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用于转化 植物的改良的培养基组合物、选择方法和农杆菌菌株

阅读：671发布：2024-01-05

专利汇可以提供用于转化植物的改良的培养基组合物、选择方法和农杆菌菌株专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及通过农杆菌介导的体细胞胚性愈伤组织或胚性悬浮培养物的转化以及使所转化的细胞再生为结实植物来生产转基因植物的领域。具体地，本发明涉及产生大戟科(Euphorbiaceae)转基因植物。本发明还涉及培养基组合物、选择方法和改造的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株，其改善了农杆菌介导的转化效率。，下面是用于转化植物的改良的培养基组合物、选择方法和农杆菌菌株专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于转化麻风树属(Jatropha)植物的方法，其包括步骤：
a)在固体培养基上或液体培养基中建立和维持胚性愈伤组织细胞，其中所述培养基包括不含NH4NO3的MS盐、MS维生素、碳水化合物源、聚乙二醇(PEG)，生长素、谷氨酰胺和天冬酰胺，其中所述碳水化合物源是量为10g/l至30g/l的蔗糖，所述PEG的量为10g/l至80g/l，所述生长素是量为0.01mg/l至2mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，所述谷氨酰胺的量为0.1g/l至1g/l，所述天冬酰胺的量为0.1g/l至1g/l；
b)将所述细胞与携带含有感兴趣的多核苷酸的感兴趣的T-DNA载体的农杆菌培养物在共培养培养基中共培养以产生转化的细胞，所述转化的细胞具有稳定地整合入它们基因组的感兴趣的多核苷酸，其中所述共培养培养基包含农杆菌MinAB盐、维生素B5和NADPH氧化酶抑制剂，其中所述NADPH氧化酶抑制剂是量为1μM至10μM的二亚苯基碘(DPI)，并且其中所述农杆菌是AGL1、以保藏名称PTA-10447保藏于美国典型培养物保藏中心的AGL2、或以保藏名称PTA-10448保藏于美国典型培养物保藏中心的AGL3；
c)在选择培养基上选择所述转化的细胞，所述选择培养基包含Gamborg B5矿物盐、维生素B5、选择剂、抑制农杆菌生长的化合物、碳水化合物源和生长素，其中所述碳水化合物源是量为10g/l至30g/l的蔗糖，所述生长素是量为0.1mg/l至10mg/l的2,4-D；
d)在发育培养基上使所选择的转化的细胞发育成转基因体细胞胚，所述发育培养基包括不含NH4NO3的MS盐、维生素B5、选择剂、抑制农杆菌生长的化合物、1g/l的谷氨酰胺、
0.5g/l的天冬酰胺、碳水化合物源和植物凝胶，所述碳水化合物源是30g/l的蔗糖；
e)在成熟培养基上使所述转基因体细胞胚成熟，所述成熟培养基包括不含NH4NO3的MS盐、维生素B5、选择剂、抑制农杆菌生长的化合物、1g/l的谷氨酰胺、0.5g/l的天冬酰胺、
0.1g/l的酪蛋白水解物、碳水化合物源和植物凝胶，所述碳水化合物源是20g/l的蔗糖和
20g/l的麦芽糖；
f)在萌发培养基上使所述体细胞胚萌发成小植株，所述萌发培养基包含MS盐、MS维生素、0.1g/l的酪蛋白水解物、碳水化合物源、琼脂和2.0mg/l的赤霉酸(GA3)，所述碳水化合物源是20g/l的蔗糖；和
g)将所述小植株转移入土壤以进一步发育成开花植物。
2.权利要求1的方法，其中所述PEG为PEG 8000。
3.权利要求1或2的方法，其中所述共培养培养基还包含毒力诱导剂。
4.权利要求3的方法，其中所述毒力诱导剂是乙酰丁香酮。
5.权利要求4的方法，其中所述共培养培养基含有量为5μM至200μM的乙酰丁香酮。
6.权利要求1或2的方法，其中所述共培养培养基还包含组氨酸。
7.权利要求3的方法，其中所述共培养培养基还包含组氨酸。
8.权利要求4的方法，其中所述共培养培养基还包含组氨酸。
9.权利要求1的方法，其中在多孔支持物进行共培养。
10.权利要求9的方法，其中所述多孔支持物是膜或滤纸。
11.权利要求9或10的方法，其中所述多孔支持物覆盖于液体或固体培养基上。
12.权利要求1的方法，其中在含有植物凝胶的固体培养基上进行选择。
13.权利要求12的方法，其中所述固体培养基含有包埋在所述固体培养基中的共培养的细胞。
14.权利要求1的方法，其中在含有低熔点琼脂糖的固体培养基上进行选择。
15.权利要求1的方法，其中所述抑制农杆菌生长的化合物为头孢噻肟。
16.权利要求1的方法，其中生长素的量为2mg/l。
17.权利要求1的方法，其中所述选择在液体培养基中进行一段足够长的时间以产生鱼雷期或子叶期体细胞胚。
18.权利要求17的方法，其中所述选择包括传代，并且在选择培养基中降低蔗糖水平进行所述传代步骤。
19.权利要求18的方法，其中所述选择在小生长容器中进行。
20.权利要求19的方法，其中所述小生长容器是多孔平板。
21.权利要求1的方法，其中DPI的量为1μM至5μM。

