道(Zhong等人(1992)Planta[植物]187：490-497)，此类方法可能花费12-23周来生产植物，其包括以下步骤：供应2，4-D以刺激玉米的体细胞胚形成(占用8周)、从初级体细胞胚产生胚性愈伤组织(占用另外的8周)、形成芽(占用另外的3周)、并最终生根(占用另外的1至3周)。可替代地，Zhong等人立即供应细胞分裂素以及生长素，以刺激直接形态发生而产生芽和直接植物形成(从8至28周)(Zhong等人(1992)Planta[植物]187：490-497)。
[0009] 尽管植物分子生物学(尤其是植物转化和再生方法)中的进展，仍然需要高通量系统来快速且有效地生产转基因植物，来为进行研究和产品开发的决定提供更多的时间和灵活性。这样的用于转化的高通量系统促进生产大量的转基因植物用于基因测试和/或产品开发，同时降低材料和人工成本。发明内容
[0010] 在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在一方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在一方面，位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-
2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-
61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。
在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、
21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，所述单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天内或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-
61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。
在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、
21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，所述单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天内或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
[0011] 在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)其组合；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物；其中所述WUS/WOX同源框多肽包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列；或其中所述WUS/WOX同源框多肽由SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个的核苷酸序列编码；并且其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、
20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在一方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在一方面，位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。
在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、
12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：
17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。
在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，所述单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且所述转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在一方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在一方面，位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。
在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、
12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：
17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。
在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，所述单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且所述转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
[0012] 在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS2多肽的核苷酸序列；或(ii)编码ODP2多肽的核苷酸序列；或(iii)其组合；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物；其中所述WUS2多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；或其中所述WUS2多肽由SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码；并且其中所述ODP2多肽包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：17或21中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。
在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在一方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在一方面，位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：
AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBIl-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。
在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。
在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、
13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、
66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。
在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在一方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在一方面，位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：
AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBIl-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。
在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。
在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、
13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、
66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。
在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
[0013] 在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在一方面，位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(12KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：
AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。
在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、
12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUSl多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。
在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、
12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUSl多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
[0014] 在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)
[0015] 使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在一方面，编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列发生在起始转化后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在一方面，位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。
在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、
35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。
在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约
7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、
35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。
在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约
7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
[0016] 在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；和(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在一方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在一方面，位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。
在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBIl-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：
WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。
在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、
63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或
68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-
5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBIl-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：
WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。
在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、
63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或
68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-
5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
[0017] 在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)在约14天至约60天内使(b)的所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在一方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在一方面，位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、
11、13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、
66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天内或在转化细胞的约0至约14天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
11、13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、
66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天内或在转化细胞的约0至约14天内形成。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
[0018] 在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成，并且其中所述可再生植物结构在转化细胞的约0-7天或约0-14天内形成；并且(c)在转化所述细胞的约14天至约60天内使(b)的可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在一方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在一方面，位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：
AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。
在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。
在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、
13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、
66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在一方面，化学诱导型启动子是XVE。在一方面，化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在一方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在一方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在一方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在一方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在一方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一方面，诱导型启动子包含生长素响应元件。在一方面，诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在一方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在一方面，启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在一方面，诱导型启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在一方面，启动子是去阻抑型启动子。在一方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在一方面，发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。
在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自双子叶植物。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽选自：WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。
在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、
13、或15中的任一个。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在一方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在一方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、
66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，ODP2是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在一方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在一方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在一方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在一方面，单子叶植物是玉米或稻。在一方面，单子叶植物是玉米。在一方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在一方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在一方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在一方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在一方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在一方面，外植体是未成熟胚。在一方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在一方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在一方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在一方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在一方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。
[0019] 本披露包含用于快速和有效转化植物(例如，单子叶植物，如玉米)的方法和组合物。在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或约0至约14天内产生。在一方面，发芽包含将可再生植物结构转移至包含外源性细胞分裂素和形成转基因植物的成熟培养基。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，(c)发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至启动子，所述启动子选自诱导型启动子、发育调节型启动子、或组成型启动子。在一方面，与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、
35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：
AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子；并且与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、SDR、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，外植体源自单子叶植物或双子叶植物。在一方面，种子来自通过所述方法生产的植物。
35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：
AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子；并且与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、SDR、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，外植体源自单子叶植物或双子叶植物。在一方面，种子来自通过所述方法生产的植物。
[0020] 在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且；(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。其中所述WUS/WOX同源框多肽包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或
16中的任一个的氨基酸序列；或其中所述WUS/WOX同源框多肽由SEQ ID NO：3、5、7、9、11、
13、或15中的任一个的核苷酸序列编码；并且其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或约0至约14天内产生。在一方面，发芽包含将可再生植物结构转移至包含外源性细胞分裂素和形成转基因植物的成熟培养基。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，(c)发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至启动子，所述启动子选自诱导型启动子、发育调节型启动子、或组成型启动子。在一方面，与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子；并且与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、SDR、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，外植体源自单子叶植物或双子叶植物。在一方面，种子来自通过所述方法生产的植物。
16中的任一个的氨基酸序列；或其中所述WUS/WOX同源框多肽由SEQ ID NO：3、5、7、9、11、
13、或15中的任一个的核苷酸序列编码；并且其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或约0至约14天内产生。在一方面，发芽包含将可再生植物结构转移至包含外源性细胞分裂素和形成转基因植物的成熟培养基。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，(c)发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至启动子，所述启动子选自诱导型启动子、发育调节型启动子、或组成型启动子。在一方面，与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子；并且与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、SDR、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，外植体源自单子叶植物或双子叶植物。在一方面，种子来自通过所述方法生产的植物。
[0021] 在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包含：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使(b)的可再生植物结构发芽约14至约60天以形成小植株；并且(d)允许(c)的小植株生长成植物。在一方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或约0至约14天内产生。在一方面，发芽包含将可再生植物结构转移至包含外源性细胞分裂素和形成转基因植物的成熟培养基。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，(c)发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至启动子，所述启动子选自诱导型启动子、发育调节型启动子、或组成型启动子。在一方面，与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：
UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子；并且与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、SDR、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，外植体源自单子叶植物或双子叶植物。在一方面，种子来自通过所述方法生产的植物。
UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)。与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子；并且与编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、SDR、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在一方面，外植体源自单子叶植物或双子叶植物。在一方面，种子来自通过所述方法生产的植物。
[0022] 在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的一个或多个细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在一方面，本披露进一步提供了用于生产小植株的方法，所述小植株获得自使用所披露的方法制备的可再生植物结构。在一方面，本披露进一步提供了用于生产植物的方法，所述植物获得自可再生植物结构。在各个方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在一方面，本披露进一步提供了试剂盒，所述试剂盒包含：(a)表达构建体，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；以及(b)用于在不存在外源性细胞分裂素的情况下获得植物可再生结构的说明书，其中没有愈伤组织形成；以及(c)用于使可再生植物结构发芽以形成转基因植物的说明书。
[0023] 本披露包含用于快速和有效转化植物(例如，单子叶植物，如玉米)的方法和组合物。在各个方面，本披露提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0-7天或约0-14天内产生。在各个方面，发芽包含将可再生植物结构转移至包含外源性细胞分裂素和形成转基因植物的成熟培养基。在各个方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在各个方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在各个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在各个方面，诱导型启动子是GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A或XVE。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列被可操作地连接至启动子，所述启动子选自诱导型启动子、发育调节型启动子、或组成型启动子。在各个方面，组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2，NOS、
35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)诱导型启动子选自：GLB1、OLE、LTP2、AXIG1 DR5、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或XVE；并且发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在各个方面，外植体源自单子叶植物或双子叶植物。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)诱导型启动子选自：GLB1、OLE、LTP2、AXIG1 DR5、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或XVE；并且发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在各个方面，外植体源自单子叶植物或双子叶植物。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
[0024] 在另外的方面，本披露提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)其组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且；(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物；其中所述WUS/WOX同源框多肽包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列；或其中所述WUS/WOX同源框多肽由SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个的核苷酸序列编码；并且其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0-7天或约0-14天内产生。在各个方面，发芽包含将可再生植物结构转移至包含外源性细胞分裂素和形成转基因植物的成熟培养基。在各个方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在各个方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在各个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在各个方面，诱导型启动子是GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A或XVE。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列被可操作地连接至启动子，所述启动子选自诱导型启动子、发育调节型启动子、或组成型启动子。在各个方面，组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2.NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)诱导型启动子选自：GLB1、OLE、LTP2、AXIG1 DR5、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或XVE；并且发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在各个方面，外植体源自单子叶植物或双子叶植物。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
[0025] 在另外的方面，本披露提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)允许(b)的可再生植物结构成长为小植株，持续约14天至约60天；并且(d)允许(c)的小植株生长成植物。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0-7天或约0-14天内产生。在各个方面，发芽包含将可再生植物结构转移至包含外源性细胞分裂素和形成转基因植物的成熟培养基。在各个方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在各个方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在各个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在各个方面，诱导型启动子是GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A或XVE。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列被可操作地连接至启动子，启动子选自诱导型启动子、发育调节型启动子、和组成型启动子。在各个方面，组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2，NOS、35S的-135版本、和ZM-ADF PRO(ALT2)诱导型启动子选自：GLB1、OLE、LTP2、AXIG1 DR5、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或XVE；并且发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、或LEA-D34。在各个方面，外植体源自单子叶植物或双子叶植物。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
[0026] 在另外的方面，本披露提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在各个方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在各个方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在各个方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在各个方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在各个方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在各个方面，位点特异性重组酶是FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在各个方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在各个方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在各个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在各个方面，诱导型启动子是GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、或HSP18A。在各个方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在各个方面，化学诱导型启动子是XVE。在各个方面，阻抑化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在各个方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在各个方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子。在各个方面，组成型启动子是UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PROFL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，发育调节型启动子是PLTP启动子。在各个方面，PLTP启动子源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，PLTP启动子源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在各个方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在各个方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在各个方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在各个方面，启动子包含生长素响应元件。在各个方面，启动子含有一个或多个DR5增强子基序。
在各个方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在各个方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在各个方面，启动子是NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在各个方面，启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在各个方面，启动子是去阻抑型启动子。在各个方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。
在各个方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在各个方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。
在各个方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在各个方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在各个方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在各个方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。
在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、
20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在各个方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，ODP2是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在各个方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在各个方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
在各个方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在各个方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在各个方面，启动子是NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在各个方面，启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在各个方面，启动子是去阻抑型启动子。在各个方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。
在各个方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在各个方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。
在各个方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在各个方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在各个方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在各个方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。
在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、
20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在各个方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，ODP2是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在各个方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在各个方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
