诱导胚胎干细胞为胰腺细胞的方法
阅读：497发布：2023-02-08
专利汇可以提供诱导胚胎干细胞为胰腺细胞的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种简单的能诱导胚胎干细胞分化为产胰岛素的细胞的三步培养法，此三步培养法是建立在激活蛋白A，全反式视黄酸和任选地其它成熟因子的联合诱导 基础 上的。本发明还提供了用于诱导胚胎干细胞分化为产胰岛素的细胞的 试剂 盒 。，下面是诱导胚胎干细胞为胰腺细胞的方法专利的具体信息内容。
1.一种诱导胚胎干细胞方法，包括以下顺序的步骤：
在细胞培养基中培养胚胎干细胞以形成胚体；
利用激活蛋白A孵育所述胚体；和
利用RA孵育所述胚体，使其发育为产胰岛素的前体细胞。
2.权利要求1的方法，其中当胚胎干细胞来源于小鼠时，所述培养 基为含有约10％胎牛血清的DMEM；当胚胎干细胞来源于人时，所 述培养基为CDM。
3.权利要求1的方法，其中所述激活蛋白A的浓度为约50-300ng/ml 培养基；所述RA的浓度为约1×10-7-1×10-5mol/L培养基。
4.权利要求3的方法，进一步包括以下步骤：在细胞培养基中培养 胚胎干细胞以形成胚体的步骤前，用Metrigel包被用于容纳培养基的 培养容器。
5.权利要求4的方法，其中所述metrigel在培养基中的质量百分比大 约为1％。
6.权利要求5的方法，其中所述胚体与激活蛋白A一起孵育20小 时到4天，再在不含激活蛋白A的培养基中培养6-8小时，然后用 RA孵育20小时到4天，使其发育为产胰岛素的前体细胞。
7.权利要求6的方法，进一步包括以下步骤：在含有成熟因子的培 养基中孵育获得的产胰岛素的前体细胞，以扩增产胰岛素的前体细 胞。
8.权利要求7的方法，其中所述成熟因子包括bFGF。
9.权利要求8的方法，其中所述bFGF的浓度为8-12ng/ml。
10.权利要求9的方法，进一步包括以下步骤：在含有N2增补剂、 B27增补剂、层粘连蛋白和烟酰胺的培养基中孵育所述扩增了的产胰 岛素的前体细胞以使其发育为产胰岛素的细胞。
11.权利要求10的方法，其中所述培养基为在含有N2增补剂、B27 增补剂、1μg/ml的层粘连蛋白，10ng/ml的bFGF，胰岛素-运铁蛋白- 硒-A(1∶100)和10mmol/L的烟酰胺的DMEM/F12或CDM。
12.一种诱导胚胎干细胞的试剂盒，包括激活蛋白A和RA。
13.权利要求12的试剂盒，进一步包括Metrigel。
14.权利要求13的试剂盒，进一步包括一种一级培养基。
15.权利要求14的试剂盒，进一步包括血清。
1、发明领域
本发明一般地涉及一种诱导胚胎干细胞的方法。特别地，本发明涉及 诱导胚胎干细胞为胰腺细胞的方法，以及具有此用途的试剂盒。
2、现有技术描述
糖尿病作为最常见的代谢失调性疾病，影响着世界上4-5％的人群。据 估计，到2010年，糖尿病患者的数量会超过三亿五千万。I型糖尿病是由 于胰岛中的β细胞遭受自身免疫破坏所致。所以许多研究小组都在寻找各 种方式试图来替换这些被破坏的产胰岛素的细胞。目前，胰岛细胞移植是 除了注射胰岛素外唯一有效的可治愈I型糖尿病的方法(Serup P，Madsen OD，Mandrup-Poulsen T.Islet and stem cell transplantation for treating diabetes.BMJ 2001；322：29-32)。但是，由于可移植的供体胰岛严重短缺， 导致该方法无法广泛应用。
由胚胎干(ES)细胞获得功能性的β细胞被认为能解决可移植的胰岛 不足的问题。ES细胞已经被证明能够分化成胰岛样的集落，特别是胰腺β 细胞(Soria B，Roche E，Berna G，et al.Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice.Diabetes 2000；49(2)：157-162；Lumelsky N，Blondel O，Laeng P，et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets.Science 2001；292：1389-1394；Assady S，Maor G，Amit M， et al.Insulin production by human embryonic stem cells.Diabetes 2001；50(8)：1691-169.)。Soria等通过一种“细胞捕获”的方案首次成功 地诱导胚胎干细胞分化成胰腺β细胞。(Soria B，Roche E，Berna G，et al. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice.Diabetes 2000；49(2)：157-162)。不过， 这种方法比较复杂，且需要一些遗传操作。Lumelsky等(Lumelsky N， Blondel O，Laeng P，et al.Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets.Science 2001；292：1389-1394)设计了一种诱导ES细胞分化为产胰岛素的胰岛样结 构的“五步法”，此法无需遗传操作。Hori等(Hori Y，Rulifson IC，Tsai BC， et al.Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells.Proc Natl Acad Sci U S A 2002；99(25)：16105-16110)和Blyszczuk等(Blyszczuk P，Czyz J，Kania G，et al.Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells.Proc Natl Acad Sci U S A 2003；100(3)：998-1003)通过添加生长抑制剂LY294002或过表达基因 pax4来改进Lumelsky的“五步法”。但是，所有的这些诱导方案在某些方 面都是复杂的，周期很长。Hansson等(Blyszczuk P，Czyz J，Kania G，et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells.Proc Natl Acad Sci U S A 2003；100(3)：998-1003)，在使用了“五步法”后发现ES细胞在培养中可 能通过吸收培养基中的胰岛素而使结果出现假阳性。因此，寻找能够方便 快捷地诱导ES细胞分化成胰腺β细胞的特异性诱导因子十分必要。
某些因子已经被报道可以促进确定的内胚层分化。TGF-β超家族的成 员之一，激活蛋白A(activin A)，在原肠胚形成中对内胚层和中胚层的形 成起关键性作用。高浓度下它主要诱导内胚层形成(Kumar M，Jordan N， Melton DA，et al.Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate.Developmental Biology 2003；259：109-122；Hill CS. TGF-βsignalling pathways in early Xenopus development.Curr Opin Genet Dev 2001；11(5)：533-540)。全反式视黄酸(All-trans retinoic acid，RA)是 一种充分表征的信号分子，在脊椎动物的神经外胚层和中胚层前后模式的 形成中起重要作用(Maden M.Role and distribution of retinoic acid during CNS development.Int Rev Cytol 2001；209：1-77)。目前的证据显示RA也参 与调节胚胎内胚层分化模式，特别是在胰芽形成过程中，并且它也能增强 胰腺β细胞和INS-1细胞系中胰岛素的表达(Stafford D，Prince VE.Retinoic Acid signaling is required for a critical early step in Zebrafish pancreatic development.Current Biology 2002；12(14)：1215-1220；Blumentrath J，Neye H， Verspohl EJ.Effects of retinoids and thiazolidinediones on proliferation， insulin release，insulin mRNA，GLUT2 transporter protein and mRNA of INS-1 cells.Cell Biochem Funct 2001；19：159-169)。还证明了在爪蟾中激活 蛋白A和RA联合作用可以使本来应该发育成外胚层的区域分化成可以 表达胰岛素的胰腺细胞(Moriya N，Komazaki S，Takahashi S，et al.In vitro pancreas formation from Xenopus ectoderm treated with activin and retinoic acid.Develop Growth Differ 2000；42：593-602)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种诱导胚胎干细胞为胰腺细胞的方法。本 发明的另一个目的是提供一种能用于诱导胚胎干细胞为胰腺细胞的试剂 盒。
为达到所述目的，本发明通过了提供一种诱导胚胎干细胞的方法，包 括以下顺序的步骤：
在细胞培养基中培养胚胎干细胞以形成胚体；
利用激活蛋白A孵育胚体；和
利用全反式视黄酸(RA)孵育胚体以使其发育为产胰岛素的前体细 胞。
在一方面，当胚胎干细胞来源于小鼠时，本方法中使用的培养基是含 有约10％胎牛血清的DMEM。在另一种情形，当胚胎干细胞来源于人时， 所述培养基是CDM。
在一方面，所述激活蛋白A的浓度约为50-300ng/ml培养基，所述 RA的浓度可为约1×10-7-1×10-5mol/L培养基。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：在用激活蛋白A 孵育胚体前，在包被Metrigel的培养基中孵育胚体。在一方面，所述Metrigel 在培养基中的质量百分含量约为1％。