说明书全文

用于转化 植物的改良的培养基组合物、选择方法和农杆菌

菌株

[0001] 发明背景

[0002] 本发明涉及通过农杆菌介导的体细胞胚性愈伤组织或胚性悬浮培养物的转化以及使所转化的细胞再生为结实植物来生产转基因植物的领域。具体地，本发明涉及产生大戟科(Euphorbiaceae)转基因植物。本发明还涉及培养基组合物、选择方法和改造的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株，其改善了农杆菌介导的转化效率。

[0003] 用于说明本发明的背景或提供关于实践的额外细节的出版物和其它材料通过引用并入本文，并且为了方便分别在参考文献中分组。

[0004] 全世界正面临着日益减少的化石燃料供应和日益加剧的温室效应。对可再生能源的生产和消费的提高存在着迫切的需求。在寻找替代来源以满足他们的能源安全需要并同时帮助减少引起温室效应的二氧化碳排放时，生物燃料已被许多国家公认为是国家优先考虑的事情。对生物燃料的需求已经对食物生产造成了增加的压力。例如，为了满足德国政府授权的德国对生物燃料的需求，在2017年这个国家的全部耕地将不得不用于种植生物能源作物而没有留下土地用于食物生产。为了缓解这种对土地的竞争并且满足我们对可再生燃料的需求，对利用贫瘠土地生产生物能源存在强烈的需求。

[0005] 大戟科包括有价值的树种，例如橡胶树(Hevea brasiliensis)和麻风树(Jatropha curcas)和蓖麻(Ricinus communis)。若干麻风树独有的特性使其成为用于生产生物柴油的理想植物。这些特性包括生长于贫瘠土地的能力；对水的需求低；非食品作物状态；与棕榈相比(超过3.5年)，在种植后0.5-2年可快速产油。因此，印度尼西亚政府已宣布他们决定在未来五年内将提供约300万公顷土地用于种植麻风树。许多其它亚洲国家正在采用同样大胆的计划。在不同国家中，印度在建立麻风树种植园方面是最先进的。然而，印度麻风树种植园的种子产量低，范围为0.4-12公吨/公顷(与棕榈果实约19公吨/公顷相比)。同样，报告的核油(kernel oil)含量差异很大，从40.4-85.3%(Sun，W.B.，国际麻风树大会，2008，新加坡)。蓖麻油是润滑剂的重要来源并且还是未来生物柴油潜在的来源。

[0006] 这种差异至少部分归因于对麻风树育种和农场管理缺乏研究。基因工程被认为是作物改良的快速方法。植物转化基本上为两个步骤的过程，即将基因传递入宿主细胞，随后将转化的细胞再生成为植物。体细胞胚性愈伤组织或体细胞胚性悬浮培养物通常被认为是最有效的再生方法，由于大多数转化的细胞已获得成胚潜力，其将很自发地驱使它们发育成体细胞胚。已经公开了用于起始麻风树体细胞胚和维持胚性悬浮培养物的有效方法(国际专利申请号PCT/SG2009/000015；美国临时专利：61/025,430)。

[0007] 植物转化方法可宽泛地分类为2组：DNA直接转移(例如电穿孔和颗粒轰击)和农杆菌介导的转化。至今，后者已成为转化许多植物所选择的方法。事实上，大多数可商购的转基因棉花和油菜品种源自此方法(Cerdeira和Duke，2006；Dunwell，2000)。之前在玉米(Dunwell，1999；Vega等人，2008；Wang和Frame，2009)、稻(Christou，1997；Hayashimoto等人，1990；Lee等人，1991；Zhang等人，1997)和大豆(Christou等人，1988；Christou等人，1987；Olhoft等人，2003)中的工作显示了将外来DNA引入作物植物的不同方法的实例。转基因植物可在农杆菌介导的转化后获得。这种方法特征在于低频率的转基因产生和形成嵌合体(Gould等人，1991)。转基因植物还可在农杆菌介导的未成熟胚的转化后获得。由于未成熟胚的愈伤组织诱导和植物再生频率通常很高，至今未成熟胚一直是最优选的外植体。转化后，不论DNA传递的方法如何，未成熟胚非常难于再生出可育的植物(Cheng等人，
1991)。。另外，在整年内获得未成熟胚通常很困难，并且它们适合于培养的阶段还严格依赖于时间，因此限制了其应用。尽管用未成熟胚转化的频率范围为约0.14%至约4.3%，收回的转基因的数目仍是转化胚数目的一小部分。体细胞胚适合于通过根癌农杆菌和颗粒轰击转化。体细胞胚性愈伤组织可以方便地作为液体培养物维持并且快速扩增以生产克隆群体。
因此，一旦建立了优良品种的体细胞胚性培养物，将为开发出聚合有转基因性状的遗传学纯系节省多年的时间。

