一种酶活测定用的电化学传感器及其制备方法、凝乳酶活性的电化学测定方法
阅读：512发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种酶活测定用的电化学传感器及其制备方法、凝乳酶活性的电化学测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 提供了一种酶活测定用的电化学 传感器 及其制备方法、 凝乳酶 活性的电化学测定方法，属于电化学传感器。本申请提供的酶活测定用的电化学传感器，制作简单，方便检测；且对 电流 信号 变化敏感。利用该电化学传感器进行酶活的测定，不使用复杂的底物，操作过程简单，测量的 精度 高，特异性比较强，能较好的避免不必要的干扰；而且 稳定性 好，能重复使用，能降低检测的成本；同时测试反应的时间也较短，方便快速检测，具有较高的使用价值。，下面是一种酶活测定用的电化学传感器及其制备方法、凝乳酶活性的电化学测定方法专利的具体信息内容。
1.一种酶活测定用的电化学传感器，其特征在于，所述电化学传感器包括裸电极、沉积在所述裸电极表面的金属镀层，以及结合于所述金属镀层的底物肽段。
2.根据权利要求1所述的酶活测定用的电化学传感器，其特征在于，所述裸电极为玻碳电极、金电极、银电极、铂电极。
3.根据权利要求1所述的酶活测定用的电化学传感器，其特征在于，所述金属镀层为金镀层。
4.根据权利要求1所述的酶活测定用的电化学传感器，其特征在于，所述底物肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.如权利要求1-4任一项所述的酶活测定用的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将清洗晾干的裸电极在HAuCl4溶液中进行电镀，得到镀金电极；
将底物肽溶液在2-6℃条件下浸润所述镀金电极20-30h，得到基础修饰电极；
用9-13mmol/L的己硫醇封闭处理所述基础修饰电极50-65min，洗净晾干得到酶活测定用的电化学传感器。
6.根据权利要求5所述的酶活测定用的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述HAuCl4溶液的浓度为9-13mmol/L；所述电镀的电位为-0.25V到-0.17V，时间为185-225s。
7.一种凝乳酶活性的电化学测定方法，其特征在于，所述电化学测定方法使用如权利要求1-4任一项所述的酶活测定用的电化学传感器进行检测；包括以下步骤：
用标准凝乳酶溶液配制成多个活性梯度的溶液；
预热所述电化学传感器，将所述电极置于配制好的标准凝乳酶溶液进行酶反应；
清洗所述的修饰电极，并将所述的修饰电极置于电流测定溶液中进行电流测定，分别测得多个活性梯度溶液的数据，构建凝乳酶活性与电流的标准曲线；
再次用待检凝乳酶样本进行检测，将测得的所述待检凝乳酶样本的数据通过所述标准曲线计算得到所述待检凝乳酶样本的活性。
8.根据权利要求7所述的凝乳酶活性的电化学测定方法，其特征在于，所述预热温度为
37℃，时间为4-7min；所述酶反应的温度为37℃，时间为8-13min；优选地，所述酶反应的时间为10min。
9.根据权利要求7所述的凝乳酶活性的电化学测定方法，其特征在于，所述电流测定溶液为[Ru（NH3）5Cl]2+；所述电流测定的初始电位0V，终止电位-0.5V。
一种酶活测定用的电化学传感器及其制备方法、凝乳酶活性
的电化学测定方法
技术领域
[0001] 本申请涉及电化学传感器领域，具体而言，涉及一种酶活测定用的电化学传感器及其制备方法、凝乳酶活性的电化学测定方法。
