本
发明涉及氨基酸的制备方法。 背景技术
作为氨基酸的制备方法,众所周知的有采用属于棒状杆菌属
(Corynebacterium)、 短杆菌属(Brevibacterium)、 埃希氏菌 (Escherichia)属、微杆菌属(Microbacterium)、 沙雷氏菌属 (Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)的
微生物等的
发酵生产法(非
专利文献1)。
在上述发酵生产法中,开发了用于提高其生产效率的各种技术, 作为其中的一种,已知有通过调整培养基的
温度和pH、或者向培养液 中添加
表面活性剂,使L-氨基酸在培养液中析出晶体,再使培养液中 的L-氨基酸的浓度维持在一定量以下,通过L-氨基酸的高浓度积累而 避免抑制生产性的方法(专利文献1)。
而且,作为使
溶解度较低的L-谷氨酸(L-Glu)在培养基中结晶的
方法,已知有使用将pH调整成析出L-Glu的条件的培养基的方法(专
利文献2),在培养液中的L-苯丙氨酸(L-Phe)的浓度在饱和溶解度以
上的条件下,在所述培养液中添加L-Phe的a晶体,或者通过将该培
养液的pH变更为7. 8-8. 3的范围,使培养液中的L-Phe的a晶体析出
的方法(专利文献3)。
但是,由于上述方法中培养液中包含细微的氨基酸的结晶,在基 于结晶与菌体的粒径的差异而直接分离两者的方法中氨基酸的产率
低,因此为了提高氨基酸的产率, 一旦溶解培养液中积累的氨基酸的 结晶,即进行向培养液中添加
水等,加热培养液等操作后,使用离心 式或过滤分离机等分离菌体和培养液后,必须进行浓缩结晶。
作为直接分离氨基酸的结晶的和菌体方法,已知有采用液体分流
器的方法(专利文献4),只不过氨基酸的结晶回收率在80°/»以下。
如上所述,在氨基酸的发酵生产方法中, 一边使氨基酸在培养基 中析出晶体, 一边进行培养的方法较为优异,但是也正在寻求效率更 高的方法„
非专利文献l:氨基酸发酵,学会出版中心,1986年 专利文献l:特开昭62-288号
公报 专利文献2:特开2002-238593号公报 专利文献3:特许第3239905号公报 专利文献4:特许第2958789号公报
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供简便且生产效率高的氨基酸的制备方法。
用于解决问题的方法
本发明涉及以下(1)-(7)。
(1) 氨基酸的制备方法,其特征在于,在培养基中添加平均粒径 为1-120)am的氨基酸的结晶使得该氨基酸的结晶浓度为0. 5g/1以上 后,在该培养基中培养具有生产这种氨基酸的能
力的微生物,使之在 该培养基中生成并累积该氨基酸的结晶,从培养物中收集该氨基酸的 结晶。
(2) 氨基酸的制备方法,其特征在于,在培养基中添加氨基酸的 结晶使培养基中的氨基酸的结晶的总表面积达到0. 02ra2/1以上后,在 该培养基中培养具有生产这种氨基酸的能力的微生物,使之在该培养 基中生成并累积该氨基酸的结晶,从培养物中收集该氨基酸的结晶。
(3) 上述(1)或(2)的方法,添加的氨基酸的结晶为具有0. 06mVcm3 以上的
比表面积的氨基酸结晶。
(4) 上述(l)-(3)中任一项的方法,生成并累积的氨基酸的结晶的 平均粒子径在15 ium以上。
(5) 上述(l)-(4)中任一项的方法,其特征在于,由培养物中收 集氨基酸的方法基于它们的粒径的差异分离生产氨基酸的微生物和累 积的氨基酸结晶。(6) 上述(l)-(4)中任一项的方法,其特征在于,由培养物中收 集氨基酸的方法基于它们的比重的差异分离生产氨基酸的微生物和累 积的氨基酸结晶。(7) 上述(l)-(6)中任一项的方法,其特征在于,氨基酸为L-谷 氨酰胺、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸 或L-
色氨酸。发明效果根据本发明,可以提供简便且生产效率高的氨基酸的制备方法。