在另一个实施方案中，用激活蛋白A孵育胚体20小时到4天，再在 不含激活蛋白A的培养基中继续培养6-8小时，然后再利用RA孵育20 小时到4天以使其发育为产胰岛素的前体细胞。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：在含有成熟因 子的培养基中培养由此生成的产胰岛素的前体细胞以使其扩增。在一个实 施方案中，所述成熟因子是浓度为8-12ng/ml的bFGF。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：在含有N2添 加剂、B27添加剂、层粘连蛋白(Laminin)和烟酰胺的培养基中孵育此扩 增了的产胰岛素的前体细胞以使其发育为产胰岛素的细胞。在一方面，所 述培养基是含N2添加剂(1∶100，可从Gibco购买)，B27添加剂(1∶50， 可从Gibco购买)，1μg/ml的层粘连蛋白，10ng/ml的bFGF，胰岛素- 运铁蛋白-硒-A(1∶100，可从Gibco购买)，以及10mmol/L烟酰胺的 DMEM/F12或CDM培养基。
本发明进一步提供一种诱导胚胎干细胞分化的试剂盒。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括激活蛋白A和RA。在另一个实 施方案中，所述试剂盒进一步包括Metrigel。在再一个实施方案中，所述 试剂盒进一步包括血清和/或一级培养基。在一方面，Metrigel被包被在所 述一级培养基上。在另一方面，单独提供Metrigel。在另一方面，所述一 级培养基含有成熟因子，例如bFGF。在另一个实施方案中，所述试剂盒 进一步包括一种含有bFGF的二级培养基。
附图说明
图1A为在本发明中提供的能诱导ES细胞向胰岛素阳性细胞分化的 三步培养法。
图1B为小鼠ES-R1细胞形成EB细胞集落的照片。
图1C为在三步培养法的第二步中的胰腺前体细胞呈现上皮样结构的 照片。
图1D-图1E为在三步培养法的第三步出现的细胞集落样结构的照片。
图2A为RT-PCR检测在第二步末由激活蛋白A或RA分别诱导的分化 细胞标志基因的表达情况。
图2B为RT-PCR检测在第二步末由激活蛋白A和RA共同诱导的分化 细胞标志基因的表达情况。
图2C为RT-PCR检测在第三步末分化细胞标志基因的表达情况。
图3A为三步培养法得到的细胞被胰岛素一抗染色的免疫组化检测结 果。
图3B为三步培养法得到的细胞被C-肽一抗染色的免疫组化检测结 果。
图3C为未经激活蛋白A和RA诱导的细胞的胰岛素二氨基联苯胺四 盐酸盐(DAB)染色检测结果(200×)。
图3D为经激活蛋白A和RA诱导的细胞的胰岛素DAB染色检测结 果(200×)。
图3E和图3G为由三步培养法诱导的转染了EGFP报告基因的ES-R1 细胞的EGFP表达情况，其中E、G分别代表不同的结构(200×)。
图3F和图3H为由三步培养法诱导的转染了EGFP报告基因的ES-R1 细胞被胰岛素一抗染色的免疫组化分析结果，其中F、H分别代表不同的 结构(200×)。
图3I为由ELISA检测的胰岛素释放结果。
图4A为被移植了分化细胞的糖尿病小鼠(n＝9)和被移植了PBS的糖尿 病小鼠(n＝12)存活率的比较。
图4B为被移植了分化细胞的糖尿病小鼠(n＝5)和被移植了PBS的糖尿 病小鼠(n＝3)血液葡萄糖水平的分析。
图5A为被移植了PBS的小鼠胰岛素表达的免疫组化分析结果(200 ×)。
图5B为被移植了分化细胞的小鼠胰岛素表达的免疫组化分析(200 ×)。
图6为人胚胎干(hES)细胞的诱导方法流程。
图7A为由CDM作用/RA方法诱导的hES的标志基因的表达情况。
图7B为仅由CDM培养的对照hES的标志基因的表达情况。
图8A-D为最终诱导的hES细胞表达C-肽和Pdx1的照片(400×)。
图8E-H为最终诱导的hES细胞表达胰高血糖素和C-肽的照片。
图8I-L为最终诱导的hES细胞表达淀粉酶和C-肽的照片(400×)。
图8M-P为最终诱导的hES细胞表达C-肽和促生长素抑制素的照片。
图9A为悬浮和贴壁培养获得的末端分化细胞胰岛素分泌量的比较。
图9B为悬浮和贴壁培养获得的末端分化细胞C-肽释放量的比较。
图10A为移植了被诱导细胞的糖尿病裸鼠和移植了PBS小鼠，以及 移植了未经诱导细胞的小鼠的血液葡萄糖水平的比较。
图10B为被操作小鼠腹膜内葡萄糖耐量测试结果。
图11A为被诱导细胞中人C-肽表达的照片(400×)。
图11B为人核特异性抗体的染色结果，显示了C-肽阳性细胞来源于人 ES细胞(400×)。
优选实施方案详述
预先的研究显示，胚胎干细胞能够被特异性诱导分化成胰腺β细胞 (Blyszczuk P，Czyz J，Kania G，et al.Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells.Proc Natl Acad Sci U S A 2003；100(3)：998-1003； Hansson M，Tonning A，Frandsen U，et al.Artifactual Insulin Release From Differentiated Embryonic Stem Cells.Diabetes 2004；53：2603-2609)。但是， 绝大多数诱导方案都需要大约一个月才能获得胰岛素阳性的细胞。本发明 提供了一种新的三步培养法，它是基于激活蛋白A、RA和其它一些成熟 因子例如matrigel、烟酰胺(nicotinamide)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)的联合作用。在该三步培养法的第三步末，这些被诱导的细胞形 成小的胰岛样的集落结构并表达胰腺β细胞的标志基因，包括insulin、 pdx1、glut2、isl1和hnf3β，并且还能通过移植拯救经STZ处理的糖尿病 小鼠。
三种因子，如激活蛋白A，RA和matrigel，在我们的胰腺β细胞实验诱 导方案中起了十分重要的作用。激活蛋白A对早期确定的内胚层的发育十 分重要。它是二硫键稳定的蛋白，属于TGF-β超家族。它与细胞表面受体 的结合能诱导许多基因的表达，包括mixl1和goosecoid，这对早期内胚层 的发育很重要(Kumar M，Jordan N，Melton DA，et al.Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate.Developmental Biology 2003；259：109-122；Hill CS.TGF-βsignalling pathways in early Xenopus development.Curr Opin Genet Dev 2001；11(5)：533-540)。Kubo等报 导激活蛋白A能够诱导ES细胞分化成为确定的内胚层细胞(Kubo A， Shinozaki K，Shannon JM，et al.Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.Development 2004；131：1651-1662)。另外， 激活蛋白A在培养的人胰岛中促进胰岛素的分泌(Florio P，Luisi S， Marchetti P，et al.Activin A stimulates insulin secretion in cultured human pancreatic islets.J Endocrinol Invest 2000；23(4)：231-234)，并在患糖尿病的 新生小鼠的β细胞发育中调控分化和β细胞的再生(Lei L，Yi Z，Seno M，et al.Activin A and Betacellulin Effect on Regeneration of Pancreatic β-Cells in Neonatal Streptozotocin-Treated Rats.Diabetes 2004；53：608-615)。激活蛋白 A的这些功能的联合能够解释它如何在我们的系统中起作用。第二，近期 已经证明RA除了具有诱导外胚层和中胚层发育的功能，在早期胎胰发育 中也是一个重要的信号分子(Maden M.Role and distribution of retinoic acid during CNS development.Int Rev Cytol 2001；209：1-77)。在斑马鱼的发育中， RA信号上调能够诱导胰脏和肝脏内胚层前端的显著扩增。相反地，用 BMS493抑制RA，能够抑制胚胎内胚层向胰腺的早期分化(Stafford D， Prince VE.Retinoic Acid signaling is required for a critical early step in Zebrafish pancreatic development.Current Biology 2002；12(14)：1215-1220)。 而且，Micallef等报导，在小鼠胚胎干细胞分化的第四天加入RA能诱导pdx1 阳性的内胚层形成(Micallef SJ，Janes ME，Knezevic K，et al.Retinoic Acid Induces Pdx1-Positive Endoderm in Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells.Diabetes 2004 Dec 7[Epub ahead of print])。对于胰腺的成熟，RA在 内分泌和导管细胞分化中的作用主要是通过旁分泌以及上调pdx1基因实 现的(Tulachan SS，Doi R，Kawaguchi Y，et al.All-trans retinoic acid induces differentiation of ducts and endocrine cells by mesenchymal/epithelial interactions in embryonic pancreas.Diabetes 2003；52(1)：76-84)。在背胰的发 育中RA被发现通过抑制外分泌部分分化而促进内分泌部分发育(Chen Y， Pan FC，Brandes N，et al.Retinoic acid signaling is essential for pancreas development and promotes endocrine at the expense of exocrine cell differentiation in Xenopus.Developmental Biology 2004；271：144-160)。因 此，很显然RA能促进胰腺前体细胞和内分泌细胞的发育。在激活蛋白A 诱导ES细胞向内胚层分化的过程中，RA可以进一步促进内胚层向胰腺前 体的特化。在用激活蛋白A和RA诱导后，分化的胚胎干细胞可以表达许 多胰腺前体细胞的标志基因，例如pdx1、hnf3α和hnf4β。