背景技术
[0002] 奶酪是世界上主要的乳制品之一。目前，大多数的奶酪都是用凝乳酶作为凝结剂生产的。凝乳蛋白酶和胃蛋白酶对酪蛋白有不同的特异性水解作用，并显著影响奶酪的风味及品质。与其它凝乳酶相比，凝乳酶凝乳活性较高，有利于干酪的制作。同时，残余的凝乳蛋白酶被认为是奶酪软化的原因之一。因此，凝乳酶的测定是干酪生产中一个重要的科学、技术、工业和经济指标。
[0003] 凝乳酶是一种特殊的乳凝血天冬氨酸蛋白酶，它能特异性水解酪蛋白中的105苯丙氨酸-106甲硫氨酸（Phe105-Met106）的肽键，并从蛋白的C端释放出长为64个氨基酸的亲水性残肽(糖巨肽)，从而导致酪蛋白胶束的凝固和凝胶的形成，最终分离成奶酪和乳清。
[0004] 测定蛋白酶活性的经典方法是在牛奶沉淀开始絮凝时，通过肉眼观察测定加入凝乳蛋白酶后牛奶的凝结时间来确定凝乳酶的活性。国际乳制品联合会则采用色谱法进行凝乳酶活性的测定。另外，酶联免疫吸附试验(ELISA) 、高效液相色谱(HPLC) 和质谱等方法也已被开发用于凝乳酶的定量。虽然这些方法可以有效地测定凝乳酶，但这些方法仍存在一定的缺点，如观察的主观性、耗时、仪器昂贵、效率低、测量步骤长、预处理繁琐等，阻碍了其实际应用。
[0006] 本申请设计的底物肽段的等电点较高，在中性环境时，肽段带正点，与溶液中的带正电荷的离子排斥，导致电流较低；当底物肽被凝乳酶水解后，正电荷片段脱离，电极上剩下中性肽片段，这时带正电荷的离子容易接近电极，从而使电流升高；因此可以通过此电极测定凝乳酶活性。
[0009] 在前述的第一方面的一些实施例中，金属镀层为金镀层。
[0010] 在实施例中，金属材料中，银和铜的导电性最好，金次之；然而银和铜都比金活跃，在自然环境或者氧化还原条件下，容易发生反应而影响其导电性；因此本申请中选用较为导电性和稳定性都较好金作为金属镀层。
[0011] 在前述的第一方面的一些实施例中，底物肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012] 在实施 例中 ，SEQ ID NO .1所示的底 物肽的 氨基酸序列为 ： CGGGHPHPHLSFMAIPPKK；多肽的N端的半胱氨酸残基与Au/GCE结合，GGG有利于多肽与Au/GCE的高效结合。凝乳酶能对F和M残基之间的肽键进行剪切。
[0013] 底物肽的等电点(pI)为9.9，当在pH 7.0的环境中时，肽段带正电荷(电荷:+2.2)，会与带正电荷的离子发生排斥作用，导致带正电荷离子的电信号物质不易接触到电极表面，故会出现峰值电流较低的现象。当底物肽的Phe -Met键被凝乳蛋白酶酶解时，带正电荷的肽片段(MAIPPKK, 等电点为 10.4)从电极表面释放出来，剩下的是中性肽片段(CGGGHPHPHLSF, 等电点为7.4) (pH 7.0时电荷为+0.2)。此时正电荷离子会更易接近电极表面，从而使得峰电流值升高。
[0014] 本申请的第一方面提供了一种上述的酶活测定用的电化学传感器的制备方法，制备方法包括以下步骤:将清洗晾干的裸电极在HAuCl4溶液中进行电镀，得到镀金电极；
将底物肽溶液在2-6℃条件下浸润镀金电极20-30h，得到基础修饰电极；
用9-13mmol/L的己硫醇封闭处理基础修饰电极50-65min，洗净晾干得到酶活测定用的电化学传感器。
将底物肽溶液在2-6℃条件下浸润镀金电极20-30h，得到基础修饰电极；
用9-13mmol/L的己硫醇封闭处理基础修饰电极50-65min，洗净晾干得到酶活测定用的电化学传感器。