附图说明图l:图1是表示添加的氨基酸的结晶的平均粒径,比表面积和 总表面积与培养基中所积累的氨基酸的结晶的形状和回收率之间的关 系的图。而且,图中的照片,纵方向的边是1000 Mm。具体实施方式1.本发明的制备方法中可使用的微生物本发明的制备方法中可使用的微生物如果是具有生产氨基酸的 能力的微生物,没有特别的限制,该微生物可以是从自然分离的微生 物,而且也可以是氨基酸的生产性被人为改善了的微生物。所谓氨基酸的生产性被人为改善了的微生物,可以例举有通过单 独或组合使用以下方法获得的微生物:(a) 緩和或解除至少一种控制氨基酸的生物合成的机制的方法,(b) 表达强化至少一种参与氨基酸的生物合成的酶的方法,(c) 使至少一种参与氨基酸的生物合成的酶基因的拷贝数增加的方法,(d) 弱化或阻断由氨基酸的生物合成途径向该氨基酸之外的代谢 产物的分支的代谢途径至少一个的方法,和(e) 选择对氨基酸的类似物的耐受性比野生型抹高的细胞林的方法等。上述(a)的具体的方法,记载于 Agric. Biol. Chem, 43,105-111(1979) 、 J.Bacteriol , 110, 761-763 ( 1972 )和 Appl.Microbiol.Biotechnol. , 39, 318-323 (1993)等中,上述(b)的 具体方法记载于 Agric. Biol. Chem. , 43, 105-111 (1979)和 J.Bacteriol. ,110, 761-763 (1972)等中,上述(c)的具体方法记载 于Appl.Microbiol,Biotechnol. , 39, 318-323 (1993)和Agric. Biol. Chem. , 39, 371-377 (1987)等中,上述(d)的具体方法记载于 Appl. Environ. Micrbiol. ,38,181-190 (1979)和 Agric. Biol. Chem., 42, 1773-1778 (1978)等中,上述(e)的具体方法记载于 Agric. Biol. Chem. , 36, 1675-1684 (1972)、 Agric. Biol. Chem. , 41,109 -116 (1977) 、 Agric. Biol. Chem. , 37, 2013-2 02 3 (197 3)和Agric. Biol. Chem. , 51, 2089-2094 (1987)等中。而且,对于由上述(a)-(e)中任一项或它们的组合的方法制备具 有生成、积累氨基酸的能力的微生物的制备方法,在Biotechnology 2nd ed. , Vol. 6, Products of Primary Metabolism(VCH Verlagsgesellschaf t mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14b和Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, 1—35 (2003),氨基酸发酵,学会出 版中心,相田浩等人(1986)中记载了许多例子,而且除上述之外,具 体的具有生成、积累具体的氨基酸的能力的微生物的制备方法已有特 开2003-164297, Agric.Biol.Chem. , 39, 15 3-160 (1975) ,Agric. Biol. Chem. , 39, 1149-1153 (1975), 特开昭 58-13599, J.Gen.Appl. Microbiol. , 4, 272-283 (1958), 特开昭 63—94985, Agric. Biol. Chem. , 37, 201 3-2023 (1973) , W097/15673、特开昭56-18596、特开昭 56-144092和特表2003-511086等多篇报道,通过参照上述文献等, 可以制备具有生产氨基酸的能力的微生物。
作为上述具有生产氨基酸的能力的微生物,如果是可以适用上述(a)-(e)的方法的微生物或具有上述遗传特征的微生物,就可以是任意 一种微生物,优选可以列举原核生物,更优选细菌。作为原核生物,埃希氏菌(Escherichia)属,沙雷氏菌属 (Serratia),芽孢杆菌属,短杆菌属(Brevibacterium),棒状杆菌属 (Corynebacterium), 微杆菌属(Microbacterium), 假单胞菌属 (Pseudomonas) ,
土壤杆菌属(Agrobacter ium), 月旨环酸杆菌属 (Al icyclobaci 1 lus),鱼腥蓝细菌属(Anabena),蓝细菌属(Anacyst is) 属、节杆菌(Arthrobacter)属、固氮杆菌属(Azotobacter),着色菌 属(Chromatium), 欧文氏菌属(Erwinia), 甲基杆菌属 (Methylobacterium), 席蓝细菌属(Phormidium), 红细菌属 (Rhodobacter), 红曱单月包菌属(Rhodopseudomonas), 红螺菌属 (Rhodospirillum), 栅藻属 (Scenedesmus), 链霉菌属 (Streptomyces), 聚球蓝细菌属(Synechoccus)和发酵单胞菌属 (Zymomonas)等的微生物。例如、可以列举大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、 巨大芽孢杆菌(Baci 1 lus megaterium)、