[0027] 在另外的方面，本披露提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)其组合；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物；其中所述WUS/WOX同源框多肽包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列；或其中所述WUS/WOX同源框多肽由SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个的核苷酸序列编码；并且其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在各个方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在各个方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在各个方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在各个方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在各个方面，位点特异性重组酶是FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在各个方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在各个方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在各个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在各个方面，诱导型启动子是GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、或HSP18A。在各个方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在各个方面，化学诱导型启动子是XVE。在各个方面，阻抑化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在各个方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在各个方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子。在各个方面，组成型启动子是UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，发育调节型启动子是PLTP启动子。在各个方面，PLTP启动子源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，PLTP启动子源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在各个方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在各个方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在各个方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在各个方面，启动子包含生长素响应元件。在各个方面，启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在各个方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在各个方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在各个方面，启动子是NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在各个方面，启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在各个方面，启动子是去阻抑型启动子。在各个方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是SEQ ID NO：4。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽由SEQ ID NO：3编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是SEQ ID NO：6。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽由SEQ ID NO：5编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是SEQ ID NO：8。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽由SEQ ID NO：7编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是SEQ ID NO：14。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽由SEQ ID NO：13编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是SEQ ID NO：20。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：19编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。
在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
[0028] 在另外的方面，本披露提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS2多肽的核苷酸序列；或(ii)编码ODP2多肽的核苷酸序列；或(iii)其组合；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物；其中所述WUS2多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；或其中所述WUS2多肽由SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码；并且其中所述ODP2多肽包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：17或21中的任一个的核苷酸序列编码。在各个方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在各个方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在各个方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在各个方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在各个方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在各个方面，位点特异性重组酶是FLP、Cre、SSV1、λInt、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在各个方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在各个方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在各个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在各个方面，诱导型启动子是GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、或HSP18A。在各个方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在各个方面，化学诱导型启动子是XVE。在各个方面，阻抑化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在各个方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在各个方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子。在各个方面，组成型启动子是UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，发育调节型启动子是PLTP启动子。在各个方面，PLTP启动子源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。
在各个方面，PLTP启动子源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在各个方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在各个方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在各个方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在各个方面，启动子包含生长素响应元件。
在各个方面，启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在各个方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在各个方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在各个方面，启动子是NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在各个方面，启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在各个方面，启动子是去阻抑型启动子。在各个方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
在各个方面，PLTP启动子源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在各个方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在各个方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在各个方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在各个方面，启动子包含生长素响应元件。
在各个方面，启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在各个方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在各个方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在各个方面，启动子是NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在各个方面，启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在各个方面，启动子是去阻抑型启动子。在各个方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
[0029] 在另外的方面，本披露提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在各个方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在各个方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在各个方面，位点特异性重组酶是FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在各个方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在各个方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在各个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在各个方面，诱导型启动子是GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、或HSP18A。在各个方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在各个方面，化学诱导型启动子是XVE。在各个方面，阻抑化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在各个方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在各个方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子。在各个方面，组成型启动子是UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，发育调节型启动子是PLTP启动子。在各个方面，PLTP启动子源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，PLTP启动子源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在各个方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在各个方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在各个方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在各个方面，启动子包含生长素响应元件。在各个方面，启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在各个方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在各个方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在各个方面，启动子是NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在各个方面，启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在各个方面，启动子是去阻抑型启动子。在各个方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、
8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在各个方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在各个方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在各个方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在各个方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在各个方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在各个方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在各个方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在各个方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
[0030] 在另外的方面，本披露提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在各个方面，编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在起始转化后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在各个方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在各个方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在各个方面，位点特异性重组酶是FLP、Cre、SSV1、λInt、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在各个方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在各个方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在各个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在各个方面，诱导型启动子是GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、或HSP18A。在各个方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在各个方面，化学诱导型启动子是XVE。在各个方面，阻抑化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在各个方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在各个方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在各个方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，发育调节型启动子是PLTP启动子。在各个方面，PLTP启动子源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，PLTP启动子源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在各个方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。
在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，ODP2是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：
17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在各个方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。
在各个方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在各个方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，ODP2是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：
17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在各个方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。
在各个方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在各个方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
[0031] 在另外的方面，本披露提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；和(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在各个方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在各个方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在各个方面，位点特异性重组酶是FLP、Cre、SSV1、λInt、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在各个方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在各个方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在各个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在各个方面，诱导型启动子是GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、或HSP18A。在各个方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在各个方面，化学诱导型启动子是XVE。在各个方面，阻抑化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在各个方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在各个方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子。在各个方面，组成型启动子是UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，发育调节型启动子是PLTP启动子。在各个方面，PLTP启动子源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，PLTP启动子源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在各个方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在各个方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在各个方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在各个方面，启动子包含生长素响应元件。
在各个方面，启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在各个方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在各个方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在各个方面，启动子是NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在各个方面，启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在各个方面，启动子是去阻抑型启动子。在各个方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。
在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、
5、7、9、11、13、或15中的任一个。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在各个方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在各个方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在各个方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在各个方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、
64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在各个方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，ODP2是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在各个方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在各个方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
在各个方面，启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在各个方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在各个方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在各个方面，启动子是NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在各个方面，启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在各个方面，启动子是去阻抑型启动子。在各个方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。
在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、
5、7、9、11、13、或15中的任一个。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在各个方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在各个方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在各个方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在各个方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、
64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在各个方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，ODP2是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在各个方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在各个方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天或在转化细胞的约0至约14天内形成，并且转基因植物在转化细胞的约14天内至转化细胞的约60天内形成。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
[0032] 在另外的方面，本披露提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)在约14天至约60天内使(b)的可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在各个方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在各个方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在各个方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在各个方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在各个方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在各个方面，位点特异性重组酶是FLP、Cre、SSV1、λInt、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在各个方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在各个方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在各个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在各个方面，诱导型启动子是GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、或HSP18A。在各个方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在各个方面，化学诱导型启动子是XVE。在各个方面，阻抑化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在各个方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在各个方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子。在各个方面，组成型启动子是UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALTl)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-
2，NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，发育调节型启动子是PLTP启动子。在各个方面，PLTP启动子源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。
在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，PLTP启动子源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在各个方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在各个方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在各个方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在各个方面，启动子包含生长素响应元件。在各个方面，启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在各个方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在各个方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在各个方面，启动子是NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在各个方面，启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在各个方面，启动子是去阻抑型启动子。在各个方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在各个方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在各个方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在各个方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在各个方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。
在各个方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，ODP2是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在各个方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在各个方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天内或在转化细胞的约0至约14天内形成。
在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
2，NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，发育调节型启动子是PLTP启动子。在各个方面，PLTP启动子源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。
在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，PLTP启动子源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在各个方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在各个方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在各个方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在各个方面，启动子包含生长素响应元件。在各个方面，启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在各个方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在各个方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在各个方面，启动子是NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在各个方面，启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在各个方面，启动子是去阻抑型启动子。在各个方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在各个方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在各个方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在各个方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在各个方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。
在各个方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，ODP2是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在各个方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在各个方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，可再生植物结构在转化细胞的约0至约7天内或在转化细胞的约0至约14天内形成。
在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
[0033] 在另外的方面，本披露提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成，并且其中所述可再生植物结构在转化细胞的约0-7天或约0-14天内形成；并且(c)在约14天至约60天内使(b)的可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在各个方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在各个方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在各个方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在各个方面，发芽在存在外源性细胞分裂素的情况下进行。在各个方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在各个方面，位点特异性重组酶是FLP、Cre、SSV1、λInt、 HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在各个方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在各个方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在各个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在各个方面，诱导型启动子是GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、或HSP18A。在各个方面，诱导型启动子是化学诱导型启动子。在各个方面，化学诱导型启动子是XVE。在各个方面，阻抑化学诱导型启动子被TETR、ESR、或CR阻抑，并且去发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。在各个方面，阻抑物是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。在各个方面，阻抑物是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子。在各个方面，组成型启动子是UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2，NOS、35S的-135版本、或ZM-ADF PRO(ALT2)在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子或发育调节型启动子。在各个方面，发育调节型启动子是PLTP启动子。在各个方面，PLTP启动子源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，PLTP启动子源自双子叶植物。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1-2或55-61中的任一个。在各个方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2中的任一个。在各个方面，诱导型启动子是生长素诱导型启动子。在各个方面，生长素诱导型启动子是AXIG1。在各个方面，AXIG1启动子包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在各个方面，启动子包含生长素响应元件。在各个方面，启动子含有一个或多个DR5增强子基序。在各个方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在各个方面，启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。在各个方面，启动子是NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。在各个方面，启动子是包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列的DR5启动子。在各个方面，启动子是去阻抑型启动子。在各个方面，去阻抑型启动子是TETR、ESR、或CR。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是单子叶植物核苷酸。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列是双子叶植物核苷酸。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。在各个方面，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在各个方面，WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在各个方面，WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。在各个方面，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在各个方面，WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。在各个方面，WUS/WOX同源框多肽是WOX5多肽。
在各个方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在各个方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在各个方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，ODP2是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在各个方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在各个方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。
在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
在各个方面，WOX5多肽是WOX5A多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米或稻WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽是玉米WOX5多肽。在各个方面，WOX5多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在各个方面，WOX5多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由包含SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在各个方面，ODP2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，ODP2是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列。在各个方面，ODP2多肽由包含SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。在各个方面，BBM2多肽是单子叶植物多肽。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在各个方面，单子叶植物是玉米或稻。在各个方面，单子叶植物是玉米。在各个方面，BBM2多肽是双子叶植物多肽。在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在各个方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。在各个方面，外植体源自单子叶植物。在各个方面，单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在各个方面，外植体源自双子叶植物。
在各个方面，双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在各个方面，所述方法在不存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，所述方法在存在生根培养基的情况下进行。在各个方面，外植体是未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是1-5mm未成熟胚。在各个方面，未成熟胚是3.5-5mm未成熟胚。在各个方面，外源性细胞分裂素在转化细胞的约7天后或在转化细胞的约14天后在发芽期间使用。在各个方面，(a)的多肽的表达是瞬时的。在各个方面，提供了来自通过所述方法生产的植物的种子。
[0034] 在一方面，本披露进一步提供了试剂盒，所述试剂盒包含：(a)表达构建体，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；以及(b)用于在不存在外源性细胞分裂素的情况下获得植物可再生结构的说明书，其中没有愈伤组织形成。在各个方面，试剂盒提供了用于在约14天至约60天内获得转化的植物的说明书。在各个方面，试剂盒提供了用于从使用试剂盒转化的外植体获得植物的说明书。
[0035] 在一方面，本披露进一步提供了试剂盒，所述试剂盒包含：(a)表达构建体，所述表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；以及(b)用于在不存在外源性细胞分裂素的情况下获得植物可再生结构的说明书，其中没有愈伤组织形成。在各个方面，试剂盒提供了用于在约14天至约60天内获得转化的植物的说明书。在各个方面，试剂盒提供了用于从使用试剂盒转化的外植体获得植物的说明书。
[0036] 在一方面，本披露进一步提供了试剂盒，所述试剂盒包含：(a)表达构建体，所述表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；以及(b)用于在不存在外源性细胞分裂素的情况下获得植物可再生结构的说明书，其中没有愈伤组织形成。在各个方面，试剂盒提供了用于在约14天至约60天内获得转化的植物的说明书。在各个方面，试剂盒提供了用于从使用试剂盒转化的外植体获得植物的说明书。
[0039] 图1示出了使用所披露的方法(参见实例5)处理的未成熟胚的代表性图像。箭头表示处理后在表面上新形成的代表性胚。
[0040] 图2示出了使用所披露的方法(参见实例5)处理的未成熟胚的代表性图像。图像示出了处理后表面上的荧光胚。
[0041] 图3示出了源自使用所披露的方法(参见实例7)获得的单个原始合子未成熟胚的多个成熟体细胞胚在成熟培养基上生长13天后的代表性图像。
[0042] 图4示出了使用所披露的方法(参见实例7)从45个原始转化的合子未成熟胚获得的植物的代表性图像。
[0043] 图5示出了源自在农杆菌感染先锋优良春小麦品种HC0456D的未成熟胚后两周快速形成的体细胞胚的早期发芽的芽。
[0044] 图6示出了来自农杆菌转染后两天的未成熟合子胚的盾片表面(箭头)上的早期垂周分裂的代表性图像。
[0045] 图7示出了来自农杆菌转染后两天的转染的未成熟合子胚的盾片表面上形成的小球状体细胞胚的代表性图像。
[0046] 图8示出了来自农杆菌转染后两天的转染的未成熟合子胚的盾片表面上形成的较大球状体细胞胚的代表性图像。
[0047] 图9示出了来自农杆菌转染四天后的转染的未成熟合子胚的盾片表面上形成的转化期体细胞胚的代表性图像，显示出体细胞胚的光滑表面以及缺乏与下面的合子胚的血管连接。