[0016] 在前述的第二方面的一些实施例中，HAuCl4溶液的浓度为9-13mmol/L；电镀的电位为-0.25V到-0.17V，时间为185-225s。
[0017] 在实施例中，通过电沉积镀金的方式，将单质金镀到玻碳电极的表面，能形成厚度均匀的镀层；保证电极的一致性；有利于得到一致的实验结果。
[0018] 在实施例中，在经过己硫醇封闭后，再在电极上负载一定的超分子，能很好的增加电化学传感器的灵敏性。
[0019] 本申请第三方面提供了一种凝乳酶活性的电化学测定方法，电化学测定方法使用上述的酶活测定用的电化学传感器进行检测；包括以下步骤：用标准凝乳酶溶液配制成多个活性梯度的溶液；
预热电化学传感器，将电极置于配制好的标准凝乳酶溶液进行酶反应；
清洗电极，并将电极置于电流测定溶液中进行电流测定，分别测得多个活性梯度溶液的数据，构建凝乳酶活性与电流的标准曲线；
再次用待检凝乳酶样本进行检测，将测得的待检凝乳酶样本的数据通过标准曲线计算得到待检凝乳酶样本的活性。
预热电化学传感器，将电极置于配制好的标准凝乳酶溶液进行酶反应；
清洗电极，并将电极置于电流测定溶液中进行电流测定，分别测得多个活性梯度溶液的数据，构建凝乳酶活性与电流的标准曲线；
再次用待检凝乳酶样本进行检测，将测得的待检凝乳酶样本的数据通过标准曲线计算得到待检凝乳酶样本的活性。
[0020] 在实施例中，通过对标准酶活的样本进行检测，构建酶活与电流数据的标准曲线，然后测定待测样本，将测得的数据通过标准曲线计算，得到待测样本的酶活数据值。
[0021] 本申请的第二方面的一些实施例中，预热温度为37℃，时间为4-7min；酶反应的温度为37℃，时间为8-13min；优选地，酶反应的时间为10min。
[0022] 在实施例中，生物活性的酶，通常的最佳反应温度为37℃，当然也可以在37℃左右浮动，预热4-7min，保证电极能完全达到预热温度，且内外温度值稳定一致；而酶在37℃的条件下，反应8-13min；优选地反应10min，既能保证反应充分，又能达到快速反应和检测的目的。
[0023] 在前述的第二方面的一些实施例中电流测定溶液为[Ru（NH3）5Cl]2+；电流测定的初始电位0V，终止电位-0.5V。
[0024] 在实施例中，[Ru（NH3）5Cl]2+溶液有利于进行微分脉冲伏安法对电流信号进行检测。
[0025] 与现有技术相比，本申请的有益效果为本申请提供的酶活测定用的电化学传感器，制作简单，不需要复杂的底物，方便检测；且对电流信号变化敏感。利用该电机传感器进行酶活的测定，操作过程简单，测量的精度高，特异性比较强，能较好的避免不必要的干扰；而且稳定性好，能重复使用，能降低检测的成本；同时测试反应的时间也较短，方便快速检测，具有较高的使用价值。
[0027] 图1是实验例1中电极的电子显微镜图；图2是实验例1中电化学传感器的阻抗EIS图谱、CV曲线，可行性结果，反应时间，标准曲线的图；
图3是实验例2中测定的凝乳酶特异性检测结果；
图4是实验例2中电化学传感器稳定性检测结果；
图5是实验例2中电化学传感器重复性检测结果。
图3是实验例2中测定的凝乳酶特异性检测结果；
图4是实验例2中电化学传感器稳定性检测结果；
图5是实验例2中电化学传感器重复性检测结果。
具体实施方式
[0028] 下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0029] 以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
[0030] 实施例1本实施例提供一种酶活测定用的电化学传感器的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