淀粉 液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、
凝结芽孢杆菌 (Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Baci 1 lus 1 icheniformis)、 短小芽孑包杆菌(Baci 1 lus pumilus)、 产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、 未成熟短杆菌(Brevibacterium immariophilum)、 解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、 黄色短杆菌 (Brevibacterium flavum)、 产乳酸短杆菌 (Brevibacterium lactofermentum)、 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、 嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、嗜氨杆 菌(Microbacterium ammoniaphi lum)、 无花果沙雷氏菌(Serrat ia HcarU)、 居泉沙雷氏菌(Serrat ia fonticola)、 液化沙雷氏菌 (Serratia 1 iquefaciens)、 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)、 放射形 土壤杆菌 (Agrobacterium radiobacter)、发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、 悬钩子 土壤杆菌(Agrobacterium rubi)、 柱孑包鱼腥蓝细菌(Anabaena cylindrica)、桶形鱼腥蓝细菌(Anabaenadol iolum)、水华鱼腥蓝细 菌(Anabaena flos-aquae)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)、 柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)、球形节杆菌(Arthrobacter globformis) , Arthrobacter hydrocarbonglutamicus , 迈索尔节杆 菌 (Arthrobacter mysorens),
烟草节杆菌 (Arthrobacter nicotianae),
石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus), 原玻璃螞 节杆菌(Arthrobacter protophormiae), 玫瑰色石蜡节杆菌 (Arthrobacter roseoparaffinus), 疏碌节杆菌(Arthrobacter sulfureus), 产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens), 巴氏着色 菌(Chromatium buderi), 微温着色菌(Chromatium tepidum), 酒色 着色菌 (Chromatium vinosum), 沃氏着色菌 (Chromatium warmingii) , Chromatium fluviatile, 喧夏孢欧文氏菌(Erwinia uredo窗a),胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora),'菱萝欧文 氏菌(Erwinia ananas),草生欧文氏菌(Erwinia herbicola) , Erwinia punctata, Erwinia terreus, 罗得西亚曱基杆菌(Methylobacteri認 rhodesianum), 扭脱甲基杆菌(Methy lobacter ium extorquens), 席 蓝细菌属种(Phormidium sp. )ATCC 