[0008] 许多不同的外植体可以与携带有T-DNA载体的农杆菌菌株共培养来产生转基因细胞，所述转基因细胞可以通过体细胞胚发生或器官发生途径再生成正常植物。对麻风树再生和转化的研究一直非常有限。

[0009] Jha等人(2007)报告了使用叶组织产生麻风树体细胞胚。Li等人(2008)报告了将叶盘与农杆菌共培养转化麻风树并通过器官发生途径再生。然而，在麻风树研究领域中两种方法都是不容易重复的(Z.Mao等人，Temasek Life Science Laboratories，新加坡，私人通信；A.Suwanto，Bogor Agricultural University，印度尼西亚；私人通信)。

[0010] Mao等人(美国临时专利申请号61/122,454)公开了通过农杆菌介导的叶外植体转化和通过体细胞胚发生途径再生来产生转基因麻风树植物。该发明还使用嫁接技术克服转基因小植株生根困难。

[0011] 国际公开号WO 2008/012832公开了体外繁殖麻风树的有效方法，其通过叶盘直接再生，没有任何中间愈伤组织阶段。没有报告过基于此再生方法的遗传转化。

[0012] 因此，仍有待开发用于转化麻风树的可靠和高效的方法。尤其欢迎将导致更短的再生时间、更高的转化率和高通量转化工作的改良。

[0013] T-DNA通过农杆菌细胞向植物宿主细胞的传递依赖于毒力基因的预诱导。已知在受伤的植物组织中天然产生的诱导剂包括多种酚类化合物，例如乙酰丁香酮、芥子酸(3,5-二甲基氧-4-羟基肉桂酸)、丁香酸(4-羟基-3,5-二甲基氧基苯甲酸)、阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)、儿茶酚(1,2-邻苯二酚)、对羟基苯甲酸(4-羟基苯甲酸)、β-雷琐酸(2,4-二羟基苯甲酸)、原儿茶酸(3,4-二羟基苯甲酸)、焦性没食子酸(2,3,4-三羟基苯甲酸)、没食子酸(3,4,5-三羟基苯甲酸)和香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)(美国专利号6,483,013)。

[0014] 已发现组成型表达的virG突变蛋白质(virGN54D)可提高农杆菌毒力和转化效率(Hansen等人，1994)。同样，添加毒力诱导剂，例如乙酰丁香酮或胭脂碱，提高了在固体培养基上繁殖的棉花茎尖(Veluthambi等人，1999)和体细胞胚性愈伤组织(美国专利号6,483,013)的转化效率。乙酰丁香酮是大量不能分泌农杆菌毒力诱导化合物的真菌转化所必不可少的(Bundock等人，1995；de Groot等人，1998)。

[0015] 美国专利号6,162,965和6,310,273公开了根癌农杆菌在与植物细胞，尤其是禾本科植物共培养期间会诱导细胞坏死。抑制坏死的化合物，例如，2,5-降冰片二烯、降冰片烯、硫代硫酸银、氨基乙氧基乙烯基甘氨酸、钴盐、乙酰水杨酸或水杨酸，可用于改善转化效率。类似地，在转化载体中可包含编码细胞死亡抑制子蛋白质(p53、iap或dad-1)的核苷酸序列以实现相同的目标。

[0016] 类似地，大豆子叶节外植体受伤和根癌农杆菌感染导致了组织中广泛的酶促褐变和细胞死亡。硫醇化合物，例如L-半胱氨酸、二硫苏糖醇(DTT)和硫代硫酸钠，通过抑制植物病原体和伤害应答的酶(例如过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO))的活性改善了T-DNA传递。观察到了硫醇化合物的加成效果。对大豆最有效的组合是1mM硫代硫酸钠+8.8mM L-半胱氨酸+1mM DTT(Olhoft等人，2003)。

[0017] 一氧化氮(NO)涉及防御反应，控制和消除它可能增加病原体例如在植物转化期间的农杆菌的感染(美国专利号7,388,126)。NO调节剂包括NG-单甲基-L-精氨酸、单乙酸盐(N-甲基-L-精氨酸，AcOH；L-NMMA)、NG-单甲基-L-高精氨酸、单乙酸盐(NMMHA，AcOH)、NG-单甲基-L-精氨酸、二-p-羟基偶氮苯-p′-磺酸盐(N-甲基-L-Arg，diHABS；L-NMMA)和回转(clinorotation)。

[0018] 细胞质膜NADPH氧化酶的活化与植物和微生物不相容的相互作用相关，导致产生超氧化物，其可由超氧化物歧化酶转化为H2O2。二亚苯基碘可以有效地抑制NADPH氧化酶(Sagi和Fluhr，2001)。至今，没有证据表明NADPH氧化酶在相容性植物-微生物相互作用中，例如在转化过程期间的麻风树-农杆菌相互作用中起任何作用。也不存在任何关于使用NADPH氧化酶抑制剂，例如二亚苯基碘，来改善农杆菌介导的转化效率的报告。