1.1用擦镜纸将玻碳电极GCE表面的残余物质擦拭干净,在抛光膜上洒上0.3μm氧化铝抛光粉，用去离子水均匀分散于膜上，将电极与抛光膜保持垂直进行打磨；
1.2用去离子水清洗电极。然后再用0.05μm氧化铝抛光粉进行再一次打磨；去离子水清洗电极；
1.3将已抛光处理的电极浸在乙醇中短暂超声5s，然后再将电极浸入去离子水中，再将短暂超声5s将电极用去离子水清洗，空气中晾干待用；
1.4打磨抛光并清洗晾干的玻碳电极GCE浸入配制的浓度为9mmol/LHAuCl4溶液中；
1.5进行电沉积镀金，电压为-0.25V，时间为185s，得到镀金电极；
1.6将序列如SEQ ID NO.1所示CGGGHPHPHLSFMAIPPKK的多肽配制成10mmol/L的底物肽溶液；
1.7将镀金电极在2℃下通过浸润底物肽溶液30h；得到基础修饰电极；
1.8用去离子水清洗基础修饰电极，将9mmol/L的己硫醇封闭处理基础修饰电极65min，洗净晾干得到酶活测定用的电化学传感器。
1.1用擦镜纸将玻碳电极GCE表面的残余物质擦拭干净,在抛光膜上洒上0.3μm氧化铝抛光粉，用去离子水均匀分散于膜上，将电极与抛光膜保持垂直进行打磨；
1.2用去离子水清洗电极。然后再用0.05μm氧化铝抛光粉进行再一次打磨；去离子水清洗电极；
1.3将已抛光处理的电极浸在乙醇中短暂超声5s，然后再将电极浸入去离子水中，再将短暂超声5s将电极用去离子水清洗，空气中晾干待用；
1.4打磨抛光并清洗晾干的玻碳电极GCE浸入配制的浓度为9mmol/LHAuCl4溶液中；
1.5进行电沉积镀金，电压为-0.25V，时间为185s，得到镀金电极；
1.6将序列如SEQ ID NO.1所示CGGGHPHPHLSFMAIPPKK的多肽配制成10mmol/L的底物肽溶液；
1.7将镀金电极在2℃下通过浸润底物肽溶液30h；得到基础修饰电极；
1.8用去离子水清洗基础修饰电极，将9mmol/L的己硫醇封闭处理基础修饰电极65min，洗净晾干得到酶活测定用的电化学传感器。
[0031] 实施例21.1用擦镜纸将玻碳电极GCE表面的残余物质擦拭干净,在抛光膜上洒上0.3μm氧化铝抛光粉，用去离子水均匀分散于膜上，将电极与抛光膜保持垂直进行打磨；
1.2用去离子水清洗电极。然后再用0.05μm氧化铝抛光粉进行再一次打磨；去离子水清洗电极；
1.3将已抛光处理的电极浸在乙醇中短暂超声5s，然后再将电极浸入去离子水中，再将短暂超声5s将电极用去离子水清洗，空气中晾干待用；
1.4打磨抛光并清洗晾干的玻碳电极GCE浸入配制的浓度为9mmol/LHAuCl4溶液中；
1.5进行电沉积镀金，电压为-0.17V，时间为225s，得到镀金电极；
1.6将序列如SEQ ID NO.1所示CGGGHPHPHLSFMAIPPKK的多肽配制成10mmol/L的底物肽溶液；
1.7将镀金电极在4℃下通过浸润底物肽溶液24h；得到基础修饰电极；
1.8用去离子水清洗基础修饰电极，将10mmol/L的己硫醇封闭处理基础修饰电极
60min，洗净晾干得到酶活测定用的电化学传感器。
1.2用去离子水清洗电极。然后再用0.05μm氧化铝抛光粉进行再一次打磨；去离子水清洗电极；
1.3将已抛光处理的电极浸在乙醇中短暂超声5s，然后再将电极浸入去离子水中，再将短暂超声5s将电极用去离子水清洗，空气中晾干待用；
1.4打磨抛光并清洗晾干的玻碳电极GCE浸入配制的浓度为9mmol/LHAuCl4溶液中；
1.5进行电沉积镀金，电压为-0.17V，时间为225s，得到镀金电极；