29409,荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus), 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides), 生芽红假 单月包菌(Rhodopseudomonas blastica), 海红菌(Rhodopseudomonas marina),血色红假单孢菌(Rhodopseudomonas palustris), 深红红 螺菌(Rhodospirillum rubrum), 需盐红螺菌(Rhodospiri 1 lum salexigens),盐场红螺菌(Rhodospiri 1 lum salinarium),产二素链 霉菌(Streptomyces ambofaciens),金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens),金色链霉菌(Streptomyces aureus), 杀
真菌素链霉 菌(Streptomyces fungicidicus), 灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes),灰色链霉菌(Streptomyces griseus), 浅青紫 链霉菌(Streptomyces lividans), 橄榄灰链霉菌(Streptomyces olivogriseus), 枝链霉菌(Streptomyces rameus), 田无链霉菌 (Streptomyces tanashiensis),酒红链霉菌(Streptomyces vinaceus) 和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等,作为优选原核生物,可以 列举属于埃希氏杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒杆 菌属、假单胞菌属或链霉菌属等的细菌、例如,属于上述埃希氏杆菌 属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、假单胞菌属或 链霉菌属等的种,作为更优选的细菌,可以列举大肠杆菌、谷氨酸棒 杆菌、产氨棒杆菌、产乳酸棒杆菌、黄色棒杆菌、棒杆菌.工7 4力 '〉只、黄色短杆菌、产乳酸短杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、 粘质沙雷氏菌、恶臭假单胞菌、Pseudomonas aerugi謂a、链霉菌-七卩力,一或浅青紫链霉菌,特别优选大肠杆菌,谷氨酸棒杆菌,产 氨棒杆菌,更具体的可以例举有具有生产L-谷氨酰胺能力的FERM P4806, ATCC14751和ATCC14752等,具有生产L-缬氨酸能力的 ATCC1 3005和ATCC19561等,具有生产L-亮氨酸能力的FERMBP-4704 和ATCC21 302等,具有生产L-异亮氨酸能力的FERM BP-3757和 ATCC14310等,具有生产L-苯丙氨酸能力的ATCC1 3281和ATCC21669 等,具有生产L-酪氨酸能力的ATCC21652等,和具有生产L-色氨酸能 力的DSM10118、 DSM10121、 DSM10123和FERM BP-1777等。而且,上述由FERM编号表示的菌抹可以从独立行政法人产业技 术综合研究所专利生物保藏中心(日本)获得,由ATCC编号表示的菌林 可以从美国典型培养物保藏中心(美国)获得,由DSM编号表示的菌林 可 以 从 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(德国)获得。2.本发明的氨基酸的制备方法作为本发明的氨基酸的制备方法,可以例举有(1)特征在于在 培养基中添加平均粒径为1-120um的氨基酸的结晶使得该氨基酸的 结晶浓度为0. 5g/l以上后,在培养基中培养具有生产上迷1的该氨基 酸的能力的微生物,使该培养基中生成并累积该氨基酸的结晶,从培 养物中收集该氨基酸的结晶的氨基酸的制备方法;和(2)特征在于在培养基中添加氨基酸结晶使培养基中的氨基酸结晶的总表面积达到0. 02m7l以上后,在该培养基中培养具有生产上述1的该氨基酸的能 力的微生物,使该培养基中生成并累积该氨基酸的结晶,从培养物中 收集该氨基酸的结晶的氨基酸的制备方法。在上述培养基中培养该微生物的方法除了添加氨基酸的结晶之 外,可以按照微生物的培养中可以使用的常规的方法进行。也就是说,如果是含有该微生物能够同化的