[0048] 图10示出了来自农杆菌转染四天后的转染的未成熟合子胚的盾片表面上形成的多个转化期体细胞胚的代表性图像，证明紧密接近的体细胞胚源自下面的合子胚表面并且不是通过次生体细胞胚发生。
[0049] 图11示出了代表性的更高的放大倍数的图像，证明发育体细胞胚内的高有丝分裂指数，如在视野内多个细胞中观察到的中期和后期结构所指示的(如箭头所示)。
[0050] 图12示出了在用含有AXIG1 PRO：：WUS2和PLTP PRO：：BBM的T-DNA转化后10天的玉米未成熟胚。许多体细胞胚，其中一些在发育时融合在一起，并且观察到从盾片表面生长的早期发育的叶。用油红O染色20分钟并在70％异丙醇中洗涤两次后，体细胞胚发育过程中积累的脂质染成红色(黑色箭头)，而发育的叶(用白色箭头标记)和原始转化的合子盾片(用白色箭头标记)积累非常少的染色，表示这些组织中典型的较低水平的脂质沉积。
[0051] 图13示出了胚在盖玻片和载玻片之间被按压并然后用油红O染色之后的体细胞胚细胞的光学显微照片。清晰地观察到在细胞内散布着红色染色的脂滴(如黑色箭头所例示)。
[0052] 图14示出了在所有取样的植物组织中表达的代表性组成型表达的大豆EF1A基因的Illumina转录物定量。
[0053] 图15示出了胚/种子特异性基因LTP3的Illumina转录物定量，各转录物水平表示各种植物器官和不同发育阶段中的启动子活性。
[0054] 图16示出了如通过处理过的未成熟子叶在农杆菌介导的转化以引入T-DNA后产生体细胞胚的频率所测量的转化响应，该T-DNA含有如下表达盒，该表达盒中拟南芥WUS基因在以下5种启动子之一的后面：Gm-光敏色素P450启动子(P450PRO)；Gm-糖基水解酶启动子(GH PRO)；Gm-同源结构域/起始结构域蛋白质启动子(HSD PRO)；Gm-LTP3启动子(LTP3 PRO)；Gm-类异胡豆苷合酶1(Strictosidine Synthase-Like1)启动子(SSL1 PRO)；没有WUS表达的为阴性对照(NEG CON)。对于每个启动子，盒的上端和下端表示数据分布的上下四分位数，而盒内的线表示中位数。对于P450PRO，在该分析中只包括两个重复，因此没有计算中位数。
[0055] 图17A示出了光学显微照片，并且图17B示出了对应的体细胞胚的落射荧光图像，该体细胞胚被移动到成熟培养基上以完成胚发育(在用含体验Gm-LTP3 PRO：：At-WUS的T-DNA转化下面的未成熟子叶后35天在成熟培养基上所示)。箭头指向发红色荧光的体细胞子叶中的一个；比例尺代表2mm的长度。
具体实施方式
[0056] 将在下文中参考附图更全面地描述本文的披露内容，其中示出了一些但不是全部可能的方面。实际上，披露内容可能以许多不同的形式体现，并且不应被解释为局限于本文所阐述的方面；而是提供这些方面使得本披露能满足适用的法律要求。
[0057] 所披露的组合物和方法所涉及的领域中的技术人员将想到，本文所披露的许多修改和其他方面具有以下描述和相关附图中呈现的教导的益处。因此，应当理解，这些披露内容不限于所披露的特定方面，并且修改和其他方面旨在包括在所附权利要求书的范围内。尽管本文中采用了特定的术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
[0058] 还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，而不旨在加以限制。如在本说明书和权利要求书中所使用的，术语“包括”可以包括“由......组成”的方面。除非另有定义，本文所使用的全部技术和科学术语具有与所披露的组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书和下面的权利要求书中，将参考本文中所定义的许多术语。
[0059] I.用于生产转基因植物的方法和组合物
[0060] 本披露包含用于生产转基因植物的方法和组合物，所述方法和组合物包括(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。可再生植物结构在转化的约0-7天或约0-14天内产生。在一方面，发芽包含将可再生植物结构转移至包含外源性细胞分裂素和形成转基因植物的成熟培养基。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列能够刺激可再生植物结构的形成。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列能够刺激可再生植物结构的形成。
[0061] 在一方面，控制在所述方法的每个转化的细胞中的(a)的多肽的表达。控制的表达脉冲持续特定的时间段。对(a)的多肽表达的控制可以通过如下文所披露的各种方法来实现。
[0062] 应当理解，本披露的方法产生单个可再生植物结构，所述可再生植物结构由在已经进行转化的外植体上或内部的单个细胞直接形成，并且在可再生植物结构起始之前没有发生中间的源自单个细胞的细胞或组织增殖。相反，本领域已知的先前描述的转化和再生方法涉及中间的源自单个细胞的细胞或组织增殖，所述细胞或组织增殖包括被称为愈伤组织、未分化的愈伤组织、胚性愈伤组织和器官发生愈伤组织的生长模式类型。在各个方面，术语“愈伤组织”是指在不受控制的生长下未分化的细胞团块。愈伤组织可以通过在含有植物生长调节剂如生长素(例如2，4-D)或细胞分裂素的培养基(其中含有细胞分裂素的培养基称为去分化培养基)中培养植物组织的分化细胞来获得。可以添加到组织培养基以刺激胚发生的生长素的实例包括：天然存在的生长素，例如吲哚-3-乙酸(IAA)、氯吲哚-3-乙酸(CL-IAA)、2-苯乙酸(PAA)、吲哚-3-丙酸(IPA)和吲哚-3-丁酸(IBA)，还有合成生长素，例如1-萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和2，4，5-三氯苯氧基乙酸(2，4，5-T)。可以添加到组织培养基以刺激形态发生(特别是分生组织和芽发育)的细胞分裂素的实例包括：苄基氨基嘌呤(BAP)、玉米素、激动素、噻苯隆(TDZ)、间拓扑林(meta-topolin)和甲氧基拓扑林(methoxy-topolin)。添加到组织培养基中的生长素和细胞分裂素是外源性的。应当进一步理解，本领域已知的先前描述的转化和再生的方法还涉及中间的源自单个细胞的细胞或组织增殖，所述细胞或组织增殖包括：被称为分生组织增殖的生长模式类型，所述分生组织增殖涵盖从头分生组织形成(Gordon Kamm等人(2007)Development[发育]134：3539-
3548)、多芽形成(Zhong等人(1992)Planta[植物]187：483-489)和绿色组织培养(Cho等人(1998)Plant Sci[植物科学]138：229-244；Cho等人(2004)Plant Cell Rep[植物细胞报告]22：483-489)，全部都需要培养基中有细胞分裂素(例如US 8395020B2；US 8581035B2)。
3548)、多芽形成(Zhong等人(1992)Planta[植物]187：483-489)和绿色组织培养(Cho等人(1998)Plant Sci[植物科学]138：229-244；Cho等人(2004)Plant Cell Rep[植物细胞报告]22：483-489)，全部都需要培养基中有细胞分裂素(例如US 8395020B2；US 8581035B2)。
[0063] 在所披露的方法中，可以使用各种外植体，包括未成熟的胚、1-5mm合子胚、3-5mm胚、和源自以下各项的胚：成熟的穗来源的种子、叶基、来自成熟植物的叶、叶尖、未成熟的花序、雄花穗、未成熟的穗和花丝。在各个方面，用于转化的源自植物的外植体包括未成熟的胚、1-5mm合子胚、和3.5-5mm胚。在一方面，用于所披露的方法的胚可以源自成熟的穗来源的种子、叶基、来自成熟植物的叶、叶尖、未成熟的花序、雄花穗、未成熟的穗和花丝。
[0064] 可再生植物结构被定义为能够形成全功能可育植物的多细胞结构，例如但不限于体细胞胚、胚性愈伤组织、体细胞分生组织和/或器官发生愈伤组织。
[0065] 体细胞胚被定义为通过与合子胚发育相似的发育阶段进行的多细胞结构，包括球状和转化期胚的形成、胚轴和盾片的形成、以及脂质和淀粉的积累。源自合子胚的单个体细胞胚发芽以产生单个非嵌合植物，其可能原始地源自单个细胞。
[0066] 胚性愈伤组织被定义为脆弱或不脆弱的未分化的或部分未分化的细胞的混合物，其对向(subtend)从而增殖能够再生为成熟可育植物的初生和次生体细胞胚。
[0067] 体细胞分生组织被定义为与作为种子来源的胚的一部分的顶端分生组织类似的多细胞结构，其特征在于具有未分化的顶端圆顶，其侧面是叶原基并且对向为血管起始，顶端圆顶产生地上营养植物。此类体细胞分生组织可以形成单个或融合的分生组织簇。
[0068] 器官发生愈伤组织被定义为分化的生长植物结构的紧密混合物，包括但不限于：顶端分生组织、根分生组织、叶和根。
[0069] 发芽是可再生结构生长以形成小植株，所述小植株继续生长以产生植物。
[0070] 转基因植物被定义为含有转基因的成熟的可育植物。
[0071] 用于所披露的方法的外植体可以源自单子叶植物，所述单子叶植物包括但不限于：大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。可替代地，用于所披露的方法的外植体可以源自双子叶植物，所述双子叶植物包括但不限于：羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。
[0072] 在另外的方面，用于所披露的方法的外植体可以源自禾本科(Poaceae)家族成员的植物。外植体可以从其来源的合适的植物的非限制性实例包括谷类作物，包括但不限于：大麦、玉米(玉米)、燕麦、稻、黑麦、高粱、小麦、粟、黑小麦；叶和茎作物，包括但不限于：竹子、滨草、草地早熟禾、芦苇、黑麦草、甘蔗；草坪植物、观赏草、以及其他草(例如柳枝稷和草坪草)。
[0073] 在另外的方面，所披露的方法中使用的外植体可以源自任何植物，包括高等植物，例如被子植物门和裸子植物门的种类。双子叶植物纲和单子叶植物纲的亚纲的植物是合适的。合适的物种可以来自以下科：爵床科、葱科、六出花科、石蒜科、夹竹桃科、槟榔科、菊科、小檗科、胭脂树科、十字花科、凤梨科、大麻科、石竹科、三尖杉科、藜科、秋水仙科、葫芦科、薯蓣科、麻黄科、古柯科、大戟科、蝶形花科、唇形科、亚麻科、石松科、锦葵科、黑药花科、芭蕉科、桃金娘科、蓝果树科、罂粟科、松科、车前草科、禾本科、蔷薇科、茜草科、杨柳科、无患子科、茄科、紫杉科、山茶科和葡萄科。
[0074] 在所披露的方法中使用的外植体可以从其来源的合适的物种包括以下属的成员：秋葵属、冷杉属、槭属、翦股颖属、葱属、六出花属、凤梨属、穿心莲属、须芒草属、艾属、芦竹属、颠茄属、小檗属、菾属(Beta)、红木属、芸苔属、金盏花属、山茶属、喜树属、大麻属、辣椒属、红花属、长春花属、三尖杉属、菊属、金鸡钠属、西瓜属、咖啡属、秋水仙属、紫苏属(Coleus)、黄瓜属、南瓜属、狗牙根属、曼陀罗属、石竹属、毛地黄属、薯蓣属、油棕属、麻黄属、蔗茅属、古柯属、桉属、羊茅属、草莓属、雪花莲属、大豆属、棉属、向日葵属、橡胶树属、大麦属、莨菪属、麻风树属、莴苣属、亚麻属、黑麦草属、羽扇豆属、番茄属、石松属、木薯属、苜蓿属、薄荷属、芒属、芭蕉属、烟草属、稻属、黍属、罂粟属、银胶菊属、狼尾草属、矮牵牛属、虉草属(Phalari)、梯牧草属、松属、早熟禾属、一品红属、杨属、萝芙木属、蓖麻属、蔷薇属(Rosa)、甘蔗属、柳属、血根草属、东茛菪属、黑麦属、茄属、高粱属、大米草属、菠菜属、艾菊属、红豆杉属、可可属、小黑麦属、小麦属、北美穗草属、藜芦属、长春花属、葡萄属、和玉米属。
[0075] 在另外的方面，所披露的方法中使用的外植体可以源自对农业、园艺、用于生产液体燃料分子和其他化学品的生物质、和/或林业重要或有意义的植物。非限制性实例包括：例如，柳枝稷(Panicum virgatum，switchgrass)、双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthus giganteus)(芒)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)(能源甘蔗)、大叶钻天杨(Populus balsamifera)(白杨)、玉蜀黍(Zea mays)(玉米)、大豆(Glycine max，soybean)、甘蓝型油菜(Brassica napus)(低芥酸菜籽)、小麦(Triticum aestivum，wheat)、陆地棉(Gossypium hirsutum)(棉花)、稻(Oryza sativa，rice)、向日葵(Helianthus annuus，sunflower)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、甜菜(Beta vulgaris，sugar beets)、御谷(Pennisetum glaucum)(珍珠稷)、黍属物种(Panicum spp.)、高粱属物种(Sorghum spp.)、芒属物种(Miscanthus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、斑茅属物种(Erianthus spp.)、杨属物种(Populus spp.)、须芒草(Andropogon gerardii)(大须芒草)、象草(Pennisetum purpureum，elephant grass)、虉草(Phalaris arundinacea，reed canarygrass)、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草)、高羊茅(Festuca arundinacea)(牛尾草)、草原索草(Spartina pectinata，prairie cord-grass)、芦竹(Arundo donax，giant reed)、黑麦(Secale cereale，rye)、柳属物种(Salix spp.)(柳树)、桉属物种(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦属物种(Triticosecale spp.)(小麦属植物-小麦X黑麦)、竹子、红花(Carthamus tinctorius，safflower)、麻风树(Jjatropha curcas，jatropha)、蓖麻(Ricinus communis，castor)、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈树)、亚麻(Linum usitatissimum，flax)、芥菜(Brassica juncea)、木薯(Manihot esculenta，cassava)、番茄(Lycopersicon esculentum，tomato)、莴苣(Lactuca sativa，lettuce)、香蕉(Musa paradisiaca，banana)、马铃薯(Solanum tuberosum，potato)、芸苔(Brassica oleracea)(西兰花、花椰菜、抱子甘蓝)、野茶树(Camellia sinensis)(茶树)、草莓(Fragaria ananassa，strawberry)、可可树(Theobroma cacao，cocoa)、咖啡树(Coffea arabica，coffee)、葡萄(Vitis vinifera，grape)、菠萝(Ananas comosus)(凤梨)、辣椒(Capsicum annum)(辣椒和甜辣椒)、洋葱(Allium cepa，onion))、甜香瓜(Cucumis melo)(甜瓜)、黄瓜(Cucumis sativus，cucumber)、笋瓜(Cucurbita maxima，squash)、南瓜(Cucurbita moschata，squash)、菠菜(Spinacea oleracea，spinach)、西瓜(Citrullus lanatus，watermelon)、黄秋葵(Abelmoschus esculentus，okra)、茄子(Solanum melongena，eggplant)、罂粟(Papaver somniferum，opium poppy)、东方罂粟(Papaver orientale)、欧洲紫杉(Taxus baccata)、短叶红豆杉(Taxus brevifolia)、香青蒿(Artemisia annua)、大麻(Cannabis sativa)、喜树(Camptotheca acuminate)、长春花(Catharanthus roseus)、长春花(Vinca rosea、金鸡纳树(Cinchona officinalis)、秋水仙(Colchicum autumnale)、加州藜芦(Veratrum californica)、毛花洋地黄(Digitalis lanata)、毛地黄(Digitalis purpurea)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、穿心莲(Andrographis paniculata)、颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stomonium)、小檗属物种(Berberis spp.)、三尖杉属物种(Cephalotaxus spp.)、草麻黄(Ephedra sinica)、麻黄属物种(Ephedra spp.)、古柯(Erythroxylum coca)、雪花莲(Galanthus wornorii)、东莨菪属物种(Scopolia spp.)、蛇足石松(Lycopodium serratum)(＝蛇足石杉(Huperzia serrata))、石松属物种(Lycopodium spp.)、蛇根木(Rauwolfia serpentina)、萝芙木属物种(Rauwolfia spp.)、血根草(Sanguinaria canadensis)、莨菪属物种(Hyoscyamus spp.)、金盏花(Calendula officinalis)、小白菊(Chrysanthemum parthenium)、毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)、小艾菊(Tanacetum parthenium)、银胶菊(Parthenium argentatum，guayule)、橡胶树属物种(Hevea spp.)(橡胶树)、绿薄荷(Mentha spicata)(薄荷)、洋薄荷(Mentha piperita)(薄荷)、红木(Bixa orellana)、六出花属物种(Alstroemeria spp.)、蔷薇属物种(Rosa spp.)(玫瑰)、康乃馨(Dianthus caryophyllus，carnation)、矮牵牛属物种(Petunia spp.)(矮牵牛花)、一品红(Poinsettia pulcherrima，poinsettia)、烟草(Nicotiana tabacum，tobacco)、羽扇豆(Lupmus albus，lupin)、北美穗草(Uniola paniculata)(燕麦)、翦股颖(bentgrass)(剪股颖属物种(Agrostis spp.))、美洲山杨(Populus tremuloides)(山杨)、松属物种(Pinus spp.)(松树)、冷杉属物种(Abies spp.)(冷杉)、槭属物种(Acer spp.)(枫树)、大麦(Hordeum vulgare，barley)、草地早熟禾(Poapratensis)(早熟禾)、黑麦草属物种(Lolium spp.)(黑麦草)、梯牧草(Phleum pratense，timothy)、和针叶树。感兴趣的是为能源生产而种植的植物，即所谓的能源作物，例如基于纤维素的能源作物，如柳枝稷(Panicum virgatum，switchgrass)、双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthus giganteus)(芒)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)(能源甘蔗)、大叶钻天杨(Populus balsamifera)(白杨)、须芒草(Andropogon gerardii)(大须芒草)、象草(Pennisetum purpureum，elephant grass)、虉草(Phalaris arundinacea，reed canarygrass)、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草)、高羊茅(Festuca arundinacea)(牛尾草)、草原索草(Spartina pectinata，prairie cord-grass)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、芦竹(Arundo donax，giant reed)、黑麦(Secale cereale，rye)、柳属物种(Salix spp.)(柳树)、桉属物种(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦属物种(Triticosecale spp.)(小麦属植物-小麦X黑麦)、和竹子；以及基于淀粉的能源作物，如玉蜀黍(Zea mays)(玉米)和木薯(Manihot esculenta，cassava)；以及基于蔗糖的能源作物，如甘蔗属物种(甘蔗)和甜菜(Beta vulgaris，sugar beets)；以及生产生物柴油的能源作物，如大豆(Glycine max，soybean)、甘蓝型油菜(Brassica napus)(低芥酸菜籽)、向日葵(Helianthus annuus，sunflower)、红花(Carthamus tinctorius，safflower)、麻风树(Jatropha curcas，jatropha)、蓖麻(Ricinus communis，castor)、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈树)、亚麻(Linum usitatissimum，flax)和芥菜(Brassica juncea)。
[0076] 如本文所使用，“生物质可再生能源植物”意指具有或生产包括储存的太阳能的、可以被转换成电能、液体燃料和其他有用的化学品的材料(原始的或加工的)。一般来说，此类植物包括专用能源作物以及农业和木本植物。生物质可再生能源植物的实例包括：柳枝稷(Panicum virgatum，switchgrass)、双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthus giganteus)(芒)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)(能源甘蔗)、大叶钻天杨(Populus balsamifera)(白杨)、须芒草(Andropogon gerardii)(大须芒草)、象草(Pennisetum purpureum，elephant grass)、虉草(Phalaris arundinacea，reed canarygrass)、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草)、高羊茅(Festuca arundinacea)(牛尾草)、草原索草(Spartina pectinata，prairie cord-grass)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、芦竹(Arundo donax，giant reed)、黑麦(Secale cereale，rye)、柳属物种(Salix spp.)(柳树)、桉属物种(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦属物种(Triticosecale spp.)(小麦属植物-小麦X黑麦)、竹子、玉蜀黍(Zea mays)(玉米)、木薯(Manihot esculenta，cassava)、甘蔗属物种(甘蔗)、甜菜(Beta vulgaris，sugar beets)、大豆(Glycine max，soybean)、甘蓝型油菜(Brassica napus)(低芥酸菜籽)、向日葵(Helianthus annuus，sunflower)、红花(Carthamus tinctorius，safflower)、麻风树(Jatropha curcas，jatropha)、蓖麻(Ricinus communis，castor)、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈树)、亚麻(Linum usitatissimum，flax)和芥菜(Brassica juncea)。
[0077] 在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于14天。
[0078] 在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在各个方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于14天。
[0079] 在一方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在各个方面，编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在起始转化后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于14天。
[0080] 在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或这两种核苷酸序列可以被靶向用于通过位点特异性重组酶的切除。因此，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或这两种核苷酸序列的表达可以通过在转化后所希望的时间切除来控制。应当理解，当使用位点特异性重组酶来控制编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或这两种核苷酸序列在表达构建体中的表达时，所述表达构建体包含位于待切除的多核苷酸序列侧翼的适当的位点特异性切除位点，例如Cre lox位点(如果使用Cre重组酶)。位点特异性重组酶不必共位于包含编码WUS WOX同源框多肽的核苷酸序列；编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或这两种核苷酸序列的表达构建体上。然而，在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。
[0081] 用于控制编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或这两种多核苷酸序列的表达的位点特异性重组酶可以选自各种合适的位点特异性重组酶。例如，在各个方面，位点特异性重组酶是FLP、Cre、SSV1、λInt、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。位点特异性重组酶可以是非稳定的融合多肽。非稳定的融合多肽可以是TETR(G17A)～CRE或ESR(G17A)～CRE。
[0082] 在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。合适的发育调节型启动子包括GLB1、OLE、和脂质转移蛋白质2(LTP2)(Kalla等人，1994.Plant J.[植物杂志]6：849-860和US 5525716)。合适的诱导型启动子包括环境诱导型热休克启动子，包括HSP17.7、HSP26、或HSP18A。可替代地，与位点特异性重组酶可操作地连接的诱导型启动子可以是化学诱导型启动子，例如XVE启动子。
[0083] 在一方面，与位点特异性重组酶可操作地连接的化学诱导型启动子是XVE。化学诱导型启动子可以被四环素阻抑物(TETR)、胺苯磺隆阻抑物(ESR)、或氯磺隆阻抑物(CR)阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。阻抑物可以是TETR，并且四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素(Gatz，C.、Frohberg，C.和Wendenburg，艮(1992)Stringent repression and homogeneous de-repression by tetracycline of a modified CaMV 35S promoter in intact transgenic tobacco plants[完整转基因烟草植物中四环素对经修饰的CaMV 35S启动子的严格阻抑和同质去阻抑]，Plant J.[植物杂志]2，397-404)。
[0084] 可替代地，阻抑物可以是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯，烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆(US 20110287936，以其全文通过引用结合在此)。
[0085] 在一方面，当表达构建体包含位点特异性重组酶切除位点时，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或这两种核苷酸序列可以可操作地连接至生长素诱导型启动子、发育调节型启动子、或组成型启动子。在上下文中有用的示例性组成型启动子包括：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S PRO的-135版本(或35S启动子的更长版本)、和ZM-ADF PRO(ALT2)。在上下文中有用的示例性生长素诱导型启动子包括AXIG1和DR5。在上下文中有用的示例性发育调节型启动子包括PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、和LEA-D34。
[0086] 表达编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或这两种核苷酸序列的适当的持续时间可以通过使用发育调节型启动子(例如诸如磷脂转移蛋白(PLTP)等启动子)实现。PLTP启动子包括PLTP、PLTP1、PLTP2、和PLTP3，如下面进一步描述的。在特定的方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1-2、和55-61中的任一个。所使用的PLTP启动子可以是玉米或双色高粱PLTP启动子，如SEQ ID NO：1或2的启动子(美国临时申请号62/271230，以其全文通过引用结合在此)。可以与本披露的方法一起使用的其他适当的发育调节型启动子包括：源自编码以下各项的基因的启动子：果糖-1，6-二磷酸酯酶蛋白质、NAD(P)-结合的罗斯曼折叠(Rossmann-Fold)蛋白质、脂肪细胞质膜相关蛋白样蛋白质、里斯克(Rieske)[2Fe-2S]铁硫结构域蛋白质、叶绿体呼吸减少6蛋白质(chlororespiratory reduction 6protein)、D-甘油酸酯3-激酶、叶绿体样蛋白质、叶绿素a-b结合蛋白7、叶绿体样蛋白质、紫外线-B-阻抑蛋白质、Soul血红素结合家族蛋白质、光系统I反应中心亚基psi-N蛋白质、和短链脱氢酶/还原酶蛋白质。启动子可以源自编码单子叶植物(例如玉米、稻、或高粱)中的前述蛋白质的基因。用于本披露的方法的合适的发育调节型启动子包括SEQ ID NO：1-2、28-40、55-61、81-83和86-88和106中示出的那些。
[0087] 在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或这两种多核苷酸序列可以可操作地连接至生长素诱导型启动子。在各个方面，生长素诱导型启动子可以是AXIG1。具体地，生长素诱导型启动子可以是SEQ ID NO：39。启动子还可以包含一个或多个生长素响应元件。在另外的方面，启动子可以包含一个或多个DR5基序。具体地，启动子可以是SEQ ID NO：40。
[0088] 在一方面，启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。在另外的方面，经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子包含启动子中的一个或多个操纵子序列，所述操纵子序列位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。例如，这种类型的合适的启动子包括但不限于：NOS、IN2-2、35S的-135版本、CC-UBIl-PRO和ZM-ADF4-PRO启动子。
[0089] 在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或这两种核苷酸序列可以可操作地连接至发育调节型启动子。合适的发育调节型启动子包括：源自以下各项的植物基因的启动子：果糖-1，6-二磷酸酯酶、NAD(P)-结合的罗斯曼折叠蛋白质、脂肪细胞质膜相关蛋白样蛋白质、里斯克(Rieske)[2Fe-2S]铁硫结构域蛋白质、叶绿体呼吸减少6蛋白质、D-甘油酸酯3-激酶、叶绿体样蛋白质、叶绿素a-b结合蛋白7、叶绿体样蛋白质、紫外线-B-阻抑蛋白质、Soul血红素结合家族蛋白质、光系统I反应中心亚基psi-N蛋白质、和短链脱氢酶/还原酶。在各个方面，这些启动子源自单子叶植物(例如玉米、稻等)中对应的基因。可替代地，这些启动子可以源自双子叶植物中对应的基因。在特定的方面，发育调节型启动子包含SEQ ID NO：1-2、28-40、55-61、81-
83和86-88和106中的任一个。
83和86-88和106中的任一个。
[0090] 在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或这两种核苷酸序列可以可操作地连接至去阻抑型启动子。有用的去阻抑型启动子包括：35S：Top3、NOS：：Top、NOS：Top2、UBI：Top3、BSV：Top3、AXIG1：Top、IN2-2：Top和DR5：Top(其中Top是TETR、ESR或CR结合以阻抑表达的18碱基操纵子序列的缩写)。
[0091] 在一方面，本披露提供了允许阳性生长选择的转化方法。本领域技术人员可以理解，常规植物转化方法主要依赖阴性选择方案，其中使用抗生素或除草剂(阴性选择剂)来抑制或杀死未转化的细胞或组织，并且由于抗性基因的表达，转基因细胞或组织继续生长。相反，本披露的方法可以在不应用阴性选择剂的情况下使用。因此，尽管野生型细胞可以无阻碍地生长，但通过比较，包含所披露的WUS2和ODP2表达盒的细胞由于它们相对于周围野生型组织的生长速度加快可以被容易地鉴定。除了简单观察更快的生长之外，本披露的方法提供了含有WUS2和ODP2表达盒的转基因细胞，所述细胞相对于未转化的细胞表现出更快速的形态发生，表现为可再生的植物结构形成。因此，可以使用此类差别的生长和形态发生发育来容易地区别转基因可再生植物结构与周围的非转化组织，这一过程在本文中被称为“阳性生长选择”。
[0092] 在各个方面，本披露的方法可以在不使用生根培养基的情况下进行。可替代地，在一方面，本披露的方法可以在使用生根培养基的情况下进行。如本文所使用，“生根培养基”或“选择性生根培养基”是指包含基础性盐、碳源、维生素、矿物质和植物激素的组织培养基。在一方面，植物激素可以按不同的浓度或比例提供，其中根组织从置于选择性生根培养基上的细胞发育并增殖。在一方面，选择性生根培养基含有草铵膦、灭草烟、胺苯磺隆、甘露糖或其他选择剂。在一方面，选择性生根培养基含有生长素和细胞分裂素、含有单独的细胞分裂素或不含有植物激素。
[0093] 在一方面，本披露的方法在不使用细胞分裂素的情况下在可再生植物结构形成期间和/或发芽期间进行。在另外的方面，本披露的方法可以在不使用细胞分裂素的情况下在转化与起始转化后至少约7天之间进行。在另外的方面，本披露的方法可以在不使用细胞分裂素的情况下在转化与起始转化后至少约14天之间进行。
[0094] 在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或每种核苷酸序列可操作地连接至PLTP启动子。PLTP启动子包括PLTP、PLTP1、PLTP2、和PLTP3。PLTP启动子可以源自单子叶植物，包括但不限于：玉米、大麦、燕麦、黑麦、甘蔗、粟、高粱、小麦、狗尾草属物种、或稻。在另外的方面，PLTP启动子是玉米、稻、或狗尾草属物种PLTP启动子。在特定的方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1-2和55-61。在特定的方面，PLTP启动子是玉米或稻PLTP启动子。在另外的方面，PLTP启动子是玉米PLTP启动子。在另外的方面，PLTP启动子是稻PLTP启动子。在一方面，PLTP启动子包含SEQ ID NO：1或2。PLTP启动子还可以源自双子叶植物，包括但不限于：羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在上下文中有用的其他发育调节型启动子包括LGL、LEA-
14A、和LEA-D34。在特定的方面，本方法中有用的其他启动子包括SEQ ID NO：28-40、81-83、
86-88、和106中的任一个。
14A、和LEA-D34。在特定的方面，本方法中有用的其他启动子包括SEQ ID NO：28-40、81-83、
86-88、和106中的任一个。
[0095] 在一方面，本披露包括用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)其组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物；其中所述WUS/WOX同源框多肽包含SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、或16中的任一个的氨基酸序列；或其中所述WUS/WOX同源框多肽由SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、或15中的任一个的核苷酸序列编码；并且其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQ ID NO：18、20、63、65、或67中的任一个的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：
17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。
17、19、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。
[0096] 可再生植物结构在转化的约0-7天或约0-14天内产生。在一方面，发芽包含将可再生植物结构转移至包含外源性细胞分裂素和形成转基因植物的成熟培养基。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列能够刺激可再生植物结构的形成。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列能够刺激可再生植物结构的形成。
[0097] 在一方面，本披露包括用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS2多肽的核苷酸序列；(ii)编码ODP2多肽的核苷酸序列；或(iii)其组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物；其中所述WUS2多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；或其中所述WUS2多肽由SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码；并且其中所述ODP2多肽包含SEQ ID NO：18、63、65、或67的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68中的任一个的核苷酸序列编码。
[0098] 在一方面，本披露包括用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。
[0099] 在一方面，本披露包括用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的一个或多个细胞，所述表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。
[0100] 在一方面，本披露包括用于生产转化的植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化一个或多个外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；和(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。
[0101] 在一方面，本披露包括用于生产转化的植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；
(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)在约14天至约60天内使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。
(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)在约14天至约60天内使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。
[0102] 术语“植物”是指整株植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子和它们的后代。植物细胞包括但不限于：来自种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。
[0103] 植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于以下：根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和各种形式的细胞和培养物(例如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以是在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。
[0104] 本披露还包括通过本文所披露的任何方法或组合物获得的植物。
[0105] 在一方面，本披露包括用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；
(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)在约14天至约60天内使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。
(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)在约14天至约60天内使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。
[0106] 本披露还包括来自通过本文所披露的任何方法或组合物获得的植物的种子。
[0107] 在一方面，本披露包括试剂盒，所述试剂盒包含：(a)表达构建体，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；以及(b)用于在不存在外源性细胞分裂素的情况下，获得可再生植物结构的说明书，其中没有愈伤组织形成；以及(c)用于使可再生植物结构发芽以形成转基因植物的说明书。
[0108] 在一方面，本披露包括试剂盒，所述试剂盒包含：(a)表达构建体，所述表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；以及(b)用于在不存在外源性细胞分裂素的情况下，获得可再生植物结构的说明书，其中没有愈伤组织形成；以及(c)用于使可再生植物结构发芽以形成转基因植物的说明书。
[0109] 在一方面，本披露包括试剂盒，所述试剂盒包含：(a)表达构建体，所述表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；以及(b)用于在不存在外源性细胞分裂素的情况下，获得可再生植物结构的说明书，其中没有愈伤组织形成；以及(c)用于使可再生植物结构发芽以形成转基因植物的说明书。
[0110] 所披露的试剂盒可以进一步包含用于在转化外植体后约14天至约60天内使可再生植物结构发芽以形成转基因植物的说明书。
[0111] II.AP2-DNA结合结构域蛋白质(ODP2/BBM)
[0112] 本披露的方法包括胚珠发育蛋白质2(ODP2)多肽、及相关的多肽(例如，Babyboom(BBM)蛋白家族蛋白质)的多核苷酸序列和的氨基酸序列。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2、或BMN3多肽。本披露的ODP2多肽含有两个预测的APETALA2(AP2)结构域，并且是AP2蛋白家族的成员(PFAM登录号PF00847)。玉米ODP2多肽的AP2结构域位于SEQ ID NO：2的从约氨基酸S273至N343和从约S375至R437)。已经表明推定的转录因子的AP2家族调节广泛范围的发育过程，并且家族成员的特征在于存在AP2DNA结合结构域。预测该保守核心形成结合DNA的两亲性α螺旋。AP2结构域首先在APETALA2中被鉴定，该APETALA2是调节分生组织身份、花器官规格、种皮发育和花同源异型基因表达的拟南芥蛋白。现在已经发现AP2结构域存在于各种蛋白质中。
[0113] 本披露的ODP2多肽与AP2家族内的几种多肽享有同源性，例如，参见US 8420893(以其全文通过引用结合在此)的图1提供了玉米和稻ODP2多肽与具有两个AP2结构域的八种其他蛋白质的比对。图1中还提供了出现在US 8420893的比对中的所有蛋白质的共有序列。
[0114] 包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽可以源自单子叶植物。在各个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽源自大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽源自玉米、大麦、燕麦、黑麦、甘蔗、粟、高粱、小麦、狗尾草属物种、或稻。在另外的方面，单子叶植物是玉米、高粱、稻、或狗尾草属物种。在仍另外的方面，单子叶植物是玉米或稻。在另外的方面，单子叶植物是玉米。在另外的方面，单子叶植物是稻。