1.6将序列如SEQ ID NO.1所示CGGGHPHPHLSFMAIPPKK的多肽配制成10mmol/L的底物肽溶液；
1.7将镀金电极在4℃下通过浸润底物肽溶液24h；得到基础修饰电极；
1.8用去离子水清洗基础修饰电极，将10mmol/L的己硫醇封闭处理基础修饰电极
60min，洗净晾干得到酶活测定用的电化学传感器。
[0032] 实施例31.1用擦镜纸将玻碳电极GCE表面的残余物质擦拭干净,在抛光膜上洒上0.3μm氧化铝抛光粉，用去离子水均匀分散于膜上，将电极与抛光膜保持垂直进行打磨；
1.2用去离子水清洗电极。然后再用0.05μm氧化铝抛光粉进行再一次打磨；去离子水清洗电极；
1.3将已抛光处理的电极浸在乙醇中短暂超声5s，然后再将电极浸入去离子水中，再将短暂超声5s将电极用去离子水清洗，空气中晾干待用；
1.4打磨抛光并清洗晾干的玻碳电极GCE浸入配制的浓度为9mmol/LHAuCl4溶液中；
1.5进行电沉积镀金，电压为-0.2V，时间为200s，得到镀金电极；
1.6将序列如SEQ ID NO.1所示CGGGHPHPHLSFMAIPPKK的多肽配制成10mmol/L的底物肽溶液；
1.7将镀金电极在6℃下通过浸润底物肽溶液20h；得到基础修饰电极；
1.8用去离子水清洗基础修饰电极，将13mmol/L的己硫醇封闭处理基础修饰电极
50min，洗净晾干得到酶活测定用的电化学传感器。
1.2用去离子水清洗电极。然后再用0.05μm氧化铝抛光粉进行再一次打磨；去离子水清洗电极；
1.3将已抛光处理的电极浸在乙醇中短暂超声5s，然后再将电极浸入去离子水中，再将短暂超声5s将电极用去离子水清洗，空气中晾干待用；
1.4打磨抛光并清洗晾干的玻碳电极GCE浸入配制的浓度为9mmol/LHAuCl4溶液中；
1.5进行电沉积镀金，电压为-0.2V，时间为200s，得到镀金电极；
1.6将序列如SEQ ID NO.1所示CGGGHPHPHLSFMAIPPKK的多肽配制成10mmol/L的底物肽溶液；
1.7将镀金电极在6℃下通过浸润底物肽溶液20h；得到基础修饰电极；
1.8用去离子水清洗基础修饰电极，将13mmol/L的己硫醇封闭处理基础修饰电极
50min，洗净晾干得到酶活测定用的电化学传感器。
[0033] 实施例4本实施例提供一种利用实施例2制备的酶活测定用的电化学传感器对待检样本的凝乳酶酶活进行检测，检测方法包括：
1.1用标准凝乳酶溶液配制成多个活性梯度的溶液；
1.2在37℃的温度条件下预热酶活测定用的电化学传感器4min；
1.3将电化学传感器置于配制好的标准凝乳酶溶液进行酶反应8min；
1.4清洗电化学传感器，将电化学传感器置于含有电流测定溶液为[Ru（NH3）5Cl]2+离子的溶液中，电流测定；初始电位0V，终止电位-0.5V；
1.5分别测定多个活性梯度的溶液的电流数据，并构建凝乳酶活性与电流的标准曲线;
1.6用待检凝乳酶样本按照步骤1.2-1.4的方法测定待检样本的电流值，并根据标准曲线计算得到待检样本的活性数据。
1.1用标准凝乳酶溶液配制成多个活性梯度的溶液；
1.2在37℃的温度条件下预热酶活测定用的电化学传感器4min；
1.3将电化学传感器置于配制好的标准凝乳酶溶液进行酶反应8min；
1.4清洗电化学传感器，将电化学传感器置于含有电流测定溶液为[Ru（NH3）5Cl]2+离子的溶液中，电流测定；初始电位0V，终止电位-0.5V；
1.5分别测定多个活性梯度的溶液的电流数据，并构建凝乳酶活性与电流的标准曲线;
1.6用待检凝乳酶样本按照步骤1.2-1.4的方法测定待检样本的电流值，并根据标准曲线计算得到待检样本的活性数据。