碳源、氮源、无机盐 类等,能够有效进行该微生物的培养的培养基,优选液体培养基,可 以使用天然培养基、合成培养基的任意一种。作为碳源,可以是该微生物能够同化的碳源,可以使用
葡萄糖、 果糖、
蔗糖、含有这些物质的糖蜜、淀粉或淀粉
水解产物等碳水化合 物;
醋酸、丙酸等
有机酸;
乙醇、正丙醇等醇类等。作为氮源,可以使用氨、
氯化铵、疏酸铵、醋酸铵、
磷酸铵等无 机酸或有机酸的铵盐、其它含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵 母提取物、玉米浆、
酪蛋白水解产物、豆饼和豆饼水解产物、各种发 酵菌体和其消化物等。作为无机盐,可以使用磷酸二氢
钾、
磷酸氢二钾、磷酸镁、
硫酸 镁、
氯化钠、硫酸亚
铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸
钙等。上述(1)的制备方法中添加的氨基酸的结晶的平均粒径为1-120 ym,如果是使结晶在培养基的浓度为0. 5g/1以上的氨基酸的结晶, 对所添加的氨基酸的结晶的平均粒径,量,氨基酸的种类和结晶形的 种类等的不作限制,但是作为添加的氨基酸的结晶的平均粒径,可以 列举l-120jum,优选2-110 jam,更优选5-70iam,更优选7-50iam, 特别优选10-35 jam,最优选11-13ym。作为氨基酸的结晶量,可以列举添加后的培养基中的氨基酸的结 晶浓度达到0. 5g/1以上,优选达到2-30g/l,更优选达到3-"g/1, 更优选达到4-22g/l,特别优选5-20g/l,最优选达到5.5-16. 5g/l 的量。而且,作为上述添加的氨基酸的结晶的平均粒径与添加量的组 合,如果可以是使平均粒径为1-U0jjm且结晶在培养基中的浓度为 0.5g/l以上的组合,则没有特别的限制,可以列举使平均粒径为1-120 jam且结晶浓度为0. 5g/l,优选平均粒径为2-llOjam且结晶浓度为 2-30g/1,更优选平均粒径为5-70nm且结晶浓度为3-25g/l,更优选 平均粒径为7-50 jam且结晶浓度为4-22g/l,特别优选平均粒径为 10-35 nm且结晶浓度为5-20g/l,最优选平均粒径为11-13ym且结晶 浓度为5. 5-16.5g/1的组合。在培养基中添加氨基酸的结晶的时期可以在培养基中培养具有 生产氨基酸的能力的微生物前,或者在培养基中培养具有生产氨基酸 的能力的微生物后的培养期间中的任意时期,优选在培养基中培养具 有生产氨基酸的能力的微生物后,从培养基中的氨基酸浓度达到饱和 溶解度前后开始,到在培养基中析出氨基酸的结晶前;更优选在培养 基中的氨基酸浓度达到饱和溶解度后,到在培养基中析出氨基酸的结 晶前;更优选培养基中的氨基酸浓度为过饱和的时候,在培养基中析 出氨基酸的结晶前。不过,上述所谓培养基中析出氨基酸的结晶前, 优选是完全没有观察到氨基酸的结晶的时期,在结晶回收率方面等, 如果在能实现本发明的效果的范围内,也可以观察到微量的氨基酸的 结晶的析出。培养基中的氨基酸的浓度为过饱和时添加氨基酸的结晶时的氨 基酸的结晶量,作为相对于添加时的培养基量的量,可以列举O. sg/i 以上,优选达到2-30g/1,更优选达到3-25g/l,更优选达到4-22g/l, 特别优选5-20g/l,最优选达到5. 5-16. 5g/l。培养基中的氨基酸的浓度为过饱和时添加氨基酸的结晶时,作为 添加的氨基酸的结晶的平均粒径和量的组合,可以列举平均粒径为 1-120 iam的结晶且添加0. 5g/l以上的相对于添加时的培养基量的量, 优选平均粒径为2-110um且添加2-30g/l的相对于添加时的培养基量 的量,更优选平均粒径为5-70jum且添加3-25g/l的相对于添加时的 培养基量的量,更优选平均粒径为7-50lam且添加4-22g/l的相对于 添加时的培养基量的量,特别优选平均粒径为10-35nm且添加 5-20g/l的相对于添加时的培养基量的量,最优选平均粒径为11-13 U m且添加5. 5-16, 5g/l的相对于添加时的培养基量的量的组合。而且,上述(2)的制备方法中添加的氨基酸的结晶如果是培养基 中的氨基酸的结晶的总表面积达到0. 02m2/l以上的氨基酸结晶,则对 所添加的氨基酸的结晶的平均粒径、量、氨基酸的种类和结晶形的种 类等不作限制,但是作为添加的氨基酸的结晶,可以列举添加后的培 养基中的氨基酸的结晶的总表面积达到0.02m2/l以上,优选 0. 08-70m2/1,更优选0. 2-23ra2/1,更优选0. 