[0019] 过度生长的农杆菌会危及转化后的植物细胞的存活，并且还对T-DNA转移过程具有影响。感兴趣的基因向植物细胞中的多拷贝插入受到T-DNA转移入细胞的频率的影响。农杆菌介导的转化方案力求实现有限拷贝数目的DNA进入任一细胞中的转化事件。多重插入的存在可以导致基因沉默或降低转化基因的表达水平，其由若干机制引起，包括多重拷贝之间的重组。

[0020] 国际公开号WO 2001/09302和美国专利申请公开2003/0204875公开了在转化过程中控制农杆菌的生长以改善转化效率。根据所述公开，在将农杆菌接种于可转化的植物细胞并与其共培养期间使用抑制剂会在若干植物系统中导致提高的转化效率和所引入的遗传组分的低拷贝数目。优选的生长抑制剂是含有重金属的化合物例如硝酸银或硫代硫酸银、抗生素例如羧苄西林、抗生素和克拉维酸的组合例如安美汀或特美汀。

[0021] 美国专利号6,323,396要求了产生转基因双子叶植物的方法的权利，该方法在不存在对营养缺陷型农杆菌菌株具有杀菌或抑菌效果的化合物下，通过用营养缺陷型农杆菌菌株系统地感染外植体组织、原生质体或小孢子体并在植物再生培养基上再生。农杆菌菌株为LBA4404metHV(LMGP-18486)或ATHV ade，his，(LMG P-18485)。国际公开号WO/2005/103271公开了用于农杆菌介导的胚性悬浮培养物转化的改良方法，其通过使用用于胚性细胞共培养的固体支持物和一套用于共培养和选择转化体的培养基来实现。所述方法尤其适合于转化棉花胚性愈伤组织。

[0022] 发明概述

[0023] 本发明涉及通过农杆菌介导的体细胞胚性愈伤组织或胚性悬浮培养的转化，并将转化的细胞再生成结实植物以产生转基因植物的领域。具体地，本发明涉及产生大戟科(Euphorbiaceae)转基因植物。本发明还涉及培养基组合物、选择方法和改造的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株，其改善了农杆菌介导的转化效率。

[0024] 具体地，本发明涉及用于制备体细胞胚性愈伤组织的方法，所述组织对经由农杆菌细胞的T-DNA接合是高度易感的；用于农杆菌介导的转化和细胞系维持的培养基组合物和共培养条件；用于选择转基因细胞(其由于农杆菌细胞的过度生长和抗生素抗性而倾向于被农杆菌杀死)和将转化的细胞再生成结实植物的方法。

[0025] 因此，第一方面，本发明提供了用于转化大戟科植物的方法。该方法包括步骤：

[0026] (a)建立和维持胚性愈伤组织细胞；

[0027] (b)将所述细胞与携带含有感兴趣的多核苷酸的感兴趣的T-DNA载体的农杆菌培养物在共培养培养基中共培养以产生转化的细胞，所述转化的细胞具有稳定地整合入它们的基因组的感兴趣的多核苷酸；

[0028] (c)在选择培养基上选择所述转化的细胞；

[0029] (d)在发育培养基上使所选择的转化的细胞发育成转基因体细胞胚；

[0030] (e)在成熟培养基上使所述转基因体细胞胚成熟；

[0031] (f)在萌发培养基上将体细胞胚萌发成小植株；和

[0032] (g)将所述小植株转移至土壤以进一步发育成开花植物。

[0033] 在一个实施方案中，本发明涉及用于制备体细胞胚性愈伤组织的方法，所述组织对经由农杆菌细胞的T-DNA接合是高度易感的。在一个实施方案中，所述胚性愈伤组织源自体细胞胚。在另一个实施方案中，所述胚性愈伤组织源自合子胚。在一个实施方案中，通过将部分细胞群转移入合适容器中的约20ml至约100ml的液体培养基中来定期(优选约每周)传代愈伤组织。优选将传代约2天至约7天后的新鲜传代愈伤组织用于转化。在一个实施方案中，优选的液体培养基包含修改的MS盐(不含NH4NO3的MS盐)、MS维生素、约10g/l至约30g/l蔗糖、约10g/l至约80g/l聚乙二醇(PEG)8000、约0.01mg/l至约2mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、约0.1g/l至约1g/l的谷氨酰胺和约0.1g/l至约1g/l的天冬酰胺。另外，可使用含有所述培养基组分的固体化的培养基或滤器支持的培养基来繁殖胚性愈伤组织。

[0034] 在另一个实施方案中，本发明涉及用于将T-DNA高效传递入胚性愈伤组织的培养基组合物。在一个实施方案中，培养基含有NADPH氧化酶抑制剂，例如二亚苯基碘(DPI)，约1μM至约50μM。在一个实施方案中，培养基优选添加有农杆菌毒力诱导剂，例如乙酰丁香酮(AS)，约5μM至约500μM。在另一个实施方案中，培养基含有农杆菌MinAB盐(Chilton等人，1974)。在另外的实施方案中，培养基含有低浓度的葡萄糖，约5mM至约50mM。在另外的实施方案中，培养基含有甘油，约0.1%至约2%。在另外的实施方案中，培养基任选地含有支持农杆菌细胞正常生长的化合物，例如组氨酸。