这些数据显示， 激活蛋白A和RA的联合作用能够诱导胚胎干细胞向早期胰腺细胞的分 化。本发明的结果也表明同时使用激活蛋白A和RA进行诱导比只用其中 之一更为有效。已经证明matrigel在胰腺的体外分化和成熟中起着很重要的 胞外基质的作用。Matrigel是一种包括层粘连蛋白在内的胞外基质和一些 生长因子例如FGF和TGF-β的混合物，对胰腺祖细胞的迁移、三维囊状结 构的形成和胰岛芽突出有重要作用(Gao R，Ustinov J，Pulkkinen MA，et al. Characterization of Endocrine Progenitor Cells and Critical Factors for Their Differentiation in Human Adult Pancreatic Cell Culture.Diabetes 2003； 52：2007-2015)。Gittes GK等也证明matrigel中最主要的成分之一，层粘连 蛋白，参与了小鼠胚胎胰导管系的选择(Jiang FX，Cram DS，DeAizpurua HJ， et al.Laminin-1 promotes differentiation of fetal mouse pancreatic betacells. Diabetes 1999；48：722-730；Crisera CA，Kadison AS，Breslow GD，et al. Expression and role of laminin-1 in mouse pancreatic organogenesis.Diabetes 2000；49：936-944)。而且，培养在matrigel上的人胰腺导管上皮细胞能够形 成胰岛素阳性的胰岛样集落结构(Bonner-Weir S，Taneja M，Weir GC，et al. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.Proc Natl Acad Sci U S A 2000；97：7999-8004)。本发明证明matrigel在诱导中对于小的 胰岛样集落结构形成是必需的。如果ES细胞单独培养在层粘连蛋白或者明 胶(gelatin)上，细胞集落不能很好的形成。在此后的例举性实施例中进一 步显示分化的细胞在matrigel上生长得比在层粘连蛋白或明胶上好。这些说 明，matrigel能比层粘连蛋白或明胶提供更多的诱导因子。
本发明提供了一种新的、能在短期内诱导ES细胞向功能性的产胰岛素 的细胞分化的三步培养法，此方法基于激活蛋白A、RA以及任选地其它 成熟因子的组合。结果显示TGF-β和RA信号对于胰腺β细胞的发育和成熟 是很关键的。胰岛素阳性细胞还能进一步表达一些特征性的胰腺β细胞标 志基因，例如insulinI、pdx1、glut2、hnf3β和isl1。而且，利用携带位于胰 岛素启动子下游的EGFP的报告基因的载体，本发明能够降低假阳性率， 从而真实地诱导ES细胞分化为产胰岛素的细胞。此外，如下述实施例所证 明的，当被移植到肾包囊部位下时本发明还能够拯救链脲菌素(STZ)诱 导的糖尿病小鼠。此处描述的诱导系统为研究胰腺β细胞的形成和分化机 制提供了一种新的体外诱导模型，同时为I型糖尿病的移植治疗提供了一种 潜在的产胰岛素的细胞的来源。
到此已对本发明进行了概括的描述，通过参考下面的实施例将更便于 对其内容的理解。这些实施例的提供是为了进行例证，而不意欲限制本发 明。
实施例
实施例1、诱导小鼠胚胎干细胞为胰腺细胞
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
在含20％胎牛血清(FBS)(Gibco-BRL)，1000U/ml白血病抑制因子 (LIF，Gibco-BRL)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM， Gibco-BRL)培养基中培养一个已被广泛测试过ES细胞品系-- ES-R1(Nagy A，Rossant J，Nagy R，et al.Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.Proc.Natl. Acad.Sci.USA 1993；90：8424-8428)。
一、ES细胞培养和分化的条件
ES细胞向胰腺β细胞分化的方法(三步培养法，参见图1A)如下所示：
第一步，为诱导胚体(EB)的形成，用胰蛋白酶常规消化ES细胞并使 其悬浮在装有无LIF的10％FBS/DMEM培养基的Petri培养皿(Alpha medical instrument)中。24至48小时后(参见图1B)，收集EB并转移到装有无LIF的 10％FBS/DMEM培养基且包被了1％Matrigel(BD Biosciences)的培养皿 中。两小时后，EB开始铺展，并在含有100ng/ml激活蛋白A(Sigma)的 10％FBS/DMEM培养基中培养24小时。然后，再将EB转入10％ FBS/DMEM中培养6-8小时作为间歇时间。间歇过后，再用含有10-6M RA (Sigma)的10％FBS/DMEM培养基继续培养分化的EB细胞24小时。
第二步，为了引起产胰岛素的前体细胞的扩增，用含有10ng/ml bFGF (Sigma)的10％FBS/DMEM培养基培养分化的EB细胞3-5天，在此期间， 大部分的细胞呈现上皮样结构(参见图1C)。
第三步，为引起产胰岛素的细胞的成熟，在第二步中扩增的细胞被转 入含有N2增补剂(1∶100，Gibco-BRL)，B27增补剂(1∶50Gibco-BRL)，1μg/ml 层粘连蛋白(Sigma)，10ng/ml bFGF(Sigma)和10mM烟碱胺(Sigma)的 DMEM/F12培养基(Gibco-BRL)中继续培养3-5天(Lumelsky N，Blondel O，Laeng P，et al.Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets.Science 2001；292：1389-1394)。用尼康 相差显微镜(TS-100)观察细胞的形态。结果显示被培养的细胞形成集落结 构(参见图1D和图1E)。
二、用RT-PCR检测分化的细胞中基因的表达情况
用Catrimox-14RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取由第二步或第三步得到 被激活蛋白A和RA共同诱导的，没有被激活蛋白A和RA诱导的，或仅被 其中之一诱导的细胞的总RNA。用MMLV逆转录酶(Promega)将RNA逆转 录为cDNA。利用PCR缓冲液中Ex Taq聚合酶(TaKaRa)体系完成PCR反 应。循环条件如下：在94℃反应5分钟，之后循环35个周期(在94℃变性 50秒，在56-58℃退火30秒，在72℃延长40秒)，最后再在72℃培养4分 钟。利用Prime Premier 5.0设计pdx1，glut2，isl1，β-肌动蛋白等的PCR引物。 PCR引物的序列(有义链和反义链分别显示)如下：
InsulinI：TAGTGACCAGCTATAATCAGAG(序列号1)和 ACGCCAAGGTCTGAAGGTCC(288bp)(序列号2)；
hnf3β：ACCTGAGTCCGAGTCTGACC(序列号3)和 GGCACCTTGAGAAAGCAGTC(345bp)(序列号4)；
pdx1：CTTAGCGTGTCGCCACAGCCCTCCA(序列号5)和 TCCAACAGCCGCCTTTCGTTATTCT(472bp)(序列号6)；
glut2：GGATAAATTCGCCTGGATGA(序列号7)和 TTCCTTTGGTTTCTGGAACT(299bp)(序列号8)；
isl1：ATTTGCCACCTAGCCACAGCACC(序列号9)和 CGCATTTGATCCCGTACAACCTG(335bp)(序列号10)；
β-actin：CCTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAA(序列号11)和 ATACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA(480bp)(序列号12)；
hnf4α：ACACGTCCCCATCTGAAG(序列号13)和 CTTCCTTCTTCATGCCAG(269bp)(序列号14).
结果如图2A-图2C所示，图2A的第一行显示第二步末得到的只用激活 蛋白A诱导的细胞主要表达hnf3β和pdx-1；第二行显示第二步末得到的只 用RA诱导的细胞只表达hnf3β。图2B表明，第二步末得到的用激活蛋白A 和RA双因子诱导的细胞表达标志基因：pdx-1，hnf3β，insulinI和hnf4α；图 2C表明在第三步末，激活蛋白A和RA双因子诱导的细胞主要表达insulinI， pdx-1，isl1，glut2和hnf3β(第三泳道“+”)。图2A-图2C中，-RT表示 没有逆转录的阴性对照，空白表示在阴性对照中仅使用水；图2C中，第一 泳道“胰腺”为成熟小鼠胰腺细胞阳性对照；第二泳道的符号“-”表示 在第三步末没有用激活蛋白A和RA诱导的小鼠ES-R1细胞；符号“+” 表示在第三步末有用激活蛋白A和RA双因子诱导的小鼠ES-R1细胞。
这些细胞不表达其它胰岛内分泌细胞(非β细胞)的标志，如胰高血 糖素或促生长素抑制素。该结果表明TGF-β和RA信号可能对胰腺β细胞 的发育和成熟具有特异性。并发现诱导过程对激活蛋白A和RA的具有严 格的依赖性，如果缺少二者其一则几乎没有小细胞集落的形成，且被诱导 的细胞不表达或仅微弱表达胰岛素，pdx1，isl1，glut2和hnf3β(参见图2C 中第二泳道)。此外，我们还发现如果用层粘连蛋白或明胶代替matrigel来 铺被培养皿，在第三步没有小细胞集落形成。
三、免疫组化分析
为了证明诱导的胰岛素阳性细胞还能够表达C-肽，对其进行了免疫组 化分析：将由第三步得到的被诱导细胞用4％多聚甲醛固定，PBS洗三遍 后用10％正常山羊或兔血清室温孵育20分钟。弃山羊血清，分别加胰岛素 一抗(兔多克隆IgG，1∶200，Santa Cruz)或C-肽一抗(Linco)4℃过夜培养 细胞。接着进一步用罗丹明缀合山羊抗兔二抗IgG，FITC缀合兔抗山羊二抗 IgG(1∶200，Santa Cruz)或生物素缀合IgG(工作溶液，Santa Cruz)孵育。利用 DAB作为以生物素缀合IgG作为二抗时的反应底物。用奥林帕斯相差显微 镜(Olympus IX-71)捕获图像。结果表明细胞既表达胰岛素，又表达C- 肽(图3A和图3B)。