[0115] 包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽可以源自双子叶植物。包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽可以源自羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。
[0116] 包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽可以源自禾本科家族成员的植物。两个AP2-DNA结合结构域可以从其来源的合适的植物的非限制性实例包括谷类作物，包括但不限于：大麦、玉米(玉米)、燕麦、稻、黑麦、高粱、小麦、粟、黑小麦；叶和茎作物，包括但不限于：竹子、滨草、草地早熟禾、芦苇、黑麦草、甘蔗；草坪植物、观赏草、以及其他草(例如柳枝稷和草坪草)。
[0117] 在另外的方面，在所披露的方法中使用的包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽可以源自任何植物，包括高等植物，例如被子植物门和裸子植物门的种类。双子叶植物纲和单子叶植物纲的亚纲的植物是合适的。合适的物种可以来自以下科：爵床科、葱科、六出花科、石蒜科、夹竹桃科、槟榔科、菊科、小檗科、胭脂树科、十字花科、凤梨科、大麻科、石竹科、三尖杉科、藜科、秋水仙科、葫芦科、薯蓣科、麻黄科、古柯科、大戟科、蝶形花科、唇形科、亚麻科、石松科、锦葵科、黑药花科、芭蕉科、桃金娘科、蓝果树科、罂粟科、松科、车前草科、禾本科、蔷薇科、茜草科、杨柳科、无患子科、茄科、紫杉科、山茶科和葡萄科。
[0118] 包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽可以从其来源的合适的物种包括以下属的成员：秋葵属、冷杉属、槭属、翦股颖属、葱属、六出花属、凤梨属、穿心莲属、须芒草属、艾属、芦竹属、颠茄属、小檗属、菾属(Beta)、红木属、芸苔属、金盏花属、山茶属、喜树属、大麻属、辣椒属、红花属、长春花属、三尖杉属、菊属、金鸡钠属、西瓜属、咖啡属、秋水仙属、紫苏属(Coleus)、黄瓜属、南瓜属、狗牙根属、曼陀罗属、石竹属、毛地黄属、薯蓣属、油棕属、麻黄属、蔗茅属、古柯属、桉属、羊茅属、草莓属、雪花莲属、大豆属、棉属、向日葵属、橡胶树属、大麦属、莨菪属、麻风树属、莴苣属、亚麻属、黑麦草属、羽扇豆属、番茄属、石松属、木薯属、苜蓿属、薄荷属、芒属、芭蕉属、烟草属、稻属、黍属、罂粟属、银胶菊属、狼尾草属、矮牵牛属、虉草属(Phalari)、梯牧草属、松属、早熟禾属、一品红属、杨属、萝芙木属、蓖麻属、蔷薇属(Rosa)、甘蔗属、柳属、血根草属、东茛菪属、黑麦属、茄属、高粱属、大米草属、菠菜属、艾菊属、红豆杉属、可可属、小黑麦属、小麦属、北美穗草属、藜芦属、长春花属、葡萄属、和玉米属。
[0119] 在另外的方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽可以源自对农业、园艺、用于生产液体燃料分子和其他化学品的生物质、和/或林业重要或有意义的植物。非限制性实例包括：例如，柳枝稷(Panicum virgatum，switchgrass)、双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthus giganteus)(芒)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)(能源甘蔗)、大叶钻天杨(Populus balsamifera)(白杨)、玉蜀黍(Zea mays)(玉米)、大豆(Glycine max，soybean)、甘蓝型油菜(Brassica napus)(低芥酸菜籽)、小麦(Triticum aestivum，wheat)、陆地棉(Gossypium hirsutum)(棉花)、稻(Oryza sativa，rice)、向日葵(Helianthus annuus，sunflower)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、甜菜(Beta vulgaris，sugar beets)、御谷(Pennisetumglaucum)(珍珠稷)、黍属物种(Panicum spp.)、高粱属物种(Sorghum spp.)、芒属物种(Miscanthus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、斑茅属物种(Erianthus spp.)、杨属物种(Populus spp.)、须芒草(Andropogon gerardii)(大须芒草)、象草(Pennisetum purpureum，elephant grass)、虉草(Phalaris arundinacea，reed canarygrass)、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草)、高羊茅(Festuca arundinacea)(牛尾草)、草原索草(Spartina pectinata，prairie cord-grass)、芦竹(Arundo donax，giant reed)、黑麦(Secale cereale，rye)、柳属物种(Salix spp.)(柳树)、桉属物种(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦属物种(Triticosecale spp.)(小麦属植物-小麦X黑麦)、竹子、红花(Carthamus tinctorius，safflower)、麻风树(Jjatropha curcas，jatropha)、蓖麻(Ricinus communis，castor)、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈树)、亚麻(Linum usitatissimum，flax)、芥菜(Brassica juncea)、木薯(Manihot esculenta，cassava)、番茄(Lycopersicon esculentum，tomato)、莴苣(Lactuca sativa，lettuce)、香蕉(Musa paradisiaca，banana)、马铃薯(Solanum tuberosum，potato)、芸苔(Brassica oleracea)(西兰花、花椰菜、抱子甘蓝)、野茶树(Camellia sinensis)(茶树)、草莓(Fragaria ananassa，strawberry)、可可树(Theobroma cacao，cocoa)、咖啡树(Coffa arabica，coffee)、葡萄(Vitis vinifera，grape)、菠萝(Ananas comosus)(凤梨)、辣椒(Capsicum annum)(辣椒和甜辣椒)、洋葱(Allium cepa，onion))、甜香瓜(Cucumis melo)(甜瓜)、黄瓜(Cucumis sativus，cucumber)、笋瓜(Cucurbita maxima，squash)、南瓜(Cucurbita moschata，squash)、菠菜(Spinacea oleracea，spinach)、西瓜(Citrullus lanatus，watermelon)、黄秋葵(Abelmoschus esculentus，okra)、茄子(Solanum melongena，eggplant)、罂粟(Papaver somniferum，opium poppy)、东方罂粟(Papaver orientale)、欧洲紫杉(Taxus baccata)、短叶红豆杉(Taxus brevifolia)、香青蒿(Artemisia annua)、大麻(Cannabis sativa)、喜树(Camptotheca acuminate)、长春花(Catharanthus roseus)、长春花(Vinca rosea、金鸡纳树(Cinchona officinalis)、秋水仙(Colchicum autumnale)、加州藜芦(Veratrum californica)、毛花洋地黄(Digitalis lanata)、毛地黄(Digitalis purpurea)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、穿心莲(Andrographis paniculata)、颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stomonium)、小檗属物种(Berberis spp.)、三尖杉属物种(Cephalotaxus spp.)、草麻黄(Ephedra sinica)、麻黄属物种(Ephedra spp.)、古柯(Erythroxylum coca)、雪花莲(Galanthus wornorii)、东莨菪属物种(Scopolia spp.)、蛇足石松(Lycopodium serratum)(＝蛇足石杉(Huperzia serrata))、石松属物种(Lycopodium spp.)、蛇根木(Rauwolfia serpentina)、萝芙木属物种(Rauwolfia spp.)、血根草(Sanguinaria canadensis)、莨菪属物种(Hyoscyamus spp.)、金盏花(Calendula officinalis)、小白菊(Chrysanthemum parthenium)、毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)、小艾菊(Tanacetum parthenium)、银胶菊(Parthenium argentatum，guayule)、橡胶树属物种(Hevea spp.)(橡胶树)、绿薄荷(Mentha spicata)(薄荷)、洋薄荷(Mentha piperita)(薄荷)、红木(Bixa orellana)、六出花属物种(Alstroemeria spp.)、蔷薇属物种(Rosa spp.)(玫瑰)、康乃馨(Dianthus caryophyllus，camation)、矮牵牛属物种(Petunia spp.)(矮牵牛花)、一品红(Poinsettia pulcherrima，poinsettia)、烟草(Nicotiana tabacum，tobacco)、羽扇豆(Lupinus albus，lupin)、北美穗草(Uniola paniculata)(燕麦)、翦股颖(bentgrass)(剪股颖属物种(Agrostis spp.))、美洲山杨(Populus tremuloides)(山杨)、松属物种(Pinus spp.)(松树)、冷杉属物种(Abies spp.)(冷杉)、槭属物种(Acer spp.)(枫树)、大麦(Hordeum vulgare，barley)、草地早熟禾(Poapratensis)(早熟禾)、黑麦草属物种(Lolium spp.)(黑麦草)、梯牧草(Phleum pratense，timothy)、和针叶树。感兴趣的是为能源生产而种植的植物，即所谓的能源作物，例如基于纤维素的能源作物，如柳枝稷(Panicum virgatum，switchgrass)、双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthus giganteus)(芒)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)(能源甘蔗)、大叶钻天杨(Populus balsamifera)(白杨)、须芒草(Andropogon gerardii)(大须芒草)、象草(Pennisetum purpureum，elephant grass)、虉草(Phalaris arundinacea，reed canarygrass)、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草)、高羊茅(Festuca arundinacea)(牛尾草)、草原索草(Spartina pectinata，prairie cord-grass)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、芦竹(Arundo donax，giant reed)、黑麦(Secale cereale，rye)、柳属物种(Salix spp.)(柳树)、桉属物种(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦属物种(Triticosecale spp.)(小麦属植物-小麦X黑麦)、和竹子；以及基于淀粉的能源作物，如玉蜀黍(Zea mays)(玉米)和木薯(Manihot esculenta，cassava)；以及基于蔗糖的能源作物，如甘蔗属物种(甘蔗)和甜菜(Beta vulgaris，sugar beets)；以及生产生物柴油的能源作物，如大豆(Glycine max，soybean)、甘蓝型油菜(Brassica napus)(低芥酸菜籽)、向日葵(Helianthus annuus，sunflower)、红花(Carthamus tinctorius，safflower)、麻风树(Jatropha curcas，jatropha)、蓖麻(Ricinus communis，castor)、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈树)、亚麻(Linum usitatissimum，flax)和芥菜(Brassica juncea)。
[0120] 包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽可以源自生物质可再生能源植物。生物质可再生能源植物的实例包括在上文所述的那些。
[0121] 具体地，本披露提供了分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO：18、20、63、65和67中示出的氨基酸序列的核苷酸序列。进一步提供了由本文所述的核酸分子(SEQ ID NO：17、19、21、62、64、66、和68)编码的氨基酸序列的多肽、及其片段和变体。
[0122] 在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在另外的方面，ODP2多肽源自单子叶植物多肽。在特定的方面，ODP2多肽源自玉米、大麦、燕麦、黑麦、甘蔗、粟、高粱、小麦、狗尾草属物种、或稻。在一方面，ODP2多肽源自玉米、稻、或狗尾草属物种。在一方面，ODP2多肽源自玉米或稻。在特定的方面，ODP2多肽源自玉米。在特定的方面，ODP2多肽源自稻。在另外的方面，ODP2多肽源自双子叶植物多肽。在特定的方面，ODP2多肽源自羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。通过所披露的方法和组合物的表达构建体表达的ODP2多肽可以是包含SEQ ID NO：18、63、65、或67的多肽。ODP2多肽可以由SEQ ID NO：17、21、62、64、66、或68的多核苷酸编码。
[0123] 在一方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。BBM2多肽可以是单子叶植物多肽，包括但不限于：诸如玉米、大麦、燕麦、黑麦、甘蔗、粟、高粱、小麦、狗尾草属物种、或稻等单子叶植物。在特定的方面，单子叶植物是玉米、甘蔗、稻、或狗尾草属物种。在进一步的特定的方面，单子叶植物是玉米或稻。在仍进一步的特定的方面，单子叶植物是玉米。可替代地，BBM2多肽可以是双子叶植物多肽，包括但不限于：其中所述双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、低芥酸菜籽、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥、或棉花。在一个方面，BBM2多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在另外的方面，BBM2多肽由包含SEQ ID NO：19的序列的核苷酸序列编码。
[0124] 本披露涵盖分离的或基本上纯化的核酸或蛋白质ODP2/BBM组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白质、或其生物活性部分基本上或本质上不含与如在其天然存在的环境中发现的核酸分子或蛋白质正常相伴或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的核酸分子或蛋白质当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。最佳地，“分离的”核酸不含在该核酸从其来源的生物体的基因组DNA中天然位于该核酸的侧翼的序列(即，位于该核酸的5′和3′端的序列)(最佳地是蛋白质编码序列)。例如，在各个方面，分离的核酸分子可以含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、或0.1kb的核酸序列，该核酸序列在该核酸从其来源的细胞的基因组DNA中天然地位于该核酸分子的侧翼。基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有少于约30％、
20％、10％、5％、或1％(以干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当重组产生本披露的蛋白质或其生物活性部分时，最佳地，培养基表示少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非目的蛋白化学品。
20％、10％、5％、或1％(以干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当重组产生本披露的蛋白质或其生物活性部分时，最佳地，培养基表示少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非目的蛋白化学品。
[0125] 所披露的核苷酸序列的片段和变体以及由此编码的蛋白质也涵盖在本披露中。“片段”意在是核苷酸序列的一部分或者氨基酸序列和因此由其编码的蛋白质的一部分。核苷酸序列的片段可以编码保留天然蛋白质的生物活性的蛋白质片段，并因此具有ODP2活性。可替代地，用作杂交探针的核苷酸序列的片段通常不编码保留生物活性的片段性蛋白质。因此，核苷酸序列的片段的范围可以是从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、以及多达编码本披露的蛋白质的全长核苷酸序列。
[0126] “ODP2活性”或“胚珠发育蛋白2活性”意指ODP2多肽具有以下示例性活性中的至少一种：增加植物细胞的再生能力；致使植物细胞胚发生；增加植物细胞的转化效率；改变植物细胞的含油量；结合DNA；增加非生物胁迫耐受性；在非生物胁迫下增加或维持产量；增加无性胚形成；改变淀粉含量；改变胚大小或激活转录。测定此类活性的方法是本领域已知的，并且在下面更全面地描述。
[0127] 编码本披露的ODP2/BBM蛋白质的生物活性部分的ODP2/BBM核苷酸序列的片段将编码至少15个、25个、30个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、709个连续氨基酸或多达本披露的全长ODP2/BBM蛋白质中存在的氨基酸总数。用作杂交探针或PCR引物的ODP2核苷酸序列的片段通常不需要编码ODP2/BBM蛋白质的生物活性部分。
[0128] 因此，ODP2/BBM核苷酸序列的片段可以编码ODP2/BBM蛋白质的生物活性部分，或者其可以是可以使用下面披露的方法用作杂交探针或PCR引物的片段。ODP2/BBM蛋白质的生物活性部分可以通过分离本披露的ODP2/BBM核苷酸序列之一的一部分、表达ODP2/BBM蛋白的编码部分(例如，通过体外重组表达)、和评估ODP2/BBM蛋白的编码部分的活性来制备。作为ODP2/BBM核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少16个、20个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、800个、
900个、1,000个、1,100个、1，200个、1,300个、或1,400个、1,500个、1,600个、1,700个、1,800个、1,900个、2,000个、2,100个、2,200个连续核苷酸、或多达本文披露的全长ODP2/BBM核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：17、19和21)中存在的核苷酸数目。
900个、1,000个、1,100个、1，200个、1,300个、或1,400个、1,500个、1,600个、1,700个、1,800个、1,900个、2,000个、2,100个、2,200个连续核苷酸、或多达本文披露的全长ODP2/BBM核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：17、19和21)中存在的核苷酸数目。
[0129] “变体”旨在表示基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所使用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守的变体包括如下那些序列，由于遗传密码的简并性，所述序列编码本披露的ODP2/BBM多肽之一的氨基酸序列。变体ODP2/BBM2多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如通过使用定点诱变产生但仍编码本披露的ODP2蛋白质的多核苷酸。通常，如通过本文别处所描述的序列比对程序和参数确定的，本披露的特定多核苷酸的变体将与该特定的多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更多的序列同一性。
98％、99％或更多的序列同一性。
[0130] “变体”蛋白质旨在表示通过在天然蛋白质的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失和/或添加、和/或在天然蛋白质的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代而源自天然蛋白质的蛋白质。如本文所述，由本披露涵盖的变体蛋白质具有生物活性，即它们继续拥有天然蛋白质的所希望的生物活性，即该多肽具有ODP2/BBM活性(即，调节植物的再生能力、致使植物胚发生、增加植物的转化效率、改变植物的油含量、增加细胞增殖、增加非生物胁迫耐受性、在非生物胁迫下增加或维持产量、改变淀粉含量、增加无性胚形成、结合DNA或调节转录)。此类变体可以由例如遗传多态性或人类操作产生。本披露的天然ODP2/BBM蛋白质的生物活性变体将与天然蛋白质的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如本文别处描述的序列比对程序和参数所确定的。本披露的蛋白质的生物活性变体可以与该蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基、少至
1-10个、例如6-10个、少至5个、少至4个、3个、2个、或甚至1个氨基酸残基。
96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如本文别处描述的序列比对程序和参数所确定的。本披露的蛋白质的生物活性变体可以与该蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基、少至
1-10个、例如6-10个、少至5个、少至4个、3个、2个、或甚至1个氨基酸残基。
[0131] 本披露的ODP2/BBM蛋白质可以按各种方式进行改变，包括氨基酸取代、缺失、截短、融合和插入。用于此类操作的方法在本领域中是普遍已知的。例如，可以通过DNA中的突变来制备ODP2蛋白质的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]82：488-492；Kunkel等人(1987)Methodsin Enzymol.[酶学方法]154：367-382；美国专利号4,873,192；
Walker和Gaastra，编辑(1983)Techniniques in Molecular Biology[分子生物学技术](MacMillan Publishing Company，New York[麦克米兰出版有限公司，纽约])和在其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质的生物活性的适当的氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人，(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure[蛋白质序列和结构图谱](Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.[国家生物医学研究基金会，华盛顿特区])的模型中找到，其通过引用结合在此。保守取代，例如将一个氨基酸与具有相似特性的另一个氨基酸交换，可能是最佳的。
Walker和Gaastra，编辑(1983)Techniniques in Molecular Biology[分子生物学技术](MacMillan Publishing Company，New York[麦克米兰出版有限公司，纽约])和在其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质的生物活性的适当的氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人，(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure[蛋白质序列和结构图谱](Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.[国家生物医学研究基金会，华盛顿特区])的模型中找到，其通过引用结合在此。保守取代，例如将一个氨基酸与具有相似特性的另一个氨基酸交换，可能是最佳的。
[0132] III.WUS/WOX同源框多肽
[0133] 本披露的方法包含多核苷酸序列和WUS/WOX同源框多肽的氨基酸序列。下文称为WUS的Wuschel蛋白质在顶端分生组织的起始和维持中发挥关键作用，所述顶端分生组织含有多能干细胞库(Endrizzi等人，(1996)Plant Journal[植物杂志]10：967-979；Laux等人，(1996)Development[发育]122：87-96；和Mayer等人，(1998)Cell[细胞]95：805-815)。WUS基因的拟南芥植物突变体含有错误指定并且似乎经历分化的干细胞。WUS编码新颖同源域蛋白，其可能起转录调节因子的作用(Mayer等人，(1998)Cell[细胞]95：805-815)。认为拟南芥芽分生组织的干细胞群体由促进器官起始的CLAVATA(CLV)基因和干细胞身份所需的WUS基因之间的调节环维持，其中CLV基因在转录水平上阻抑WUS，并且WUS表达足以诱导分生组织细胞身份和干细胞标记CLV3的表达(Brand等人，(2000)Science[科学]289：617-619；Schoof等人，(2000)Cell[细胞]100：635-644)。WUS在拟南芥中的组成型表达已显示从叶(在植物中)引起不定芽增殖(Laux，T.，Talk Presented at the XVI International Botanical Congress Meeting[在第16届国际植物学大会会议上发表的讲座]，1999年8月1日至7日，St.Louis，Mo.[密苏里州圣路易斯])。
[0134] 在一方面，WUS/WOX同源框多肽是WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、或WOX9多肽(van der Graaff等人，2009，Genome Biology[基因组生物学]10：248)。WUS/WOX同源框多肽可以是单子叶植物WUS/WOX同源框多肽。在各个方面、WUS/WOX同源框多肽可以是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦WUS/WOX同源框多肽。可替代地，WUS/WOX同源框多肽可以是双子叶植物WUS/WOX同源框多肽。具体地，本披露提供了分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、和16示出的氨基酸序列的核苷酸序列。进一步提供了由本文所述的核酸分子(SEQ ID NO：3、
5、7、9、11、13、和15)编码的氨基酸序列的多肽、及其片段和变体。
5、7、9、11、13、和15)编码的氨基酸序列的多肽、及其片段和变体。
[0135] WUS/WOX同源框多肽可以源自禾本科家族成员的植物。WUS/WOX同源框多肽可以从其来源的合适的植物的非限制性实例包括谷类作物，包括但不限于：大麦、玉米(玉米)、燕麦、稻、黑麦、高粱、小麦、粟、黑小麦；叶和茎作物，包括但不限于：竹子、滨草、草地早熟禾、芦苇、黑麦草、甘蔗；草坪植物、观赏草、以及其他草(例如柳枝稷和草坪草)。
[0136] 在另外的方面，所披露的方法中使用的WUS/WOX同源框多肽可以源自任何植物，包括高等植物，例如被子植物门和裸子植物门的种类。双子叶植物纲和单子叶植物纲的亚纲的植物是合适的。合适的物种可以来自以下科：爵床科、葱科、六出花科、石蒜科、夹竹桃科、槟榔科、菊科、小檗科、胭脂树科、十字花科、凤梨科、大麻科、石竹科、三尖杉科、藜科、秋水仙科、葫芦科、薯蓣科、麻黄科、古柯科、大戟科、蝶形花科、唇形科、亚麻科、石松科、锦葵科、黑药花科、芭蕉科、桃金娘科、蓝果树科、罂粟科、松科、车前草科、禾本科、蔷薇科、茜草科、杨柳科、无患子科、茄科、紫杉科、山茶科和葡萄科。
[0137] WUS/WOX同源框多肽可以从其来源的合适的物种包括以下属的成员：秋葵属、冷杉属、槭属、翦股颖属、葱属、六出花属、凤梨属、穿心莲属、须芒草属、艾属、芦竹属、颠茄属、小檗属、菾属(Beta)、红木属、芸苔属、金盏花属、山茶属、喜树属、大麻属、辣椒属、红花属、长春花属、三尖杉属、菊属、金鸡钠属、西瓜属、咖啡属、秋水仙属、紫苏属(Coleus)、黄瓜属、南瓜属、狗牙根属、曼陀罗属、石竹属、毛地黄属、薯蓣属、油棕属、麻黄属、蔗茅属、古柯属、桉属、羊茅属、草莓属、雪花莲属、大豆属、棉属、向日葵属、橡胶树属、大麦属、莨菪属、麻风树属、莴苣属、亚麻属、黑麦草属、羽扇豆属、番茄属、石松属、木薯属、苜蓿属、薄荷属、芒属、芭蕉属、烟草属、稻属、黍属、罂粟属、银胶菊属、狼尾草属、矮牵牛属、虉草属(Phalari)、梯牧草属、松属、早熟禾属、一品红属、杨属、萝芙木属、蓖麻属、蔷薇属(Rosa)、甘蔗属、柳属、血根草属、东茛菪属、黑麦属、茄属、高粱属、大米草属、菠菜属、艾菊属、红豆杉属、可可属、小黑麦属、小麦属、北美穗草属、藜芦属、长春花属、葡萄属、和玉米属。
[0138] 在另外的方面，WUS/WOX同源框多肽可以源自对农业、园艺、用于生产液体燃料分子和其他化学品的生物质、和/或林业重要或有意义的植物。非限制性实例包括：例如，柳枝稷(Panicum virgatum，switchgrass)、双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthus giganteus)(芒)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)(能源甘蔗)、大叶钻天杨(Populus balsamifera)(白杨)、玉蜀黍(Zea mays)(玉米)、大豆(Glycine max，soybean)、甘蓝型油菜(Brassica napus)(低芥酸菜籽)、小麦(Triticum aestivum，wheat)、陆地棉(Gossypium hirsutum)(棉花)、稻(Oryza sativa，rice)、向日葵(Helianthus annuus，sunflower)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、甜菜(Beta vulgaris，sugar beets)、御谷(Pennisetum glaucum)(珍珠稷)、黍属物种(Panicum spp.)、高粱属物种(Sorghum spp.)、芒属物种(Miscanthus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、斑茅属物种(Erianthus spp.)、杨属物种(Populus spp.)、须芒草(Andropogon gerardii)(大须芒草)、象草(Pennisetum purpureum，elephant grass)、虉草(Phalaris arundinacea，reed canarygrass)、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草)、高羊茅(Festuca arundinacea)(牛尾草)、草原索草(Spartina pectinata，prairie cord-grass)、芦竹(Arundo donax，giant reed)、黑麦(Secale cereale，rye)、柳属物种(Salix spp.)(柳树)、桉属物种(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦属物种(Triticosecale spp.)(小麦属植物-小麦X黑麦)、竹子、红花(Carthamus tinctorius，safflower)、麻风树(Jjatropha curcas，jatropha)、蓖麻(Ricinus communis，castor)、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈树)、亚麻(Linum usitatissimum，flax)、芥菜(Brassica juncea)、木薯(Manihot esculenta，cassava)、番茄(Lycopersicon esculentum，tomato)、莴苣(Lactuca sativa，lettuce)、香蕉(Musa paradisiaca，banana)、马铃薯(Solanum tuberosum，potato)、芸苔(Brassica oleracea)(西兰花、花椰菜、抱子甘蓝)、野茶树(Camellia sinensis)(茶树)、草莓(Fragaria ananassa，strawberry)、可可树(Theobromna cacao，cocoa)、咖啡树(Coffea arabica，coffee)、葡萄(Vitis vinifera，grape)、菠萝(Ananas comosus)(凤梨)、辣椒(Capsicum annum)(辣椒和甜辣椒)、洋葱(Allium cepa，onion))、甜香瓜(Cucumis melo)(甜瓜)、黄瓜(Cucumis sativus，cucumber)、笋瓜(Cucurbita maxima，squash)、南瓜(Cucurbita moschata，squash)、菠菜(Spinacea oleracea，spinach)、西瓜(Citrullus lanatus，watermelon)、黄秋葵(Abelmoschus esculentus，okra)、茄子(Solanum melongena，eggPlant)、罂粟(Papaver somniferum，opium poppy)、东方罂粟(Papaver orientale)、欧洲紫杉(Taxus baccata)、短叶红豆杉(Taxus brevifolia)、香青蒿(ArtemisZa annua)、大麻(Cannabis sativa)、喜树(Camptotheca acuminate)、长春花(Catharanthus roseus)、长春花(Vinca rosea、金鸡纳树(Cinchona officinalis)、秋水仙(Colchicum autumnale)、加州藜芦(Veratrum californica)、毛花洋地黄(Digitalis lanata)、毛地黄(Digitalis purpurea)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、穿心莲(Andrographis paniculata)、颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stomonium)、小檗属物种(Berberis spp.)、三尖杉属物种(Cephalotaxus spp.)、草麻黄(Ephedra sinica)、麻黄属物种(Ephedra spp.)、古柯(Erythroxylum coca)、雪花莲(Galanthus wornorii)、东莨菪属物种(Scopolia spp.)、蛇足石松(Lycopodium serratum)(＝蛇足石杉(Huperzia serrata))、石松属物种(Lycopodium spp.)、蛇根木(Rauwolfia serpentina)、萝芙木属物种(Rauwolfia spp.)、血根草(Sanguinaria canadensis)、莨菪属物种(Hyoscyamus spp.)、金盏花(Calendula officinalis)、小白菊(Chrysanthemum parthenium)、毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)、小艾菊(Tanacetum parthenium)、银胶菊(Parthenium argentatum，guayule)、橡胶树属物种(Hevea spp.)(橡胶树)、绿薄荷(Mentha spicata)(薄荷)、洋薄荷(Mentha piperita)(薄荷)、红木(Bixa orellana)、六出花属物种(Alstroemeria spp.)、蔷薇属物种(Rosa spp.)(玫瑰)、康乃馨(Dianthus caryophyllus，carnation)、矮牵牛属物种(Petunia spp.)(矮牵牛花)、一品红
(Poinsettia pulcherrima，poinsettia)、烟草(Nicotiana tabacum，tobacco)、羽扇豆(Lupinus albus，lupin)、北美穗草(Uniola paniculata)(燕麦)、翦股颖(bentgrass)(剪股颖属物种(Agrostis spp.))、美洲山杨(Populus tremuloides)(山杨)、松属物种(Pinus spp.)(松树)、冷杉属物种(Abies spp.)(冷杉)、槭属物种(Acer spp.)(枫树)、大麦(Hordeum vulgare，barley)、草地早熟禾(Poa pratensis)(早熟禾)、黑麦草属物种(Lolium spp.)(黑麦草)、梯牧草(Phleum pratense，timothy)、和针叶树。感兴趣的是为能源生产而种植的植物，即所谓的能源作物，例如基于纤维素的能源作物，如柳枝稷(Panicum virgatum，switchgrass)、双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthus giganteus)(芒)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)(能源甘蔗)、大叶钻天杨(Populus balsamifera)(白杨)、须芒草(Andropogon gerardii)(大须芒草)、象草(Pennisetum purpureum，elephant grass)、虉草(Phalaris arundinacea，reed canarygrass)、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草)、高羊茅(Festuca arundinacea)(牛尾草)、草原索草(Spartina pectinata，prairie cord-grass)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、芦竹(Arundo donax，giant reed)、黑麦(Secale cereale，rye)、柳属物种(Salix spp.)(柳树)、桉属物种(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦属物种(Triticosecale spp.)(小麦属植物-小麦X黑麦)、和竹子；以及基于淀粉的能源作物，如玉蜀黍(Zea mays)(玉米)和木薯(Manihot esculenta，cassava)；以及基于蔗糖的能源作物，如甘蔗属物种(甘蔗)和甜菜(Beta vulgaris，sugar beets)；以及生产生物柴油的能源作物，如大豆(Glycine max，soybean)、甘蓝型油菜(Brassica napus)(低芥酸菜籽)、向日葵(Helianthus annuus，sunflower)、红花(Carthamus tinctorus，safflower)、麻风树(Jatropha curcas，jatropha)、蓖麻(Ricinus communis，castor)、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈树)、亚麻(Linum usitatissimum，flax)和芥菜(Brassica juncea)。
(Poinsettia pulcherrima，poinsettia)、烟草(Nicotiana tabacum，tobacco)、羽扇豆(Lupinus albus，lupin)、北美穗草(Uniola paniculata)(燕麦)、翦股颖(bentgrass)(剪股颖属物种(Agrostis spp.))、美洲山杨(Populus tremuloides)(山杨)、松属物种(Pinus spp.)(松树)、冷杉属物种(Abies spp.)(冷杉)、槭属物种(Acer spp.)(枫树)、大麦(Hordeum vulgare，barley)、草地早熟禾(Poa pratensis)(早熟禾)、黑麦草属物种(Lolium spp.)(黑麦草)、梯牧草(Phleum pratense，timothy)、和针叶树。感兴趣的是为能源生产而种植的植物，即所谓的能源作物，例如基于纤维素的能源作物，如柳枝稷(Panicum virgatum，switchgrass)、双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthus giganteus)(芒)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)(能源甘蔗)、大叶钻天杨(Populus balsamifera)(白杨)、须芒草(Andropogon gerardii)(大须芒草)、象草(Pennisetum purpureum，elephant grass)、虉草(Phalaris arundinacea，reed canarygrass)、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草)、高羊茅(Festuca arundinacea)(牛尾草)、草原索草(Spartina pectinata，prairie cord-grass)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、芦竹(Arundo donax，giant reed)、黑麦(Secale cereale，rye)、柳属物种(Salix spp.)(柳树)、桉属物种(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦属物种(Triticosecale spp.)(小麦属植物-小麦X黑麦)、和竹子；以及基于淀粉的能源作物，如玉蜀黍(Zea mays)(玉米)和木薯(Manihot esculenta，cassava)；以及基于蔗糖的能源作物，如甘蔗属物种(甘蔗)和甜菜(Beta vulgaris，sugar beets)；以及生产生物柴油的能源作物，如大豆(Glycine max，soybean)、甘蓝型油菜(Brassica napus)(低芥酸菜籽)、向日葵(Helianthus annuus，sunflower)、红花(Carthamus tinctorus，safflower)、麻风树(Jatropha curcas，jatropha)、蓖麻(Ricinus communis，castor)、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈树)、亚麻(Linum usitatissimum，flax)和芥菜(Brassica juncea)。
[0139] WUS/WOX同源框多肽可以源自生物质可再生能源。生物质可再生能源植物的实例包括在上文所述的那些。
[0140] 用于所披露的方法和组合物中的WUS/WOX同源框多肽可以是WUS1多肽。在一方面，WUS1多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS1多肽。在另外的方面，WUS1多肽是玉米或稻WUS1多肽。在另外的方面，WUS1多肽是玉米WUS1多肽。具体地，WUS1多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或WUS1多肽由包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。
[0141] 用于所披露的方法和组合物中的WUS/WOX同源框多肽可以是WUS2多肽。在各个方面，WUS2多肽是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦WUS多肽。在一方面，WUS2多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS2多肽。在另外的方面，WUS2多肽是玉米或稻WUS2多肽。在另外的方面，WUS2多肽是玉米WUS2多肽。具体地，WUS2多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列或WUS2多肽由包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。