[0034] 实施例5本实施例提供一种利用实施例2制备的酶活测定用的电化学传感器对待检样本的凝乳酶酶活进行检测，检测方法包括：
1.1用标准凝乳酶溶液配制成多个活性梯度的溶液；
1.2在37℃的温度条件下预热酶活测定用的电化学传感器7min；
1.3将电化学传感器置于配制好的标准凝乳酶溶液进行酶反应13min；
1.4清洗电化学传感器，将电化学传感器置于含有电流测定溶液为[Ru（NH3）5Cl]2+离子的溶液中，电流测定；初始电位0V，终止电位-0.5V；
1.5分别测定多个活性梯度的溶液的电流数据，并构建凝乳酶活性与电流的标准曲线;
1.6用待检凝乳酶样本按照步骤1.2-1.4的方法测定待检样本的电流值，并根据标准曲线计算得到待检样本的活性数据。
1.1用标准凝乳酶溶液配制成多个活性梯度的溶液；
1.2在37℃的温度条件下预热酶活测定用的电化学传感器7min；
1.3将电化学传感器置于配制好的标准凝乳酶溶液进行酶反应13min；
1.4清洗电化学传感器，将电化学传感器置于含有电流测定溶液为[Ru（NH3）5Cl]2+离子的溶液中，电流测定；初始电位0V，终止电位-0.5V；
1.5分别测定多个活性梯度的溶液的电流数据，并构建凝乳酶活性与电流的标准曲线;
1.6用待检凝乳酶样本按照步骤1.2-1.4的方法测定待检样本的电流值，并根据标准曲线计算得到待检样本的活性数据。
[0035] 实施例6本实施例提供一种利用实施例2制备的酶活测定用的电极对待检样本的凝乳酶酶活进行检测，检测方法包括：
1.1用标准凝乳酶溶液配制成多个活性梯度的溶液；
1.2在37℃的温度条件下预热酶活测定用的电化学传感器5min；
1.3将电化学传感器置于配制好的标准凝乳酶溶液进行酶反应10min；
1.4清洗电化学传感器，将电化学传感器置于含有电流测定溶液为[Ru（NH3）5Cl]2+离子的溶液中，电流测定；初始电位0V，终止电位-0.5V；
1.5分别测定多个活性梯度的溶液的电流数据，并构建凝乳酶活性与电流的标准曲线;
1.6用待检凝乳酶样本按照步骤1.2-1.4的方法测定待检样本的电流值，并根据标准曲线计算得到待检样本的活性数据。
1.1用标准凝乳酶溶液配制成多个活性梯度的溶液；
1.2在37℃的温度条件下预热酶活测定用的电化学传感器5min；
1.3将电化学传感器置于配制好的标准凝乳酶溶液进行酶反应10min；
1.4清洗电化学传感器，将电化学传感器置于含有电流测定溶液为[Ru（NH3）5Cl]2+离子的溶液中，电流测定；初始电位0V，终止电位-0.5V；
1.5分别测定多个活性梯度的溶液的电流数据，并构建凝乳酶活性与电流的标准曲线;
1.6用待检凝乳酶样本按照步骤1.2-1.4的方法测定待检样本的电流值，并根据标准曲线计算得到待检样本的活性数据。
[0036] 实验例1本实验例对电极进行表征，对可行性以及稳定性进行检测。
[0037] 分别测定电极的阻抗图谱和循环伏安CV曲线，均在阻抗溶液中进行检测，阻抗溶液：用0.1 M KCl配制 1 mM [Fe(CN)6]3−/4−。
[0038] 按照实施例2中方法分别制备裸电极GCE，镀金电极Au/GCE，基础修饰电极Pep/Au/GCE和酶活测定用的电化学传感器HT/Pep/Au/GCE；然后在电化学传感器HT/Pep/Au/GCE上滴加10μL 25U/mL的凝乳酶溶液，置于37℃反应10min后，用去离子水清洗三次（轻柔处理）制得电极Chy/HT/Pep/Au/GCE。