利用DTZ染色(Shiroi A，Yoshikawa M，Yokota H，et al.Identification of insulin-producing cells derived from embryonic stem cells by Zinc-Chelating Dithizone.STEM CELLS 2002；20(4)：284-292)来检测由该三步培养法发育 而来的细胞或没有经过激活蛋白A和RA诱导发育而来的细胞(对照组)。 结果表明经三步处理出现了的DTZ阳性细胞集落(洋红色)(图3D)，而对 照组中无DTZ阳性细胞集落(图3C)。这表明由此得到的细胞集落含有胰 岛素阳性的细胞。
四、EGFP报告基因的构建以及ES细胞的转染
有证据表明ES细胞后代能够吸收来源于培养基中的胰岛素而被胰岛 素抗体染色为阳性(Hori Y，Rulifson IC，Tsai BC，et al.Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2002；99(25)：16105-16110)。为确定胰岛素确实是 由诱导的细胞集落产生，采用EGFP报告体系来检测胰岛素的表达。用 EGFP报告载体转染R1 ES细胞，其中含有一个被胰岛素启动子驱动的绿 色荧光蛋白质cDNA。利用G418筛选已接入此载体的ES细胞，并利用激活 蛋白A和RA对其进行诱导。具体方法如下：构建人胰岛素启动子接EGFP 的载体。将一个从pFOXCAT-362 hIns(Odagiri H，Wang JH，and German MS. Function of the Human Insulin Promoter in Primary Cultured Islet Cells.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 1996；271(4)：1909-1915)切下 0.4kb的含人胰岛素启动子的Xba I和Hind III片段与CMV启动子已被 AseI和HindIII切除的pCMV-EGFPN3载体(BD Biosciences)连接。将此 具有新霉素抗性的载体通过电穿孔转染到ES R1细胞品系中，并用250 μg/ml G418(Gibco-BRL)筛选阳性ES克隆。筛选出的小鼠ES-R1阳性克隆 首先通过激活蛋白A和RA双因子刺激，利用EGFP对得到的小细胞集落进 行检测。EGFP结果如图3E和图3G所示，在得到的小的细胞集落中可以检 测到EGFP的表达。另外其表达模式同胰岛素表达相吻合(图3F和图3H， 按照第三步的免疫组化分析方法进行检测)。这些数据表明激活蛋白A和 RA以及其它成熟的因子的联合作用，能够诱导ES细胞向胰腺细胞的分化。
五、ELISA检测胰岛素的分泌量
为了进一步测试诱导后的细胞的胰岛素分泌量是否能够对葡萄糖具 有依赖性，使用了两种浓度(5.5mM和27.7mM)的葡萄糖。用含有2.5mM 葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液(pH 7.4)在37℃来预孵育细胞90分钟。为诱导 胰岛素的释放，再用含27.7mM葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液在37℃孵育15 分钟(样品A)。将另一组细胞先用含2.5mM葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液 在37℃预孵育90分钟，为诱导胰岛素的释放，再用含5.5mM葡萄糖的 Krebs-Ringer缓冲液在37℃孵育15分钟(样品B，作为对照)。收集被调节 的培养基。用Rat/Mouse Insulin ELISA试剂盒(CRYSTAL CHEM INC)检 测两份培养基样品的胰岛素分泌量。细胞总蛋白量用BCATM Protein Assay 试剂盒(PIERCE)测定。结果表明细胞在高葡萄糖浓度中胰岛素的分泌量 比低葡萄糖浓度时高五倍左右(参见图3I，图3I中胰岛素的含量单位为ng胰 岛素/mg细胞总蛋白；柱A为经27.7mM葡萄糖处理后的胰岛素分泌水平， 比柱B(经5.5mM葡萄糖处理的)高近5倍)。该结果表明ES来源的胰岛素 阳性细胞进行的胰岛素分泌也能够受葡萄糖浓度的调控。
六、产胰岛素的细胞向小鼠肾包囊下的移植
为了测试ES细胞来源的胰岛素阳性细胞是否能够逆转糖尿病小鼠，将 分化细胞移植到STZ诱发的糖尿病小鼠的左侧肾包囊中(n＝9)。具体方法如 下：
在细胞或PBS移植前，向6到8周的129只公鼠腹腔内注射50mg/kg剂量 的链脲菌素(STZ，Sigma)，连续注射5天，以诱导的实验糖尿病的形成。 当被STZ处理的小鼠血液葡萄糖浓度高于13.9mM时，向小鼠左侧肾包囊中 移植1×106个产胰岛素的细胞。向对照组(n＝12)进行PBS处理。用 GlucoTREND2(Roche)从被剪断的尾巴中测量血液葡萄糖浓度。取经过手 术的肾脏进行冰冻切片，并对肾包囊中被移植细胞的胰岛素表达进行免疫 组化分析。结果表明被分化细胞处理的糖尿病小鼠(n＝9)存活时间较长， 其存活率达到70％，而移植了PBS的糖尿病小鼠(n＝12，实线)存活率为25％ (图4A)。并且存活的小鼠能够将体重维持在正常水平。约两周后，被进行 细胞移植的糖尿病小鼠的血液葡萄糖恢复到正常水平(低于13.9mM)； 相反，进行了PBS移植的小鼠(n＝3)的血液葡萄糖持续维持较高水平 (＞13.9mM)(图4B)。此外，将进行了细胞移植的左肾切除后，小鼠的血液 葡萄糖上升至14mM。利用胰岛素一抗没有在注射了PBS的左肾中检测到 胰岛素阳性细胞(图5A)；而只在被分化细胞处理的STZ-糖尿病小鼠肾脏 中检测到胰岛素阳性细胞(图5B)。这些结果表明来源于ES细胞的胰岛素 阳性的细胞可以逆转糖尿病小鼠。
实施例2、诱导人胚胎干细胞为胰腺细胞
本发明使用了人ES细胞品系，H1或H9。(Thomson JA，Itskovitz-Eldor J， Shapiro SS，et al.Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.Science 1998；282：1145-1147.)。这些细胞的培养温度为37℃。
培养体系为化学组份确定的培养基(CDM：50％IMDM(Gibco)， 50％F12(Gibco)，单硫甘油(sigma)450umol/L，胰岛素-运铁蛋白-硒-A (ITS，Gibco)，清蛋白片段V(Sigma)5mg/ml)。简要地，hES细胞被转入 CDM进行分化。然后用激活蛋白A和RA诱导hES细胞向胰腺前体细胞 的分化。在此基础上，利用在mES诱导方法中描述的胰岛培养条件进一步 成熟hES来源的胰腺β细胞。
为进行分化，实验流程设计如下：
第一步，将hES细胞传代到被1％Matrigel(B&D Biosciences)包被的组 织培养皿(Nunc)上。然后，用改良的CDM(11)替换上述培养基。此改良 的CDM含有：50％IMDM(Gibco)和50％F12NUT-MIX(Gibco)，并添加胰 岛素-运铁蛋白-硒-A(1∶100，Gibco)，450μM的单硫甘油(sigma)和5mg/ml 的清蛋白片段V(Sigma)。两天后，以含50ng/ml激活蛋白A(Sigma)的 CDM培养基对这些细胞诱导4天。
第二步，激活蛋白A诱导4天后，将细胞转移到含有10-6M RA(Sigma) 的CDM中，再诱导4天。
第三步，将培养基从CDM变换为改良的胰岛成熟培养基(12)： DMEM/F12(Gibco)，胰岛素-运铁蛋白-硒-A(1∶100，Gibco)和2mg/ml清蛋 白片段V(Sigma)以及10ng/ml bFGF。细胞在此培养基中培养3天。之后， 再转入含DMEM/F12(Gibco)，胰岛素-运铁蛋白-硒-A(1∶100，Gibco)和2 mg/ml清蛋白片段V(Sigma)以及10mM烟碱胺(Sigma)。并在此培养基 中培养2天。然后再利用0.5mg/ml的分散酶(Gibco)消化这些细胞，并将其 转移到超级低依附培养皿(Costar)中放置5天，以形成悬浮培养液从而实现 胰岛的成熟。
二、分化细胞中基因表达的RT-PCR分析。
根据实施例1第二部分描述的方法，利用RT-PCR检测了促生长素抑制 素(SST)，Glut2，淀粉酶(Amy)，Sox17，Hnf4α，pdx-1，胰岛素(INS)，Hb9，葡 糖激酶(GCK)，IFABP等在分化细胞和对照组细胞中(培养在不含激活蛋白 A和RA诱导的CDM中)的表达。在此，分化细胞是指依照此三步培养法 获得的成熟β细胞。对照组细胞指被激活蛋白A和RA其中之一诱导的细 胞。PCR引物序列(有义和反义分别显示)如下：
gapd：GTCATTGAGAGCAATGCCAG(序列号15)和 GTGTTCCTACCCCCAATGTG(200bp)(序列号16)；
sox17：CAGTGACGACCAGAGCCAGACC(序列号17)和 CCACGACTTGCCCAGCATCTT(292bp)(序列号18)；
pdx1：ACCAAAGCTCACGCGTGGAAA(序列号19)和 TGATGTGTCTCTCGGTCAAGTT(200bp)(序列号20)；
hlxb9：CCTAAGATGCCCGACTTCAACTCCC(序列号21)和 GCCCTTCTGTTTCTCCGCTTCCTG(276bp)(序列号22)；
hnf4α：ATCAGAAGGCACCAACCTCAAC(序列号23)和 TGTCTTTGTCCACCACGCACT(197bp)(序列号24)；
胰岛素：GAGGCCATCAAGCACCAYCAC(序列号25)和 GGCTGCGTCTAGTTGCAGTA(373bp)(序列号26)；
glut2：GCTACCGACAGCCTATTCTA(序列号27)和 CAAGTCCACTGACATGAAG(267bp)(序列号28)；
淀粉酶(amy)：CTGACAACTTCAAAGCAAA(序列号29)和 TACAGCATCCACAAATACGA(358bp)(序列号30)；
促生长素抑制素(SST)：GATGCTGTCCTGCCGCCTCC(序列号31)和 TGCCATAGCCGGGTTTGA(292bp)(序列号32)；
sur1：TTGCCGAAACCGTAGAAGGA(序列号33)和 TTGGAGACCATTAGGGCGTAG(268bp)(序列号34)；
胰高血糖素(GCG)：AGGCAGACCCACYCAGTGA(序列号35)和 AACAATGGCGACCTCTTCTG(308bp)(序列号36)；
葡糖激酶(GCK)：AGGGAATGCTTGCCGACTC(序列号37)和 CACTGGCCTCTTCATGGGT(375bp)(序列号38).