[0142] 用于所披露的方法和组合物中的WUS/WOX同源框多肽可以是WUS3多肽。在一方面，WUS3多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WUS3多肽。在另外的方面，WUS3多肽是玉米或稻WUS3多肽。在另外的方面，WUS3多肽是玉米WUS3多肽。具体地，WUS3多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或WUS3多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列编码。
[0143] 用于所披露的方法和组合物中的WUS/WOX同源框多肽可以是WOX2A多肽。在一方面，WOX2A多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WOX2A多肽。在另外的方面，WOX2A多肽是玉米或稻WUS2A多肽。在另外的方面，WOX2A多肽是玉米WOX2A多肽。具体地，WOX2A多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或WOX2A多肽由包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列编码。
[0144] 用于所披露的方法和组合物中的WUS/WOX同源框多肽可以是WOX4多肽。在一方面，WOX4多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WOX4多肽。在另外的方面，WOX4多肽是玉米或稻WUS4多肽。在另外的方面，WOX4多肽是玉米WOX4多肽。具体地，WOX4多肽包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或WOX4多肽由包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列编码。
[0145] 用于所披露的方法和组合物中的WUS/WOX同源框多肽可以是WOX5A多肽。在一方面，WOX5A多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WOX5A多肽。在另外的方面，WOX5A多肽是玉米或稻WUS5A多肽。在另外的方面，WOX5A多肽是玉米WOX5A多肽。具体地，WOX5A多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或WOX5A多肽由包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列编码。
[0146] 用于所披露的方法和组合物中的WUS/WOX同源框多肽可以是WOX9多肽。在一方面，WOX9多肽是玉米、高粱、稻或狗尾草属物种WOX9多肽。在另外的方面，WOX9多肽是玉米或稻WUS9多肽。在另外的方面，WOX9多肽是玉米WOX9多肽。具体地，WOX9多肽包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列或WOX9多肽由包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列编码。
[0147] 本披露涵盖分离的或基本上纯化的核酸或蛋白质WUS/WOX组合物。WUS/WOX核苷酸序列的片段和变体以及由此编码的蛋白质也涵盖在本披露中。“片段”意在是核苷酸序列的一部分或者氨基酸序列和因此由其编码的蛋白质的一部分。核苷酸序列的片段可以编码保留天然蛋白质的生物活性的蛋白质片段，并因此具有WUS/WOX活性。可替代地，用作杂交探针的核苷酸序列的片段通常不编码保留生物活性的片段性蛋白质。因此，核苷酸序列的片段的范围可以是从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、以及多达编码本披露的蛋白质的全长核苷酸序列。
[0148] 编码本披露的WUS/WOX蛋白质的生物活性部分的WUS/WOX核苷酸序列的片段将编码至少15个、25个、30个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、709个连续氨基酸或多达本披露的全长WUS/WOX蛋白质中存在的氨基酸总数。用作杂交探针或PCR引物的WUS/WOX核苷酸序列的片段通常不需要编码WUS/WOX蛋白质的生物活性部分。
[0149] 因此，WUS/WOX核苷酸序列的片段可以编码WUS/WOX蛋白质的生物活性部分，或者其可以是可以使用下面披露的方法用作杂交探针或PCR引物的片段。WUS/WOX蛋白质的生物活性部分可以通过分离本披露的WUS/WOX核苷酸序列之一的一部分、表达WUX/WOX蛋白的编码部分(例如，通过体外重组表达)、和评估WUS/WOX蛋白编码部分的活性来制备。作为WUS/WOX核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少16个、20个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、800个、900个、1,000个、1,100个、1,200个、1,300个、或1,400个、1,500个、1,600个、1,700个、1,800个、1,900个、
2,000个、2,100个、2,200个连续核苷酸或多达本文披露的全长WUS/WOX核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13和15)中存在的核苷酸数目。
2,000个、2,100个、2,200个连续核苷酸或多达本文披露的全长WUS/WOX核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13和15)中存在的核苷酸数目。
[0150] “变体”旨在表示基本上相似的序列。对于多核苷酸，保守的变体包括如下那些序列，由于遗传密码的简并性，所述序列编码本披露的WUS/WOX多肽之一的氨基酸序列。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如通过使用定点诱变产生但仍编码本披露的WUS/WOX蛋白质的多核苷酸。通常，如通过本文别处所描述的序列比对程序和参数确定的，本披露的特定多核苷酸的变体将与该特定的多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。
[0151] “变体”蛋白质旨在表示通过在天然蛋白质的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失和/或添加、和/或在天然蛋白质的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代而源自天然蛋白质的蛋白质。由本披露涵盖的变体蛋白质具有生物活性，即它们继续拥有天然蛋白质的所希望的生物活性，即多肽具有WUS/WOX活性。此类变体可以由例如遗传多态性或人类操作产生。本披露的天然WUS/WOX蛋白质的生物活性变体将与天然蛋白质的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如本文别处描述的序列比对程序和参数所确定的。本披露的蛋白质的生物活性变体可以与该蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个、例如6-10个、少至5个、少至4个、3个、2个、或甚至1个氨基酸残基。
[0152] 本披露的WUS/WOX蛋白质可以按各种方式进行改变，包括氨基酸取代、缺失、截短、和插入。用于此类操作的方法在本领域中是普遍已知的。例如，可以通过DNA中的突变来制备WUS/WOX蛋白质的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.[酶学方法]154：367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra，编辑(1983)Techniuques in Molecular Biology[分子生物学技术]
(MacMillan Publishing Company，New York[麦克米兰出版有限公司，纽约])和在其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质的生物活性的适当的氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人，(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure[蛋白质序列和结构图谱](Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.[国家生物医学研究基金会，华盛顿特区])的模型中找到，其通过引用结合在此。保守取代，例如将一个氨基酸与具有相似特性的另一个氨基酸交换，可能是最佳的。
(MacMillan Publishing Company，New York[麦克米兰出版有限公司，纽约])和在其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质的生物活性的适当的氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人，(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure[蛋白质序列和结构图谱](Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.[国家生物医学研究基金会，华盛顿特区])的模型中找到，其通过引用结合在此。保守取代，例如将一个氨基酸与具有相似特性的另一个氨基酸交换，可能是最佳的。
[0153] IV.转化方法
[0154] 本披露的方法和组合物可以利用各种转化方法(视情况而定)。即，转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可以根据被靶向用于转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而变化。将核苷酸序列引入植物细胞并随后插入植物基因组中的合适的方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniuques[生物技术]4：320-334)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83：5602-
5606)、农杆菌介导的转化(Townsend等人，美国专利号5,563,055；Zhao等人，美国专利号5,
981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBOJ.[欧洲分子生物学学会杂志]3：
2717-2722)、和弹道粒子加速法(参见，例如Sanford等人，美国专利号4,945,050；Tomes等人，美国专利号5,879,918；Tomes等人，美国专利号5,886,244；Bidney等人，美国专利号5,
932,782；Tomes等人(1995)，“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment[通过微粒轰击将DNA直接转移到完整的植物细胞中]”，在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基础方法]中，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag[施普林格出版社]，柏林)；和McCabe等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：923-926)。还参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年评]22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology[生物技术]6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞发育生物学]27P：175-
182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；
Datta等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：736-740(稻)；Klein等人(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：559-563(玉米)；Tomes，美国专利号5,240,855；Buising等人，美国专利号5,322,783和5,324,646；Tomes等人(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment[通过微粒轰击将DNA直接转移到完整的植物细胞中]”，在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基础方法]中，Gamborg编辑(Springer-Verlag[施普林格出版社]，柏林)(玉米)；Klein等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；Bowen等人，美国专利号5，736，
369(谷类作物)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]84：
5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)在The Experimental Manipulation of Ovule Tissues[胚珠组织的实验操作]中，Chapman等人编辑(Longman[朗文出版社]，纽约)，第
197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418；
和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(晶须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports[植物细胞报告]12：250-255，以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany[植物学年报]75：407-413(稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌转化的玉米)；将其全部通过引用结合在此。
5606)、农杆菌介导的转化(Townsend等人，美国专利号5,563,055；Zhao等人，美国专利号5,
981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBOJ.[欧洲分子生物学学会杂志]3：
2717-2722)、和弹道粒子加速法(参见，例如Sanford等人，美国专利号4,945,050；Tomes等人，美国专利号5,879,918；Tomes等人，美国专利号5,886,244；Bidney等人，美国专利号5,
932,782；Tomes等人(1995)，“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment[通过微粒轰击将DNA直接转移到完整的植物细胞中]”，在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基础方法]中，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag[施普林格出版社]，柏林)；和McCabe等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：923-926)。还参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年评]22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology[生物技术]6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞发育生物学]27P：175-
182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；
Datta等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：736-740(稻)；Klein等人(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：559-563(玉米)；Tomes，美国专利号5,240,855；Buising等人，美国专利号5,322,783和5,324,646；Tomes等人(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment[通过微粒轰击将DNA直接转移到完整的植物细胞中]”，在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基础方法]中，Gamborg编辑(Springer-Verlag[施普林格出版社]，柏林)(玉米)；Klein等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；Bowen等人，美国专利号5，736，
369(谷类作物)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]84：
5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)在The Experimental Manipulation of Ovule Tissues[胚珠组织的实验操作]中，Chapman等人编辑(Longman[朗文出版社]，纽约)，第
197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418；
和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(晶须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports[植物细胞报告]12：250-255，以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany[植物学年报]75：407-413(稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌转化的玉米)；将其全部通过引用结合在此。
[0155] 本披露的方法和组合物可以用于任何植物物种(包括但不限于单子叶植物和双子叶植物)的转化。感兴趣的植物物种的实例包括但不限于：玉米(玉蜀黍(Zea mays))、芸苔属物种(Brassica sp.)(例如，甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、稻(rice，Oryza sativa)、黑麦(rye，Secale cereale)、高粱(双色高粱(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、稷(例如，珍珠稷(御谷(Pennisetum glaucum))、黍(proso millet，Panicum miliaceum)、粟(foxtail millet，Setaria italica)、穇子(龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(sunflower，Helianthus annuus)、红花(safflower，Carthamus tinctorius)、小麦(wheat，Triticum aestivum)、大豆(soybean，Glycine max)、烟草(tobacco，Nicotiana tabacum)、马铃薯(potato，Solanum tuberosum)、花生(peanut，Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(番薯(Ipomoea batatas))、木薯(cassava，Manihot esculenta)、咖啡(咖啡属物种(Coffea spp.))、椰子(coconut，Cocos nucifera)、凤梨(菠萝(Ananas comosus))、柑橘树(柑橘属物种(Citrus spp.))、可可树(cocoa，Theobroma cacao)、茶树(山茶树(Camellia sinensis))、香蕉(芭蕉属物种(Musa spp.))、鳄梨(avocado，Persea americana)、无花果(fig，Ficus casica)、番石榴(guava，Psidium guajava)、芒果(mango，Mangifera indica)、橄榄(olive，Olea europaea)、木瓜(番木瓜(Caricapapaya))、腰果(cashew，Anacardium occidentale)、澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)、扁桃树(巴旦杏(Prunus amygdalus))、甜菜(sugar beets，Beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗属物种(Saccharum spp.))、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
[0156] 蔬菜包括番茄(tomatoes，Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，莴苣(Lactuca sativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(lima bean，Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属物种(Lathyrus spp.))和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(cucumber，C.sativus)、香瓜(cantaloupe，C.cantalupensis)和甜瓜(musk melon，C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属物种(Rhododendron spp.))、绣球花(hydrangea，Macrophylla hydrangea)、木槿(hibiscus，Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属物种(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属物种(Tulipa spp.))、水仙(水仙属物种(Narcissus spp.))、矮牵牛(petunias，Petuniahybrida)、康乃馨(carnation，Dianthus caryophyllus)、一品红(poinsettia，Euphorbia pulcherrima)和菊花。
[0157] 可以用于实践本披露的针叶树包括，例如：松树，如火炬松(loblolly pine，Pinus taeda)、湿地松(slash pine，Pinus elliotii)、美国黄松(西黄松)、美国黑松(扭叶松)、和蒙特利松(辐射松(Pinus radiata))；道格拉斯杉(Douglas-fir)(北美黄杉(Pseudotsuga menziesii))；东部铁杉或加拿大铁杉(Canadian hemlock，Tsuga canadensis)；西部铁杉(异叶铁杉(Tsuga heterophylla))；大果铁杉(Mountain hemlock，Tsuga mertensiana)；落叶松(Tamarack或Larch)(粗皮落叶松(Larix occidentalis))；北美云杉(白云杉(Picea glauca))；红杉(北美红杉(Sequoia sempervirens))；枞树(true fir)，如银杉(胶冷杉(Abies amabilis))和胶枞(香脂冷杉(Abies balsamea))；以及雪松，如西方红雪松(北美乔柏(Thujaplicata))和阿拉斯加黄雪松(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。桉属物种可以用于实践本披露，包括巨桉(E.grandis)(及其杂交种，如“urograndis”)、蓝桉(E.globulus)、赤桉(E.camaldulensis)、细叶桉(E.tereticornis)、多枝桉
(E.viminalis)、亮果桉(E.nitens)、悉尼蓝桉(E.saligna)和尾叶桉(E.urophylla)。最佳的，本披露的植物是作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)，更佳地是玉米和大豆植物，又更佳地是玉米植物。
(E.viminalis)、亮果桉(E.nitens)、悉尼蓝桉(E.saligna)和尾叶桉(E.urophylla)。最佳的，本披露的植物是作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)，更佳地是玉米和大豆植物，又更佳地是玉米植物。
[0158] 特别感兴趣的植物包括提供感兴趣的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。感兴趣的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括但不限于豆类和豌豆。豆类包括但不限于：瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆和鹰嘴豆。
[0159] 可选择标记包含允许人们通常在特定条件下鉴定或选择包含它的分子或细胞或对其进行选择的DNA区段。这些标记可以编码活性，例如但不限于RNA、肽或蛋白质的产生，或可以提供RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物等的结合位点。可选择标记的实例包括但不限于包含限制性内切酶位点的DNA区段；编码针对另外的毒性化合物提供抗性的产物的DNA区段，所述毒性化合物(例如抗生素，如壮观霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、Basta、新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT))；编码在受体细胞中本身缺乏的产物的DNA区段(例如，tRNA基因、营养缺陷型标记)；编码可以容易地鉴定的产物(例如，表型标记，例如β-半乳糖苷酶、GUS；荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)和细胞表面蛋白)的DNA区段；产生用于PCR的新引物位点(例如，以前未并列的两个DNA序列的并列)，包含通过限制性内切核酸酶或其他DNA修饰酶、化学品等不起作用或起作用的DNA序列；并且包含允许其鉴定的特异性修饰(例如，甲基化)所需的DNA序列。
[0160] 另外的可选择标记包括赋予除草剂化合物(例如草甘膦、磺酰脲、草胺磷、溴草腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸酯(2，4-D))抗性的基因。通常参见，Yarranton(1992)Curr Opin Biotech[生物技术新见]3：506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：6314-6318；Yao等人(1992)Cell[细胞]71：
63-72；Reznikoff(1992)Mol Microbiol[分子微生物学]6：2419-2422；Barkley等人(1980)在The Operon[操纵子]中，第177-220页；Hu等人(1987)Cell[细胞]48：555-566；Brown等人(1987)Cell[细胞]49：603-612；Figge等人(1988)Cell[细胞]52：713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86：5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science[科学]248：480-483；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg[海德堡大学博士论文]；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90：1917-
1921；Labow等人(1990)Mol Cell Biol[分子细胞生物学]10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：3952-3956；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res[核酸研究]19：4647-4653；Hillen和Wissman(1989)Topics Mol Struc Biol[热点分子结构生物学]10：143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob Agents Chemother[抗微生物剂和化疗]35：1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemtstry[生物化学]27：
1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg[海德堡大学博士论文]；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob Agents Chemother[抗微生物剂和化疗]36：913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册]，第78卷(Springer-Verlag，Berlin[柏林施普林格出版社])；Gill等人(1988)Nature[自然]334：721-724。此类披露内容通过引用结合在此。以上可选择标记的列表并不意指是限制性的。任何可选择标记都可以用于所述方法和组合物中。
63-72；Reznikoff(1992)Mol Microbiol[分子微生物学]6：2419-2422；Barkley等人(1980)在The Operon[操纵子]中，第177-220页；Hu等人(1987)Cell[细胞]48：555-566；Brown等人(1987)Cell[细胞]49：603-612；Figge等人(1988)Cell[细胞]52：713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86：5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science[科学]248：480-483；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg[海德堡大学博士论文]；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90：1917-
1921；Labow等人(1990)Mol Cell Biol[分子细胞生物学]10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：3952-3956；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res[核酸研究]19：4647-4653；Hillen和Wissman(1989)Topics Mol Struc Biol[热点分子结构生物学]10：143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob Agents Chemother[抗微生物剂和化疗]35：1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemtstry[生物化学]27：
1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg[海德堡大学博士论文]；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob Agents Chemother[抗微生物剂和化疗]36：913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册]，第78卷(Springer-Verlag，Berlin[柏林施普林格出版社])；Gill等人(1988)Nature[自然]334：721-724。此类披露内容通过引用结合在此。以上可选择标记的列表并不意指是限制性的。任何可选择标记都可以用于所述方法和组合物中。
[0161] 因为所描述的方法的体细胞胚发生和胚成熟的时间范围被截短，因此选择方案必须迅速发生，以便有效消除非转基因胚和所产生的发芽T0植物。结果，取决于选择剂在短时间范围内的严格性，回收的“野生种(escape)”(或为野生型的可再生T0植物)的百分比增加。为了消除野生种，在谷物中转基因事件的传统体外选择已经在1.5至3个月的时间范围内发生，并且需要在选择培养基上进行多次传代培养以积聚足够的愈伤组织用于再生(Gordon-Kamm等人，1990，Plant Cell[植物细胞]2：603-618；Negrotto等人，2000，Plant Cell Reports[植物细胞报告]；Zhao等人，2001，Mol.Breed.[分子育种]8，323-333；Wu等人，2014，In Vitro Cell.Dev.Biol.[体外细胞发育生物学]50：9-18；参见Kan Wang，2014，Agrobacterium Protocols[农杆菌方案]，第1卷，第3版，Springer-Verlag，New York[施普林格出版社，纽约]的综述)。本披露通过消除愈伤组织培养并且取而代之直接通过快速胚发生和发芽发展为独立的T0植物(各自代表单独的整合事件)(需要快速起作用的选择剂)来消除大部分这种长持续时间的选择。
[0162] 在本方法中有用的某些可选择标记包括但不限于：玉米HRA基因(Lee等人，1988，EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]7：1241-1248)(其赋予对磺酰脲和咪唑啉酮的抗性)、GAT基因(其赋予对草甘膦的抗性)(Castle等人，2004，Science[科学]304：1151-1154)，赋予对壮观霉素的抗性的基因(例如aadA基因(Svab等人，1990，Plant Mol Biol.[植物分子生物学]14：197-205)和赋予对草胺磷的抗性的bar基因(White等人，1990，Nucl.Acids Res.[核酸研究]25：1062)、和PAT(或针对玉米的moPAT，参见Rasco-Gaunt等人，2003，Plant Cell Rep.[植物细胞报告]21：569-76)、以及允许在含有甘露糖的培养基上生长的PMI基因(Negrotto等人，2000，Plant Cell Rep.[植物细胞报告]22：684-690)对于在所述方法的体细胞胚发生和胚成熟所涵盖的短暂时间内进行快速选择非常有用。然而，取决于所使用的可选择标记和被转化的作物、近交系或品种，野生型野生种的百分比可能改变。在玉米和高粱中，HRA基因有效地降低野生型野生种的频率。
[0163] V.改进植物性状和特征的方法
[0164] 本披露提供了用于以增加的效率和速度生产转基因植物的新颖组合物和方法。所披露的方法和组合物可以进一步包含提供改进的性状和特征的多核苷酸。
[0165] 如本文所使用，“性状”是指植物或特定植物材料或细胞的生理学、形态学、生物化学、或物理学特征。在一些情况下，这种特征是人眼可见的，例如种子或植物大小，或者可以通过生物化学技术测量，例如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油含量，或者通过观察代谢或生理过程(例如通过测量二氧化碳的吸收)，或者通过观察一种或多种基因的表达水平(例如通过使用Northern分析、RT-PCR、微阵列基因表达测定或报告基因表达系统)，或者通过农业观察(例如胁迫耐受性、产量或病原体耐受性)。用于描述本披露的方面的“增强的性状”包括改进的或增强的水利用效率或耐旱性、渗透胁迫耐受性、高盐度胁迫耐受性、热胁迫耐性、增强的耐寒性(包括发芽耐寒性)、增加的产量、增强的氮利用效率、早期植物生长和发育、后期植物生长和发育、增强的种子蛋白质和增强的种子油生产。
[0166] 任何目的多核苷酸都可以用于本披露的方法中。感兴趣的是表型的各种变化，包括修改植物中的脂肪酸组成，改变植物的氨基酸含量、淀粉含量或碳水化合物含量，改变植物的病原体防御机制，影响籽粒大小、蔗糖负荷等。目的基因还可能参与调节营养物的流入，并且参与调节植酸基因的表达，尤其是降低种子中的植酸水平。这些结果可以通过提供异源产物的表达或增加植物中内源产物的表达来实现。可替代地，可以通过提供一种或多种内源产物，特别是植物中的酶或辅酶因子的表达降低来实现这些结果。这些改变导致转化的植物表型上的变化。
[0167] 目的基因反映了参与作物发育的那些基因的商业市场和利益。感兴趣的作物和市场的变化，以及随着发展中国家打开国际市场，新作物和技术也将出现。此外，随着我们对农艺学性状和特征(例如产量和杂种优势)的了解增加，用于转化的基因的选择也会相应改变。目的基因的一般类别包括，例如涉及信息的那些基因(例如锌指)，涉及通讯的那些基因(例如激酶)，以及涉及管家的那些基因(例如热休克蛋白)。转基因的更具体类别包括，例如，编码对农学、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特征、和商业产品而言重要的性状的基因。目的基因通常包括参与油、淀粉、碳水化合物或营养素代谢的那些基因，以及影响籽粒大小、蔗糖负载量等的基因。
[0168] 通过所披露的方法和组合物引入外植体中的多核苷酸可以可操作地连接至合适的启动子。“启动子”意指位于转录起点上游的DNA区域，并且参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质以启动转录，包括或不包括5′UTR。“植物启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子，无论其起源是否是植物细胞。示例性植物启动子包括但不局限于从植物、植物病毒以及包含在植物细胞中表达的基因的细菌(如来自农杆菌或根瘤菌)获得的那些启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先在某些组织(例如叶、根或种子)中启动转录的启动子。此类启动子被称为“组织优选的”。仅在某些组织中启动转录的启动子被称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动一种或多种器官中的某些细胞类型(例如根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“阻抑型”启动子可以是在环境或外源控制下的启动子。可能影响诱导型启动子的转录的环境条件的实例包括厌氧条件或某些化学品或光的存在。可替代地，可以通过提供合适的化学品或其他试剂来影响诱导型或阻抑型启动子的外源控制，所述化学品或其他试剂经由与靶多肽相互作用导致对启动子的诱导或抑制。组织特异性启动子、组织优选启动子、细胞类型特异性启动子和诱导型启动子构成了“非组成型”启动子的类别。“组成型”启动子是在大多数条件下有活性的启动子。如本文所使用，“反义方向”包括提及以反义链转录的方向可操作地连接至启动子的多核苷酸序列。反义链与内源转录产物充分互补，这样使得内源性转录产物的翻译经常被抑制。“可操作地连接”是指核酸片段在单个核酸片段上的缔合，这样使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。
例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它与编码序列可操作地连接(即编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以在正义或反义方向上可操作地连接至调节序列上。
例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它与编码序列可操作地连接(即编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以在正义或反义方向上可操作地连接至调节序列上。
[0169] 除了使用传统的育种方法之外，还可通过遗传方式改变农学上重要的性状(例如油、淀粉、和蛋白质含量)。修饰包括增加油酸、饱和及不饱和油的含量、增加赖氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸、以及还有对淀粉的修饰。在美国专利号5,703,049、5,885,801、5,885,802、和5,990,389中描述了Hordothionin蛋白质修饰，将这些专利通过引用结合在此。
另一个实例是由美国专利号5,850,016中描述的大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白质，以及Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]165：99-
106描述的来自大麦的糜蛋白酶抑制剂，这些文献的披露通过引用结合在此。
另一个实例是由美国专利号5,850,016中描述的大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白质，以及Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]165：99-
106描述的来自大麦的糜蛋白酶抑制剂，这些文献的披露通过引用结合在此。
[0170] 编码序列的衍生物可以通过定点诱变制造，以增加编码的多肽中预先选择的氨基酸的水平。例如，可以使用如来自向日葵种子(Lilley等人(1989)Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs[关于植物蛋白在人类食物和动物饲料中的应用的世界大会进展]，Applewhite编辑(American Oil Chemists Society，Champaign，Ill.[美国油化学协会，平原市，伊利诺伊州])，第497-502页；通过引用结合在此)；玉米(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]261：6279；Kirihara等人(1988)Gene[基因]71：359；这些文献通过引用结合在此)；和稻(Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12：123，通过引用结合在此)的富含甲硫氨酸的植物蛋白。其他农业重要的基因编码乳胶、Floury2、生长因子、种子储存因子、和转录因子。
[0171] 昆虫抗性基因可以编码对严重影响产量的有害生物的抗性，这些有害生物例如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等。此类基因包括，例如，苏云金芽孢杆菌毒性蛋白基因(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene[基因]48：109)；等。
[0172] 编码疾病抗性性状的基因包括解毒基因，例如抗伏马毒素(美国专利号5,792,931)；无毒力(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones等人(1994)Science[科学]266：789；Martin等人(1993)Science[科学]262：1432；和Mindrinos等人(1994)Cell[细胞]78：1089)；等。
[0173] 除草剂抗性性状可以包括编码针对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)之作用的除草剂的抗性的基因，特别是磺酰脲型除草剂(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)；编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂的抗性的基因，诸如草胺膦或basta(例如bar基因)；草甘磷(如，EPSPS基因和GAT基因；参见例如美国专利公开号20040082770和WO 03/092360)或本领域已知的其他此类基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，以及ALS-基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。
[0174] 不育性基因还可以在表达盒中编码，并为物理去雄提供替代方案。以这种方式使用的基因的实例包括美国专利号5,583,210中所描述的雄性组织优选基因和具有雄性不育表型的基因(如QM)。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒性的化合物的那些基因。
[0175] 谷物的质量反映在诸如饱和与不饱和的油的水平和类型、必需氨基酸的质量和数量以及纤维素水平等性状上。在玉米中，经修饰的hordothionin蛋白质描述于美国专利号5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中。