4-15m2/1,特别优选 0. 7-9. 3mV"最优选2. 0-7. Om2/1的氨基酸的结晶。作为上述(2)的制备方法中添加的具体的氨基酸的结晶,可以列 举使平均粒径为1-120 um且结晶浓度为0. 5g/1以上,优选平均粒径 为2-110jam且结晶浓度为2-30g/l,更优选平均粒径为5-70Mm且结 晶浓度为3-25g/l,更优选平均粒径为7-50um且结晶浓度为4-22g/1, 特别优选平均粒径为10-35 iam且结晶浓度为5-20g/1,最优选平均粒 径为11-13um且结晶浓度为5. 5-16. 5g/1的氨基酸的结晶。在培养基中添加氨基酸的结晶时期与上述(l)的制备方法相同。作为培养基中的氨基酸的浓度为过饱和时,添加氨基酸的结晶时 的氨基酸的结晶,可以列举根据添加时的培养基量计算的时候的总表 面积为0. 02mVl以上,优选0. 08-70m2/1,更优选0. 2-23m2/1 ,更优 选0. 4-15m2/1,特别优选0. 7-9. 3m2/1,最优选2. 0-7. 0m2/1的氨基酸 的结晶。作为具体的氨基酸的结晶,可以列举使平均粒径为l-UO)am且 相对于添加时的培养基量的量为0. 5g/1以上的结晶,优选平均粒径为 2-llGMm且相对于添加时的培养基量的量为2-30g/l的结晶,更优选 平均粒径为5-70"m且相对于添加时的培养基量的量为3-25g/1的结 晶,更优选平均粒径为7-50pm且相对于添加时的培养基量的量为 4-22g/1的结晶,特别优选平均粒径为10-35 jam且相对于添加时的培 养基量的量为5-20g/l的结晶,最优选平均粒径为11-13 Min且相对于 添加时的培养基量的量为5. 5-16. 5g/l的结晶。
在上述内容中,作为测定培养物中的培养基量的方法,可以是公 知的任意一种方法,可以列举,例如通过离心分离培养物,分离培养 基与菌体等不溶物质,测定沉淀的不溶物质的体积,从培养物量中减 去其体积的方法等。进而,在上述(1)和(2)的制备方法中,添加的氨基酸的结晶,可 以列举平均比表面积为0. 06m7cm3以上的氨基酸的结晶,优选 0. 07-7. 2mVcm3,更优选0. 07-1. 43m2/cm3,更优选0, 1-1. 0mVcm3,特 别优选0. 14-0. 72mVcm3的氨基酸的结晶。作为在上述(1)和(2)的制备方法中添加的氨基酸,如果是微生物 可生产的氨基酸,可以是任意一种氨基酸,优选可以列举选自于L-谷 氨酰胺、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸 和L-色氨酸的氨基酸,更优选选自于L-谷氨酰胺、L-缬氨酸和L-色 氨酸的氨基酸,更优选L-谷氨酰胺。不过,可以从本发明的制备方法 中添加的氨基酸的结晶中除去L-苯丙氨酸的oc晶体。本发明中可以使用的用于培养基添加的氨基酸的结晶可以照原 样使用市售品或用公知的方法例如发酵生产法和纯化法获得的氨基酸 的结晶等,或者可以通过用市售的
粉碎机,例如M4型自由粉碎机(奈 良机械制作所制)、Atomizer-TAP-20型(东京Atomizer制造社制)、 Air Classifying Mi 11 (H0S0KAWA MICRON POWDER SYSTEMS 乂>司制) 等,将市售的氨基酸的结晶或由上述的公知方法获得的氨基酸的结晶 制备成具有目的平均粒径的氨基酸的结晶来获得。例如,通过使用M4型自由粉碎机,在筛cj) 1. Omm,转数4500rpm, 处理速度约400kG/h的条件下粉碎由公知的发酵生产法和纯化法获得 的平均粒径为约llOum的氨基酸的结晶,可以获得平均粒径在约45 ILim的氨基酸的结晶,再通过在筛(J) 0. 3mm,转数6000rpm,处理速度 约200kG/h的条件下粉碎该氨基酸的结晶,可以获得平均粒径为约11 jam的氨基酸的结晶。氨基酸的结晶的比表面积,可以使用市售的测定仪进行测定,例 如Seishin企业抹式会社制SK LASER MICRON SIZER LMS-24 (LASER 衍射'散射式粒度分布测定装置)测定,不过优选在测定氨基酸的结晶 的比表面积时,假定该结晶为球状且是相似系进行计算。可以根据氨基酸的结晶的比表面积和添加的量计算氨基酸的结 晶的总表面积。培养在通常的振荡培养或深部通气搅拌培养等好
氧条件下进行。培养温度可以是15-40°C,培养时间通常为5小时-7天。在培养过程 中,将pH维持在3. 0~9.0。使用
无机酸或有机酸、