结果如图7A和图7B所示，表明分化的ES细胞能够表达成熟β细胞的 标志基因如胰岛素，pdx-1，葡糖激酶和glut2(图7A)。相反，对照组基本 上不表达任何标志基因(图7B)。
三、免疫组化分析。
用4％多聚甲醛固定被诱导细胞，PBS洗三遍后，在含有0.3％ tritonX-100(Sigma)和10％正常血清的PBS中，室温孵育细胞40分钟。然后 再用山羊抗人sox17抗体(1∶40，R&D SYSTEMS)一抗，小鼠抗人胰岛素单 克隆抗体(1∶100，CHEMICON)一抗，兔抗人C-肽抗体(1∶200，Linco)一 抗，胰高血糖素(山羊多克隆IgG，1∶200，Santa Cruz)一抗，pdx1(山羊多 克隆IgG，1∶200，Santa Cruz)一抗，淀粉酶(兔多克隆IgG，1∶500，Sigma) 一抗，ngn3(山羊多克隆IgG，1∶200，Santa Cruz)一抗或促生长素抑制素(山 羊多克隆IgG，1∶200，Santa Cruz)一抗在4℃过夜孵育，并进一步分别用下 列二抗孵育：TRITC-缀合山羊抗兔IgG，FITC-缀合兔抗山羊IgG，FITC- 缀合山羊抗鼠IgG，FITC-缀合驴抗山羊IgG或TRITC-缀合驴抗兔IgG (1∶200，全部购自Jackson ImmunoResearch，INC.)。利用DAPI(Sigma)染 色检测细胞核。用奥林帕斯相差显微镜(Olympus IX-71)捕获图像。用 Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)计算了C-肽阳性细胞的百分数。
结果表明这些细胞能够表达胰腺β细胞基因，例如C-肽，pdx-1等(图 8)。
四、产胰岛素的细胞向肾包囊下的移植
为了证明ES细胞来源的胰岛素阳性细胞是否能够在体内环境下行使 正常的功能，将分化细胞移植到STZ诱发的糖尿病小鼠的左侧肾包囊中 (n＝12)。具体方法如下：
所有的动物操作都经过北京大学教育动物护理与使用委员会的批准。 在细胞或PBS移植前，向4到6周的BALB/c公裸鼠腹腔内注射40mg/kg剂量 的链脲菌素(STZ，Sigma)，连续注射5天，以诱导实验糖尿病的形成。当 被STZ处理的小鼠已发展患有糖尿病时，将大约1×106个诱导细胞移植到左 肾包囊中。无激活蛋白A和RA诱导的PBS或细胞作为实验对照使用。过 夜禁食后，利用i.g.葡萄糖(2.5g kg-1体重)进行了糖耐性测试。利用 GlucoTREND2(Roche)从剪断的尾巴中测定血液葡萄糖水平。取经过手术 的肾脏进行冰冻切片，并利用免疫组化分析确定被移植了细胞的肾包囊中 C-肽的表达。利用小鼠抗人核单克隆抗体(1∶30，CHEMICON)检测到了 hES来源的细胞。用奥林帕斯相差显微镜(Olympus IX-71)捕获图像。结 果显示注射了PBS的肾脏中没有发现胰岛素阳性细胞；此移植小鼠的结果 显示在图11A和11B中。移植了人ES来源的分化细胞能够表达C-肽(图 11A)。C-肽阳性细胞能通过对人核特异性抗体被染色，说明这些细胞来源 于人ES细胞(图11B)。
人胚胎干(hES)细胞向胰腺β细胞的实验诱导为I型糖尿病的移植治 疗提供了一种潜在的来源。本发明提供的三步培养法能够诱导hES分化为 功能性的产胰岛素的细胞。这种基于将hES培养在化学成分确定的培养基 (CDM)及激活蛋白A，全反式视黄酸(RA)和其它成熟因子(参见图 6)中的方法模拟了体内胰腺发育的信号传导。通过RT-PCR检测发现，hES 来源的细胞表达胰腺β细胞标志基因，例如pdx1，胰岛素，葡糖激酶和 glut2(参见图7)。这些细胞为C-肽，pdx1，胰高血糖素，促生长素抑制素或 淀粉酶阳性，且C-肽阳性排除了胰岛素是通过免疫组化检测方法被吸收的 可能性(参见图8)。为了进一步分析诱导后细胞的胰岛素分泌是否是葡萄 糖依赖型，使用了两种浓度(2.5mM和27.5mM)的葡萄糖。用Krebs-Ringer 缓冲液在37℃来预孵育细胞90分钟后，用含有2.5mM葡萄糖的 Krebs-Ringer缓冲液在37℃来预孵育15分钟。为诱导胰岛素的释放，再用 27.5mM葡萄糖孵育细胞15分钟。收集各自的被调节的培养基。用Rat/Mouse Insulin ELISA试剂盒(Linco)检测两份培养基样品的胰岛素分泌量。细胞 内C-肽浓度由Human C-肽ELISA试剂盒(Linco)测定。细胞总蛋白量用 BCATM Protein Assay试剂盒(PIERCE)检测。结果表明在悬浮培养中被诱 导的细胞在高葡萄糖水平培养基中分泌胰岛素的量与在低葡萄糖水平培 养基中相比提高了200％(图9A)。而且，悬浮培养产生的细胞细胞内C- 肽含量也增加了(图9B)。然而，由贴壁培养培养获得的细胞的胰岛素分 泌量不响应葡萄糖的刺激(图9A，B)。这些数据表明与贴壁培养相比， 悬浮培养引起了胰岛样细胞更高效的成熟。
为了研究被诱导的细胞是否能够在体内具有功能性，我们向糖尿病裸 鼠的肾包囊下移植了分化细胞。30％的移植了被诱导细胞的小鼠的血液葡 萄糖在近6周内维持在正常水平(＜13.9mM)(图10A)。糖耐受性检测显 示这30％的血液葡萄糖被逆转了的裸鼠，与被进行了对照操作的小鼠相比， 还获得了改善了的葡萄糖调控能力(图10B)。移植后一个月，在被移植了 由此三步培养法诱导的细胞的肾包囊中检测到了C-肽阳性细胞。利用人核 特异性抗体对这些细胞进行染色，结果显示这些C-肽阳性细胞来源于被注 射的hES细胞(图11A和11B)。
这些结果清楚地显示hES细胞来源的产胰岛素的细胞不仅能够存活； 而且它们还能体内逆转30％的STZ诱导的糖尿病小鼠。此发现为人类胰岛 细胞的发育机制的研究提供了一个新的体外模型，并且这些hES来源的产 胰岛素的细胞可在未来的对I型糖尿病移植治疗中被利用。
为达到所述目的，本发明通过了提供一种诱导胚胎干细胞的方法，包 括以下顺序的步骤：
在细胞培养基中培养胚胎干细胞以形成胚体；
利用激活蛋白A孵育胚体；和
利用全反式视黄酸(RA)孵育胚体以使其发育为产胰岛素的前体细 胞。
在一方面，当胚胎干细胞来源于小鼠时，本方法中使用的培养基是含 有约10％胎牛血清的DMEM。在另一种情形，当胚胎干细胞来源于人时， 所述培养基是CDM。
在一方面，所述激活蛋白A的浓度约为50-300ng/ml培养基，所述 RA的浓度可为约1×10-7-1×10-5mol/L培养基。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：在用激活蛋白A 孵育胚体前，在包被Metrigel的培养基中孵育胚体。在一方面，所述Metrigel 在培养基中的质量百分含量约为1％。
在另一个实施方案中，用激活蛋白A孵育胚体20小时到4天，再在 不含激活蛋白A的培养基中继续培养6-8小时，然后再利用RA孵育20 小时到4天以使其发育为产胰岛素的前体细胞。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：在含有成熟因 子的培养基中培养由此生成的产胰岛素的前体细胞以使其扩增。在一个实 施方案中，所述成熟因子是浓度为8-12ng/ml的bFGF。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：在含有N2添 加剂、B27添加剂、层粘连蛋白(Laminin)和烟酰胺的培养基中孵育此扩 增了的产胰岛素的前体细胞以使其发育为产胰岛素的细胞。在一方面，所 述培养基是含N2添加剂(1∶100，可从Gibco购买)，B27添加剂(1∶50， 可从Gibco购买)，1μg/ml的层粘连蛋白，10ng/ml的bFGF，胰岛素- 运铁蛋白-硒-A(1∶100，可从Gibco购买)，以及10mmol/L烟酰胺的 DMEM/F12或CDM培养基。
本发明进一步提供一种诱导胚胎干细胞分化的试剂盒。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括激活蛋白A和RA。在另一个实 施方案中，所述试剂盒进一步包括Metrigel。在再一个实施方案中，所述 试剂盒进一步包括血清和/或一级培养基。在一方面，Metrigel被包被在所 述一级培养基上。在另一方面，单独提供Metrigel。在另一方面，所述一 级培养基含有成熟因子，例如bFGF。在另一个实施方案中，所述试剂盒 进一步包括一种含有bFGF的二级培养基。
附图说明
图1A为在本发明中提供的能诱导ES细胞向胰岛素阳性细胞分化的 三步培养法。
图1B为小鼠ES-R1细胞形成EB细胞集落的照片。
图1C为在三步培养法的第二步中的胰腺前体细胞呈现上皮样结构的 照片。
图1D-图1E为在三步培养法的第三步出现的细胞集落样结构的照片。
图2A为RT-PCR检测在第二步末由激活蛋白A或RA分别诱导的分化 细胞标志基因的表达情况。
图2B为RT-PCR检测在第二步末由激活蛋白A和RA共同诱导的分化 细胞标志基因的表达情况。
图2C为RT-PCR检测在第三步末分化细胞标志基因的表达情况。
图3A为三步培养法得到的细胞被胰岛素一抗染色的免疫组化检测结 果。
图3B为三步培养法得到的细胞被C-肽一抗染色的免疫组化检测结 果。
图3C为未经激活蛋白A和RA诱导的细胞的胰岛素二氨基联苯胺四 盐酸盐(DAB)染色检测结果(200×)。
图3D为经激活蛋白A和RA诱导的细胞的胰岛素DAB染色检测结 果(200×)。
图3E和图3G为由三步培养法诱导的转染了EGFP报告基因的ES-R1 细胞的EGFP表达情况，其中E、G分别代表不同的结构(200×)。
图3F和图3H为由三步培养法诱导的转染了EGFP报告基因的ES-R1 细胞被胰岛素一抗染色的免疫组化分析结果，其中F、H分别代表不同的 结构(200×)。
图3I为由ELISA检测的胰岛素释放结果。
图4A为被移植了分化细胞的糖尿病小鼠(n＝9)和被移植了PBS的糖尿 病小鼠(n＝12)存活率的比较。
图4B为被移植了分化细胞的糖尿病小鼠(n＝5)和被移植了PBS的糖尿 病小鼠(n＝3)血液葡萄糖水平的分析。
图5A为被移植了PBS的小鼠胰岛素表达的免疫组化分析结果(200 ×)。
图5B为被移植了分化细胞的小鼠胰岛素表达的免疫组化分析(200 ×)。
图6为人胚胎干(hES)细胞的诱导方法流程。
图7A为由CDM作用/RA方法诱导的hES的标志基因的表达情况。
图7B为仅由CDM培养的对照hES的标志基因的表达情况。
图8A-D为最终诱导的hES细胞表达C-肽和Pdx1的照片(400×)。
图8E-H为最终诱导的hES细胞表达胰高血糖素和C-肽的照片。
图8I-L为最终诱导的hES细胞表达淀粉酶和C-肽的照片(400×)。
图8M-P为最终诱导的hES细胞表达C-肽和促生长素抑制素的照片。
图9A为悬浮和贴壁培养获得的末端分化细胞胰岛素分泌量的比较。
图9B为悬浮和贴壁培养获得的末端分化细胞C-肽释放量的比较。
图10A为移植了被诱导细胞的糖尿病裸鼠和移植了PBS小鼠，以及 移植了未经诱导细胞的小鼠的血液葡萄糖水平的比较。
图10B为被操作小鼠腹膜内葡萄糖耐量测试结果。
图11A为被诱导细胞中人C-肽表达的照片(400×)。
图11B为人核特异性抗体的染色结果，显示了C-肽阳性细胞来源于人 ES细胞(400×)。
优选实施方案详述
预先的研究显示，胚胎干细胞能够被特异性诱导分化成胰腺β细胞 (Blyszczuk P，Czyz J，Kania G，et al.Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells.Proc Natl Acad Sci U S A 2003；100(3)：998-1003； Hansson M，Tonning A，Frandsen U，et al.Artifactual Insulin Release From Differentiated Embryonic Stem Cells.Diabetes 2004；53：2603-2609)。但是， 绝大多数诱导方案都需要大约一个月才能获得胰岛素阳性的细胞。本发明 提供了一种新的三步培养法，它是基于激活蛋白A、RA和其它一些成熟 因子例如matrigel、烟酰胺(nicotinamide)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)的联合作用。在该三步培养法的第三步末，这些被诱导的细胞形 成小的胰岛样的集落结构并表达胰腺β细胞的标志基因，包括insulin、 pdx1、glut2、isl1和hnf3β，并且还能通过移植拯救经STZ处理的糖尿病 小鼠。