[0039] 采用扫描电镜SEM，原子力显微镜AFM，对电极GCE、Au/GCE、Pep/Au/GCE、HT/Pep/Au/GCE、Chy/HT/Pep/Au/GCE表面进行形貌表征。采用阻抗图谱EIS及循环伏安CV曲线来反映各电极表面负载物质变化情况。
[0040] 实验结果如图1所示，SEM图像显示，裸电极GCE表面光滑（图1A），表明电极表面已处理干净；镀金电极Au/GCE表面负载了一层大小基本均匀的金纳米颗粒（图1A）；电极Pep/Au/GCE表面出现了部分隆起小颗粒物质（图1B），说明底物肽已成功负载在电极表面；与电极Pep/Au/GCE相比，可以明显看出电极HT/Pep/Au/GCE表面隆起颗粒外的部分被一层细密的物质掩盖（图1C），说明封闭剂HT有很好进行非特异性位点的封闭；在进行酶切后发现电极Chy/HT/Pep/Au/GCE表面隆起的颗粒状物质形态发生明显变化，且隆起颗粒变小（图1D），说明底物肽被酶切后游离出的肽被去离子水清洗掉。
[0041] AFM图像显示，在无酶处理的情况下，Pep/Au/GCE电极表面出现了较大颗粒状的隆起（图1E），在进行酶处理后，Chy/HT/Pep/Au/GCE电极表面隆起颗粒变化，且颗粒间间距变小（图1F）。这与SEM图像结果一致。
[0042] EIS结果显示，在镀金后，电化学传感器的阻抗比裸电极小(图2A），是因为电化学传感器表面的金纳米粒子具有良好的导电性能，对应的电流也就会增加，如CV图像结果显示，与GCE电流相比，Au/GC电流明显增加（图2B)。随后，随着电极表面负载的物质越多，电极的阻抗也就随之增加，电流随之减小。在进行酶切后，电化学传感器阻抗减小，电流增大。该实验结果与SEM及AFM图像所显示的各电极表面形态变化结果基本一致。
[0043] 以去离子水或无菌水作为对照组进行可行性的检测。按实施例2进行两组电化学传感器的构建，电化学传感器先于37℃预热5min后，迅速向其中一组电极表面滴加10μL的去离子水，另一组则滴加10μL 25U/mL的凝乳酶溶液。将两组电化学传感器同时置于37℃反应10min，然后用去离子水清洗三次（轻柔）。然后在25mL 10mM [Ru(NH3)5Cl]2+中用DPV进行电信号的检测，参数设置：初始电位0V，终止电位-0.5V，调幅0.05V，脉宽0.05s。
[0044] 凝乳蛋白酶作用时间的探索，将电化学传感器置于37℃预热5min，加入同浓度（25U/mL）的凝乳酶，再将电极置于37℃，反应时间依次为0min，2min，5min，10min，15min，25min，30min。反应完成后用去离子水清洗三次（轻柔）。然后在25mL 10mM [Ru(NH3)5Cl]2+中用DPV进行电信号的检测，参数设置：初始电位0V，终止电位-0.5V，调幅0.05V，脉宽
0.05s。
0.05s。
[0045] 凝乳酶活性标准曲线的建立，根据实施例6提供的方法，凝乳酶稀释成不同浓度（0，2.5，5，10，15，20，25 U/mL）进行标准曲线的测定，分别测定电流值。
[0046] 与对照组的DPV峰电流值相比，实验组的峰电流值变化明显（图2C）,证明该电化学传感器是构建成功的，并且能成功用于凝乳酶的检测。
[0047] 实验结果显示（图2D），DPV峰电流值随着反应时间的延长而增大，优选为8-13min，更优选地，到达10min后保持恒定。故选取10min为最佳酶促反应时间。
[0048] DPV的峰电流值随着凝乳酶活性的增加而增大（图2E），在检测范围内（2.5-25U/mL），电流值与凝乳酶浓度成良好的线性关系： I (μA) = 4.45 C(U/mL) − 2.39 (R2 = 0.994)（结果如图2F所示），检出限 LOD =0.8 U/mL (S/N=3)。