[0176] 还可以在可以增加例如用于乙醇生产的淀粉或提供蛋白质表达的一种基因或多种基因上编码商业性状。转化植物的另一个重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，例如在美国专利号5,602,321中所述。多种基因(例如β-酮硫解酶、PHBase(聚羟基丁酸酯合酶)、和乙酰乙酰辅酶A还原酶)(参见Schubert等人(1988)J.Bacteriol.[细菌学杂志]170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
[0177] 外源产物包括植物酶和植物产物，以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些产物。此类产物包括酶、辅因子、激素等。可以增加具有改进的氨基酸分布以改进植物的营养价值的蛋白质，特别是修饰的蛋白质的水平。这通过表达具有增加的氨基酸含量的此类蛋白质来实现。
[0178] 在一方面，能以增加的效率和速度引入外植体中的另外的目的农艺性状是诸如增加产量等性状或提供增加的植物价值(包括例如改善的种子质量)的其他性状。特别感兴趣的是提供以下各项的性状：改善或增强的水分利用效率或耐旱性、渗透胁迫耐受性、高盐度胁迫耐受性、热胁迫耐受性、增强的耐寒性(包括萌发耐寒性)、增加的产量、提高的氮利用效率、植物生长发育较早、植物生长发育迟缓、增强的种子蛋白质以及增强的种子油生产。
[0179] 许多农艺性状可以影响“产量”，这些农艺性状包括但不限于植物高度、豆荚数目、植物上的豆荚位置、节间数目、豆荚粉碎的发生率、颗粒尺寸、生节和固氮作用的效率、养分同化的效率、对生物和非生物应力的抗性、碳同化、植物结构、对倒伏的抗性、种子萌芽百分比、秧苗活力以及幼体性状。可以影响产量的其他性状包括：发芽(包括在胁迫条件下的发芽)、生长速率(包括在胁迫条件下的生长速率)、穗数目、每个穗的种子数目、种子大小、种子的组成(淀粉、油、蛋白质)以及种子填充的特征。还感兴趣的是转基因植物的产生，所述转基因植物表现出可能或可能不赋予植物总产量增加的所希望的表型特性。此类特性包括增强的植物形态、植物生理学或从转基因植物收获的成熟种子的改良组分。
[0180] 本披露的转基因植物的“增加的产量”可以按许多方式进行证明和测量，包括测试重量、每株植物的种子数量、种子重量、每单位面积的种子数量(即每英亩的种子或种子重量)、蒲式耳/英亩、吨/英亩以及公斤/公顷。例如，可以将玉米产量测量为通常基于水分调整(例如15.5％的水分)来报告的每单位生产面积的去壳玉米粒的产量，例如以蒲式耳/英亩或公吨/公顷为单位。增加的产量可能是由于改善了关键生物化学化合物(例如氮、磷和碳水化合物)的利用，或者是由于改善了对环境胁迫(例如寒冷、炎热、干旱、盐、以及有害生物或病原体攻击)的耐受性所致。作为植物生长调节剂的改变的表达或者细胞周期或光合作用途径改变的结果，性状增强重组DNA还可以用于提供具有改善的生长和发育以及最终增加的产量的转基因植物。
[0181] 许多农艺性状可以影响“产量”，这些农艺性状包括但不限于植物高度、豆荚数目、植物上的豆荚位置、节间数目、豆荚粉碎的发生率、颗粒尺寸、生节和固氮作用的效率、养分同化的效率、对生物和非生物应力的抗性、碳同化、植物结构、对倒伏的抗性、种子萌芽百分比、秧苗活力以及幼体性状。可以影响产量的其他性状包括：发芽(包括在胁迫条件下的发芽)、生长速率(包括在胁迫条件下的生长速率)、穗数目、每个穗的种子数目、种子大小、种子的组成(淀粉、油、蛋白质)以及种子填充的特征。还感兴趣的是转基因植物的产生，所述转基因植物表现出可能或可能不赋予植物总产量增加的所希望的表型特性。此类特性包括增强的植物形态、植物生理学或从转基因植物收获的成熟种子的改良组分。
[0182] VI.抑制基因的方法
[0183] 在一方面，所披露的方法和组合物可以用于以增加的效率和速度将多核苷酸引入植物中，所述多核苷酸可用于植物中靶基因的基因抑制。对于植物基因工程的几个方面来说，降低特定基因的活性(也被称为基因沉默或基因抑制)是所希望的。用于基因沉默的许多技术对于本领域技术人员来说是熟知的，包括但不限于：反义技术(参见例如：Sheehy等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85：8805-8809；以及美国专利号5,107,065；5,453,566；和5,759,829)；共抑制(例如，Taylor(1997)Plant Cell[植物细胞]9：
1245；Jorgensen(1990)Trends Biotech.[生物技术趋势]8(12)：340-344；Flavell(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91：3490-3496；Finnegan等人(1994)Bio/Technology[生物技术]12：883-888；和Neuhuber等人(1994)Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]244：230-241)；RNA干扰(Napoli等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2：279-289；美国专利号5,034,323；Sharp(1999)Genes Dev.[基因与发育]13：139-141；Zamore等人(2000)Cell[细胞]101：25-33；Javier(2003)Nature[自然]425：257-263；以及Montgomery等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]95：15502-15507)；病毒诱导的基因沉默(Burton等人(2000)Plant Cell[植物细胞]12：691-705：和Baulcombe(1999)Curr.Op.Plant Bio.[植物生物学新见]2：109-113)；靶RNA特异性核酶(Haseloff等人(1988)Nature[自然]334：585-591)；发夹结构(Smith等人(2000)Nature[自然]407：319-
320；WO 99/53050；WO 02/00904；和WO 98/53083)；核酶(Steinecke等人(1992)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]11：1525；美国专利号4,987,071；和Perriman等人(1993)Antisense Res.Dev.[反义研究与发展]3：253)；寡核苷酸介导的靶向修饰(例如WO 03/
076574和WO 99/25853)；锌指靶向分子(例如WO 01/52620；WO 03/048345；和WO 00/
42219)；人造微小RNA(US 8106180；Schwab等人(2006)Plant Cell[植物细胞]18：1121-
1133)，以及其他方法或本领域技术人员已知的上述方法的组合。
1245；Jorgensen(1990)Trends Biotech.[生物技术趋势]8(12)：340-344；Flavell(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91：3490-3496；Finnegan等人(1994)Bio/Technology[生物技术]12：883-888；和Neuhuber等人(1994)Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]244：230-241)；RNA干扰(Napoli等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2：279-289；美国专利号5,034,323；Sharp(1999)Genes Dev.[基因与发育]13：139-141；Zamore等人(2000)Cell[细胞]101：25-33；Javier(2003)Nature[自然]425：257-263；以及Montgomery等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]95：15502-15507)；病毒诱导的基因沉默(Burton等人(2000)Plant Cell[植物细胞]12：691-705：和Baulcombe(1999)Curr.Op.Plant Bio.[植物生物学新见]2：109-113)；靶RNA特异性核酶(Haseloff等人(1988)Nature[自然]334：585-591)；发夹结构(Smith等人(2000)Nature[自然]407：319-
320；WO 99/53050；WO 02/00904；和WO 98/53083)；核酶(Steinecke等人(1992)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]11：1525；美国专利号4,987,071；和Perriman等人(1993)Antisense Res.Dev.[反义研究与发展]3：253)；寡核苷酸介导的靶向修饰(例如WO 03/
076574和WO 99/25853)；锌指靶向分子(例如WO 01/52620；WO 03/048345；和WO 00/
42219)；人造微小RNA(US 8106180；Schwab等人(2006)Plant Cell[植物细胞]18：1121-
1133)，以及其他方法或本领域技术人员已知的上述方法的组合。
[0184] VII.将基因组编辑技术引入植物中的方法
[0185] 在一方面，所披露的方法和组合物可以用于以增加的效率和速度将多核苷酸引入植物中，所述多核苷酸可用于在植物的基因组中靶向用于修饰的特定位点。可以用所披露的方法和组合物引入的位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的那些修饰，所述方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等。
例如，所披露的方法和组合物可以用于将CRISPR-Cas系统引入植物中，为了植物或植物细胞基因组中靶序列的基因组修饰的目的、用于选择植物、用于缺失碱基或序列、用于基因编辑、以及用于将目的多核苷酸插入植物的基因组中。因此，所披露的方法和组合物可以与CRISPR-Cas系统一起使用以提供用于修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点和目的核苷酸的有效系统。
例如，所披露的方法和组合物可以用于将CRISPR-Cas系统引入植物中，为了植物或植物细胞基因组中靶序列的基因组修饰的目的、用于选择植物、用于缺失碱基或序列、用于基因编辑、以及用于将目的多核苷酸插入植物的基因组中。因此，所披露的方法和组合物可以与CRISPR-Cas系统一起使用以提供用于修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点和目的核苷酸的有效系统。
[0186] 在一方面，本披露包含用于生产转基因植物的方法和组合物，其中所述方法包括将目的多核苷酸引入植物细胞的基因组中的靶位点中，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的一个或多个细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且其中转化进一步包含：能够表达指导核苷酸的第一表达构建体和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体，其中所述指导核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使得Cas内切核酸酶能够在靶位点处引入双链断裂的复合物。可替代地，包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达构建体可以还可以包含能够表达指导核苷酸的核苷酸序列和能够表达Cas内切核酸酶的核苷酸序列。
[0187] 在一方面，Cas内切核酸酶基因是植物优化的Cas9内切核酸酶，其中植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合植物基因组的基因组靶序列并在植物基因组的基因组靶序列中产生双链断裂。
[0188] Cas内切核酸酶由指导核苷酸指导来识别细胞的基因组中的特定靶位点并且任选地在细胞的基因组中的特定靶位点处引入双链断裂。CRISPR-Cas系统提供用于修饰植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点的有效系统。进一步提供了使用指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统来提供用于修饰细胞基因组内的靶位点和用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的有效系统的方法和组合物。一旦鉴定出基因组靶位点，就可以采用多种方法来进一步修饰靶位点，这样使得它们包含多种目的多核苷酸。所披露的组合物和方法可以用于引入CRISPR-Cas系统用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列。待编辑的核苷酸序列(目的核苷酸序列)可以位于由Cas内切核酸酶识别的靶位点的内部或外部。
[0189] CRISPR基因座(规律间隔成簇短回文重复序列)(又称为SPIDR-间隔区散在同向重复序列)构成最近描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由部分回文的短而高度保守的DNA重复序列(通常为24至40bp，重复从1至140次，也被称为CRISPR重复序列)组成。重复序列(通常具有物种特异性)由恒定长度的可变序列(通常为20至58，取决于CRISPR基因座(WO 2007/025097，2007年3月1日公布))间隔。
[0190] CRISPR基因座首次在大肠杆菌中被识别(Ishino等人(1987)J.Bacterial.[细菌学杂志]169：5429-5433；Nakata等人(1989)J.Bacterial.[细菌学杂志]171：3553-3556)。相似的间隔短序列重复序列已经在地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鱼腥藻属(Anabaena)、和结核分枝杆菌(Mycobactermm tuberculosis)中被鉴定出(Groenen等人(1993)Mol.Microbiol.[分子微生物学]10：1057-
1065；Hoe等人(1999)Emerg.Infect.Dis.[新兴传染病]5：254-263；Masepohl等人(1996)Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报]1307：26-30；Mojica等人(1995)Mol.Microbiol.[分子微生物学]17：85-93)。该CRISPR基因座与其他SSR的不同之处在于重复序列的结构，该结构已被命名为短规律间隔重复序列(SRSR)(Janssen等人(2002)OMICS J.Integ.Biol.[组学：整合生物学杂志]6：23-33；Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.[分子微生物学]36：244-246)。重复序列是以成簇形式发生的短元件，这些短元件总是由以恒定长度的可变序列规律地间隔开(Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.[分子微生物学]36：
244-246)。
1065；Hoe等人(1999)Emerg.Infect.Dis.[新兴传染病]5：254-263；Masepohl等人(1996)Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报]1307：26-30；Mojica等人(1995)Mol.Microbiol.[分子微生物学]17：85-93)。该CRISPR基因座与其他SSR的不同之处在于重复序列的结构，该结构已被命名为短规律间隔重复序列(SRSR)(Janssen等人(2002)OMICS J.Integ.Biol.[组学：整合生物学杂志]6：23-33；Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.[分子微生物学]36：244-246)。重复序列是以成簇形式发生的短元件，这些短元件总是由以恒定长度的可变序列规律地间隔开(Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.[分子微生物学]36：
244-246)。
[0191] Cas基因包括通常与侧翼CRISPR基因座联接的、相关的、或接近的、或邻近的基因。术语“Cas基因”和“CRISPR相关的(Cas)基因”在本文中可互换地使用。对Cas蛋白家族的全面综述呈现于以下文献中：Haft等人(2005)Computational Biology[计算生物学]，PLoS Comput Biol[科学公共图书馆计算生物学]1(6)：e60.doi：10.1371/
journal.pcbi.0010060。
journal.pcbi.0010060。
[0192] 除了最初描述的四个基因家族之外，在WO/2015/026883中已经描述了另外41个CRISPR相关(Cas)基因家族，其通过引用结合在此。此参考文献表明CRISPR系统属于不同类别，具有不同的重复模式、基因的组、和物种范围。在给定的CRISPR基因座处的Cas基因数目在物种之间可以不同。Cas内切核酸酶涉及由Cas基因编码的Cas蛋白质，其中所述Cas蛋白质能够将双链断裂引入DNA靶序列中。Cas内切核酸酶由指导多核苷酸指导来识别细胞的基因组中的特定靶位点并且任选地在细胞的基因组中的特定靶位点处引入双链断裂。如本文所使用，术语“指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统”包括能够在DNA靶序列中引入双链断裂的Cas内切核酸酶和指导多核苷酸的复合物。当由指导核苷酸识别靶序列时，Cas内切核酸酶紧邻基因组靶位点解开DNA双链体，并且切割两个DNA链，但前提是正确的前间区序列邻近基序(PAM)被大致定向在靶序列的3’端(参见2015年2月26日公开的WO/2015/026883的图2A和图2B)。
[0193] 在一方面，Cas内切核酸酶基因是Cas9内切核酸酶，例如但不限于：2007年3月1日公开并且通过引用结合在此的WO 2007/025097的SEQ ID NO：462、474、489、494、499、505、和518中列出的Cas9基因。在另一方面，Cas内切核酸酶基因是植物、玉米或大豆优化的Cas9内切核酸酶，例如但不限于WO/2015/026883的图1A中示出的那些。在另一方面，Cas内切核酸酶基因可以可操作地连接至Cas密码子区域上游的SV40核靶向信号和Cas密码子区域下游的二分型VirD2核定位信号(Tinland等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89：7442-6)。
[0194] 在一方面，Cas内切核酸酶基因是WO/2015/026883的SEQ ID NO：1、124、212、213、214、215、216、193或SEQ ID NO：5的核苷酸2037-6329的Cas9内切核酸酶基因、或其任何功能片段或变体。
[0195] 术语“功能片段”、“功能上等效的片段”和“功能等效片段”在本文中可互换使用。这些术语是指本披露的Cas内切核酸酶序列的一部分或子序列，其中产生双链断裂的能力被保留。
[0196] 术语“功能变体”、“功能上等效的变体”和“功能等效变体”在本文中可互换使用。这些术语是指本披露的Cas内切核酸酶的变体，其中产生双链断裂的能力被保留。片段和变体可以经由诸如定点诱变和合成构建等方法来获得。
[0197] 在一方面，Cas内切核酸酶基因是可以对原则上可以被靶向的N(12-30)NGG形式的任何基因组序列进行识别的植物密码子优化的酿脓链球菌Cas9基因。
[0198] 内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，并且包括在特定位点切割DNA而不损害碱基的限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶包括I型、II型、III型、和IV型内切核酸酶，这些限制性内切核酸酶进一步包括亚型。在I型和III型系统中，甲基化酶和限制性酶活性二者均包含在单复合物中。内切核酸酶还包括大范围核酸酶，也称为归巢内切核酸酶(HE酶)，该酶相似于限制性内切核酸酶，在特定识别位点处结合并且切割，然而对于大范围核酸酶，这些识别位点通常更长，约18bp或更长(于2012年3月22日提交的专利申请PCT/US 12/30061)。基于保守的序列基序将大范围核酸酶分类为四个家族，这些家族是LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H、和His-Cys box家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。大范围核酸酶的显著之处在于它们的长识别位点，并且还在于耐受其DNA底物中的一些序列多态性。对于大范围核酸酶的命名约定相似于对其他限制性内切核酸酶的约定。大范围核酸酶的特征还在于针对分别由独立的ORF、内含子、和内含肽编码的酶的前缀F-、I-、或PI-。在重组过程中的一个步骤涉及在识别位点处或附近的多核苷酸切割。这种切割活性可以用于产生双链断裂。对于位点特异性重组酶和它们的识别位点的综述，参见，Sauer(1994)Curr Op Biotechnol[生物技术新见]5：521-7；以及Sadowski(1993)FASEB[美国实验生物学学会联合会杂志]7：760-7。在一些实例中，重组酶来自Integrase或Resolvase家族。TAL效应子核酸酶是新一类的可以用于在植物或其他生物体的基因组中的特定靶序列处造成双链断裂的序列特异性核酸酶(Miller等人(2011)Nature Biotechnology[自然生物技术]29：143-148)。锌指核酸酶(ZFN)是由锌指DNA结合结构域和双链断裂诱导剂结构域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，该锌指结构域通常包含两个、三个、或四个锌指，例如具有C2H2结构，然而其他锌指结构是已知的并且已经被工程化。锌指结构域适于设计特异性结合所选择的多核苷酸识别序列的多肽。ZFN包括连接至非特异性内切核酸酶结构域(例如来自Ms型内切核酸酶，例如Fokl的核酸酶结构域)的工程化DNA结合锌指结构域。另外的功能性可以融合到锌指结合结构域中，这些另外的功能性包括转录激活子结构域、转录抑制子结构域、和甲基化酶。在一些实例中，核酸酶结构域的二聚化是切割活性所需的。每个锌指识别在靶DNA中的三个连续的碱基对。例如，3指结构域识别9个连续核苷酸的序列，由于该核酸酶的二聚化需要，因此两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。
[0199] 细菌和古细菌已经进化出了适应性免疫防御，称为成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR-相关的(Cas)系统，该系统使用短的RNA来引导外源核酸的降解(于2007年3月1日公开的WO 2007/025097)。来自细菌的II型CRISPR/Cas系统采用crRNA和tracrRNA将Cas内切核酸酶指导至其DNA靶。该crRNA(CRISPR RNA)包含与双链DNA靶的一条链互补，并且与tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)碱基配对形成RNA双链体的区域，该RNA双链体引导Cas内切核酸酶切割DNA靶。
[0200] 如本文所使用，术语“指导核苷酸”涉及两个RNA分子、包含可变靶向结构域的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA的合成性融合。在一方面，指导核苷酸包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域和可以与Cas内切核酸酶相互作用的RNA片段。
[0201] 如本文所使用，术语“引导多核苷酸”涉及可以与Cas内切核酸酶形成复合物的多核苷酸序列，并且使得Cas内切核酸酶能够识别并任选地切割DNA靶位点。指导多核苷酸可以是单分子或双分子。指导多核苷酸序列可以是RNA序列、DNA序列或其组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，指导多核苷酸可以包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，例如但不限于锁核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2′-氟代A、2′-氟代U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18(六乙二醇链)分子的连接、或导致环化的5′至3′共价连接。仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也被称为“指导核苷酸”。
[0202] 指导多核苷酸可以是双分子(也被称为双链体指导多核苷酸)，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(被称为可变靶向结构域或VT结构域)和与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(被称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。双分子指导多核苷酸的CER结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独的分子。两个单独的分子可以是RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。在一方面，包含连接到CER结构域的VT结构域的双链体指导多核苷酸的第一个分子被称为“crDNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“crRNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“crDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合构成时)。cr核苷酸可以包含天然存在于细菌和古细菌中的cRNA的片段。在一方面，存在于本文所披露的cr核苷酸中的细菌和古细菌中天然存在的cRNA的片段的大小的范围可以是，但并不限于2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、
15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个核苷酸。
15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个核苷酸。
[0203] 在一方面，包含CER结构域的双链体指导多核苷酸的第二个分子被称为“tracrRNA”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrDNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“tracrDNA-RNA”(当由DNA和RNA核苷酸的组合构成时)。在一方面，指导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA是包含双链体crRNA-tracrRNA的双链体化的RNA。
[0204] 指导多核苷酸还可以是单分子，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(被称为可变靶向结构域或VT结构域)和与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(被称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。“结构域”意指可以为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列的核苷酸的连续延伸。单指导多核苷酸的VT结构域和/或CER结构域可以包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一方面，单指导多核苷酸包含连接到tracr核苷酸(包含CER结构域)的cr核苷酸(包含与CER结构域连接的VT结构域)，其中该连接是包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列的核苷酸序列。由来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列构成的单指导多核苷酸可以被称为“单指导核苷酸”(当由RNA核苷酸的连续延伸构成时)或“单指导DNA”(当由DNA核苷酸的连续延伸构成时)或“单指导核苷酸-DNA”(当由RNA和DNA核苷酸的组合构成时)。在本披露的一方面，单指导核苷酸包含可以与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的cRNA或cRNA片段和tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述指导核苷酸Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。使用单指导多核苷酸对比双链体指导多核苷酸的一个方面是，为了表达单指导多核苷酸，仅需要制造一个表达盒。
[0205] 术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在此可互换地使用，并且包括与双链DNA靶位点的一个链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一个核苷酸序列结构域(VT结构域)与靶序列之间的互补％可以为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶结构域可以是至少12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、
27个、28个、29个或30个核苷酸长度。在一方面，可变靶向域包含12个至30个核苷酸的连续延伸。可变靶向域可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列或其任意组合构成。
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶结构域可以是至少12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、
27个、28个、29个或30个核苷酸长度。在一方面，可变靶向域包含12个至30个核苷酸的连续延伸。可变靶向域可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列或其任意组合构成。
[0206] 术语指导多核苷酸的“Cas内切核酸酶识别结构域”或“CER结构域”在此可互换地使用，并且包括与Cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(例如指导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。CER结构域可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如在此所述的修饰)或其任何组合构成。
[0207] 连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一方面，连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以是至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个或100个核苷酸的长度。在另一方面，连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含四核苷酸环序列，例如但不限于GAAA四核苷酸环序列。
[0208] 指导多核苷酸、VT结构域和/或CER结构域的核苷酸序列修饰可以选自但不限于由以下各项组成的组：5′帽、3’聚腺苷酸尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、将指导多核苷酸靶向亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔物18分子的连接、5′至3′共价连接、或其任何组合。这些修饰可以产生至少一个另外的有益特征，其中该另外的有益特征选自由以下组成的组：修改的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、用于蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、对互补靶序列的修改的结合亲和力、修改的细胞降解抗性和增加的细胞通透性。
[0209] 在一方面，指导核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶在DNA靶位点处引入双链断裂的复合物。
[0210] 在本披露的一方面，可变靶结构域是12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、或30个核苷酸长度。
[0211] 在本披露的一方面，指导核苷酸包含可以与II型Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的cRNA或cRNA片段和tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述指导核苷酸Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。在一方面，可以使用本领域已知的任何方法(例如但不限于粒子轰击或局部应用)将指导核苷酸直接导入植物或植物细胞中。
[0212] 在一方面，还可以通过引入重组DNA分子间接地引入指导核苷酸，该重组DNA分子包含可操作地连接至植物特定启动子的相应的指导DNA序列，该启动子能够在植物细胞中转录该指导核苷酸。术语“相应的指导DNA”包括与RNA分子相同的，但具有“T”取代RNA分子的每个“U”的DNA分子。
[0213] 在一方面，经由粒子轰击或使用所披露的用于重组DNA构建体的农杆菌转化的方法和组合物来引入该指导核苷酸，该重组DNA构建体包含可操作地连接至植物U6聚合酶III启动子的相应指导DNA。
[0214] 在一方面，指导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA是包含双链体crRNA-tracrRNA的双链体化的RNA。使用指导核苷酸对比双链体crRNA-tracrRNA的一个优点是，为了表达融合的指导核苷酸，仅需要制造一个表达盒。
[0215] 术语“靶位点”、“靶序列”、”靶DNA”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、以及“基因组靶基因座”在本文中可互换地使用，并且意指植物细胞的基因组(包括叶绿体DNA和线粒体DNA)中的多核苷酸序列，在该多核苷酸序列处通过Cas内切核酸酶在植物细胞基因组中诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中的内源性位点，或者可替代地，靶位点可以与植物异源，从而不是基因组中天然存在的，或者与其在自然界中存在的地方相比，靶位点可以发现于异源基因组位置中。
[0216] 如本文所使用，术语“内源性靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换地使用，从而意指对于植物的基因组是内源性的或天然的靶序列，并且是在植物的基因组中靶序列的内源或天然位置处。在一方面，该靶位点可以相似于由双链断裂诱导剂，例如LIG3-4内切核酸酶(美国专利公开2009-0133152 A1(2009年5月21日公开))或MS26++大范围核酸酶(2012年6月19日提交的美国专利申请13/526912)特异性识别和/或结合的DNA识别位点或靶位点。
[0217] “人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指已经引入植物的基因组中的靶序列。此类人工靶序列可以在序列上与植物的基因组中的内源性或天然靶序列相同，但是位于植物的基因组中的不同位置(即，非内源性的或非天然的位置)处。
[0218] “改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”、和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指如本文披露的靶序列，当与非改变的靶序列相比时，该靶序列包括至少一种改变。例如，此类“改变”包括：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任意组合。
[0219] VIII.引入用于位点特异性整合的核苷酸的方法
[0220] 在一方面，所披露的方法和组合物可以用于以增加的效率和速度将多核苷酸引入植物中，所述多核苷酸可用于将核苷酸序列靶向整合到植物中。例如，可以使用所披露的方法和组合物来引入侧翼为不相同的重组位点包含目的核苷酸序列的转移盒，所述转移盒用于转化包含靶位点的植物。在一方面，靶位点包含至少一组不相同的重组位点，所述重组位点对应于转移盒上的那些。侧翼为重组位点的核苷酸序列的交换受重组酶影响。因此，所披露的方法和组合物可以用于引入用于靶向整合核苷酸序列的转移盒，其中所述转移盒侧翼为不相同的重组位点，所述重组位点由识别非相同重组位点和实现非相同重组位点处的重组的重组酶识别。因此，所披露的方法和组合物可以用于改进含有不相同重组位点的、源自可再生植物结构的植物的发育效率和速度。
[0221] 在一方面，本披露包含用于生产转基因植物的方法和组合物，其中所述方法包括将目的多核苷酸引入植物细胞的基因组中的靶位点中，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的一个或多个细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；其中转化进一步包括：用包含侧翼为不相同的重组位点的目的核苷酸序列的转移盒转化外植体的细胞；并且其中所述外植体来源于具有包含靶位点的基因组的植物，所述靶位点侧翼为与所述转移盒的侧翼位点相对应的不相同的重组位点。所述方法可以进一步包括提供识别非同源重组位点和实现在非同源重组位点处的重组的重组酶，所述重组酶被提供给外植体的一个或多个细胞、可再生植物结构、源自可再生植物结构的小植株、或源自来源于可再生植物结构的小植株的植物。
[0222] 因此，所披露的方法和组合物可以进一步包括用于将外源核苷酸定向、靶向整合到转化植物中的组合物和方法。在一方面，所披露的方法在基因靶向系统中使用新颖重组位点，所述基因靶向系统有助于将所希望的基因和核苷酸序列定向靶向先前引入靶植物基因组中的相应的重组位点。
[0223] 在一方面，侧翼为两个不相同的重组位点的核苷酸序列被引入源自靶生物体基因组的外植体的一个或多个细胞中，从而建立用于插入目的核苷酸序列的靶位点。一旦建立了稳定的植物或培养组织，将侧翼有与侧翼靶位点的那些重组位点相对应的重组位点的第二构建体或目的核苷酸序列，在重组酶蛋白存在下引入稳定转化的植物或组织中。该过程导致靶位点和转移盒的不相同的重组位点之间的核苷酸序列的交换。
[0224] 应认识到，以这种方式制备的转化植物可以包含多个靶位点；即多组不相同的重组位点。以这种方式，转化植物中的靶位点的多个操作是可获得的。转化植物中的靶位点是指已经插入转化植物基因组中并包含不相同的重组位点的DNA序列。
[0225] 用于所披露的方法的重组位点的实例在本领域中是已知的并且包括FRT位点(参见，例如Schlake和Bode(1994)Biochemistry[生物化学]33：12746-12751；Huang等人(1991)Nucleic Acids Research[核酸研究]19：443-448；Paul D.Sadowski(1995)In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology[核酸研究与分子生物学研究进展]，第51卷，第53-91页；Michael M.Cox(1989)于Mobile DNA[移动DNA]中，Berg和Howe(编辑)American Society of Microbiology[美国微生物学会]，Washington D.C.[华盛顿特区]，第116-670页；Dixon等人(1995)18：449-458；Umlauf和Cox(1988)The EMBO Journal[欧洲分子生物学协会杂志]7：1845-1852；Buchholz等人(1996)Nucleic Acids Research[核酸研究]24：3118-3119；Kilby等人(1993)Trends Genet.[遗传学趋势]9：413-421；Rossant和Geagy(1995)Nat.Med.[自然医学]1：592-594；Albert等人(1995)The Plant J.[植物杂志]7：649-659；Bayley等人(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18：353-
361；Odell等人(1990)Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]223：369-378；以及Dale和Ow(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88：10558-105620；以其全文通过引用结合在此)；Lox(Albert等人(1995)Plant J.[植物杂志]7：649-659；Qui等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91：1706-1710；Stuurman等人(1996)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]32：901-913；Odell等人(1990)Mol.Gen.Gevet.[分子和普通遗传学]223：369-378；Dale等人(1990)Gene[基因]91：79-85；以及Bayley等人(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18：353-361)。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的大多数天然存在的菌株中发现的两微米质粒编码位点特异性重组酶，其促进两个反向重复序列之间的DNA反转。这种反转在质粒拷贝数扩增中起着核心作用。
361；Odell等人(1990)Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]223：369-378；以及Dale和Ow(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88：10558-105620；以其全文通过引用结合在此)；Lox(Albert等人(1995)Plant J.[植物杂志]7：649-659；Qui等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91：1706-1710；Stuurman等人(1996)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]32：901-913；Odell等人(1990)Mol.Gen.Gevet.[分子和普通遗传学]223：369-378；Dale等人(1990)Gene[基因]91：79-85；以及Bayley等人(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18：353-361)。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的大多数天然存在的菌株中发现的两微米质粒编码位点特异性重组酶，其促进两个反向重复序列之间的DNA反转。这种反转在质粒拷贝数扩增中起着核心作用。
[0226] 蛋白质(指定的FLP蛋白质)催化位点特异性重组事件。最小重组位点(FRT)已被定义，并且包含围绕不对称8-bp间隔子的两个反向的13碱基对(bp)重复序列。FLP蛋白质切割重复序列和间隔子连接处的位点，并经由3′磷酸共价连接至DNA。位点特异性重组酶如FLP在特定靶序列处切割和再次连接DNA，从而导致两个相同位点之间的精确限定的重组。为了起作用，系统需要重组位点和重组酶。不需要辅助因子。因此，整个系统可以插入植物细胞中并在其中起作用。已显示酵母FLP\FRT位点特异性重组系统在植物中起作用。迄今为止，该系统已被用于切除不需要的DNA。参见Lyznik等人(1993)Nucleic Acid Res.[核酸研究]21：969-975。相比之下，本披露利用不相同的FRT用于植物基因组中核苷酸序列的交换、靶向、排列、插入和表达的控制。
[0227] 在一方面，需要转化的、含有整合到其基因组中的靶位点的目的生物体，如来自植物的外植体。靶位点的特征在于侧翼为不相同的重组位点。另外需要靶向盒，其含有侧翼有与包含在转化生物体的靶位点中的那些位点相对应的不相同重组位点的核苷酸序列。需要识别不相同重组位点并催化位点特异性重组的重组酶。
[0228] 应认识到，重组酶可以通过本领域已知的任何方式提供。即，通过瞬时表达或通过提供重组酶或重组酶蛋白质的信使RNA(mRNA)，可以在生物体或植物细胞中通过用能够在生物体中表达重组酶的表达盒来转化生物体而提供。
[0229] “不相同的重组位点”意指侧翼重组位点在序列上不相同并且不会重组，或在位点之间的重组将是最小化的。即，一个侧翼重组位点可以是FRT位点，而第二个重组位点可以是突变的FRT位点。本披露的方法中使用的不相同重组位点阻止或大大抑制两个侧翼重组位点之间的重组和其中所含的核苷酸序列的切除。因此，应认识到，可以在本披露中使用任何合适的不相同重组位点，包括FRT和突变FRT位点、FRT和lox位点、lox和突变lox位点、以及本领域已知的其他重组位点。