碱溶液、尿素、 碳酸钙、氨等进行pH调节。而且,培养中可以根据需要,在培养基中添加氨爷青霉素和四环 素等抗生素。当培养被采用诱导性启动子作为启动子的表达栽体转化的微生 物时,根据需要,还可以向培养基中加入诱导物。例如,在培养被釆 用lac启动子的表达载体转化的微生物时,可以向培养基中加入异丙 D-硫代半乳糖苷等;在培养经采用trp启动子的表达栽体转化 的微生物时,可以向培养基中加入吲哚
丙烯酸等。作为上述方法中培养基中所累积的氨基酸,如果是微生物可生产 的氨基酸,可以是任意一种氨基酸,优选可以列举选自于L-谷氨酰胺、 L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨 酸的氨基酸,更优选选自于L-谷氨酰胺、L-缬氨酸和L-色氨酸的氨基 酸,更优选L-谷氨酰胺。而且,作为上述方法中培养基中所累积的氨基酸的结晶,可以列 举平均粒径在15 jum以上,优选20ym以上,更优选^Mm以上,更 优选40pm以上,特别优选50|am以上,最优选60 u m以上的结晶。在本发明的制备方法中,作为收集培养物中的氨基酸的结晶的方 法,如果是常规的氨基酸的纯化方法,可以是任意一种方法,优选可 以列举通过利用培养结束后的菌体和结晶的粒径以及比重差异,直接 分离纯化培养终止后的培养物中的菌体和氨基酸的结晶来进行分离纯 化氨基酸的结晶的方法。作为上述利用粒径和比重差异分离纯化氨基酸的结晶的方法,可
以列举以往公知的方法-重力分级分离法,离心分级分离法,更优选离 心分级分离法,该离心分级分离法中更优选沉降式离心分离法。通过上述收集方法,可以以高回收率获得充分纯化的氨基酸的结 晶,但是根据需要,可以再通过使用活性碳或离子交换
树脂等的常规 的方法或通过
有机溶剂的提取、结晶、薄层色i脊、高效液相色i脊法等 进行纯化。以下,记载了
实施例,但是本发明不受这些实施例的限制。 实施例1L-谷氨酰胺的结晶的制备(1)在装入了生产培养基[250g/1葡萄糖,30g/L NH4C1、 1. Og/L K2HP04、 l.Og/L KH2P04、 0. 5g/L MgS04 • 7H20、 20mg/L FeS04、 2mg/L MnS04'4H20、 10jjg/L生物素、lmg/L石克胺素
盐酸盐、pH6.8]的体积为 500L的
发酵罐中, 一边调节适宜的pH、培养温度, 一边进行培养(谷 氨酸纟奉杆菌ATCC14752。培养开始后,培养基中的L-谷氨酰胺的浓度 达到其饱和溶解度后,L-谷氨酰胺的结晶在培养基中析出前,在培养 基中添加平均粒径40um的L-谷氨酰胺的结晶,使得结晶浓度达到 16. 5g/l。然后,继续培养, 一边使L-谷氨酰胺的结晶在培养基中成 长, 一边进行培养。培养开始约96小时时终止培养,获得了 noL含 有90g/L的L-谷氨酰胺的培养物。使用巴工业(抹)制沉降器(PTM006 型),从该培养物中分离获得6.2kg的L-谷氨酰胺。该结晶的平均粒 径为62ym。此时,培养基中析出的结晶通过沉降器的回收率为98.9%。实施例2L-谷氨酰胺的结晶的制备(2)作为培养中添加的结晶,除了使用平均粒径为图l所示的粒径的 L-谷氨酰胺的结晶之外,用与实施例1同样的方法进行培养,获得了 L-谷氨酰胺的结晶。而且,使用SeisMn企业林式会社制SK LASER MICRON SIZER LMS-24 (LASER衍射.散射式粒度分布测定装置)测定L- 谷氨酰胺的结晶的比表面积。但是优选在测定氨基酸的结晶的比表面 积时,假定该结晶为球状且是相似系进行计算。添加的L-谷氨酰胺的结晶和通过发酵生产获得的L-谷氨酰胺的 结晶的形状、L-谷氨酰胺的结晶的回收率,千燥物含量等示于图1。如图l所示,可知在培养基中不添加结晶的情况下,由于培养基 中析出细微的结晶,通过离心分离的结晶回收率降低,而且添加的氨 基酸的粒径小者,结晶回收率有上升的倾向。而且,添加结晶时,培 养终止时获得的培养基中的氨基酸的结晶的平均粒径全部都为30 ym 以上。而且,还可知通过篮型离心分离机使以沉降器分离的结晶脱液, 通过干燥获得的结晶的含量(干燥物含量)由于添加总表面积大的结晶 而提高。根据上述内容,通过本发明的制备方法,不仅L-谷氨酰胺、在 各种氨基酸的发酵生产中,通过在培养基中添加氨基酸的结晶使培养 基中的氨基酸的过
饱和度保持到 一定以下,并且使作为晶种的适当数 量的氨基酸的结晶存在于培养基中,即通过调整在培养基中添加的氨 基酸的结晶的平均粒径和量或者该结晶的总表面积,可以控制培养中 培养基中析出的氨基酸的结晶的粒径,其结果表明与菌体容易分离, 并且可以获得回收率高的氨基酸的结晶。
工业实用性通过本发明可以简便且有效地制备氨基酸。