技术领域
[0001] 本
发明属于
生物催化领域，具体涉及一种利用脂肪酶催化合成C-6’-月桂酰基京尼平苷的方法。
背景技术
[0002] 京尼平苷是一种环烯醚萜
葡萄糖苷，是栀子的主要药效成分。京尼平苷对消化系统、心血管系统和中枢神经系统
疾病均有显著疗效，此外，京尼平苷还有一定的抗炎、抗
氧化、抗
肿瘤和
治疗软组织损伤的作用。京尼平苷除了药用以外，在其它领域也得到广泛的应用，如可用作
植物增产剂、生物检测剂等。
[0003] 作为一种环烯醚萜苷类化合物，京尼平苷拥有的极性官能团使其亲
水性较强，更加容易溶解在水、甲醇中，可以溶解在
乙醇、丙
酮与正丁醇之中，但是难溶于氯仿、乙醚、苯等亲脂性
有机溶剂，脂溶性差，这很大程度上地限制了京尼平苷的应用。在应用中常将京尼平苷以某种形式进行修饰，得到更为稳定、脂溶性更好的京尼平苷衍生物。
[0004] 目前，京尼平苷的修饰主要通过化学法进行。CN102875617A中汤文建等人以京尼平苷为原料，经过一系列乙酰化，脱乙酰基，缩合等一系列复杂反应制得了多种京尼平苷衍生物。然而化学修饰法存在工艺步骤复杂、反应条件苛刻、反应位点选择性差和环境污染较大等问题。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种利用脂肪酶催化合成C-6’-月桂酰基京尼平苷的方法，以解决
现有技术存在的工艺步骤复杂、反应条件苛刻、反应位点选择性差和环境污染较大等问题
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 一种利用脂肪酶催化合成C-6’-月桂酰基京尼平苷的方法，它包括如下步骤：
[0008] 将京尼平苷和桂酸乙烯酯溶于溶剂中，以固定化脂肪酶为催化剂进行反应，反应液经离心、溶解和柱纯化后，即得产物。
[0009] 其中，京尼平苷和桂酸乙烯酯的摩尔比为1：1～10。
[0010] 其中，所述的固定化脂肪酶由疏
棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、米黑根毛霉菌脂肪酶、南极假丝
酵母脂肪酶B或南极假丝酵母脂肪酶A中的任意一种固定在载体上得到。
[0011] 其中，所述的载体为
硅胶、纺织制品或
树脂。
[0012] 其中，
[0013] 所述硅胶优选为粒径5～20μm的硅胶颗粒；
[0014] 所述树脂优选为粒径0.1～1mm的颗粒状树脂；
[0015] 所述纺织制品优选为100目的尼龙86。
[0016] 所述的固定化脂肪酶可以通过将脂肪酶通过
吸附或化学键合固定在载体上制备得到，例如采用水相固定化法将脂肪酶吸附固定在载体上，具体操作为：将脂肪酶溶解在缓冲液中，加入载体，震荡或搅拌一定时间后，经抽滤、洗涤和干燥，获得固定化脂肪酶。
[0017] 其中，所述的脂肪酶的酶活为250～10000U/g，脂肪酶酶活的定义为：在40℃下，在pH8.0的
磷酸缓冲溶液中
水解橄榄油，每分钟释放出1mmol
脂肪酸所需的酶量为一个酶活单位。其中，脂肪酶和京尼平苷的
质量比为0.5～5：1。
[0018] 其中，所述的溶剂的油水分配系数LogP为-0.5～+4.0，优选正己烷，叔戊醇，四氢呋喃或丙酮。
[0019] 其中，所述反应的反应
温度为35～55℃，反应时间为20～60h。
[0020] 其中，反应时，反应体系置于摇床上，摇床转速为150～200r/min。
[0021] 其中，
[0022] 离心方法为以2000～5000r/min的转速离心5～10min；
[0023] 溶解方法为取离心所得上层液体，吹干溶剂后，所得油状物溶解于乙腈中；
[0024] 柱纯化所用色谱柱为SSepax Bio-C18 10μm，150mm x 21.2mm。色谱条件为：流动相：乙腈-水(80:20)柱温：25℃进样量：1.5mL流速：5mL/min检测
波长：210nm。
[0025] 本发明的反应式如下：
[0026]
[0027] 有益效果：
[0028] 与现有技术相比，本发明具有如下优势：本发明首次利用脂肪酶催化合成天然产物京尼平苷的衍生物C-6’-月桂酰基京尼平苷，相对于化学修饰法，本发明具有反应条件温和，催化位点选择性强，工艺步骤简单，环境友好等特点。同时，本发明使用的固定化脂肪酶，易与底物及产物分离，寿命长可重复使用进行连续化生产，降低了生产成本。本发明制备得到的产品C-6’-月桂酰基京尼平苷较京尼平苷脂溶性得到了较大的改善，应用前景更为广阔。
附图说明
[0029] 图1为
实施例3中制备得到的C-6’-月桂酰基京尼平苷的正离子质谱图；
[0030] 图2为实施例3中制备得到的C-6’-月桂酰基京尼平苷的核磁氢谱图；
[0031] 图3为实施例3中制备得到的C-6’-月桂酰基京尼平苷的核磁
碳谱图。
具体实施方式