[0230] 通过合适的不相同重组位点暗示，在活性重组酶存在下，两个不相同重组位点之间的序列切除(如果有的话)以显著低于核苷酸序列重组介导的交换靶向排列到植物基因组中的效率存在。因此，用于本披露中的合适的不相同位点包括在位点之间的重组效率较低的情况下(例如，在效率小于约30％至约50％，优选小于约10％至约30％，更优选小于约5％至约10％的情况下)的那些位点。
[0231] 如上所指出，靶向盒中的重组位点对应于转化植物的靶位点中的重组位点。即，如果转化植物的靶位点含有FRT和突变FRT的侧翼的不相同重组位点，则靶向盒将含有相同的FRT和突变FRT不相同的重组位点。
[0232] 此外还应认识到，用于所披露的方法中的重组酶将取决于转化植物的靶位点中的和靶向盒中的重组位点。即，如果使用FRT位点，则需要FLP重组酶。以相同的方式，在使用lox位点的情况下，需要Cre重组酶。如果不相同的重组位点包含FRT和lox位点两者，则在植物细胞中将需要FLP和Cre重组酶两者。
[0233] FLP重组酶是催化位点特异性反应的蛋白质，所述蛋白质涉及在DNA复制期间扩增酿酒酵母的两微米质粒的拷贝数。FLP蛋白质已被克隆并表达。参见例如，Cox(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院报]80：4223-4227。用于本披露中的FLP重组酶可以是来源于酵母属(Saccharomyces)的FLP重组酶。可能优选的是使用植物优选密码子合成重组酶，用于在目的植物中最佳表达。参见例如，1997年11月18日提交的、标题为“Novel Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Recombinase[编码FLP重组酶的新颖核酸序列]”的美国申请系列号08/972,258，通过引用结合在此。
[0234] 噬菌体重组酶Cre催化在两个lox位点之间的位点特异性重组。Cre重组酶是本领域已知的。参见例如，Guo等人(1997)Nature[自然]389：40-46；Abremski等人(1984)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]259：1509-1514；Chen等人(1996)Somat.Cell Mol.Genet.[体细胞与分子遗传学]22：477-488；和Shaikh等人(1977)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272：5695-5702。将其全部通过引用结合在此。这样的Cre序列也可以使用植物优选密码子来合成。
[0235] 在适当的情况下，可以对待插入植物基因组的核苷酸序列进行优化以增加转化植物中的表达。在本披露中使用哺乳动物、酵母或细菌基因的情况下，可以使用植物优选密码子合成它们以改善表达。应认识到，为了在单子叶植物中表达，也可以使用单子叶植物优选密码子合成双子叶植物基因。本领域中可获得用于合成植物优选基因的方法。参见例如，美国专利号5,380,831、5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498，这些文献通过引用结合在此。可以从目的植物中表达的蛋白质中更频繁使用的密码子确定植物优选密码子。应认识到，可以构建单子叶植物或双子叶植物优选序列以及特定植物物种的植物优选序列。参见例如，EPA 0359472；EPA 0385962；WO 91/16432；
Perlak等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，88：3324-3328；和Murray等人(1989)Nucleic Acids Research[核酸研究]，17：477-498；美国专利号5,380,831；美国专利号5,436,391；等，这些文献通过引用结合在此。进一步认识到，基因序列的全部或任何部分可以是优化的或合成的。即，也可以使用完全优化或部分优化的序列。
Perlak等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，88：3324-3328；和Murray等人(1989)Nucleic Acids Research[核酸研究]，17：477-498；美国专利号5,380,831；美国专利号5,436,391；等，这些文献通过引用结合在此。进一步认识到，基因序列的全部或任何部分可以是优化的或合成的。即，也可以使用完全优化或部分优化的序列。
[0236] 已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达并可用于本披露中。这些包括：消除编码假的聚腺苷酸化信号和外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列、及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可将序列的G-C含量调整至通过参照宿主细胞中表达的已知基因而计算出的给定细胞宿主的平均水平。当可能时，修饰序列以避免出现预测的发夹二级RNA结构。
[0237] 本披露还涵盖新颖FLP重组靶位点(FRT)。FRT已被鉴定为包含两个由8个碱基间隔子分开的13个碱基对重复序列的最小序列，如下：5′-GAAGTTCCTATTC[TCTAGAAA]GTATAGGAACTTC3’，其中括号内的核苷酸表示间隔区。只要这两个13碱基重复序列被8个核苷酸分开，间隔区中的核苷酸就可以被核苷酸组合代替。似乎间隔子的实际核苷酸序列并不重要；然而对于本披露的实践，间隔区中核苷酸的一些取代可能比其他核苷酸更好地起作用。在链交换期间，8个碱基对间隔子参与DNA-DNA配对。该区域的不对称决定了重组事件中位点对齐的方向，这将随后导致倒位或切除。如上所示，大部分间隔子可以被突变而不丧失功能。参见例如，Schlake和Bode(1994)Biochemistry[生物化学]33：12746-12751，通过引用结合在此。
[0238] 新颖FRT突变位点可以用于实践所披露的方法。这样的突变位点可以通过基于PCR的诱变来构建。尽管突变的FRT位点是已知的(参见1999年5月27日公开的WO/1999/025821的SEQ ID No：2、3、4和5)，但认识到其他突变的FRT位点可以用于实践本披露。本披露不是使用特定的FRT或重组位点，而是可以利用不相同的重组位点或FRT位点用于在植物基因组中靶向插入和表达核苷酸序列。因此，基于本披露可以构建和利用其他突变的FRT位点。
[0239] 如上所讨论的，在重组酶存在下，含有具有不相同的重组位点的靶位点的基因组DNA与含有具有相应不相同的重组位点的转移盒的载体一起导致重组。将位于侧翼重组位点之间的转移盒的核苷酸序列与位于侧翼重组位点之间的靶位点的核苷酸序列交换。以此方式，目的核苷酸序列可以精确地并入宿主的基因组中。
[0240] 应认识到，可以实践本披露的许多变化。例如，可以构建具有多个不相同的重组位点的靶位点。因此，多个基因或核苷酸序列可以在植物基因组中的精确位置处堆叠或排序。同样，一旦已经在基因组内建立了靶位点，可以通过将此类位点并入转移盒的核苷酸序列内并将位点转移至靶序列来引入另外的重组位点。因此，一旦已经建立了靶位点，就可能通过重组随后添加位点或改变位点。
[0241] 另一种变化包括提供与生物体中的靶位点可操作地连接的启动子或转录起始区域。优选地，启动子将位于第一重组位点的5′。通过用包含编码区域的转移盒转化生物体，编码区的表达将发生在转移盒整合到靶位点时。这方面提供了通过提供可选择标记序列作为编码序列来选择转化的细胞(尤其是植物细胞)的方法。
[0242] 本系统的其他优点包括：通过利用如上所讨论的转移盒并且用简单整合模式选择生物体来降低转基因或转移的DNA在生物体中整合的复杂性的能力。以相同的方式，可以通过比较若干个转化事件来鉴定基因组内的优选位点。基因组内的优选位点包括不破坏必需序列表达并提供转基因序列的充分表达的基因。
[0243] 所披露的方法还提供了在基因组内的一个位置组合多个盒的方法。可以在基因组内的靶位点添加或缺失重组位点。
[0244] 本领域已知的用于将系统的三种组分放在一起的任何方式可以用于本披露中。例如，植物可以稳定地转化以在其基因组中具有靶位点。重组酶可以被瞬时表达或提供。可替代地，能够表达重组的核苷酸序列可以稳定地整合至植物的基因组中。在相应的靶位点和重组酶的存在下，将侧翼为相应的不相同的重组位点的转移盒被插入转化植物的基因组中。
[0245] 可替代地，可以通过将转化的植物进行有性杂交来将系统的个组分放在一起。在这个方面，含有整合在其基因组中的靶位点的转化植物(亲本一)可以与已经用含有侧翼不相同的重组位点(其对应于植物一中的重组位点)的转移盒基因转化的第二植物(亲本二)进行有性杂交。植物一或植物二在其基因组内含有表达重组酶的核苷酸序列。重组酶可以在组成型或诱导型启动子的控制之下。
[0246] 诱导型启动子包括上文所述的启动子，以及热诱导型启动子、雌二醇响应型启动子、化学诱导型启动子等。病原体诱导型启动子包括来自病程相关蛋白(PR蛋白)的那些启动子，其在被病原体感染后被诱导；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如，Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.[荷兰植物病理学杂志]89：245-
254；Uknes等人(1992)Plant Cell[植物细胞]4：645-656；以及Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.[植物分子病毒学]4：111-116。以此方式，可以控制重组酶的表达和重组位点处的后续活性。
254；Uknes等人(1992)Plant Cell[植物细胞]4：645-656；以及Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.[植物分子病毒学]4：111-116。以此方式，可以控制重组酶的表达和重组位点处的后续活性。
[0247] 用于在植物中表达基因的组成型启动子是本领域已知的。此类启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒的35S启动子(Depicker等人(1982)Mol.Appl.Genet.[分子应用遗传学]1：561-573；Odell等人(1985)Nature[自然]313：810-812)、泛素启动子(Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18：675-689)、来自基因的启动子如核酮糖二磷酸羧化酶(De Almeida等人(1989)Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]218：78-98)、肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant J.[植物杂志]2：163-171)、组蛋白、DnaJ(Baszczynski等人(1997)Maydica[美迪卡杂志]42：189-201)等。
[0248] 所披露的组合物和方法可用于将转移的核苷酸序列靶向整合到特定的染色体位点。核苷酸序列可以编码任何目的核苷酸序列。特定的目的基因包括为宿主细胞和/或生物体提供容易分析的功能特征的那些，如标记基因，以及改变受体细胞表型的其他基因等。因此，可以在本披露中使用影响植物生长、高度、对疾病和昆虫的易感性、营养价值等的基因。核苷酸序列还可以编码“反义”序列以关闭或修饰基因表达。
[0249] 应认识到，核苷酸序列将被用于功能表达单元或盒中。功能性表达单元或盒意指具有功能性启动子的目的核苷酸序列，并且在大多数情况下是终止区。在本披露的实践中有各种方式来实现功能表达单元。在本披露的一个方面，将目的核酸作为功能表达单元转移或插入基因组中。
[0250] 可替代地，可将核苷酸序列插入基因组内启动子区域3′的位点。在后一种情况下，将编码序列插入启动子区域3′使得在整合时实现功能表达单元。为了方便起见，为了在植物中表达，可将编码靶位点的核酸和转移盒(包括目的核苷酸序列)包含在表达盒内。表达盒将包含与编码目的肽的核酸可操作地连接的转录起始区域或启动子。这样的表达被提供有用于将基因或目的基因插入的多个限制性位点，以便使所述基因或目的基因位于调节性区域的转录调节之下。
[0251] 转录起始区域即启动子可以对于宿主是天然的、或同源的、或外源的、或异源的，或者可以是天然序列或合成序列。外源意指转录起始区域未见于该转录起始区域引入到其中的野生型宿主中。就目的编码序列而言，可以使用天然或异源启动子。
[0252] 转录盒可以在转录的5′-3′方向上包含转录和翻译起始区、目的DNA序列以及在植物中起作用的转录和翻译终止区。终止区域可以与转录起始区域一起是天然的，可以与目的DNA序列一起是天然的，或者可以源自另一种来源。方便的终止区域可从马铃薯蛋白酶抑制剂(PinII)基因或来自根瘤农杆菌(A.tumnefaciens)的Ti-质粒的序列获得，例如胭脂碱合酶、章鱼碱合酶和乳白蛋白(opaline)合酶终止区域。还参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]262：141-144；Proudfoot(1991)Cell[细胞]64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.[基因与发育]5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene[基因]91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：7891-7903；以及Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.[核酸研究]15：9627-9639。
[0253] 表达盒可另外在表达盒构建体中包含5′前导序列。这些前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：细小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区)(Elroy-Stein，O.、Fuerst，T.R.和Moss，B.(1989)PNAS USA[美国科学院院报]，86：6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison等人(1986)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)；Virology[病毒学]，154：9-20)；以及人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，D.G.，和P.Sarnow(1991)Nature[自然]，353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白MARNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling，S.A.，和Gehrke，L.，(1987)Nature[自然]，325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)Molecular Biology of RNA[RNA分子生物学]，第237-256页；
Gallie等人(1987)Nucl.Acids Res.[核酸研究]15：3257-3273)；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lornmel，S.A.等人(1991)Virology[病毒学]，81：382-385)。还参见，Della-Cioppa，等人，(1987)Plant Physiology[植物生理学]84：965-968。和内源性玉米5′非翻译序列。还可以利用已知增强翻译的其他方法，例如内含子等。
Gallie等人(1987)Nucl.Acids Res.[核酸研究]15：3257-3273)；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lornmel，S.A.等人(1991)Virology[病毒学]，81：382-385)。还参见，Della-Cioppa，等人，(1987)Plant Physiology[植物生理学]84：965-968。和内源性玉米5′非翻译序列。还可以利用已知增强翻译的其他方法，例如内含子等。
[0254] 表达盒可以含有一个或多个基因或核酸序列以在转化的植物中转移和表达。因此，每个核酸序列将可操作地连接至5′和3′调节序列上。可替代地，可以提供多个表达盒。
[0255] 实验
[0256] 实例1：质粒。
[0257] 将包含表1中所述的T-DNA的质粒用于下文所述的实验中。表1中列出的质粒具有含有所示组分的T-DNA。
[0258] 表1.质粒组分。
[0259]
[0260]
[0261]
[0262]
[0263]
[0264]
[0265] 实例2：培养基。
[0266] 实例中引用了各种培养基以用于转化和细胞培养。培养基组成如下面表2-9中所述。
[0267] 表2.用于高粱转化的培养基。
[0268]
[0269]
[0270] aPHI-I、PHI-T、PHI-U、PHI-V、PHI-X和PHI-Z培养基，来自Zhao等人2000[0271] bMS维生素原液：0.1g/l烟酸、0.1g/l盐酸吡哆醇、0.02g/l硫胺素HCl、0.4g/l甘氨酸。
[0272] 表3.小麦液体感染培养基WI 4的组成。
[0273]
[0274] 表4.小麦共培养基WC#10的组成。
[0275]
[0276]
[0277] 表5.小麦绿色组织培养基DBC4的组成。
[0278]
[0279] 表6.小麦绿色组织诱导培养基DBC6的组成。
[0280]
[0281]
[0282] 表7.小麦再生培养基MSA的组成。
[0283]
[0284] 表8.小麦再生培养基MSB的组成。
[0285]
[0286] 表9.用于玉米转化、选择和再生的培养基形成。
[0287]
[0288]
[0289]
[0290] 表9，续。
[0291]
[0292]
[0293] 实例3：粒子轰击。
[0294] 在轰击前，从先锋近交系PH184C的穗中分离10-12个DAP未成熟胚，并将其置于含16％蔗糖的培养基上3小时，以使盾片细胞质壁分离。
[0295] 每次粒子轰击通常使用四种质粒；1)含有用于重组酶介导的盒交换的FRT侧翼供体盒的供体质粒(100ng/μl)，2)含有表达盒UBI PRO：：FLPm：：PinII的质粒(2.5ng/μl)，3)含有表达盒UBI PRO：：ODP2：：PinII的质粒(10ng/μl)，和4)含有表达盒UBI：：WUS2：：PinII的质粒(5ng/μl)。为了将DNA附着到0.6μm金颗粒上，在低结合微量离心管(索伦森生物科学公司(Sorenson Biosciences)39640T)中通过一起添加每种质粒10μl(总共40μl)将四种质粒混合。向该悬浮液中添加50μl的0.6μm金颗粒(30μg/μl)和1.0μl的转运蛋白(Transit)20/20(目录号MIR5404，米卢斯生物有限责任公司(Mirus Bio LLC))，并将悬浮液置于旋转振荡器上10分钟。以10,000RPM(约9400x g)将悬浮液离心并弃去上清液。将金颗粒重悬于
120μl的100％乙醇中，以低功率短暂超声处理，并将10μl移液到每个飞片(flier)上。然后风干飞片以去除所有剩余的乙醇。使用基因枪PDF-1000在28英寸汞柱处使用200PSI破裂片进行粒子轰击。
120μl的100％乙醇中，以低功率短暂超声处理，并将10μl移液到每个飞片(flier)上。然后风干飞片以去除所有剩余的乙醇。使用基因枪PDF-1000在28英寸汞柱处使用200PSI破裂片进行粒子轰击。
[0296] 实例4：农杆菌介导的玉米转化。
[0297] A.农杆菌主板的制备。
[0298] 将具有二元供体载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)从-80℃冷冻等分试样划线到固体12V培养基上，并在28℃在黑暗中培养2-3天以制备主板。
[0299] B.使农杆菌在固体培养基上生长。
[0300] 从主板中挑取农杆菌的单个菌落或多个菌落，并划线到含有810I培养基的第二平板上，并在28℃在黑暗中孵育1-2天。将农杆菌感染培养基(700培养基；5ml)和100mM 3′-5′-二甲氧基-4′-对羟基苯乙酮(乙酰丁香酮；5μL)添加到通风橱中的14mL锥形管中。将来自第二板的大约3个满环的农杆菌悬浮在管中，并然后将管涡旋以形成均匀的悬浮液。将悬浮液(1ml)转移到分光光度计管中，并将悬浮液的光密度(550nm)调节至约0.35-2.0的读
9
数。农杆菌浓度为大约0.5至2.0×10 cfu/mL。将最终农杆菌悬浮液等分到2mL微量离心管中，每个管含有约1mL的悬浮液。然后尽快使用悬浮液。
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数。农杆菌浓度为大约0.5至2.0×10 cfu/mL。将最终农杆菌悬浮液等分到2mL微量离心管中，每个管含有约1mL的悬浮液。然后尽快使用悬浮液。
[0301] C.使农杆菌在液体培养基中生长。
[0302] 可替代地，可以通过在液体培养基中生长来制备农杆菌用于转化。感染前一天，用30ml的557A培养基(10.5g/l磷酸氢二钾、4.5g/l无水磷酸二氢钾、1g/l硫酸铵、0.5g/l柠檬酸钠脱水物、10g/l蔗糖、1mM硫酸镁)和30μL壮观霉素(50mg/mL)和30μL乙酰丁香酮(20mg/mL)制备125ml烧瓶。将来自第二板的半环农杆菌悬浮在烧瓶中并置于设定为200rpm的定轨摇床上，并在28℃下孵育过夜。将农杆菌培养物以5000rpm离心10分钟。除去上清液并添加含有乙酰丁香酮溶液的农杆菌感染培养基。通过涡旋重悬细菌，并将农杆菌悬浮液的光密度(550nm)调节至约0.35至2.0的读数。
[0303] D.玉米转化。
[0304] 将玉米(玉蜀黍(Zea mays L.))栽培品种的穗在20％(v/v)漂白剂(5.25％次氯酸钠)(加1滴Tween 20)中表面灭菌15-20分钟，接着在无菌水中洗涤3次。将未成熟胚(IE)从穗中分离并置于2ml含有乙酰丁香酮溶液的农杆菌感染培养基中。胚的最佳大小根据近交系而变化，但对于用WUS2和ODP2进行转化，可以使用大尺寸范围的未成熟胚。取出溶液并将1ml农杆菌悬浮液添加到胚中，并将管涡旋5-10秒。使微量离心管在通风橱中静置5分钟。将农杆菌和胚的悬浮液倾倒入710I共培养培养基中(参见表9)。使用无菌刮铲将留在管中的任何胚转移到板上。将农杆菌悬浮液取出并将胚轴侧向下置于培养基上。将板用Parafilm 膜(抗湿软塑料，可获自贝米斯公司(Bemis Company，Inc)，尼纳中心1号4楼，邮箱669，尼纳市，威斯康星州54957(1Neenah Center 4th floor，PO Box 669，Neenah，WI 54957))密封，并在21℃在黑暗中孵育1-3天进行共培养。
[0305] 将胚转移至静止培养基(605T培养基)而不进行选择。3至7天后，将它们转移至补充有选择剂的成熟培养基(289Q培养基)中。
[0306] 实例5：ODP2和WUS2的表达。
[0307] 以下实验证明，在农杆菌感染后立即表达ODP2和WUS2导致直接体细胞胚发生。
[0308] A.PLTP启动子驱动ODP2并且NOS启动子驱动WUS2表达导致快速、直接的体细胞胚形成。
[0309] 在授粉后大约11天从先锋玉米近交系PH184C收获未成熟胚(长度2-2.5mm)，并用农杆菌菌株AGL1感染，该菌株AGL1含有具有以下组成的T-DNA；RB+NOS PRO：：Top2：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO：：UBI1ZM INTRON：：ESR：：SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO：：HRA：：SB-PEPC1 TERM+LTP2 PRO：：
ZS-YELLOW：：PINII TERM-LB，如实例3中所述。对于PLTP PRO，参见SEQ ID NO.1。将农杆菌在液体培养基中生长至光密度为0.5(在520nm处)，并将未成熟胚(来自三个独立穗的53个、
52个和56个胚)在农杆菌悬浮液中孵育5分钟，然后从液体中取出放置在固体710I培养基上。
ZS-YELLOW：：PINII TERM-LB，如实例3中所述。对于PLTP PRO，参见SEQ ID NO.1。将农杆菌在液体培养基中生长至光密度为0.5(在520nm处)，并将未成熟胚(来自三个独立穗的53个、
52个和56个胚)在农杆菌悬浮液中孵育5分钟，然后从液体中取出放置在固体710I培养基上。
[0310] 24小时后，将胚移至605T培养基以开始针对农杆菌进行选择。6天后，在124个处理过的未成熟胚中的每一个的表面上观察到许多小的体细胞胚。每个未成熟胚含有大量不同的单个体细胞胚，许多胚被清晰的胚柄支撑。由ODP2和WUS2的表达产生的代表性胚显示在图1和图2中，例如参见图1中指向新形成的胚的箭头。也可以在图2中看到新形成的荧光胚。在农杆菌感染开始后4天使用具有来自顶部的照明的立体显微镜捕获图1中的图像。合子胚的总长度为大约1.5mm。将图2中显示的胚用AXIG1：：WUS2：：IN2和PLTP：：ODP2：：OS-T28表达盒以及UBI PRO：：ZS-GREEN：：PINII表达盒转化。图像显示了在使用所披露的方法处理后，生长在经最初转化的合子胚的盾片表面上的荧光胚。，使用具有落射荧光附加器和标准莱卡GFP过滤器装置的立体显微镜，在农杆菌感染开始后4天捕获该图像。合子胚的总长度为大约1.5mm。
[0311] 在农杆菌感染后七天，将胚转移至成熟培养基(具有0.1mg/l灭草烟的289Q培养基)中，使用咪唑啉酮除草剂来选择转基因胚。在成熟培养基上14天后，将成熟胚移至生根培养基(13158H培养基；13158培养基加25mg/l头孢噻肟)并取样叶片用于PCR分析。从来自第一穗的53个胚中，使用PCR分析对12个除草剂抗性植物进行分析，并在实验开始(在开始农杆菌转化时开始)后32-34天之间送到温室。通过从每个植物中取得两个样品(来自两个相对的叶(来自植物的相反两侧)的各一个)来对植物取样用于PCR，以确认植物不是嵌合的。来自所有植物的每对样品的PCR结果表明没有产生嵌合植物，并且T0植物是均匀转基因的。
[0312] B.比较无除草剂的选择、添加支链氨基酸的无除草剂的选择、或用灭草烟的选择。
[0313] 进行该实验的两次重复，两次重复之间的差别仅仅是开始的未成熟胚的数量和移动到实验的连续阶段的胚(或植物)的数量。对于两次重复，用农杆菌菌株AGL1(THY-)感染的来自先锋近交系PH184C的未成熟胚，该菌株AGL1包含以下T-DNA(来自PHP77833)；RB+NOS PRO：：Top2：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO：UBI1ZM INTRON：ESR：：SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO：：HRA：：SB-PEPC1 TERM+LTP2 PRO：：ZS-YELLOW：：PINII TERM-LB。在液体农杆菌悬浮液中感染5分钟后，将未成熟胚转移至固体培养基(270I培养基)过夜。第二天，将胚移至以下三种培养基之一上：605T；具有0.1mg/l胺苯磺隆(也含有除草剂灭草烟(0.1mg/l)用于选择)加支链氨基酸(缩写为“AA”，含有100mM亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸)的605T；或具有0.1mg/l胺苯磺隆(也含有除草剂灭草烟(0.1mg/l)用于选择)、不含支链氨基酸的605T。12天后将胚移至成熟培养基，其中将来自605T培养基的胚转移至具有0.1mg/l灭草烟的289Q培养基(在成熟过程中选择)中，将来自具有0.1mg/l胺苯磺隆和AA的605T培养基的胚转移至289Q培养基(早期选择，但在成熟过程中不选择)，并且将来自具有0.1mg/l胺苯磺隆的培养基605T的胚移至289Q培养基(早期选择)。16天后，将具有健康体细胞胚的胚移至再生培养基272V培养基上。
[0314] 对于该实验的第一次重复，用农杆菌处理206个胚，并且一天后将106个、67个或33个胚移至605T培养基(第一周不选择)、具有0.1mg/l胺苯磺隆和AA的605T培养基(用AA进行早期选择)或具有0.1mg/l胺苯磺隆的605T培养基(不用AA进行早期选择)。对于下一次转移，将45个、16个和0个胚移至它们各自的成熟培养基上。对于最终转移至生根培养基，移动了18个、10个和0个小植株(单个事件)。在这些事件中，对16个和10个植物取样用于PCR，并且6个和2个植物被发现是整合转基因的单拷贝，并且分别观察到0个和2个野生种(在选择过程中存活的野生型植物)。对于该实验的这一重复，从农杆菌感染到温室的总的经过时间为48天。这些结果表明，没有继续选择到胚成熟的早期选择允许野生型野生种存活(伴随一些转基因事件)。然而，没有补充支链氨基酸的早期选择似乎在体细胞胚形成时的阶段是有胁迫的，因此没有产生事件。在成熟阶段开始时开始选择对事件回收是最有效的并且没有野生种。
[0315] 对于第二次重复，将总共196个胚用农杆菌在液体中处理5分钟，然后在710I培养基上共培养一天。此时，将94个、66个或36个胚分别移到605T培养基、具有0.1mg/l胺苯磺隆和AA的605T培养基或具有0.1mg/l胺苯磺隆的605T培养基上。十二天后，将605T上的94个胚分到具有0.1mg/l灭草烟的289Q培养基或具有0.5mg/l灭草烟的289Q培养基上(每种47个胚)。将来自具有0.1mg/l胺苯磺隆和AA的605T培养基以及具有0.1mg/l胺苯磺隆的605T培养基两者的胚移至289Q(不进行进一步选择)。成熟后，将健康小植株(事件)转移至生根培养基13158H，分别从上述四种成熟处理中移出14个、11个、13个和0个事件。最终，将4个、5个和2个植物送到温室进行三次处理，从所述处理中回收事件，并且在成熟过程中从0.5mg/l灭草烟选择仅产生一个单拷贝事件。
[0316] C.比较两种驱动ODP2表达的启动子ZM-PLTP PRO：：Top1和DR5 PRO：：Top3。
[0317] 对于这两种处理，将来自先锋近交系PH184C的未成熟胚收获、用含有各自质粒的农杆菌菌株AGL1(THY-)处理、与农杆菌在共培养培养基710I上一天后转移到605T培养基上、在605T培养基上培养10天、移到具有0.1mg/l胺苯磺隆的13226D中两天、并且然后转移到成熟培养基(具有0.1mg/l灭草烟的289Q)中13天。成熟后，将小植株(事件)移至生根(发芽)培养基13158上10天(生根阶段)。
[0318] i.ZM-PLTP启动子驱动ZM-ODP2表达。
[0319] 用含有PHP78157(SEQ ID NO.23)的农杆菌处理80个未成熟胚。最初，所有处理过的未成熟胚通过在每个盾片表面上快速产生许多单个体细胞品胚来响应。在生根阶段结束时，产生了18个小植株。将10个植物的一个子集送到温室并取样用于PCR分析(在温室的总的经过时间为46天)。在这10个中，6个是多拷贝和/或含有质粒骨架(BB)，并且有4个野生种。
[0320] ii.DR5启动子驱动ODP2表达。
[0321] 使用含有PHP78156的农杆菌处理70个未成熟胚，所述农杆菌具有含有以下的T-DNA：RB+NOS PRO：：Top2：：WUS2：：IN2-1 TERM+DR5 PRO：Top3：ODP2：：OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO：：ESR：：SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO：：HRA：：SB-PEPC1 TERM+LTP2 PRO：：ZS-YELLOW：：PINII TERM-LB(SEQ ID NO：24)。
[0322] 最初，所有处理过的未成熟胚通过在每个盾片表面上快速产生许多单个体细胞品胚来响应。在生根阶段结束时，产生了18个小植株。将12个植物的一个子集送到温室并取样用于PCR分析(在温室的总的经过时间为46天)。在通过PCR分析的这12个植物中，6个是多拷贝/BB+，4个是单拷贝和无骨架(BB-)，并且有2个野生种。
[0323] 实例6：ZM-PLTP：：ZM-ODP2+ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2。
[0324] ODP2在PLTP启动子控制下的表达和WUS2在AXIG1启动子控制下的表达导致改善的植物回收、高频率的送到温室的植物和更高频率的单拷贝事件。
[0325] 从两个玉米近交系(HC69和PH184C)收获未成熟胚，并用含有PHP79023(SEQ ID NO：25)或PHP79024(SEQ ID NO：26)的农杆菌(菌株LBA4404THY-)感染。对于近交系HC69，用PHP79024转化67个未成熟胚，最终产生26个对0.1mg/l灭草烟具有抗性的植物(相对于起始胚的数量频率为38.8％)。相比之下，当用PHP79023转化65个HC69胚时，将10个除草剂抗性植物送到温室(频率为15.4％)。另外，使用PHP79024产生的植物在温室中更有活力且更健康。在用农杆菌感染后33天，将来自两种起始质粒的转基因植物送到温室。
[0326] 对于近交系PH184C，用PHP79024转化64个未成熟胚，最终产生30个对0.1mg/l灭草烟具有抗性的植物(相对于起始胚的数量频率为46.8％)。相比之下，当用PHP79023转化73个PH184C胚时，将27个除草剂抗性植物送到温室(频率为37％)。另外，使用PHP79024产生的植物在温室中更有活力且更健康。在用农杆菌感染后33天，将来自两种起始质粒的转基因植物送到温室。因此，对于这两个近交系，使用DR5启动子来驱动WUS2(连同PLTP PRO：：ODP2)的表达迅速产生可以发芽成转基因T0植物的转基因体细胞胚，但是对于在转基因植物生产的总体频率方面和在温室中的T0活力和健康方面两者，AXIG1 PRO：：WUS2+PLTP PRO：：ODP2的组合甚至更有效。
[0327] 实例7：从支撑盾片分离体细胞胚。
[0328] 通过从原始合子未成熟胚的支撑盾片分离体细胞胚来改善独立转基因植物的回收。
[0329] 使用具有质粒PHP79066(SEQ ID NO：28)(参见表1)的农杆菌菌株AGL1(THY-)转化来自先锋近交系PHH5G的未成熟胚。在培养基710I上将45个未成熟胚与农杆菌共培养一天后，将未成熟胚移至无选择的静止培养基(605T培养基)上12天。将胚移至成熟培养基上13天，并且清楚地观察到来源于单个原始合子未成熟胚的多个成熟体细胞胚(图3)。此时，将胚从固体培养基中取出并置于液体培养基(289R培养基)中。然后将含有悬浮的玉米组织的管以高功率涡旋30-60秒，每10-15秒目视检查悬浮液直至看起来组织分散。然后将液体悬浮液倾倒在固体生根培养基(具有0.1mg/l灭草烟除草剂的13158H培养基)上，并将液体从板上用移液管移出。从这种材料中，生产了超过200个植物(图4中所示的代表性植物)，这导致每个转化的起始胚回收平均4.4个植物。在大约200个T0植物中，对152个植物取样用于PCR分析，全部基于PCR结果进行转化(无野生种)，并且43个植物对于没有农杆菌骨架的转基因是单拷贝的(28.3％单拷贝、无BB)。基于这个频率、回收的T0植物的总数量和胚的起始数量、有质量的可用的T0事件(单拷贝、无骨架)的生产基于起始胚的数量超过100％。
[0330] 实例8：CRE介导的切除。
[0331] A.UBI：：CRE：：PINII介导的切除。
[0332] 将未成熟胚从先锋近交系HC69(293个胚)和PH184C(241个胚)收获，并用农杆菌菌株AGL1(THY-)转化，该菌株AGL1具有含有表1中所示的遗传元件的质粒PHP80334(SEQ ID NO：42)。在液体培养基710I中暴露于农杆菌5分钟后，将胚铺在琼脂固化的710I培养基上过夜共培养。在共培养一天后，将胚移至静止培养基(无选择的605T)中7天、转移至成熟培养基(具有0.1mg/l灭草烟的289Q)中14天、并且然后移至生根(发芽)培养基上至少14天，然后将植物移至温室。基于转化的胚的原始数量，19.1％和13.8％的原始胚分别在HC69和PH184C中产生转基因植物。为了确定切除频率，进行了7次PCR反应以检测CRE、WUS2、ODP2、ZS-GREEN1和ESR表达盒(即，原始是在T-DNA中两个LOXP位点之间的所有多核苷酸区段)的不存在和HRA表达盒的存在。PCR结果揭示，21％的HC69植物仅含有HRA表达盒(赋予除草剂灭草烟抗性)，并且在两个原始LOXP位点之间的区段已被切除。因此，这些植物不再含有CRE、WUS2、ODP2、ZS-GREEN1和ESR表达盒。当对植物分析HRA盒存在、所有其他盒已被切除时，PH184C的切除频率甚至高于HC69，其中47％的植物显示已发生完全、完美的切除。
[0333] 当含有UBI PRO：：CRE的质粒与未设计用于切除的构建体比较时，在早期生长响应中观察到差异。与含有AXIG1 PRO：：WUS2+PLTP PRO：：ODP2的非切除构建体相比，其中体细胞胚在农杆菌感染后6天可见，在此间隔期间在UBI PRO：：CRE处理中没有观察到荧光体细胞胚。泛素启动子(UBI PRO)是一种非常强大的组成型启动子，已经被广泛使用很多年(Christensen和Quail，(1996)Transgenic Research[转基因研究]5：213-218)。由于其强度和普遍存在的表达模式，预期UBI PRO：：CRE在被引入细胞后将立即开始表达，因此预期WUS和ODP2表达盒可以在能够刺激体细胞胚形成之前被切除。然而令人惊讶的是，当原始合子胚被置于成熟培养基上时，观察到多个胚形成于原始是单个合子胚的胚上。除草剂灭草烟的成熟是针对野生型生长的非常严格的选择，并且与此一致，PCR结果证实了所得的植物是转基因的并且通过PCR分析的单拷贝T0植物的60％显示发生WUS、ODP2、CRE、ZS-GREEN1和ESR的完美切除。PHP80334的T-DNA含有位于loxP重组位点内的AXIG1 PRO：：WUS2、PLTP PRO：：ODP2、UBI PRO：：CRE、UBI PRO：：ZS-GREEN和ESR表达盒。当将这种T-DNA引入未成熟胚细胞中时，未观察到绿色荧光，这表明切除发生在绿色荧光蛋白可能累积至可见水平之前(通常在未切除的UBI PRO：：ZS-GREEN表达盒中少于24小时)。这些数据显示，WUS和ODP2的短脉冲对于快速从头体细胞胚形成和这些体细胞胚的发芽以产生转基因T0植物是有效的。
[0334] B.GLB1：：CRE介导的切除。
[0335] 将未成熟胚从先锋近交系PH184C收获，并用具有含有表1中所示遗传元件的质粒PHP80338(SEQ ID NO：43)的农杆菌菌株AGL1(THY-)转化。转化、选择和植物发芽方法与上述实例8-A中针对UBI PRO：：CRE实验描述的相同。对T0植物的PCR分析表明58％的单拷贝植物已经经历了发育基因(ODP2和WUS)和CRE的完全切除。已知在胚发育期间(LTP2、OLE、END-2)或受到胁迫刺激(IN2-1)时驱动表达的替代性启动子也导致在发芽前切除发育基因(ODP2、WUS2)和CRE以产生转基因T0植物。
[0336] 在驱动CRE表达的不同启动子的比较中，从先锋近交系HC69或PH184C收获未成熟胚，并用含有如下质粒的农杆菌菌株LBA4404(Thy-)转化，所述质粒含有具有以下组分的T-DNA；RB-loxP-AXIG1 PRO：：WUS2：：In2-1 TERM+PLTP PRO：：ODP2：：PINII TERM+“X PRO”：：CRE：：OS-T28 TERM-loxP+SB-ALS PRO：：ZM-HRA：：PINII TERM，其中“X PRO”是用于驱动WUS、ODP2和CRE切除的玉米UBI PRO、WOX2a PRO、IN2 PRO、LTP2 PRO、OLE PRO、GLB1 PRO、HSP17.7 PRO或HSP26 PRO。在液体培养基710I中暴露于农杆菌5分钟后，将胚铺在琼脂固化的710I培养基上过夜共培养。在共培养一天后，将胚移至静止培养基(无选择的605T)中7天、转移至成熟培养基(具有0.1mg/l灭草烟的289Q)中14天、并且然后移至生根(发芽)培养基上至少14天，然后将植物移至温室。
[0337] 表10.驱动CRE重组酶表达的启动子的转化和切除频率。
[0338]
[0339] 如表10中所示，通过来自给定数量的起始未成熟胚的回收的T0植物的数量来测量转化效率，并且显示了WUS2、ODP2和CRE的切除频率。表10还显示了被农杆菌感染的未成熟胚的数量、产生的T0植物的数量、计算的转化频率[(T0植物的数量/感染的胚的数量)*100]和最终的切除频率(基于在存在或不存在WUS、ODP2、CRE和HRA的情况下的PCR分析)。对于近交系PH184C，在T-DNA含有WOX2a：：CRE：：PINII或IN2：：CRE：：PINII(分别为PHP80558或PHP80560)的阴性对照处理中没有观察到切除。然而，对于驱动CRE的启动子在整个植物中强烈表达(UBI)、在发育的胚中强烈表达(LTP2、OLE、GLB1)或通过热处理强烈诱导(HSPl7.7、HSP26)的处理，切除频率的范围在40％与60％之间。对于UBI PRO，WUS2和ODP2的切除很快，这导致降低的转化频率(9％)，并且如在T0植物中测量的切除频率高达60％。对于在胚发育中到后期期间表达的启动子(LTP2、OLE和GLB1)，转化频率高于UBI(分别为33％、26％和22％)，而切除频率略低于UBI(分别为50％、40％和47％)。使用HSP17.7来控制CRE表达的处理在这两个类别中产生总体最佳结果，产生最高转化频率(54％)和最高切除频率(67％)。HSP26产生的结果与胚启动子的范围相同，并且转化和切除频率分别为32％和
54％。
54％。
[0340] 当使用胚发育型启动子进行切除时，在这些处理中观察到许多体细胞胚(类似于没有切除组分存在的实验)，这表明表达延迟到胚发育的后期阶段，但是当发育触发时，表达在整个胚中均匀、强烈，导致WUS2、ODP2和CRE的有效切除。对于热响应型启动子，推迟暴露于热(即连续三天重复42℃持续2小时)直到胚移到成熟培养基上，这导致转化后迅速形成大量体细胞胚，接着是随后的有效切除。
[0341] 实例9：改善的位点特异性重组事件的回收。
[0342] 从PH184C收获未成熟的穗，并在粒子轰击处理当天从籽粒中提取2.0mm的未成熟胚。在粒子轰击之前将胚置于高渗透培养基(13224B培养基)上3小时。用等摩尔比的含有以下表达盒的质粒轰击未成熟胚：FRT1：PMI：：PINII TERM：FRT87+UBI PRO：UBI1ZM INTRON：：MO-FLP：：PINII TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-OD)P2：：PINII TERM+ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：
PINII TERM。在粒子轰击后，将未成熟胚保持在高渗透培养基上过夜，并然后转移到静止培养基(具有150mg/l G418的13266K培养基)中8天。在静止期后，将胚转移至成熟培养基(具有150mg/l G418的289O培养基)中21天、并且然后移至生根培养基(具有150mg/l G418的
272X培养基)中14-17天(直到根足够大以移植到土壤中)。在小植株阶段，对叶组织取样用于PCR分析以确认原始靶基因座的侧翼FRT1和FRT87位点内的基因不再存在，并且供体盒内的新基因已正确重组到靶基因座中-并且鉴定了精确的RMCE(重组酶介导的盒交换)事件。
这减少了从转化到在温室中具有精确的RMCE来源的植物的整个SSI周期，减少到43-50天，这取决于需要多长时间来产生足够的根。可替代地，使用具有AXIG1 PRO：：WUS2+PLTP PTO：：ODP2的构建体开发农杆菌介导的SSI方法。在两个单独的实验中递送两种T-DNA；第一种T-DNA在侧翼的FRT1和FRT87重组位点内含有PMI、WUS2、ODP2和DsRED表达盒(RB-UBI PRO：UBI1ZM INTRON：：MO-FLP：：PINII TERM+CaMV35S TERM+FRT1：PMI：：PINII TERM+ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+UBI PRO：：
UBI1ZM INTRON：：DsRED：FRT87-LB)(RV003866)，以及第二种T-DNA在FRT1和FRT87位点内仅含有PMI和DsRED(RB-+ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：
OS-T28 TERM UBI PRO：UBI1ZM INTRON：：MO-FLP：：PINII TERM+CaMV35S TERM+FRT1：PMI：：
PINII TERM+UBI PRO：：UBI1ZM INTRON：：DsRED：FRT87-LB)(RV004886)。如美国临时专利申请号62/296639(通过引用以其全文结合在此)所述，将每种T-DNA经由农杆菌介导的转化递送至具有FRT1-FRT87着陆位点的靶系中。使用如在#5907USPSP中所述的多重PCR测定来鉴定精确的RMCE事件，并且数据总结于表11中。与用于产生SSI事件的正常转化方法相比，使用AXIG1 PRO：：WUS2+PLTP PTO：：ODP2表达盒用于农杆菌SSI将整个SSI过程减少了几周(至少3-4周)。
PINII TERM。在粒子轰击后，将未成熟胚保持在高渗透培养基上过夜，并然后转移到静止培养基(具有150mg/l G418的13266K培养基)中8天。在静止期后，将胚转移至成熟培养基(具有150mg/l G418的289O培养基)中21天、并且然后移至生根培养基(具有150mg/l G418的
272X培养基)中14-17天(直到根足够大以移植到土壤中)。在小植株阶段，对叶组织取样用于PCR分析以确认原始靶基因座的侧翼FRT1和FRT87位点内的基因不再存在，并且供体盒内的新基因已正确重组到靶基因座中-并且鉴定了精确的RMCE(重组酶介导的盒交换)事件。
这减少了从转化到在温室中具有精确的RMCE来源的植物的整个SSI周期，减少到43-50天，这取决于需要多长时间来产生足够的根。可替代地，使用具有AXIG1 PRO：：WUS2+PLTP PTO：：ODP2的构建体开发农杆菌介导的SSI方法。在两个单独的实验中递送两种T-DNA；第一种T-DNA在侧翼的FRT1和FRT87重组位点内含有PMI、WUS2、ODP2和DsRED表达盒(RB-UBI PRO：UBI1ZM INTRON：：MO-FLP：：PINII TERM+CaMV35S TERM+FRT1：PMI：：PINII TERM+ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+UBI PRO：：