[0049] 实验例2本实施例对实施例2制备的电化学传感器进行特异性、稳定性、和重复性进行检测。
[0050] 以去离子水或无菌水作为对照组进行可行性的检测。分别测定凝乳酶Chy，凝乳酶和胰凝乳酶的混合物（Chy+Chm），凝乳酶和凝血酶的混合物（Chy+Thr），凝乳酶和脂肪酶的混合物（Chy+Lip），凝乳酶和溶菌酶的混合物（Chy+Lys），凝乳酶和胰蛋白酶的混合物（Chy+Try），凝乳酶和木瓜蛋白酶的混合物（Chy+Pap）的电流值，电极先于37℃预热5min后，迅速向电化学传感器滴加样本。将电化学传感器置于37℃反应10min，然后用去离子水清洗三次（轻柔）。然后在25mL 10mM [Ru(NH3)5Cl]2+中用DPV进行电信号的检测，参数设置：初始电位0V，终止电位-0.5V，调幅0.05V，脉宽0.05s。待测物浓度均为300μg/mL。
[0051] 实验结果如图3所示，其余样本与凝乳酶的峰电流值相比几乎可以忽略不计，而混合物与凝乳酶的峰电流值相比几乎无差别，对凝乳酶的反应基本无明显影响，说明该传感器具有很好的特异性。
[0052] 将构建好的电化学传感器于4℃环境下放置20天以上，取出后按正常检测凝乳酶的方法进行DPV电信号检测。结果如图4所示，其峰电流值基本可以达到20天前检测到的电信号的97.6%，显示良好的稳定性。
[0053] 同时准备六支以上电极，按步骤进行凝乳酶（同一浓度）的DPV电信号检测。结果如图5所示，发现这六支以上的电极的峰电流值几乎保持在同一水平，基本无变化，说明该传感器具有很好的重复性。
[0054] 实验例3将10μL已知标准活性的商业凝乳酶样品用该传感器进行检测。结果如表所示。
[0055] 表 1 市售凝乳酶活性检测实际样品 传统检测法/U mL-1* 本发明法/U mL-1 回收率 /% 相对标准偏差 /%
1 51.24 47.38 92.47 3.4
2 64.82 63.12 97.38 4.1
3 55.08 58.56 106.32 5.3
4 70.13 65.37 93.21 4.7
5 48.33 50.71 104.92 2.2
6 58.75 55.92 95.18 4.5
*注：市售凝乳酶活性测定方法：贝里奇法（Berridge’s assay；Berridge, Analyst.
1952, 77, 57b-62b）
如表1所示，通过本实验提供的电化学传感器和凝乳酶酶活测定方法，得到96.3%至
104.6%的回收率，相对标准偏差为1.1%至4.6%。说明该传感器在奶酪制作或凝乳酶检测中具有一定的潜在应用价值。
1 51.24 47.38 92.47 3.4
2 64.82 63.12 97.38 4.1
3 55.08 58.56 106.32 5.3
4 70.13 65.37 93.21 4.7
5 48.33 50.71 104.92 2.2
6 58.75 55.92 95.18 4.5
*注：市售凝乳酶活性测定方法：贝里奇法（Berridge’s assay；Berridge, Analyst.
1952, 77, 57b-62b）
如表1所示，通过本实验提供的电化学传感器和凝乳酶酶活测定方法，得到96.3%至
104.6%的回收率，相对标准偏差为1.1%至4.6%。说明该传感器在奶酪制作或凝乳酶检测中具有一定的潜在应用价值。
[0056] 以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
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