三种因子，如激活蛋白A，RA和matrigel，在我们的胰腺β细胞实验诱 导方案中起了十分重要的作用。激活蛋白A对早期确定的内胚层的发育十 分重要。它是二硫键稳定的蛋白，属于TGF-β超家族。它与细胞表面受体 的结合能诱导许多基因的表达，包括mixl1和goosecoid，这对早期内胚层 的发育很重要(Kumar M，Jordan N，Melton DA，et al.Signals from lateral plate mesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate.Developmental Biology 2003；259：109-122；Hill CS.TGF-βsignalling pathways in early Xenopus development.Curr Opin Genet Dev 2001；11(5)：533-540)。Kubo等报 导激活蛋白A能够诱导ES细胞分化成为确定的内胚层细胞(Kubo A， Shinozaki K，Shannon JM，et al.Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.Development 2004；131：1651-1662)。另外， 激活蛋白A在培养的人胰岛中促进胰岛素的分泌(Florio P，Luisi S， Marchetti P，et al.Activin A stimulates insulin secretion in cultured human pancreatic islets.J Endocrinol Invest 2000；23(4)：231-234)，并在患糖尿病的 新生小鼠的β细胞发育中调控分化和β细胞的再生(Lei L，Yi Z，Seno M，et al.Activin A and Betacellulin Effect on Regeneration of Pancreatic β-Cells in Neonatal Streptozotocin-Treated Rats.Diabetes 2004；53：608-615)。激活蛋白 A的这些功能的联合能够解释它如何在我们的系统中起作用。第二，近期 已经证明RA除了具有诱导外胚层和中胚层发育的功能，在早期胎胰发育 中也是一个重要的信号分子(Maden M.Role and distribution of retinoic acid during CNS development.Int Rev Cytol 2001；209：1-77)。在斑马鱼的发育中， RA信号上调能够诱导胰脏和肝脏内胚层前端的显著扩增。相反地，用 BMS493抑制RA，能够抑制胚胎内胚层向胰腺的早期分化(Stafford D， Prince VE.Retinoic Acid signaling is required for a critical early step in Zebrafish pancreatic development.Current Biology 2002；12(14)：1215-1220)。 而且，Micallef等报导，在小鼠胚胎干细胞分化的第四天加入RA能诱导pdx1 阳性的内胚层形成(Micallef SJ，Janes ME，Knezevic K，et al.Retinoic Acid Induces Pdx1-Positive Endoderm in Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells.Diabetes 2004 Dec 7[Epub ahead of print])。对于胰腺的成熟，RA在 内分泌和导管细胞分化中的作用主要是通过旁分泌以及上调pdx1基因实 现的(Tulachan SS，Doi R，Kawaguchi Y，et al.All-trans retinoic acid induces differentiation of ducts and endocrine cells by mesenchymal/epithelial interactions in embryonic pancreas.Diabetes 2003；52(1)：76-84)。在背胰的发 育中RA被发现通过抑制外分泌部分分化而促进内分泌部分发育(Chen Y， Pan FC，Brandes N，et al.Retinoic acid signaling is essential for pancreas development and promotes endocrine at the expense of exocrine cell differentiation in Xenopus.Developmental Biology 2004；271：144-160)。因 此，很显然RA能促进胰腺前体细胞和内分泌细胞的发育。在激活蛋白A 诱导ES细胞向内胚层分化的过程中，RA可以进一步促进内胚层向胰腺前 体的特化。在用激活蛋白A和RA诱导后，分化的胚胎干细胞可以表达许 多胰腺前体细胞的标志基因，例如pdx1、hnf3α和hnf4β。这些数据显示， 激活蛋白A和RA的联合作用能够诱导胚胎干细胞向早期胰腺细胞的分 化。本发明的结果也表明同时使用激活蛋白A和RA进行诱导比只用其中 之一更为有效。已经证明matrigel在胰腺的体外分化和成熟中起着很重要的 胞外基质的作用。Matrigel是一种包括层粘连蛋白在内的胞外基质和一些 生长因子例如FGF和TGF-β的混合物，对胰腺祖细胞的迁移、三维囊状结 构的形成和胰岛芽突出有重要作用(Gao R，Ustinov J，Pulkkinen MA，et al. Characterization of Endocrine Progenitor Cells and Critical Factors for Their Differentiation in Human Adult Pancreatic Cell Culture.Diabetes 2003； 52：2007-2015)。Gittes GK等也证明matrigel中最主要的成分之一，层粘连 蛋白，参与了小鼠胚胎胰导管系的选择(Jiang FX，Cram DS，DeAizpurua HJ， et al.Laminin-1 promotes differentiation of fetal mouse pancreatic betacells. Diabetes 1999；48：722-730；Crisera CA，Kadison AS，Breslow GD，et al. Expression and role of laminin-1 in mouse pancreatic organogenesis.Diabetes 2000；49：936-944)。而且，培养在matrigel上的人胰腺导管上皮细胞能够形 成胰岛素阳性的胰岛样集落结构(Bonner-Weir S，Taneja M，Weir GC，et al. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.Proc Natl Acad Sci U S A 2000；97：7999-8004)。本发明证明matrigel在诱导中对于小的 胰岛样集落结构形成是必需的。如果ES细胞单独培养在层粘连蛋白或者明 胶(gelatin)上，细胞集落不能很好的形成。在此后的例举性实施例中进一 步显示分化的细胞在matrigel上生长得比在层粘连蛋白或明胶上好。这些说 明，matrigel能比层粘连蛋白或明胶提供更多的诱导因子。
本发明提供了一种新的、能在短期内诱导ES细胞向功能性的产胰岛素 的细胞分化的三步培养法，此方法基于激活蛋白A、RA以及任选地其它 成熟因子的组合。结果显示TGF-β和RA信号对于胰腺β细胞的发育和成熟 是很关键的。胰岛素阳性细胞还能进一步表达一些特征性的胰腺β细胞标 志基因，例如insulinI、pdx1、glut2、hnf3β和isl1。而且，利用携带位于胰 岛素启动子下游的EGFP的报告基因的载体，本发明能够降低假阳性率， 从而真实地诱导ES细胞分化为产胰岛素的细胞。此外，如下述实施例所证 明的，当被移植到肾包囊部位下时本发明还能够拯救链脲菌素(STZ)诱 导的糖尿病小鼠。此处描述的诱导系统为研究胰腺β细胞的形成和分化机 制提供了一种新的体外诱导模型，同时为I型糖尿病的移植治疗提供了一种 潜在的产胰岛素的细胞的来源。
到此已对本发明进行了概括的描述，通过参考下面的实施例将更便于 对其内容的理解。这些实施例的提供是为了进行例证，而不意欲限制本发 明。
实施例
实施例1、诱导小鼠胚胎干细胞为胰腺细胞
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
在含20％胎牛血清(FBS)(Gibco-BRL)，1000U/ml白血病抑制因子 (LIF，Gibco-BRL)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM， Gibco-BRL)培养基中培养一个已被广泛测试过ES细胞品系-- ES-R1(Nagy A，Rossant J，Nagy R，et al.Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.Proc.Natl. Acad.Sci.USA 1993；90：8424-8428)。
一、ES细胞培养和分化的条件
ES细胞向胰腺β细胞分化的方法(三步培养法，参见图1A)如下所示：
第一步，为诱导胚体(EB)的形成，用胰蛋白酶常规消化ES细胞并使 其悬浮在装有无LIF的10％FBS/DMEM培养基的Petri培养皿(Alpha medical instrument)中。24至48小时后(参见图1B)，收集EB并转移到装有无LIF的 10％FBS/DMEM培养基且包被了1％Matrigel(BD Biosciences)的培养皿 中。两小时后，EB开始铺展，并在含有100ng/ml激活蛋白A(Sigma)的 10％FBS/DMEM培养基中培养24小时。然后，再将EB转入10％ FBS/DMEM中培养6-8小时作为间歇时间。间歇过后，再用含有10-6M RA (Sigma)的10％FBS/DMEM培养基继续培养分化的EB细胞24小时。
第二步，为了引起产胰岛素的前体细胞的扩增，用含有10ng/ml bFGF (Sigma)的10％FBS/DMEM培养基培养分化的EB细胞3-5天，在此期间， 大部分的细胞呈现上皮样结构(参见图1C)。
第三步，为引起产胰岛素的细胞的成熟，在第二步中扩增的细胞被转 入含有N2增补剂(1∶100，Gibco-BRL)，B27增补剂(1∶50Gibco-BRL)，1μg/ml 层粘连蛋白(Sigma)，10ng/ml bFGF(Sigma)和10mM烟碱胺(Sigma)的 DMEM/F12培养基(Gibco-BRL)中继续培养3-5天(Lumelsky N，Blondel O，Laeng P，et al.Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets.Science 2001；292：1389-1394)。用尼康 相差显微镜(TS-100)观察细胞的形态。结果显示被培养的细胞形成集落结 构(参见图1D和图1E)。
二、用RT-PCR检测分化的细胞中基因的表达情况
用Catrimox-14RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取由第二步或第三步得到 被激活蛋白A和RA共同诱导的，没有被激活蛋白A和RA诱导的，或仅被 其中之一诱导的细胞的总RNA。用MMLV逆转录酶(Promega)将RNA逆转 录为cDNA。利用PCR缓冲液中Ex Taq聚合酶(TaKaRa)体系完成PCR反 应。循环条件如下：在94℃反应5分钟，之后循环35个周期(在94℃变性 50秒，在56-58℃退火30秒，在72℃延长40秒)，最后再在72℃培养4分 钟。利用Prime Premier 5.0设计pdx1，glut2，isl1，β-肌动蛋白等的PCR引物。 PCR引物的序列(有义链和反义链分别显示)如下：
InsulinI：TAGTGACCAGCTATAATCAGAG(序列号1)和 ACGCCAAGGTCTGAAGGTCC(288bp)(序列号2)；
hnf3β：ACCTGAGTCCGAGTCTGACC(序列号3)和 GGCACCTTGAGAAAGCAGTC(345bp)(序列号4)；
pdx1：CTTAGCGTGTCGCCACAGCCCTCCA(序列号5)和 TCCAACAGCCGCCTTTCGTTATTCT(472bp)(序列号6)；
glut2：GGATAAATTCGCCTGGATGA(序列号7)和 TTCCTTTGGTTTCTGGAACT(299bp)(序列号8)；
isl1：ATTTGCCACCTAGCCACAGCACC(序列号9)和 CGCATTTGATCCCGTACAACCTG(335bp)(序列号10)；
β-actin：CCTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAA(序列号11)和 ATACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA(480bp)(序列号12)；
hnf4α：ACACGTCCCCATCTGAAG(序列号13)和 CTTCCTTCTTCATGCCAG(269bp)(序列号14).