UBI1ZM INTRON：：DsRED：FRT87-LB)(RV003866)，以及第二种T-DNA在FRT1和FRT87位点内仅含有PMI和DsRED(RB-+ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：
OS-T28 TERM UBI PRO：UBI1ZM INTRON：：MO-FLP：：PINII TERM+CaMV35S TERM+FRT1：PMI：：
PINII TERM+UBI PRO：：UBI1ZM INTRON：：DsRED：FRT87-LB)(RV004886)。如美国临时专利申请号62/296639(通过引用以其全文结合在此)所述，将每种T-DNA经由农杆菌介导的转化递送至具有FRT1-FRT87着陆位点的靶系中。使用如在#5907USPSP中所述的多重PCR测定来鉴定精确的RMCE事件，并且数据总结于表11中。与用于产生SSI事件的正常转化方法相比，使用AXIG1 PRO：：WUS2+PLTP PTO：：ODP2表达盒用于农杆菌SSI将整个SSI过程减少了几周(至少3-4周)。
[0343] 表11.使用WUS2和ODP2表达回收农杆菌SSI实验中的RMCE事件。
[0344]载体 #感染的胚 #T0植物 #RMCE ％RMCE
RV003866 859 42 6 0.7
RV004886 836 10 1 0.1
RV003866 859 42 6 0.7
RV004886 836 10 1 0.1
[0345] 实例10：改善的含有CAS9/CRISPR介导的基因组修饰的事件的回收。
[0346] 使用玉米基因组的CAS9介导的切割来将单个密码子改变引入玉米ALS2基因中。为了产生ALS2编辑的等位基因，将794bp同源性片段克隆到质粒载体中，并将两种127个核苷酸单链DNA寡核苷酸作为修复模板(与天然序列相比含有若干个核苷酸改变)进行测试。794bp修复模板包括单核苷酸改变，所述单核苷酸改变将指导对应于氨基酸位置165处的脯氨酸改变成丝氨酸(P165S)的DNA序列编辑，以及在ALS-CR4靶位点和PAM序列内的三个另外的改变。修复模板内PAM序列的修饰将甲硫氨酸密码子(AUG)改变为天然存在于ALS1基因中的异亮氨酸(AUU)。用于粒子轰击、选择和再生的培养基类似于本文使用的那些培养基。用两种寡核苷酸或单个质粒修复模板(UBI PRO：UBI1ZM INTRON：CAS9：：PINII、POLIII PRO：：
ALS～CR4 gRNA、UBI PRO：UBI1ZM INTRON：MOPAT～DSRED：：PINII TERM、ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：PINII TERM和ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：PINII TERM)轰击大约1,000个未成熟胚/处理。在粒子轰击后，将未成熟胚置于含有3mg/l双丙氨膦(biolaphos)的培养基上以选择除草剂抗性体细胞胚。在8天的静止期之后，将胚转移至具有双丙氨膦的成熟培养基上21天，并然后移至生根培养基上14-17天(直到根足够大以移植到土壤中)。转化后5周，将在选TM
择性培养基上生长的200个(每个处理)随机选择的独立幼小植株转移到PlantCon 容器(可容纳高度多达6”的植物的无菌塑料容器)中的新鲜双丙氨磷培养基中。将剩余的小植株(大约800个/处理)转移到在PlantConsTM(预先灭菌的植物组织培养容器，可获自MP生物医学有限责任公司(MP Biomedicals LLC)，赫顿中心驾驶道3号套房100号，圣安纳市(Santa Anna)，加利福尼亚州92707(3Hutton Center Drive，Suite 100，Santa Anna，CA 92707))中含有100ppm氯磺隆(作为编辑的ALS2基因的直接选择)的的固体培养基上。一个月后，对
384个随机取样的小植株(无选择)和经过氯磺隆选择后存活的7个小植株取样用于分析。在
9个小植株中检测到编辑的ALS2等位基因：两个小植株源自生长在双丙氨膦上生长的随机选择的小植株并使用794bp修复DNA模板产生，并且剩余的7个源自使用127nt单链寡核苷酸编辑的氯磺隆抗性小植株。对ALS1基因的分析仅揭示了证实ALS-CR4 gRNA的高特异性的野生型序列。
ALS～CR4 gRNA、UBI PRO：UBI1ZM INTRON：MOPAT～DSRED：：PINII TERM、ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：PINII TERM和ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：PINII TERM)轰击大约1,000个未成熟胚/处理。在粒子轰击后，将未成熟胚置于含有3mg/l双丙氨膦(biolaphos)的培养基上以选择除草剂抗性体细胞胚。在8天的静止期之后，将胚转移至具有双丙氨膦的成熟培养基上21天，并然后移至生根培养基上14-17天(直到根足够大以移植到土壤中)。转化后5周，将在选TM
择性培养基上生长的200个(每个处理)随机选择的独立幼小植株转移到PlantCon 容器(可容纳高度多达6”的植物的无菌塑料容器)中的新鲜双丙氨磷培养基中。将剩余的小植株(大约800个/处理)转移到在PlantConsTM(预先灭菌的植物组织培养容器，可获自MP生物医学有限责任公司(MP Biomedicals LLC)，赫顿中心驾驶道3号套房100号，圣安纳市(Santa Anna)，加利福尼亚州92707(3Hutton Center Drive，Suite 100，Santa Anna，CA 92707))中含有100ppm氯磺隆(作为编辑的ALS2基因的直接选择)的的固体培养基上。一个月后，对
384个随机取样的小植株(无选择)和经过氯磺隆选择后存活的7个小植株取样用于分析。在
9个小植株中检测到编辑的ALS2等位基因：两个小植株源自生长在双丙氨膦上生长的随机选择的小植株并使用794bp修复DNA模板产生，并且剩余的7个源自使用127nt单链寡核苷酸编辑的氯磺隆抗性小植株。对ALS1基因的分析仅揭示了证实ALS-CR4 gRNA的高特异性的野生型序列。
[0347] 将包含编辑的ALS2等位基因的所有9个植物送到温室并取样用于另外的分子分析和后代测试。对ALS2等位基因的DNA序列分析证实存在P165S修饰以及与各自修复模板相关的其他核苷酸改变。分析两个T0植物的T1和T2后代以评估编辑的ALS2等位基因的遗传。通过测序分析了来源于使用来自野生型Hi-II植物的花粉进行杂交的后代植物，并证明了在亲本植物中观察到的编辑的等位基因的有性传播预期是1∶1分离比率(分别为57∶56和47∶49)。为了测试编辑的ALS序列是否赋予除草剂抗性，将选择的具有编辑的和野生型ALS2等位基因的四周龄的分开的T1植物用四种不同浓度的氯磺隆(50、100(1x)、200和400mg/升)进行喷雾。处理后三周，具有编辑的等位基因的植物显示正常表型，而仅具有野生型等位基因的植物显示出强烈的衰老迹象。另外，从种子分离的胚在具有100ppm氯磺隆的培养基上发芽，所述种子源自于用野生型HI-II花粉授粉的植物。发芽后14天，具有编辑的等位基因的植株显示正常的高度和发达的根系，而具有野生型等位基因的植株短且没有发育根。
[0348] 在上述实验中，当包含修复模板、Cas9、ALS-CR4gRNA和MoPAT-DsRED的质粒不包含ODP2和WUS2表达盒(在两种单独的质粒上)时，在先锋近交系PHH5G(阴性对照)中在对1000个未成熟胚进行粒子轰击并且在双丙氨膦上进行选择后没有回收到事件。通过比较，当将含有PLTP PRO：：ODP2：：PINII和AXIG1 PRO：：WUS2：：PINII TERM的质粒添加到用于金颗粒制备和粒子轰击的质粒混合物中时，回收到含有对ALS基因的CAS/CRISPR介导的基因编辑的事件。在对来自先锋近交系PHH5G的大约1000个未成熟胚进行粒子轰击后，回收了超过1000多个双丙氨膦抗性小植株，并且其中9个确定含有对赋予除草剂氯磺隆抗性的基因组ALS2基因的编辑。
[0349] 实例11：高粱中的高效率转化和快速T0植物生产。
[0350] 用下面总结的方法，使用优化的农杆菌介导的方案(Wu等人，2014，In Vitro Cellular and Developmental Biology[体外细胞和发育生物学]50：8-14)进行高粱转化。
[0351] A.高粱材料和转化过程。
[0352] 本研究中使用了非单宁高粱品种TX430。温室平均温度在日间为29℃，在夜间为20℃，光周期为12h日/夜，并且通过金属卤化物(1,000W)和高压钠(1,000W)灯的3∶1比例提供补充光照。表2中列出了本研究中使用的培养基组分。基线转化方案详细描述于Zhao等人(Plant Mol.Biol.[植物分子生物学](2000)44：789-798)的“treatment C[处理C]”中。简言之，将新鲜收获的高粱未成熟谷物用50％漂白剂和0.1％Tween-20在真空下灭菌30分钟，并然后用无菌水冲洗三次。胚经受以下五个连续步骤的处理：(1)农杆菌感染：将胚与PHI-I培养基在农杆菌悬浮液(在550nm处OD＝1.0)中孵育5分钟；(2)共培养：将胚在25℃在黑暗中感染3天后在PHI-T培养基上进行培养；(3)静止：将胚在PHI-T培养基(加100mg/l羧苄青霉素)上于28℃在黑暗中培养7天；(4)选择：将胚在PHI-U培养基上培养2周，接着使用2-3周的传代培养间隔，在28℃在黑暗中在PHI-V培养基上进行培养以进行剩余的选择过程；(5)再生：将愈伤组织在PHI-X培养基上在黑暗中培养2-3周以刺激芽发育，接着在25℃在16h光照(40-120μE m-2s-1)和8h黑暗的条件下培养1周，并在PHI-Z培养基上在光照下(16h，40-120μE m-2s-1)进行最后的传代培养2-3周以刺激根生长。将再生的小植株移植到土壤中并在温室中生长(Zhao等人2000)。将T0植物自花授粉以产生T1后代用于进一步分析。
[0353] 在另一个实验中，使胚经受以下五个连续步骤：(1)用PHP79023进行农杆菌感染：将胚用PHI-I培养基在农杆菌悬浮液(在550nm处OD＝1.0)中孵育5分钟；(2)共培养：将胚在
25℃在黑暗中感染7天后在PHI-T培养基上进行培养；(3)成熟期间的选择：将胚在具有
0.1mg/l灭草烟的培养基289M上成熟4周，接着在具有0.1mg/l灭草烟的培养基13113A(培养基13113A含有半强度MS盐和维生素、0.05g/l肌醇、20g/l蔗糖和3g/l植物凝胶，pH 5.6)上生根。将再生的小植株移植到土壤中并在温室中生长(Zhao等人2000)。将T0植物自花授粉以产生T1后代用于进一步分析。
25℃在黑暗中感染7天后在PHI-T培养基上进行培养；(3)成熟期间的选择：将胚在具有
0.1mg/l灭草烟的培养基289M上成熟4周，接着在具有0.1mg/l灭草烟的培养基13113A(培养基13113A含有半强度MS盐和维生素、0.05g/l肌醇、20g/l蔗糖和3g/l植物凝胶，pH 5.6)上生根。将再生的小植株移植到土壤中并在温室中生长(Zhao等人2000)。将T0植物自花授粉以产生T1后代用于进一步分析。
[0354] B.与高粱一起使用的农杆菌菌株和载体。
[0355] 使用根癌农杆菌菌株LBA4404(Lazo等人(1991)Biotechnology[生物技术]9：963-967)，其含有具有农杆菌vir基因的第一质粒(Komari(1990)Plant Cell[植物细胞]9：303-
306；Komari等人(1996)Plant J[植物杂志]10：165-174)和含有具有以下组分T-DNA的第二质粒(PHP80334)：RB+ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO：UBI1ZM INTRON：ESR：：SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO：：
HRA：：SB-PEPC1 TERM+UBI PRO：UBI1ZM INTRON：ZS-GREEN1：：PINII TERM：SB-ACTIN TERM-LB。为了比较，使用了另一种农杆菌，其含有仅在T-DNA中含有UBI PRO：UBIl ZM INTRON：
PMI：：PINII TERM表达盒(没有ZM-WUS2或ZM-ODP2表达盒)的第二质粒，其代表本实验中的对照处理。
306；Komari等人(1996)Plant J[植物杂志]10：165-174)和含有具有以下组分T-DNA的第二质粒(PHP80334)：RB+ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO：UBI1ZM INTRON：ESR：：SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO：：
HRA：：SB-PEPC1 TERM+UBI PRO：UBI1ZM INTRON：ZS-GREEN1：：PINII TERM：SB-ACTIN TERM-LB。为了比较，使用了另一种农杆菌，其含有仅在T-DNA中含有UBI PRO：UBIl ZM INTRON：
PMI：：PINII TERM表达盒(没有ZM-WUS2或ZM-ODP2表达盒)的第二质粒，其代表本实验中的对照处理。
[0356] C.高粱转化结果。
[0357] 当使用对照质粒时，总转化频率为20％，并且在送到温室并使用qPCR分析的T0植物中，40％是单拷贝的并且不含农杆菌骨架。对于对照处理，将从农杆菌感染开始直到将T0植物送到温室的持续时间在10-13周之间变化。
[0358] 当使用含有Zm-PLTP PRO：：ZM-ODP2+DR5 PRO：：ZM-WUS2(参见表1中的PHP79023)的质粒时，总转化频率为32％，并且在送到温室并使用qPCR分析的T0植物中，42％是单拷贝的并且不含农杆菌骨架，直接从原始感染的合子未成熟胚进行体细胞胚形成，接着是体细胞胚成熟、体外发芽和根形成。使用这种启动子和发育基因的组合大大减少了从农杆菌感染到将T0植物送到温室的时间，相对于对照处理减少了大约一半。
[0359] 在使用具有T-DNA(含有RB-ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+SB-ALS PRO：：ZM-HRA：：PINII TERM+组成型DsRED表达盒-LB)的PHP82240质粒的另外的实验中，证明通过使用PHP82240在具有50mg/L羧苄青霉素的710I培养基上共培养7天改善了高粱体细胞胚的直接形成。质粒与七天共培养的这种组合导致总转化频率从17.7％翻倍至38.9％的最终值，同时相对于对照处理，将从农杆菌感染到将T0植物送到温室的时间减少大约一半(将时间范围减少为5-6周的总的经过时间)。
[0360] 实例12：小麦中的高效率转化和快速T0植物生产。
[0361] A.小麦转化方法。
[0362] 含有目的载体的农杆菌菌株LBA4404的等分试样从-80℃储存中取出并划线到含有选择剂(卡那霉素或壮观霉素，取决于细菌菌株含有哪种质粒)的固体LB培养基上。将农杆菌在黑暗中在21℃在LB板上培养2-3天，此时从板选择单个菌落，在含有选择剂的810D培养基板上划线，并然后在28℃在黑暗中孵育过夜。使用无菌刮铲将农杆菌培养物从板上转移并悬浮于具有400μM乙酰丁香酮(AS)的约5mL小麦感染培养基(WI4)中。使用相同的培养基将悬浮液的光密度(600nm)调节至约0.1至0.7。
[0363] 收集含有未成熟种子(具有1.4-2.3mm胚)的四至五个花穗，并从未成熟种子中分离未成熟胚。将小麦籽粒在20％(v/v)漂白剂(5.25％次氯酸钠)加1滴Tween 20中进行表面灭菌15分钟，然后在无菌水中洗涤2-3次。如实例4和5中所述，接着是包括小麦用农杆菌感染、共培养、静止期期间的培养、体细胞胚成熟和生根的剩余方案，包括在0.1mg/l灭草烟上进行选择和成熟的步骤来生产转基因T0小麦植物。
[0364] B.小麦转化结果。
[0365] 使用根癌农杆菌菌株LBA4404(Lazo等人1991，Biotechnology[生物技术]9：963-967)，其含有第一超级二元辅助质粒(pVIR9，美国临时申请号62/252229，其通过引用以其全文结合在此)和第二质粒(PHP79066)，其中发育基因含有具有以下组分的T-DNA；RB+ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+SB-ALS PRO：：
HRA：：SB-PEPC1 TERM+LTP2 PRO：：ZS-YELLOW1 N1：：PINII TERM+LB。为了比较，使用含有具有以下T-DNA的第二质粒(PHP24600)的另一种农杆菌：RB+CAMV35S TERM：PAT：CAMVS PRO+UBIZM PRO：DS-RED：PINII TERM+LB，其代表本实验中的对照处理。
HRA：：SB-PEPC1 TERM+LTP2 PRO：：ZS-YELLOW1 N1：：PINII TERM+LB。为了比较，使用含有具有以下T-DNA的第二质粒(PHP24600)的另一种农杆菌：RB+CAMV35S TERM：PAT：CAMVS PRO+UBIZM PRO：DS-RED：PINII TERM+LB，其代表本实验中的对照处理。
[0366] 当使用对照质粒转化来自先锋优良春小麦品种HC0456D的小麦未成熟胚时，在农杆菌感染后的前7-10天没有观察到可再生结构，而用发育基因构建体PHP79066感染的未成熟胚在感染后7-10天产生可再生结构(使用实例4和5中描述的玉米培养基)。与对照构建体观察到的增殖愈伤组织(未示出)相比，用构建体PHP79066感染的胚在2周内产生了植物样结构(图5)。在感染后6周内用PHP79066转化后回收生根的小植株。
[0367] 当含有ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+SB-ALS PRO：：HRA：：SB-PEPC1 TERM+LTP2：ZS-YELLOW：：PINII TERM的质粒用于转化时，总转化频率为64％(与对照的6％相比)。使用qPCR分析四个植物的一个子集，并且三个对WUS和ZS-YELLOW转基因两者为阳性。使用发育基因的这种组合，在感染后8-11周T0植物再生，将从农杆菌感染到将T0植物送到温室的时间减少了2-3周。
[0368] 实例13：玉米中快速从头胚形成的观察和T0植物的生产。
[0369] A.发育体细胞胚的形态学。
[0370] 用具有含有表达盒ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1I TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：PINII+UBI PRO：UBI1ZM INTRON：ZS-GREEN：：PINII TERM的T-DNA的农杆菌菌株LBA4404转化来自先锋近交系PH184C的未成熟胚后，在盾片的表面上迅速形成体细胞胚(即在4-6天内)。在农杆菌感染开始后2、4、7和12天观察到直接形成的单个体细胞胚。在近交系PH184C中，当使用NOS PRO：：ZM-WUS2：：PINII TERM+ZM-PLTP：：ODP2：：PINII TERM的组合时，观察到单个体细胞胚通过好像是重现(recapitulate)胚柄的细胞的细系链(thin tether)附着于原始转化的合子胚的盾片上。随着胚发育继续，观察到通常在合子胚中观察到的另外的形态特征，包括在顶端分生组织发育的开始时在顶端分生组织周围形成独特的胚芽鞘环和围绕胚轴形成盾片(其变成白色和不透明)。
[0371] 为了进一步说明快速形成的体细胞胚的形态，在农杆菌感染开始后2、4、6和7天对具有突出的新生体细胞胚的合子胚取样，并将其在100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中的2.5％EM级戊二醛中在室温以100rpm旋转4小时来进行固定。用100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤3次(每次15分钟)后，将样品以逐步的方式脱水；在70％EtOH中1-2小时、在80％EtOH中1-2小时、在95％EtOH中1-2小时、在100％EtOH中1-2小时、和在100％EtOH中2小时。然后，按照生产商的建议用活化的Technovit 7100乙二醇甲基丙烯酸酯浸润组织2小时，并再次用更新的活化的Technovit 7100浸润组织过夜。将浸润的组织样品置于模具中，并且通过将1ml的Hardener II添加到15ml活化的Technovit 7100中来聚合Technovit 7100。将模具在真空干燥器中置于室内真空下并使其聚合过夜。将半薄2μm切片置于载玻片上的水滴上，并在
45℃的加热板上干燥。根据说明书将切片用过碘酸-希夫试剂(西格玛公司(Sigma))染色，然后用在7％乙酸溶液中的0.5％萘酚蓝黑反染5分钟，并再次在去离子水中洗涤。然后将切片用玻璃盖玻片固定在Permount中并观察。
45℃的加热板上干燥。根据说明书将切片用过碘酸-希夫试剂(西格玛公司(Sigma))染色，然后用在7％乙酸溶液中的0.5％萘酚蓝黑反染5分钟，并再次在去离子水中洗涤。然后将切片用玻璃盖玻片固定在Permount中并观察。
[0372] 图6至图11显示了用具有T-DNA的LBA4404进行农杆菌感染后不同天数的HC69合子未成熟胚的时间进程，所述T-DNA包含以下：RB-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ODP2：：PINII TERM-LB。局部生长刺激的最早指征之一是观察到在感染的盾片表面上细胞的垂周分裂(图6)，这是该表面层中的第一个可见分裂，其通常经由伴随胚生长的平周分裂而扩大。持续的局部细胞分裂导致开始从合子胚表面突出的小细胞簇(图6)，并且这种生长迅速产生越来越大的球状(图8)和球状/过渡期(图8)胚，其在感染后仅4天，每个体细胞胚中含有多达700-800个细胞，并且表现出通常在前胚中观察到的典型的光滑表皮层，其与下面的合子胚没有血管连接。尽管发育的体细胞胚在很接近的位置观察到(图10)，但它们代表独立来源的结构。贯穿在农杆菌感染后的前6-7天的体细胞胚的生长，观察到高频率的有丝分裂结构(即明确经历前期、中期、后期或胞质分裂的细胞)(图11)，其表示这些体细胞胚的极快的生长速度。
[0373] B.染色以展示在发育的体细胞胚中的脂质积累。
[0374] 在农杆菌介导的转化(具有含有AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ODP2：：PINII TERM的T-DNA)后在未成熟合子胚的盾片表面上发育的直接形成的体细胞胚在农杆菌感染后2、4和7天取样，在70％异丙醇中洗涤5分钟，并然后在70％异丙醇中的0.5％“油红O”溶液中染色20分钟，在异丙醇中洗涤2分钟，并然后在水中洗涤两次，每次各5分钟(全部在室温进行)。在农杆菌感染后两天，如在组织中形成的红色证明的，非常少的脂质染色存在于合子未成熟胚中。在开始农杆菌感染后四天，清晰可见从原始转化的合子胚的表面生长的许多球状结构(新形成的体细胞胚)，并且这些新的体细胞胚被清晰地染成红色，这表明脂质积累。七天后，观察到结构的混合物；一些清晰的体细胞胚继续发育并被染成红色(图12中的黑色箭头)，并且一些体细胞胚开始分化分生组织和叶，这些分生组织和叶已经开始失去与脂质积累相关的红色染色(图12)。还参见图12，在这些培养条件下，原始农杆菌感染的合子胚的盾片几乎没有脂质。
[0375] 可替代地，通过在盖玻片和载玻片之间放置体细胞胚并施加压力直到单层细胞被挤出来使脂质可见。在使用上述的油红O染色方法之后，当在光学显微镜下观察时，在体细胞胚细胞内观察到大量油滴分散(图13)。
[0376] 在切片的体细胞胚中使用类似的染色方案可以检测到脂质。在农杆菌感染开始后2、4、8和12天对直接形成的单个体细胞胚进行取样，并对其进行固定、脱水、用塑料浸润并如上所述进行切片。对于脂质染色，制备在60％磷酸三乙酯(水性)中的0.5％“油红O”溶液并过滤。用60％磷酸三乙酯简单冲洗载玻片上的组织切片，并然后在“油红O”中染色10-20分钟。染色后，将切片再次用磷酸三乙酯冲洗1-2秒，并然后用蒸馏的去离子水洗涤。然后将切片用在5％的水性硫酸铁铵中的0.5％天青石蓝(Celestine Blue)染色15分钟，并且再次在DI水中洗涤。然后使用水性固定培养基将切片固定和进行观察。在发育的体细胞胚中，盾片中积累的脂质呈现红色，并且在整个切片(包括盾片和胚轴)上，每个细胞中的核将染成蓝色。
[0377] 实例14：使用单独的WUS2、使用单独的ODP2或使用WUS/ODP2组合的转化。
[0378] 从三个先锋近交系(PH184C、HC69和PHH5G)收获未成熟胚，并将来自每个近交系的胚均匀等分用于农杆菌菌株LBA4404转化，所述菌株LBA4404包含以下之一：PHP79066(SEQ ID NO：27)、PHP80912(SEQ ID NO：53)和PHP80913(SEQ ID NO：54；每个在表1中详细描述)。
[0379] 在农杆菌介导的转化后，三种不同的近交系对不同转基因组合的响应不同(表12)。对于近交系PH184C，每种处理感染230个未成熟胚，当表达单独的AXIG1：：WUS2、表达单独的PLTP：：ODP2、或表达WUS2和ODP2的组合时，84％、10％和100％的原始感染的合子胚在盾片表面上产生体细胞胚。7天后，将所有胚移至成熟培养基、然后移至发芽培养基，其中68个、8个和52个胚产生T0植物用于三种各自的处理(T0转化效率分别为30％、3％和23％)。对于近交系HC69，每种处理使用80个未成熟胚，在所有三种处理中有效产生体细胞胚和T0植物，对于AXIG1：：WUS2、PLTP：：ODP2或组合的WUS2+ODP2处理，分别产生85％、56％和68％的最终转基因T0植物频率(相对于起始胚的数量)。最后，对于近交系PHH5G，对于三种处理中的每一种处理感染168个未成熟胚，对于AXIG1：：WUS2、PLTP：：ODP2或组合的WUS2+ODP2处理，分别具有27％、0％和48％的最终转基因T0植物频率(相对于起始胚的数量)。这些数据表明，尽管近交系对单独的WUS、单独的ODP2或其组合表现出不同的响应，单个转录因子的表达可有效地产生转基因体细胞胚和T0植物。
[0380] 表12.在递送单独的WUS2、单独的ODP2或WUS2与ODP2的组合后在三个近交系中的转化响应
[0381]
[0382]
[0383] 实例15：从单个体细胞胚产生的小植株到温室的改进的转移。
[0384] 用PHP79066感染三种基因型(HC69、PHH5G和PH184C)的未成熟胚(9-11DAP)。将胚转移到共培养培养基(710I)1-3天、静止培养基605G(605J培养基+2mg/l美罗培南)7天、并然后转移到成熟培养基13329(289O+0.1mg/l灭草烟)上。在成熟培养基上3-4周后，将强壮的单个芽转移到EXcel Plugs(40/80)(国际园艺技术有限公司(International Horticulture Technologies，LLC)，航空公司高速公路2410号，霍利斯特，加利福尼亚州
95023(2410 Airline Hwy，Hollister，CA，95023))并用Moisturin(WellPlant有限公司(WellPlant，Inc.)，香料群岛路940号，斯帕克斯，内华达州89431(Spice Islands Drive，Sparks，NV，89431))。将芽在27℃在Valoya(Valoya Oy公司，Lauttasaarentie 54A，00200
2
赫尔辛基，芬兰)R系列NS2LED灯(220-305μmol/m/秒)下培养2-3周。根据需要，每隔2-3天用6N盐和维生素加0.1mg/L灭草烟将plugs浇湿。在根建立后，将plugs转移到T0接收温室并生长另外两周。在这个时间范围结束时，收集每种基因型的存活数据，并在下表13中给出。
95023(2410 Airline Hwy，Hollister，CA，95023))并用Moisturin(WellPlant有限公司(WellPlant，Inc.)，香料群岛路940号，斯帕克斯，内华达州89431(Spice Islands Drive，Sparks，NV，89431))。将芽在27℃在Valoya(Valoya Oy公司，Lauttasaarentie 54A，00200
2
赫尔辛基，芬兰)R系列NS2LED灯(220-305μmol/m/秒)下培养2-3周。根据需要，每隔2-3天用6N盐和维生素加0.1mg/L灭草烟将plugs浇湿。在根建立后，将plugs转移到T0接收温室并生长另外两周。在这个时间范围结束时，收集每种基因型的存活数据，并在下表13中给出。
[0385] 表13.转移到温室的T0植物的改进的存活。
[0386]基因型 芽* 小植株**
PH184C 54 37(68.5％)
PHH5G 36 17(47.2％)
HC69 36 27(75.0％)
PH184C 54 37(68.5％)
PHH5G 36 17(47.2％)
HC69 36 27(75.0％)
[0387] *转移到Excel plugs的芽的总数量。
[0388] **实验结束时存活的小植株的数量，括号内给出了存活百分比。
[0389] 实例16：使用高粱PLTP启动子在玉米中直接产生体细胞胚的结果。
[0390] 双色高粱PLTP启动子(SB-PLTP PRO)以SEQ ID NO：2提供。将来自先锋近交系PH184C或PHH5G的未成熟胚用具有含有T-DNA(SEQ ID NO：95)(RB+ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+SB-PLTP1 PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO：UBI1ZM INTRON：ESR：：SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO：：HRA：：SB-PEPC1 TERM+UBI PRO：：ZS-GREEN1：：PINII TERM：SB-ACTIN TERM-LB)的质粒RV012608的农杆菌菌株LBA4404转化。在培养4-6天后在近交系合子胚的表面上形成许多离散的体细胞胚。这些早期体细胞胚彼此明显不同(即，在形成的体细胞胚之间具有中间的非转基因组织)并且基于绿色荧光蛋白的表达被证实是转基因的。当这些胚被转移到具有0.1mg/l灭草烟的成熟培养基中时，胚继续发育，并且当转移到发芽培养基时，发生芽和根两者的伸长。
[0391] 实例17：使用来自同源基因来源的玉米ODP2同系物、WUS2同系物和PLTP启动子在玉米中产生体细胞胚的结果。
[0392] WUS/WOX旁系同源基因(家族成员基因和编码的蛋白质)和ODP2/BBM家族成员及其相应的SEQ ID编号列表显示在下表14中。
[0393] 表14.WUS/WOX和ODP2/BBM序列
[0394]
[0395]
[0396] *“DNA”表示多核苷酸或核酸序列；“PRT”表示多肽或蛋白质序列。
[0397] 对于下面部分A、B和C中所述的这些研究，使用单个T-DNA构型(SEQ ID NO：104)，从以下阳性对照开始：RB+ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO：UBI1ZM INTRON：ESR：：SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO：：HRA：：SB-PEPC1 TERM+UBI PRO：：ZS-GREEN1：：PINII TERM：SB-ACTIN TERM-LB。在此T-DNA的背景下，除了下面描述的三个变量以外，T-DNA的所有组分保持相同。在第一变量中，用ZM-WOX2A、ZM-WOX4、ZM-WOX5A或高粱(SB)WUS1替换ZM-WUS2(在对照质粒中)。在第二变量中，用来自两种玉米旁系同源基因(ZM-PLTP1和ZM-PLTP2)的启动子或三种禾本科直系同源基因(双色高粱SB-PLTP1、粟SI-PLTP1或稻OS-PLTP1)替换ZM-PLTP PRO(来自对照处理)。当将对照T-DNA(如上所示的所有玉米组分)引入先锋近交系PH1V5T、PH1V69和PHH5G的盾片中时，7天后大约一半的盾片表面面积覆盖有新发育的体细胞胚。该响应评分为“2”。在响应谱的上端，盾片完全被个体的苔覆盖，在感染后4-7天发育体细胞胚。该响应被给予相对评分“4”，并且所有其他处理从“0”(无响应)到“4”(最多产的体细胞胚产生)排列。当没有引入WUS2或ODP2表达盒时(例如在PHP24600，SEQ ID NO：69中)，PH1V5T产生低水平的体细胞胚(分数为1)，而PH1V69和PHH5G两者都不产生响应(分数为0)。
[0398] A.ZM-WOX家族成员或高粱WUS1替代ZM-WUS2产生不同程度的快速形成的体细胞胚。
[0399] 在该实验中，在T-DNA(SEQ ID NO：104)中含有ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2的阳性对照质粒在近交系PH1V5T和PHH5G中产生中间响应(分数2)，同时在近交系PH1V69中产生较低的分数“1”。相比之下，当三个玉米WOX家族成员替代ZM-WUS2时，观察到一系列体细胞胚发生响应(表15)，范围在来自ZM-WOX2A的较高体细胞胚响应、ZM-WOX4的低至无响应和WOX5的低响应(分别在SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：102中提供的T-DNA序列)。尽管WOX5和WOX4在转化的未成熟胚的表面上导致较少的体细胞胚，但是WOX5的所有三个自交系和WOX4的近交系子集仍有阳性响应。对于产生低水平响应的处理，近交系PH1V5T难以解释，因为它在不存在WUS2和ODP2表达盒的情况下表现出低水平的生长。然而，对于这些处理，另外两个近交系变得更具信息性，因为它们没有表现出背景生长并且明确是低水平响应(1)。
[0400] 表15.近交系转化对不同WUS同系物的响应
[0401]
[0402]
[0403] 还针对转化后快速生长响应的刺激对ZM-WUS1和ZM-WUS3与ZM-WUS2进行比较。在该实验中，使用玉米的标准粒子轰击方案(参见Svitachev等人，2015，Plant Physiology[植物生理学]169：931-945)以等摩尔比将含有UBI：：GFP：：PINII TERM的质粒与含有UBI PRO：：WUS1：：PINII TERM、UBI PRO：：WUS2：：PINII TERM或UBI PRO：：WUS3：：PINII TERM的质粒一起进行共轰击。在具有GFP滤波器的莱卡Mzfl III落射荧光显微镜下观察胚。7天后，被轰击的盾片的表面覆盖着快速生长的多细胞结构，GFP荧光处于中心。对于所有三种WUS3旁系同源基因，生长速度很快，在整个被轰击的盾片表面都有广泛的响应，并且不能识别三种WUS旁系同源基因之间的差异。基于这些观察结果，可以预期当放置在AXIG1启动子后面并且组合在具有ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2的T-DNA中用于转化玉米未成熟胚时，ZM-WUS1和ZM-WUS3将产生与ZM-WUS2相似程度的快速体细胞胚发生。
[0404] 该实验中的最终处理是用高粱(SB)WUS1(T-DNA序列以SEQ ID NO：103提供)替代玉米WUS2。这种处理产生了对任何处理的最快速和最多产的体细胞胚响应，其中大约80％的被感染的胚整个被体细胞胚覆盖。
[0405] B.替代来自玉米旁系同源基因或三种不同的禾本科直系同源基因的PLTP启动子导致不同程度的快速体细胞胚发生。
[0406] 相对于对照处理(ZM-PLTP PRO)，使用各种“同源”启动子在三种不同的先锋近交系中产生一系列快速体细胞胚发生(表16)，其中对照产生在1与2之间的分数。
[0407] 表16.对不同PLTP启动子的近交系转化响应
[0408]
[0409] 在该实验中，ZM-PLTP1启动子在感染后7天产生最高的体细胞胚发生分数，其范围从3(在PH1V5T中大概75％被体细胞胚覆盖)到4(完全被覆盖，如在PH1V69和PHH5G中)。ZM-PLTP2也产生了比对照更好的结果，在所有三种近交系中具有一致的分数3。对于来自禾本科的其他成员的PLTP1启动子，高粱和稻启动子在两个近交系中产生中等水平响应(2)，在一个近交系中产生低响应(1)，而狗尾草属启动子在两个近交系中导致低水平响应并在一个近交系中产生中等水平响应。所有测试的PLTP启动子在7天后都导致体细胞胚发生的阳性刺激。
[0410] C.ZM PLTP PRO：：ZM-LEC1与AXIG1：：WUS2或PLTP：：ODP2的组合导致体细胞胚的快速产生。
[0411] 在之前的实验中，证明了在可转化的玉米杂交种Hi-II中UBI PRO：：ZM-LEC1刺激转化频率(参见Lowe等人，2007，US 7,268,271)。
[0412] 在该实验中，在对照载体中用ZM-PLTP：：ZM-LEC1替代AXIG1：：WUS2或PLTP：：ODP2以评估在三个近交系中对快速体细胞胚发生的影响。农杆菌感染、组织培养和在7天中对胚发生的评分的条件与先前实例中描述的那些条件相同。虽然这两种新组合产生的分数都高于对照，如在表17中可以看出，AXIG1：：WUS2+PLTP：：LEC1在所有三个近交系中导致最强的体细胞胚响应。因此，PLTP：：LEC1与WUS2或ODP2表达盒组合可有效刺激体细胞胚的快速形成。
[0413] 表17.对与LEC1的不同组合的近交系转化响应
[0414]
[0415] D.使用WUS和ODP2的组合或狗尾草属WUS和ODP2的组合导致在玉米未成熟胚的转化后体细胞胚形成。
[0416] 从含有NOS PRO：：ZM-WUS2：：IN2+UBI PRO：：ZM-ODP2：：PINII+UBI PRO：：ZS-GREEN：：PINII的玉米构建体开始，合成在稻和粟中鉴定了WUS2和ODP2的直系同源基因并将其替代在上述构建体中的玉米基因。使用含有PHP80911(玉米WUS2和ODP2)、PHP79530(稻基因)或PHP79531(粟基因)的农杆菌菌株LBA4404转化来自近交系PHH5G和PH184C的未成熟胚。在培养基上14天后，在解剖显微镜和落射荧光显微镜下检查未成熟胚，并使用先前描述的体细胞胚发生量表(0-4)进行评分。对于近交系PH184C，在农杆菌感染后14天的体细胞胚评分分别为2、2和1(分别对应玉米、粟和稻的基因对)。对于近交系PHH5G，在农杆菌感染后14天的体细胞胚评分分别为3、3和2(分别对应玉米、粟和稻的基因对)。将这些未成熟胚暴露于WUS2和ODP2的表达的时间长度是上述部分5A、5B和5C中的材料的两倍，这导致比如果在7天时收集数据更高的体细胞胚发生分数。来自每个物种的同源WUS和ODP2基因的组合刺激体细胞胚形成。在不存在WUS2或ODP2的情况下，在PHH5G中未观察到体细胞胚形成。
[0417] 在禾本科内，玉米和稻位于种系发生的相反端，中间是粟。基于WUS、ODP2和PLTP的上述不同序列的结果，这项工作证明，来自稻科植物成员的组合可以有效地用于在转化后快速刺激体细胞胚发生。
[0418] 实例18.使用大豆LTP3启动子控制WUS的表达以改进大豆转化。
[0419] 为了鉴定可能使用拟南芥WUS基因改进转化方法的新启动子，对该基因的使用进行了综述。在农杆菌介导的转化和整个愈伤组织生长后立即表达的拟南芥WUS的高水平表达(例如，使用大豆EF1A PRO)增加了事件形成的速率。然而，继续在这个水平上表达这种转录因子阻碍了事件再生。可能的解决方案是在再生小植株之前切除该基因并限制拟南芥WUS在使体细胞胚分化和成熟中异位表达。基于此，寻找在培养的细胞、胚和发育未成熟种子中表达，并且在其他植物组织中没有表达或具有低得多的表达的新启动子。大豆LTP3启动子符合这些标准，一种以前未确定的大豆磷脂转移酶基因。如在图14和图15中所示，当与EF1A PRO的组成型表达(图14)相比时，LTP3的表达(图15)是：i)在发育未成熟种子中强烈、和ii)在其他样品和植物部分中弱或不强，而在所有组织中都观察到EF1A的表达。
[0420] 含有具有表达盒GM-LTP3 PRO：：AT-WUS：：UBI14 TERM+GM-UBQ PRO：：TAGRFP：：UBQ3 TERM的T-DNA的农杆菌菌株AGL1用于转化先锋大豆品种PHY21。在农杆菌感染开始后四天，用无菌培养基洗涤组织以除去过量的细菌。9天后将组织移至体细胞胚成熟培养基中，并且22天后转基因体细胞胚已准备好进行脱水。此时，良好形成的成熟体细胞胚在带有RFP滤波器装置的落射荧光立体显微镜下发红色荧光。发育的体细胞胚是有功能的并且发芽以在温室中产生健康的植物。这种产生体细胞胚和发芽以形成植物的快速方法将从农杆菌感染到将转基因T0植物转移到温室的典型时间范围从四个月(用于常规大豆转化)减少到两个月。
[0421] 如图16(显示了农杆菌感染后2周未成熟子叶外植体的体细胞胚发生响应的分布)中的箱线图所示，使用LTP3启动子来驱动At-WUS的表达导致体细胞胚发生的显著改进(如与测试的其他启动子(参见图16)或不含WUS表达盒的阴性对照相比(参见图16))。
[0422] 在受感染的未成熟子叶群体中的体细胞胚响应的增加还伴随着快速体细胞胚发育，其在两种光学显微镜下观察以评估形态学(图17A)并在落射荧光下观察红色荧光(图17B)。它显示准备好干燥并随后在农杆菌感染后仅5周发芽的成熟的转基因大豆体细胞胚。
当没有用LTP3：：At-WUS转化未成熟子叶(对照处理)时，成熟体细胞胚不仅以大大降低的频率产生(参见图16)，而且从农杆菌感染到体细胞胚成熟的相当阶段的持续时间需要培养9周。
当没有用LTP3：：At-WUS转化未成熟子叶(对照处理)时，成熟体细胞胚不仅以大大降低的频率产生(参见图16)，而且从农杆菌感染到体细胞胚成熟的相当阶段的持续时间需要培养9周。
[0423] 实例19.增加对WUS2、ODP2和CRE表达盒已切除且剩余的性状基因是单拷贝的T0植物的回收的切除激活的可选择标记HRA。
[0424] 为了构建具有切除激活的HRA表达的载体，HRA基因被在内含子中心含有单个loxP靶位点的ST-LS1内含子中断，并且进行了测试以证明含有loxP的内含子功能正常。将HRA表达盒的两半(在loxP位点处分开)移至T-DNA的相对端，每一半具有它自己的内部loxP位点，其比HRA两半更靠近T-DNA的中心。在两个loxP位点内的是AXIG1 PRO：：WUS2：：IN2 TERM、PLTP PRO：：ODP2：：OS-T28 TERM、ZM-GLB1 PRO：：CRE：：pinII和SB-UBI PRO：：ZS-GREEN：：OS-UBI TERM表达盒(参见表1中的PHP81814、和SEQ ID NO：80)。
[0425] 该构建体产生高频率的快速体细胞胚形成，并且切除组合的WUS/ODP2/CRE/ZS-GREEN盒以激活HRA表达和回收单拷贝T0植物。在一组实验中，将总共2332个未成熟胚(来自近交系PHH5G)用于通过携带PHP81814的农杆菌菌株LBA4404THY-进行转化。在被感染的总体胚中，总共回收了604个T0植物，并且在这些604个T0植物中，总共215个不再含有WUS2、ODP2、CRE和SZ-GREEN表达盒(完全切除)。结果总共回收了9.2％的质量事件(完美事件的数量相对于起始胚的数量)。
[0426] 在一组分开的用近交系HC69的三个实验中，将741个未成熟胚用含有PHP81814的农杆菌转化，并且在温室中产生315个T0植物，其中30个是HRA的单拷贝且所有其他基因被切除，其质量事件的频率为4％。
[0427] 实例20.使用具有胚特异性表达模式的启动子驱动WUS2和/或ODP2表达以改进玉米转化。
[0428] 对于这些实验，使用单个T-DNA配置，从用作阳性对照的以下配置开始：RB+ZM-AXIG1 PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO：UBI1ZM INTRON：ESR：：SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO：：HRA：：SB-PEPC1 TERM+UBI PRO：：ZS-GREEN1：：PINII TERM：SB-ACTIN TERM-LB。将阳性对照与具有驱动WUS2和ODP2表达的胚特异性启动子的质粒进行比较。使用质粒PHP24600作为阴性对照(不表达WUS2和ODP2转基因)以提供较低的比较基线。
[0429] 当使用ZM-SRD PRO、ZM-LGL PRO、ZM-LEA14-A PRO或ZM-LEA-D-34启动子(分别为SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83)替换该构建体中驱动WUS2表达的ZM-AXIG1 PRO，预期增加的转化频率和快速体细胞胚发生的刺激与用阳性对照载体所观察到的类似，两者都显著高于阴性对照处理(PHP24600)。同样地，当使用ZM-SRD PRO、ZM-LGL PRO、ZM-LEA14-A PRO或ZM-LEA-D-34启动子替换该构建体中驱动ODP2表达的ZM-PLTP PRO时，再次预期增加的转化频率和快速体细胞胚发生的刺激与用阳性对照载体所观察到的类似，两者都显著高于阴性对照处理(PHP24600)。
[0430] 实例21.序列鉴定
[0431] 本披露中引用了各种序列。序列标识符见于下表18。
[0432] 表18.
[0433]
[0434]
[0435]
[0436]
[0437]
[0438] *“DNA”表示多核苷酸或核酸序列；“PRT”表示多肽或蛋白质序列。
[0439] 如本文所使用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等效物等。本文使用的所有技术和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义，除非另有明确说明。
[0440] 本说明书中提到的所有专利、出版物和专利申请都表明本披露所属领域的技术人员的水平。将所有专利、出版物和专利申请通过引用以其全文结合在此，其程度就像明确且个别指出通过引用将每一篇个别专利、出版物或专利申请以其全文结合一样。
[0441] 虽然出于清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式对前述披露内容进行了详细描述，但是在所附权利要求书的范围内可以实践某些改变和修改。
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