[0035] 在另一个实施方案中，本发明涉及优选的农杆菌菌株(AGL2)的用途。根据此实施方案，所述农杆菌菌株含有组成型活性virA基因。在一个实施方案中，所述菌株的毒力活化不需要化学诱导剂。在另一个实施方案中，所述virA基因整合入基因组或Ti质粒中以提高稳定性。在另外的实施方案中，所述virA基因源自超毒力菌株。在另外的实施方案中，所述virA基因源自AGL1。在一个实施方案中，所述菌株不含有野生型virA等位基因。在另一个实施方案中，所述菌株的使用改善转化效率。

[0036] 在另一个实施方案中，本发明涉及优选的农杆菌菌株(AGL3)的用途。在一个实施方案中，所述菌株还含有抑制农杆菌细胞在选择培养基上生长的突变。在另一个实施方案中，所述菌株含有影响氨基酸利用的突变，其优选不影响谷氨酰胺或天冬酰胺的利用。在另外的实施方案中，所述突变发生在具有组成型活性virA等位基因的背景下。在另一个实施方案中，所述菌株的使用改善转化效率。

[0037] 在另一个实施方案中，本发明涉及使用培养基覆盖(medium-over-lay)技术选择转化体。在一个实施方案中，所述技术改善了对农杆菌过度生长的控制。在另一个实施方案中，所述培养基含有抑制农杆菌细胞生长的化合物。在另外的实施方案中，所述培养基还含有抑制未转化的植物细胞生长的选择剂。

[0038] 在另一个实施方案中，本发明涉及用于选择转化的细胞和将所述转化的细胞再生成正常植物的改良方法。在一个实施方案中，所述方法包含液体阶段。在另一个实施方案中，所述液体阶段缩短了再生时间。在另外的实施方案中，在与农杆菌菌株共培养后立即或短时间内进入液体阶段。在另外的实施方案中，优选不能利用至少一种氨基酸的菌株。在另一个实施方案中，液体培养基含有农杆菌生长的抑制剂例如头孢噻肟、羧苄西林、特美汀等等，和用于转化的植物细胞的选择剂例如植物活性抗生素或除草剂。

[0039] 附图概述

[0040] 图1显示了用AGL2(pC305.1)转化的悬浮培养物。用x-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸)染色共培养2个月后的胚。

[0041] 图2显示了与AGL2(pCambia1305.1)或AGL3(pCambia1305.1)共培养的胚性愈伤组织。在共培养阶段之前或过程中，所有的培养基中均添加0.3mg/l的组氨酸。将充分洗涤后的愈伤组织以小块转移至添加有7mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的固体Bd2培养基上并且在相同的条件下培养。在选择培养基上第一次培养4周后给平皿拍照。

[0042] 图3显示了在如实施例2中描述的含有(200μM)AS或不含AS的培养基上与AGL1(pCambia1305.1bar)或AGL2(pCambia1305.1bar)共培养53小时的胚性愈伤组织。立即用X-gluc染色愈伤组织并拍照。

[0043] 图4显示了来自4个不同细胞系的体细胞胚性愈伤组织，其与AGL2(pCambia1305.1)共培养并且通过将愈伤组织包埋入LMP Bd2培养基进行选择。共培养培养基JIM2添加有1μM二亚苯基碘(DPI)、5μM DPI或终浓度为1mM硫代硫酸钠、8.8mM L半胱氨酸和1mM二硫苏糖醇(DTT)的抗氧化剂混合物。2个月的选择后，记录潮霉素抗性的体细胞胚。在每个细胞系中，将源自与不含DPI的JIM2共培养的体细胞胚(CK)的数目设定为100，并通过将实际数目除以CK的数目计算其它共培养条件的体细胞胚的相对数目。结果源自四个细胞系的平均值，每个细胞系由6个选择性平皿组成。“AOC”指含1mM硫代硫酸钠、8.8mM L-半胱氨酸和1mM DTT的培养基。

[0044] 图5显示了在选择培养基上茁壮发育的体细胞胚(在共培养后选择约2个月)，并且移除小片叶组织并放置于填充有200μl含1mM X-gluc的磷酸缓冲液(50mM)的微孔板的孔中。真空渗入后，将组织在37℃孵育过夜并用70%乙醇使组织澄清。

[0045] 图6A-6C显示了共培养后4个月的潮霉素抗性小植株。图6A：如实施例2中描述地将体细胞胚性愈伤组织与AGL2(pCambia1305.1)共培养并将其包埋入LMP Bd2培养基进行选择。图6B：用X-gluc染色的图6A中的植物之一。图6C：共培养后7个月在土壤花盆中的转基因植物的实例。

