一种诱导甘草产生毛状根的方法
专利汇可以提供一种诱导甘草产生毛状根的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种诱导甘草产生毛状根的方法。本发明所提供的诱导甘草产生毛状根的方法，是将甘草子叶节与含有Ri质粒的发根农杆菌共培养，然后，以含有头孢霉素的无菌 水 冲洗之后转入到诱导培养基中诱导培养，在甘草子叶节上生长出甘草毛状根。本发明首次以甘草子叶节为受体材料，通过发根农杆菌介导实现甘草发根的诱导，既缩短了甘草发根出现的时间，4天即可以产生出发根；又提高了转化效率，达到96％以上。并且，发根中活性成分如甘草黄 酮 高，达到1.6％；为利用甘草发根培养物来生产有用的 甘 草酸 和甘草黄酮奠定了良好的 基础 。，下面是一种诱导甘草产生毛状根的方法专利的具体信息内容。
1.一种诱导甘草产生毛状根的方法，是将甘草子叶节与含有Ri质粒的发根农杆 菌共培养，然后，以含有头孢霉素的无菌水冲洗之后转入到诱导培养基中诱导培养， 在甘草子叶节上生长出甘草毛状根。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发根农杆菌在与甘草子叶节 共培养前，先在固体YEB培养基中28℃培养两天，然后选取单克隆到液体YEB培养基 中振荡培养，收集菌液，离心收集菌体；将收集到的菌体以等同于YEB液体培养基体 积的MS液体培养基混匀。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述甘草子叶节来源于甘草种子 萌发后三天的无菌苗。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：共培养所用的共培养基为 含有50-300μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基；优选为含有200μmol/L乙酰丁 香酮的MS固体培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：共培养的时间为1-3天，优选为 2天。
6.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述诱导培养基为含有100 -1000mg/L头孢霉素的MS固体培养基；优选为含有500mg/L头孢霉素的MS固体培养 基。
技术领域
本发明涉及一种诱导甘草产生毛状根的方法。
背景技术
随着甘草的不断开发利用，国内国际两个市场2006年～2008年的需求总量为9 万～10万吨，但全国甘草总产量只有2.5万～3万吨，市场缺口高达6.5万～7万吨。 需求告急，短缺已趋白热化，严重地影响了企业生产和医院用药。2001年9月我国为 了保护日益匮乏的甘草资源，限制了对野生甘草的采挖，甘草原料缺乏加剧。目前， 人工栽培还是甘草生产的主要途径，然而人工栽培周期长，并受地域限制，不能满足 市场需求，品质方面也存在一些问题，特别是在有效成分量上，人工甘草与野生甘草 存在相当的距离。因此甘草资源匮乏及其质量的严重下降成为限制甘草深度开发利用 的瓶颈，迫切需要寻找新的解决再生甘草资源的有效途径。
随着生物工程技术的不断提高，利用发根农杆菌诱导药用植物产生毛状根，并对 毛状根进行离体培养，迅速大量的提取有效成分，是药用植物资源可持续发展的有效 途径之一。甘草发根的诱导研究早在八十年代已经开始，并已成为该领域的一个研究 热点。目前，关于如何提高甘草发根诱导效率的研究不是很多，大部分报道只注重对 影响发根生长因素的研究。陈士云(陈士云，桂耀林 发根土壤杆菌体外转化甘草子 叶及下胚轴.武汉植物学研究1991.9.04 301)等采用几种不同发根农杆菌介导甘草 下胚轴和子叶发根的诱导，得到了甘草毛状根，各菌株介导的转化效率及不同外植体 的诱导效率均有很大差异，最高的诱导率由A15834介导的甘草下胚轴产生，为93％， 但每个外植体产生的发根数量少；燕飞(燕飞，梁玉玲，崔东亚，张慧，朱宝成.发根农杆 菌转化胀果甘草的研究.河北大学学报(自然科学版).2004年05期)等用R1601发 根农杆菌介导甘草下胚轴转化的最高诱导率为56.49％；杨世海(杨世海，刘晓峰，沈昕等， 甘草Ri质粒转化及不同理化因子对甘草毛状根生长的影响，中国中药杂志， 2006，31(11)：875)等报道用LAB9402介导甘草发根转化，最高诱导率为85.2％。这些研 究所采用的外植体均为甘草子叶和下胚轴，诱导率大多较低，其发根的出现时间约为 8-10天左右。杜旻(杜旻，向德军，丁家宜等.甘草毛状根培养系统的建立及化学成分分 析植物资源与环境学报，2001，10(1)：7～10)等通过A15834和R1000两种发根农杆菌介 导产生了甘草发根，所用的外植体为甘草幼茎，最高诱导率仅为39.5％。
综上所述，目前所公开的甘草发根方法的诱导率大多不是很高，发根出现的时间 偏长，每个外植体上产生的平均发根数量少，不能满足生产实际需要。
发明内容
本发明所提供的诱导甘草产生毛状根的方法，是将甘草子叶节与含有Ri质粒的 发根农杆菌共培养，然后，以含有头孢霉素的无菌水冲洗之后转入到诱导培养基中诱 导培养，在甘草子叶节上生长出甘草毛状根。