[0032] 以下通过具体实施例对本发明技术进一步说明。应当理解，此处所描述的实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0033] 下述实施例中，柱纯化所用色谱柱为SSepax Bio-C18 10μm，150mm x 21.2mm。色谱条件为：流动相：乙腈-水(80:20)柱温：25℃进样量：1.5mL流速：5mL/min检测波长：210nm。
[0034] 实施例1
[0035] 将两种底物0.04g京尼平苷和0.1g月桂酸乙烯酯(摩尔比约1:4)加入到反应媒体10mL的四氢呋喃中，反应以0.1g固定在平均粒径为10μm的硅胶颗粒上的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶为催化剂，酶活为250U/g。在温度40℃条件下，摇床震荡(200r/min)，反应60小时。反应结束后将反应液离心分离出固定化酶，取上层液体吹干溶剂，得到的油状物用乙腈溶解，经反相制备柱纯化获得产物。产物转化率达61.3％。
[0036] 将制得的C-6'-月桂酰基京尼平苷与京尼平苷进行脂溶性实验，两者在水/正辛醇相中的分配比见表1。
[0037] 表1
[0038]
[0039] 实施例2
[0040] 将两种底物0.04g京尼平苷和0.1g月桂酸乙烯酯(摩尔比约1:4)加入到反应媒体10mL的叔戊醇中，反应以0.1g固定化在平均粒径为500μm的大孔树脂上的南极假丝酵母脂肪酶B为催化剂，酶活为1000U/g。在温度40℃条件下，摇床震荡(200r/min)，反应60小时。反应结束后将反应液离心分离出固定化酶，取上层液体吹干溶剂，得到的油状物用乙腈溶解，经反相制备柱纯化获得产物。反应转化率达53.2％。
[0041] 实施例3
[0042] 将两种底物0.04g京尼平苷和0.15g月桂酸乙烯酯(摩尔比约1:6)加入到反应媒体10mL的四氢呋喃中，反应以0.1g固定在平均粒径为5μm的硅胶颗粒上的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶为催化剂，酶活为250U/g。在温度45℃条件下，摇床震荡(200r/min)，反应60小时。反应结束后将反应液离心分离出固定化酶，取上层液体吹干溶剂，得到的油状物用乙腈溶解，经反相制备柱纯化获得产物。反应转化率达78.7％。
[0043] 实施例4
[0044] 将两种底物0.04g京尼平苷和0.1g月桂酸乙烯酯(摩尔比约1:4)加入到反应媒体10mL的正己烷中，反应以0.1g固定在平均粒径为10μm的硅胶颗粒上的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶为催化剂，酶活为250U/g。在温度40℃条件下，摇床震荡(200r/min)，反应30小时。反应结束后将反应液离心分离出固定化酶，取上层液体吹干溶剂，得到的油状物用乙腈溶解，经反相制备柱纯化获得产物。反应转化率达33.5％。
[0045] 实施例5
[0046] 将两种底物0.04g京尼平苷和0.1g月桂酸乙烯酯(摩尔比约1:4)加入到反应媒体10mL的四氢呋喃中，反应以0.2g固定化在平均粒径为1mm的大孔树脂上的南极假丝酵母脂肪酶A为催化剂，酶活为500U/g。在温度40℃条件下，摇床震荡(200r/min)，反应60小时。反应结束后将反应液离心分离出固定化酶，取上层液体吹干溶剂，得到的油状物用乙腈溶解，经反相制备柱纯化获得产物。反应转化率达12.3％。
[0047] 实施例6
[0048] 将两种底物0.04g京尼平苷和0.1g月桂酸乙烯酯(摩尔比约1:4)加入到反应媒体10mL的丙酮中，反应以0.1g固定在平均粒径为5μm的硅胶颗粒上的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶为催化剂，酶活为250U/g。在温度35℃条件下，摇床震荡(200r/min)，反应60小时。反应结束后将反应液离心分离出固定化酶，取上层液体吹干溶剂，得到的油状物用乙腈溶解，经反相制备柱纯化获得产物。反应转化率达58.7％。
[0049] 实施例7
[0050] 将两种底物0.04g京尼平苷和0.1g月桂酸乙烯酯(摩尔比约1:4)加入到反应媒体10mL的四氢呋喃中，反应以0.1g固定在100目尼龙86上的米黑根毛霉菌脂肪酶为催化剂，酶活为3000U/g。在温度40℃条件下，摇床震荡(150r/min)，反应60小时。反应结束后将反应液离心分离出固定化酶，取上层液体吹干溶剂，得到的油状物用乙腈溶解，经反相制备柱纯化获得产物。反应转化率达17.2％。
[0051] 实施例8
[0052] 脂肪酶的固定化：作为载体的D311离子交换树脂先用去离子水浸泡胀润，去杂，然后用4％NaOH和4％HCl交替在磁
力搅拌器下搅拌浸泡2小时，用去离子水洗至中性。随后将预处理后的载体树脂
真空抽滤后取1.0g放入三
角烧瓶中，加入含有1.5mL南极假丝酵母脂肪酶B酶液的缓冲液(pH 10)5mL，恒温35℃，转速110rpm，在恒温
振荡器中吸附固定10小时。固定完成后用去离子水洗涤，真空抽滤，干燥，得到固定化酶。