结果如图2A-图2C所示，图2A的第一行显示第二步末得到的只用激活 蛋白A诱导的细胞主要表达hnf3β和pdx-1；第二行显示第二步末得到的只 用RA诱导的细胞只表达hnf3β。图2B表明，第二步末得到的用激活蛋白A 和RA双因子诱导的细胞表达标志基因：pdx-1，hnf3β，insulinI和hnf4α；图 2C表明在第三步末，激活蛋白A和RA双因子诱导的细胞主要表达insulinI， pdx-1，isl1，glut2和hnf3β(第三泳道“+”)。图2A-图2C中，-RT表示 没有逆转录的阴性对照，空白表示在阴性对照中仅使用水；图2C中，第一 泳道“胰腺”为成熟小鼠胰腺细胞阳性对照；第二泳道的符号“-”表示 在第三步末没有用激活蛋白A和RA诱导的小鼠ES-R1细胞；符号“+” 表示在第三步末有用激活蛋白A和RA双因子诱导的小鼠ES-R1细胞。
这些细胞不表达其它胰岛内分泌细胞(非β细胞)的标志，如胰高血 糖素或促生长素抑制素。该结果表明TGF-β和RA信号可能对胰腺β细胞 的发育和成熟具有特异性。并发现诱导过程对激活蛋白A和RA的具有严 格的依赖性，如果缺少二者其一则几乎没有小细胞集落的形成，且被诱导 的细胞不表达或仅微弱表达胰岛素，pdx1，isl1，glut2和hnf3β(参见图2C 中第二泳道)。此外，我们还发现如果用层粘连蛋白或明胶代替matrigel来 铺被培养皿，在第三步没有小细胞集落形成。
三、免疫组化分析
为了证明诱导的胰岛素阳性细胞还能够表达C-肽，对其进行了免疫组 化分析：将由第三步得到的被诱导细胞用4％多聚甲醛固定，PBS洗三遍 后用10％正常山羊或兔血清室温孵育20分钟。弃山羊血清，分别加胰岛素 一抗(兔多克隆IgG，1∶200，Santa Cruz)或C-肽一抗(Linco)4℃过夜培养 细胞。接着进一步用罗丹明缀合山羊抗兔二抗IgG，FITC缀合兔抗山羊二抗 IgG(1∶200，Santa Cruz)或生物素缀合IgG(工作溶液，Santa Cruz)孵育。利用 DAB作为以生物素缀合IgG作为二抗时的反应底物。用奥林帕斯相差显微 镜(Olympus IX-71)捕获图像。结果表明细胞既表达胰岛素，又表达C- 肽(图3A和图3B)。
利用DTZ染色(Shiroi A，Yoshikawa M，Yokota H，et al.Identification of insulin-producing cells derived from embryonic stem cells by Zinc-Chelating Dithizone.STEM CELLS 2002；20(4)：284-292)来检测由该三步培养法发育 而来的细胞或没有经过激活蛋白A和RA诱导发育而来的细胞(对照组)。 结果表明经三步处理出现了的DTZ阳性细胞集落(洋红色)(图3D)，而对 照组中无DTZ阳性细胞集落(图3C)。这表明由此得到的细胞集落含有胰 岛素阳性的细胞。
四、EGFP报告基因的构建以及ES细胞的转染
有证据表明ES细胞后代能够吸收来源于培养基中的胰岛素而被胰岛 素抗体染色为阳性(Hori Y，Rulifson IC，Tsai BC，et al.Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2002；99(25)：16105-16110)。为确定胰岛素确实是 由诱导的细胞集落产生，采用EGFP报告体系来检测胰岛素的表达。用 EGFP报告载体转染R1 ES细胞，其中含有一个被胰岛素启动子驱动的绿 色荧光蛋白质cDNA。利用G418筛选已接入此载体的ES细胞，并利用激活 蛋白A和RA对其进行诱导。具体方法如下：构建人胰岛素启动子接EGFP 的载体。将一个从pFOXCAT-362 hIns(Odagiri H，Wang JH，and German MS. Function of the Human Insulin Promoter in Primary Cultured Islet Cells.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 1996；271(4)：1909-1915)切下 0.4kb的含人胰岛素启动子的Xba I和Hind III片段与CMV启动子已被 AseI和HindIII切除的pCMV-EGFPN3载体(BD Biosciences)连接。将此 具有新霉素抗性的载体通过电穿孔转染到ES R1细胞品系中，并用250 μg/ml G418(Gibco-BRL)筛选阳性ES克隆。筛选出的小鼠ES-R1阳性克隆 首先通过激活蛋白A和RA双因子刺激，利用EGFP对得到的小细胞集落进 行检测。EGFP结果如图3E和图3G所示，在得到的小的细胞集落中可以检 测到EGFP的表达。另外其表达模式同胰岛素表达相吻合(图3F和图3H， 按照第三步的免疫组化分析方法进行检测)。这些数据表明激活蛋白A和 RA以及其它成熟的因子的联合作用，能够诱导ES细胞向胰腺细胞的分化。
五、ELISA检测胰岛素的分泌量
为了进一步测试诱导后的细胞的胰岛素分泌量是否能够对葡萄糖具 有依赖性，使用了两种浓度(5.5mM和27.7mM)的葡萄糖。用含有2.5mM 葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液(pH 7.4)在37℃来预孵育细胞90分钟。为诱导 胰岛素的释放，再用含27.7mM葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液在37℃孵育15 分钟(样品A)。将另一组细胞先用含2.5mM葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液 在37℃预孵育90分钟，为诱导胰岛素的释放，再用含5.5mM葡萄糖的 Krebs-Ringer缓冲液在37℃孵育15分钟(样品B，作为对照)。收集被调节 的培养基。用Rat/Mouse Insulin ELISA试剂盒(CRYSTAL CHEM INC)检 测两份培养基样品的胰岛素分泌量。细胞总蛋白量用BCATM Protein Assay 试剂盒(PIERCE)测定。结果表明细胞在高葡萄糖浓度中胰岛素的分泌量 比低葡萄糖浓度时高五倍左右(参见图3I，图3I中胰岛素的含量单位为ng胰 岛素/mg细胞总蛋白；柱A为经27.7mM葡萄糖处理后的胰岛素分泌水平， 比柱B(经5.5mM葡萄糖处理的)高近5倍)。该结果表明ES来源的胰岛素 阳性细胞进行的胰岛素分泌也能够受葡萄糖浓度的调控。
六、产胰岛素的细胞向小鼠肾包囊下的移植
为了测试ES细胞来源的胰岛素阳性细胞是否能够逆转糖尿病小鼠，将 分化细胞移植到STZ诱发的糖尿病小鼠的左侧肾包囊中(n＝9)。具体方法如 下：
在细胞或PBS移植前，向6到8周的129只公鼠腹腔内注射50mg/kg剂量 的链脲菌素(STZ，Sigma)，连续注射5天，以诱导的实验糖尿病的形成。 当被STZ处理的小鼠血液葡萄糖浓度高于13.9mM时，向小鼠左侧肾包囊中 移植1×106个产胰岛素的细胞。向对照组(n＝12)进行PBS处理。用 GlucoTREND2(Roche)从被剪断的尾巴中测量血液葡萄糖浓度。取经过手 术的肾脏进行冰冻切片，并对肾包囊中被移植细胞的胰岛素表达进行免疫 组化分析。结果表明被分化细胞处理的糖尿病小鼠(n＝9)存活时间较长， 其存活率达到70％，而移植了PBS的糖尿病小鼠(n＝12，实线)存活率为25％ (图4A)。并且存活的小鼠能够将体重维持在正常水平。约两周后，被进行 细胞移植的糖尿病小鼠的血液葡萄糖恢复到正常水平(低于13.9mM)； 相反，进行了PBS移植的小鼠(n＝3)的血液葡萄糖持续维持较高水平 (＞13.9mM)(图4B)。此外，将进行了细胞移植的左肾切除后，小鼠的血液 葡萄糖上升至14mM。利用胰岛素一抗没有在注射了PBS的左肾中检测到 胰岛素阳性细胞(图5A)；而只在被分化细胞处理的STZ-糖尿病小鼠肾脏 中检测到胰岛素阳性细胞(图5B)。这些结果表明来源于ES细胞的胰岛素 阳性的细胞可以逆转糖尿病小鼠。
实施例2、诱导人胚胎干细胞为胰腺细胞
本发明使用了人ES细胞品系，H1或H9。(Thomson JA，Itskovitz-Eldor J， Shapiro SS，et al.Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.Science 1998；282：1145-1147.)。这些细胞的培养温度为37℃。
培养体系为化学组份确定的培养基(CDM：50％IMDM(Gibco)， 50％F12(Gibco)，单硫甘油(sigma)450umol/L，胰岛素-运铁蛋白-硒-A (ITS，Gibco)，清蛋白片段V(Sigma)5mg/ml)。简要地，hES细胞被转入 CDM进行分化。然后用激活蛋白A和RA诱导hES细胞向胰腺前体细胞 的分化。在此基础上，利用在mES诱导方法中描述的胰岛培养条件进一步 成熟hES来源的胰腺β细胞。
为进行分化，实验流程设计如下：
第一步，将hES细胞传代到被1％Matrigel(B&D Biosciences)包被的组 织培养皿(Nunc)上。然后，用改良的CDM(11)替换上述培养基。此改良 的CDM含有：50％IMDM(Gibco)和50％F12NUT-MIX(Gibco)，并添加胰 岛素-运铁蛋白-硒-A(1∶100，Gibco)，450μM的单硫甘油(sigma)和5mg/ml 的清蛋白片段V(Sigma)。两天后，以含50ng/ml激活蛋白A(Sigma)的 CDM培养基对这些细胞诱导4天。