[0046] 图7显示了具有正在发育的果实的开花期转基因植物的实例。

[0047] 图8显示了17株随机选择的转基因植物的Southern印迹分析。CK泳道为野生型麻风树植物的DNA。

[0048] 图9A-9C显示了麻风树体细胞胚性愈伤组织。图9A：将麻风树体细胞胚性愈伤组织与AGL3(pCambia1305.1)共培养2.5天并在含7mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的J20P培养基上选择2星期。在含减少的蔗糖(10g/l)的相似的培养基上另外传代2星期。图9B：在含7mg/l潮霉素和300mg/l头孢克肟的固体B2d培养基上对相同的共培养愈伤组织选择4个星期。图9C：包埋入LMP B2d培养基4个星期进行对相同的共培养愈伤组织的选择。

[0049] 发明详述

[0050] 本发明涉及通过农杆菌介导的体细胞胚性愈伤组织或胚性悬浮培养物的转化，并将转化的细胞再生成结实植物以产生转基因植物的领域。具体地，本发明涉及产生大戟科(Euphorbiaceae)转基因植物。本发明还涉及培养基组合物、选择方法和改造的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株，其改善了农杆菌介导的转化效率。

[0051] 因此，第一方面，本发明提供了用于转化大戟科植物的方法。该方法包括步骤：

[0052] (a)建立和传代胚性愈伤组织细胞；

[0053] (b)将新鲜传代的细胞与携带含有感兴趣的多核苷酸的感兴趣的T-DNA载体的农杆菌培养物在共培养培养基中共培养以生产转化的细胞，所述转化的细胞具有稳定地整合入它们基因组的感兴趣的多核苷酸；

[0054] (c)在选择培养基上选择所述转化的细胞；

[0055] (d)在发育培养基上将所选择的转化的细胞发育成转基因体细胞胚；

[0056] (e)在成熟培养基上使所述转基因体细胞胚成熟；

[0057] (f)在萌发培养基上使体细胞胚萌发成小植株；和

[0058] (g)将所述小植株转移至土壤以进一步发育成开花植物。

[0059] 在一个实施方案中，用于共培养的细胞源自大戟科。在另一个实施方案中，所述细胞源自麻风树属。在一个实施方案中，所述胚性愈伤组织源自体细胞胚。在一个实施方案中，所述胚性愈伤组织源自合子胚。在一个实施方案中，所述胚性愈伤组织源自体细胞胚性愈伤组织。在一个实施方案中，在固体培养基上培养这些细胞。在另一个实施方案中，在液体培养基中培养这些细胞。可以使用任何适合于维持细胞高胚发生性(embryogenecity)的培养基。据发现，包含修改的MS盐、MS维生素、诸如蔗糖的碳水化合物源、聚乙二醇(PEG)、诸如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的生长素、谷氨酰胺和天冬酰胺的培养基是尤其适合的。在一个实施方案中，包含修改的MS盐(不含NH4NO3的MS盐)、MS维生素、约10g/l至约30g/l的蔗糖、约10g/l至约80g/l的PEG 8000、约0.01mg/l至约2mg/l的2,4-D、约0.1g/l至约1g/l的谷氨酰胺和约0.1g/l至约1g/l的天冬酰胺的培养基是尤其适合的和优选的培养基。定期地(优选约每周)传代细胞。在一个实施方案中，在2000-3000lux光照，16/8昼/夜循环，26℃-30℃和50-100rpm温和摇晃的条件下培养细胞。

[0060] 在一个实施方案中，提供了用于制备体细胞胚性愈伤组织的方法，所述组织对经由农杆菌细胞的T-DNA接合是高度感易感的。在一个实施方案中，通过将部分细胞群转移入合适的容器中的约20ml至约100ml的液体培养基中来定期(优选约每周)传代胚性愈伤组织。或者，含有培养基组分的固体化的培养基或滤器支持的培养基可用做细胞培养基。优选新鲜传代(传代后约2天至约7天)的愈伤组织用于转化。

[0061] 在另一个实施方案中，本发明涉及用于高效地将T-DNA传递入胚性愈伤组织的共培养培养基组合物。在一个实施方案中，所述培养基为可促进农杆菌细胞毒力诱导的培养基，例如包含农杆菌MinAB盐的培养基(Chilton等人，1974)。在一个实施方案中，所述培养基还含有维生素，例如维生素B5。在另一个实施方案中，培养基还含有NADPH氧化酶抑制剂，例如二亚苯基碘(DPI)，约1μM至约50μM。使用NADPH氧化酶抑制剂导致改善的植物转化效率。在一个实施方案中，培养基优选添加有农杆菌毒力诱导剂，例如乙酰丁香酮(AS)，约5μM至约500μM。其它已知的诱导剂包括芥子酸(3,5-二甲基氧-4-羟基肉桂酸)、丁香酸(4-羟基-3,5-二甲基氧基苯甲酸)、阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)、儿茶酚(1,2-邻苯二酚)、对羟基苯甲酸(4-羟基苯甲酸)、β-雷琐酸(2,4-二羟基苯甲酸)、原儿茶酸(3,4-二羟基苯甲酸)、焦性没食子酸(2,3,4-三羟基苯甲酸)、没食子酸(3,4,5-三羟基苯甲酸)和香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)。在另外的实施方案中，培养基任选地含有支持农杆菌细胞正常生长的化合物，例如组氨酸。在一个实施方案中，培养基含有低浓度的葡萄糖，约5mM至约50mM。在另外的实施方案中，培养基含有甘油，约0.1%至约2%，以及缓冲剂，例如2-[N-吗啉]乙磺酸(MES)，约1mM至约20mM并调整至约pH 5.7。