其中，发根农杆菌在与甘草子叶节共培养前，先在固体YEB培养基中28℃培养两 天，然后选取单克隆到液体YEB培养基中振荡培养，收集菌液，离心收集菌体；将收 集到的菌体以等同于YEB液体培养基体积的MS液体培养基混匀。甘草子叶节来源于 甘草种子萌发后三天的无菌苗。
在本发明方法中，共培养所用的共培养基为含有50-300μmol/L乙酰丁香酮的 MS固体培养基；优选为含有200μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基。共培养的时间 为1-3天，优选为2天。诱导培养基为含有100-1000mg/L头孢霉素的MS固体培养 基；优选为含有500mg/L头孢霉素的MS固体培养基。
本发明首次以甘草子叶节为受体材料，通过发根农杆菌介导实现甘草发根的诱 导，既缩短了甘草发根出现的时间，诱导培养4天即可以产生出发根；又提高了转化 效率，达到96％以上。并且，发根中活性成分甘草总黄酮高，含量可达到发根干重的 1.6％，使生药根的两倍多(生药根为0.7％左右)，为利用甘草发根培养物来生产甘草 总黄酮奠定了良好的基础。
附图说明
图1为发根农杆菌介导Ri质粒转化甘草子叶节后甘草发根产生的照片；
图2为Ri质粒转化后甘草发根的southern杂交结果。
具体实施方式
其中，发根农杆菌应先涂布于固体YEB培养基，28℃培养2天后，选取单克隆菌 斑于液体YEB培养基中，28℃振荡培养至一定浓度，再取少量菌液至YEB培养基中扩 大培养，然后，将菌液离心收集，去上清，加入同体积的MS液体培养基混匀。甘草 种子萌发三天后的子叶节在其中浸染20分钟后，取出用无菌滤纸吸干，接入共培养 培养基，共培养2天后，无菌水冲洗，转入无激素的MS固体培养基(含有500mg/L 头孢霉素)进行诱导培养。4天后即有发根出现，得到的甘草发根转接入无激素的MS 固体培养基中继代生长。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1、用本发明的方法进行甘草发根的诱导
本实施例中，以甘草Glycyrrhiza uralensis种子萌发三天后的子叶节为受体材 料；以发根农杆菌A4为介导菌株，该菌株含Ri质粒，无抗性。
具体操作步骤如下：
1、将发根农杆菌A4菌液涂布于YEB固体培养上，28℃培养2天后长出单克隆；
2、随机挑取发根农杆菌A4克隆菌落在液体YEB培养基中，28℃振荡培养至OD600 ≈0.6-0.9，再取1ml菌液至100ml YEB液体培养基中振荡培养至OD600≈0.5-0.7，收 集菌液，3500rpm离心10分钟收集菌体；
3、将收集到的菌体以等同于YEB液体培养基体积并含有200μmol/L乙酰丁香酮 的MS液体培养基混匀；
4、将甘草的成熟种子消毒后于1/2MS培养基上萌发三天，从无菌苗上切取带有 1mm左右下胚轴和子叶的部分，纵向剖开分成两半，各带一片子叶，然后切去三分之 一的子叶部分，保留三分之二的子叶和子叶节(保留部分子叶是为了在培养过程中给 子叶节提供营养，发根的发生部位在子叶节处)。以上外植体在上述菌液中浸染20 分钟后，取出用无菌滤纸吸干，接入含有200μmol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基， 共培养2天；
5、将共培养后的甘草子叶节以含有500mg/L头孢霉素的无菌水冲洗三次，无菌 滤纸吸干，转入含有500mg/L头孢霉素的MS固体培养基上培养；4天后即有发根仅在 子叶节部分出现，而子叶部分经如此短时间的培养并不会出现发根，并且只有极少数 子叶培养10天左右会在伤口处出现少量发根，但看起来仅为一些白点，而这时候子 叶节上面的发根已经伸长并向培养基里生长。
6、12天后将从子叶节处得到的甘草发根根尖2-3cm处转接入含有200mg/L头孢 霉素的MS固体培养基中除菌并继代培养。
按上述方法，对供试材料进行了遗传转化，共处理500个子叶节，结果有480个 外植体成功的诱导出发根，平均每个外植体上的发根数为10根左右，转化效率达到 96％。发根农杆菌介导Ri质粒转化甘草子叶节后甘草发根产生的照片如图1所示。
实施例2、发根系的分子检测
随机选取实施例1中得到的3个甘草发根株系，用CTAB法提取总DNA，采用地高 辛标记的Ri质粒上与根形成有关的rolC基因片段作探针，进行southern杂交。杂 交结果显示，所得到的发根株系全部为阳性，证明发根农杆菌中的T-DNA区已成功整 合进甘草根的基因组DNA中。如图2所示，1-3分别为不同的转基因发根系，其中探 针为地高辛标记的rolC基因片段；4为未转基因的阴性对照(普通甘草组培根)；5 为阳性对照发根农杆菌A4的Ri质粒。
实施例3、发根系中的总黄酮含量检测
以紫外分光光度计检测发根系中的甘草总黄酮含量：取经继代培养20天的甘草 发根样品于60℃烘至恒重，粉碎，过60目筛，精密称取0.1g粉末，以甲醇为溶剂超 声波提取两次，每次30min，离心，合并滤液定容至10ml，取100μl，加入1ml甲 醇和0.5m110％氢氧化钠，定容至2ml，以柚皮苷为标准品，用紫外分光光度计在 420nm波长处进行检测，并计算其总黄酮占发根的干重百分比。
结果表明，发根中活性成分甘草总黄酮高，含量可达到发根干重的1.6％，是野生 甘草生药根的两倍多(生药根为0.7％左右)。
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