第二步，激活蛋白A诱导4天后，将细胞转移到含有10-6M RA(Sigma) 的CDM中，再诱导4天。
第三步，将培养基从CDM变换为改良的胰岛成熟培养基(12)： DMEM/F12(Gibco)，胰岛素-运铁蛋白-硒-A(1∶100，Gibco)和2mg/ml清蛋 白片段V(Sigma)以及10ng/ml bFGF。细胞在此培养基中培养3天。之后， 再转入含DMEM/F12(Gibco)，胰岛素-运铁蛋白-硒-A(1∶100，Gibco)和2 mg/ml清蛋白片段V(Sigma)以及10mM烟碱胺(Sigma)。并在此培养基 中培养2天。然后再利用0.5mg/ml的分散酶(Gibco)消化这些细胞，并将其 转移到超级低依附培养皿(Costar)中放置5天，以形成悬浮培养液从而实现 胰岛的成熟。
二、分化细胞中基因表达的RT-PCR分析。
根据实施例1第二部分描述的方法，利用RT-PCR检测了促生长素抑制 素(SST)，Glut2，淀粉酶(Amy)，Sox17，Hnf4α，pdx-1，胰岛素(INS)，Hb9，葡 糖激酶(GCK)，IFABP等在分化细胞和对照组细胞中(培养在不含激活蛋白 A和RA诱导的CDM中)的表达。在此，分化细胞是指依照此三步培养法 获得的成熟β细胞。对照组细胞指被激活蛋白A和RA其中之一诱导的细 胞。PCR引物序列(有义和反义分别显示)如下：
gapd：GTCATTGAGAGCAATGCCAG(序列号15)和 GTGTTCCTACCCCCAATGTG(200bp)(序列号16)；
sox17：CAGTGACGACCAGAGCCAGACC(序列号17)和 CCACGACTTGCCCAGCATCTT(292bp)(序列号18)；
pdx1：ACCAAAGCTCACGCGTGGAAA(序列号19)和 TGATGTGTCTCTCGGTCAAGTT(200bp)(序列号20)；
hlxb9：CCTAAGATGCCCGACTTCAACTCCC(序列号21)和 GCCCTTCTGTTTCTCCGCTTCCTG(276bp)(序列号22)；
hnf4α：ATCAGAAGGCACCAACCTCAAC(序列号23)和 TGTCTTTGTCCACCACGCACT(197bp)(序列号24)；
胰岛素：GAGGCCATCAAGCACCAYCAC(序列号25)和 GGCTGCGTCTAGTTGCAGTA(373bp)(序列号26)；
glut2：GCTACCGACAGCCTATTCTA(序列号27)和 CAAGTCCACTGACATGAAG(267bp)(序列号28)；
淀粉酶(amy)：CTGACAACTTCAAAGCAAA(序列号29)和 TACAGCATCCACAAATACGA(358bp)(序列号30)；
促生长素抑制素(SST)：GATGCTGTCCTGCCGCCTCC(序列号31)和 TGCCATAGCCGGGTTTGA(292bp)(序列号32)；
sur1：TTGCCGAAACCGTAGAAGGA(序列号33)和 TTGGAGACCATTAGGGCGTAG(268bp)(序列号34)；
胰高血糖素(GCG)：AGGCAGACCCACYCAGTGA(序列号35)和 AACAATGGCGACCTCTTCTG(308bp)(序列号36)；
葡糖激酶(GCK)：AGGGAATGCTTGCCGACTC(序列号37)和 CACTGGCCTCTTCATGGGT(375bp)(序列号38).
结果如图7A和图7B所示，表明分化的ES细胞能够表达成熟β细胞的 标志基因如胰岛素，pdx-1，葡糖激酶和glut2(图7A)。相反，对照组基本 上不表达任何标志基因(图7B)。
三、免疫组化分析。
用4％多聚甲醛固定被诱导细胞，PBS洗三遍后，在含有0.3％ tritonX-100(Sigma)和10％正常血清的PBS中，室温孵育细胞40分钟。然后 再用山羊抗人sox17抗体(1∶40，R&D SYSTEMS)一抗，小鼠抗人胰岛素单 克隆抗体(1∶100，CHEMICON)一抗，兔抗人C-肽抗体(1∶200，Linco)一 抗，胰高血糖素(山羊多克隆IgG，1∶200，Santa Cruz)一抗，pdx1(山羊多 克隆IgG，1∶200，Santa Cruz)一抗，淀粉酶(兔多克隆IgG，1∶500，Sigma) 一抗，ngn3(山羊多克隆IgG，1∶200，Santa Cruz)一抗或促生长素抑制素(山 羊多克隆IgG，1∶200，Santa Cruz)一抗在4℃过夜孵育，并进一步分别用下 列二抗孵育：TRITC-缀合山羊抗兔IgG，FITC-缀合兔抗山羊IgG，FITC- 缀合山羊抗鼠IgG，FITC-缀合驴抗山羊IgG或TRITC-缀合驴抗兔IgG (1∶200，全部购自Jackson ImmunoResearch，INC.)。利用DAPI(Sigma)染 色检测细胞核。用奥林帕斯相差显微镜(Olympus IX-71)捕获图像。用 Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)计算了C-肽阳性细胞的百分数。
结果表明这些细胞能够表达胰腺β细胞基因，例如C-肽，pdx-1等(图 8)。
四、产胰岛素的细胞向肾包囊下的移植
为了证明ES细胞来源的胰岛素阳性细胞是否能够在体内环境下行使 正常的功能，将分化细胞移植到STZ诱发的糖尿病小鼠的左侧肾包囊中 (n＝12)。具体方法如下：
所有的动物操作都经过北京大学教育动物护理与使用委员会的批准。 在细胞或PBS移植前，向4到6周的BALB/c公裸鼠腹腔内注射40mg/kg剂量 的链脲菌素(STZ，Sigma)，连续注射5天，以诱导实验糖尿病的形成。当 被STZ处理的小鼠已发展患有糖尿病时，将大约1×106个诱导细胞移植到左 肾包囊中。无激活蛋白A和RA诱导的PBS或细胞作为实验对照使用。过 夜禁食后，利用i.g.葡萄糖(2.5g kg-1体重)进行了糖耐性测试。利用 GlucoTREND2(Roche)从剪断的尾巴中测定血液葡萄糖水平。取经过手术 的肾脏进行冰冻切片，并利用免疫组化分析确定被移植了细胞的肾包囊中 C-肽的表达。利用小鼠抗人核单克隆抗体(1∶30，CHEMICON)检测到了 hES来源的细胞。用奥林帕斯相差显微镜(Olympus IX-71)捕获图像。结 果显示注射了PBS的肾脏中没有发现胰岛素阳性细胞；此移植小鼠的结果 显示在图11A和11B中。移植了人ES来源的分化细胞能够表达C-肽(图 11A)。C-肽阳性细胞能通过对人核特异性抗体被染色，说明这些细胞来源 于人ES细胞(图11B)。
人胚胎干(hES)细胞向胰腺β细胞的实验诱导为I型糖尿病的移植治 疗提供了一种潜在的来源。本发明提供的三步培养法能够诱导hES分化为 功能性的产胰岛素的细胞。这种基于将hES培养在化学成分确定的培养基 (CDM)及激活蛋白A，全反式视黄酸(RA)和其它成熟因子(参见图 6)中的方法模拟了体内胰腺发育的信号传导。通过RT-PCR检测发现，hES 来源的细胞表达胰腺β细胞标志基因，例如pdx1，胰岛素，葡糖激酶和 glut2(参见图7)。这些细胞为C-肽，pdx1，胰高血糖素，促生长素抑制素或 淀粉酶阳性，且C-肽阳性排除了胰岛素是通过免疫组化检测方法被吸收的 可能性(参见图8)。为了进一步分析诱导后细胞的胰岛素分泌是否是葡萄 糖依赖型，使用了两种浓度(2.5mM和27.5mM)的葡萄糖。用Krebs-Ringer 缓冲液在37℃来预孵育细胞90分钟后，用含有2.5mM葡萄糖的 Krebs-Ringer缓冲液在37℃来预孵育15分钟。为诱导胰岛素的释放，再用 27.5mM葡萄糖孵育细胞15分钟。收集各自的被调节的培养基。用Rat/Mouse Insulin ELISA试剂盒(Linco)检测两份培养基样品的胰岛素分泌量。细胞 内C-肽浓度由Human C-肽ELISA试剂盒(Linco)测定。细胞总蛋白量用 BCATM Protein Assay试剂盒(PIERCE)检测。结果表明在悬浮培养中被诱 导的细胞在高葡萄糖水平培养基中分泌胰岛素的量与在低葡萄糖水平培 养基中相比提高了200％(图9A)。而且，悬浮培养产生的细胞细胞内C- 肽含量也增加了(图9B)。然而，由贴壁培养培养获得的细胞的胰岛素分 泌量不响应葡萄糖的刺激(图9A，B)。这些数据表明与贴壁培养相比， 悬浮培养引起了胰岛样细胞更高效的成熟。
为了研究被诱导的细胞是否能够在体内具有功能性，我们向糖尿病裸 鼠的肾包囊下移植了分化细胞。30％的移植了被诱导细胞的小鼠的血液葡 萄糖在近6周内维持在正常水平(＜13.9mM)(图10A)。糖耐受性检测显 示这30％的血液葡萄糖被逆转了的裸鼠，与被进行了对照操作的小鼠相比， 还获得了改善了的葡萄糖调控能力(图10B)。移植后一个月，在被移植了 由此三步培养法诱导的细胞的肾包囊中检测到了C-肽阳性细胞。利用人核 特异性抗体对这些细胞进行染色，结果显示这些C-肽阳性细胞来源于被注 射的hES细胞(图11A和11B)。
这些结果清楚地显示hES细胞来源的产胰岛素的细胞不仅能够存活； 而且它们还能体内逆转30％的STZ诱导的糖尿病小鼠。此发现为人类胰岛 细胞的发育机制的研究提供了一个新的体外模型，并且这些hES来源的产 胰岛素的细胞可在未来的对I型糖尿病移植治疗中被利用。
发明背景
序列表
<110>北京大学
<120>诱导胚胎干细胞为胰腺细胞的方法
<130>111
<160>38
<170>PatentIn version 3.1
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cactggcctc ttcatgggt 19
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