[0062] 在一个实施方案中，在共培养步骤使用预先诱导的农杆菌。在另一个实施方案中，所述农杆菌为超毒力菌株，例如农杆菌菌株AGL1。在另外的实施方案中，所述农杆菌含有突变的virA蛋白，其不需添加诱导剂即获得毒力。在一个实施方案中，所述含有突变的virA蛋白的农杆菌为农杆菌菌株AGL2。在另一个实施方案中，所述农杆菌为营养缺陷型菌株，例如农杆菌菌株AGL3。在一个实施方案中，所述营养缺陷型菌株为非谷氨酰胺和天冬酰胺缺陷型。

[0063] 将具有高体细胞胚发生潜力的细胞与携带含有感兴趣的多核苷酸的T-DNA载体的农杆菌共培养以产生转化的细胞，其具有稳定地整合入它们的基因组中的感兴趣的多核苷酸。通常所述农杆菌还含有可选择标记基因，例如本文所描述的。在一个实施方案中，在固体培养基上进行共培养。在另一个实施方案中，优选在多孔的支持物上进行共培养，例如多孔的膜或滤纸。所述多孔支持物可浸泡于液体培养基中、可覆盖于固体培养基上或可覆盖于液体培养基上。在约1000lux持续光照，24℃-25℃的环境下共培养2-4天。

[0064] 通过在选择培养基上培养来选择转化的细胞。在一个实施方案中，在固体培养基上进行选择。在优选的实施方案中，通过将共培养的植物细胞包埋入固体培养基来进行选择。在另一个优选的实施方案中，在液体培养基中进行选择。任何合适的培养基可用于选择转化的细胞。在一个实施方案中，选择培养基包含Gamborg B5盐和维生素B5。选择培养基还包含例如蔗糖的碳水化合物源、例如2,4-D的生长素。在一个实施方案中，所述培养基包含Gamborg B5盐和维生素B5，约10g/l至约30g/l蔗糖，和约0.1mg/l至约10mg/l的2,4-D，优选约2mg/l的2,4-D。可使用一般的固化剂例如植物凝胶、琼脂和低熔点(LMP)琼脂糖来固化培养基。选择培养基还包含用于选择转化细胞的化合物(选择剂)，其依赖于包含在农杆菌中的可选择标记基因。可使用的化合物的实例包括植物活性抗生素或除草剂。
选择培养基还优选含有抑制农杆菌细胞生长的化合物。这样的化合物为本领域公知的并包括头孢噻肟、羧苄西林和特美汀。

[0065] 在一个实施方案中，在温度25℃-30℃(优选约26℃)和每天16小时光照并在一36W(约2000lux)的暖光灯管的条件下进行对转化的细胞的选择。每2-3周可在同样的新鲜培养基中进行传代。将选择剂抗性的愈伤组织转移至无激素的、添加有谷氨酰胺和天冬酰胺并另外添加有选择剂(例如潮霉素)、农杆菌抑制性化合物(例如头孢噻肟)的培养基上。这样的培养基的实例为本文中描述的DGA培养基，其含有无NH4NO3的MS盐、Gamborg B5维生素、30g/l的蔗糖、2.4g/l植物凝胶、1g/l谷氨酰胺、0.5g/l天冬酰胺，pH 5.8。一旦绿色子叶期胚产生，可将它们转移至胚成熟培养基上2-4周。适当的胚成熟培养基的实例为本文描述的M9-2培养基，其含有无NH4NO3的MS盐、Gamborg B5维生素、20g/l蔗糖、
20g/l麦芽糖、1g/l谷氨酰胺、0.5g/l天冬酰胺、2.4g/l植物凝胶、0.1g/l酪蛋白水解物，pH5.8，并且添加有选择剂和农杆菌抑制剂。完全发育的胚的萌发是本领域公知的。适当的萌发培养基的实例为本文描述的G35-2培养基，其含有MS盐、维生素、20g/l蔗糖、5.5g/l琼脂、0.1g/l酪蛋白水解物、2mg/l赤霉酸(GA3)，pH5.8。萌发的具有根的胚进一步在含有低浓度的生长素(例如0.01mg/l的α-萘乙酸(NAA))的培养基上发育。这样的培养基的实例为本文描述的W9培养基，其含有MS维生素、20g/l蔗糖、1mg/l硫酸亚铁、0.1g/l酪蛋白水解物、0.01mg/l的NAA、5.5g/l琼脂，pH5.8。培养基可包含约0.1g/l至约0.5g/l的活性炭以改善幼小植物的生长。这样的培养基的另一个实例为本文描述的W15培养基，其含有1/2MS盐、1/2MS维生素、15g/l蔗糖、1mg/l硫酸亚铁、0.1g/l活性炭、0.1g/l酪蛋白水解物、0.01mg/l的NAA、5.5g/l琼脂，pH5.8。

[0066] 通过将彻底冲洗的共培养的体细胞胚性愈伤组织以约0.1g每90mm培养皿铺在固体培养基(例如本文描述的Bd2培养基，其含有Gamborg B5盐、维生素B5、30g/l蔗糖、2.2g/l植物凝胶、2mg/l的2,4-D钠盐，pH5.8，并添加有选择剂和农杆菌抑制剂)上来进行转化的细胞的培养基包埋法选择。愈伤组织用约10ml含有低熔点(LMP)琼脂糖(0.6%)的、添加有相同的选择剂的Bd2培养基(冷却至约40℃之后)覆盖。通过小心地收集抗性愈伤组织，放置于新鲜Bd2培养基上进行传代并用LMP Bd2培养基覆盖。在LMP培养基中进行8-10星期选择直至产生子叶期胚。将处于鱼雷期至子叶期左右的抗性胚转移至添加有选择剂的DGA培养基上。在约3-4周内，将小的绿色子叶期胚转移至添加有选择剂的M9-2培养基上。在约3-4周内，将胚转移至如本文所描述的含有选择剂的G35-2培养基上。在此阶段，可以使用多至4盏36W的灯管。光照保持每天16小时。在约3周内，将萌发的胚转移至含有选择剂的W9培养基上。在约2-3周内，将小植株转移至W15培养基(不含潮霉素)上。在2-3周内，生根的小植株可以种植于土壤中。

[0067] 可以在任何适当的培养基中进行对转化的细胞的液体培养基选择，其持续一段足够产生转基因鱼雷期或子叶期体细胞胚的时间。在一个实施方案中，选择性液体培养基包含Gamborg B5盐和维生素B5。选择培养基还含有碳水化合物源(例如蔗糖)、生长素(例如2,4-D)。在一个实施方案中，培养基包含Gamborg B5盐和维生素B5，约10g/l至约20g/l蔗糖，和约0.1mg/l至约10mg/l的2,4-D，优选约2mg/l的2,4-D。在一个实施方案中，在每次传代中减少碳水化合物源(例如蔗糖)的量，从高约20g/l至低约10g/l。选择培养基还包含用于选择转化细胞的化合物，其依赖于包含在农杆菌中的可选择标记基因。可使用的化合物的实例包括植物活性抗生素或除草剂。选择培养基还优选含有抑制农杆菌细胞生长的化合物。这样的化合物为本领域公知的并包括头孢噻肟、羧苄西林和特美汀。在一个实施方案中，在小生长容器例如多孔平板中进行选择。在一个实施方案中，在2000-3000lux光照，16/8小时昼/夜循环，温度26℃-30℃和50-100rpm温和摇晃的条件下培养细胞。这样使所生产的体细胞胚成熟并萌发，像固体培养基中的那些一样。在液体阶段后的干旱步骤可能利于胚萌发。另外，可使用化学试剂，例如可模拟干旱效应的脱落酸(ABA)。

[0068] 然后将萌发的转基因植物转移至土壤以发育成开花植物。所述转基因植物可用作常规育种方案的亲本。

[0069] 另一方面，本发明涉及新的农杆菌菌株，其改善了转化效率。在一个实施方案中，所述新农杆菌菌株含有组成型活性virA基因。该菌株的毒力诱导不需添加化学物质。virA基因整合入染色体基因组或Ti质粒中以提高稳定性。所述新农杆菌菌株不含有野生型virA等位基因。virA基因在超毒力背景下表达(例如在pTiBo542背景下)并且源自pTiBo542。在一个实施方案中，所述新农杆菌菌株为AGL2。已在2009年10月28日将农杆菌菌株AGL2的培养物依据布达佩斯条约以专利保藏名称PTA-10447保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,Virginia,20110-2209 USA。ATCC已于2009年11月4日测试该保藏物的活力，所述培养物是存活的。

[0070] 另一方面，本发明涉及新的农杆菌菌株，其改善了再生效率。在一个实施方案中，改善的再生效率发生于共培养后的步骤。在一个实施方案中，所述新农杆菌菌株含有对生长造成营养缺陷的突变。所述新农杆菌菌株还可能含有编码了组成型活性virA蛋白质的基因。virA蛋白质在超毒力背景下表达，例如在pTiBo542背景下。在一个实施方案中，所述新农杆菌菌株为AGL3。已在2009年10月28日将农杆菌菌株AGL3的培养物依据布达佩斯条约以专利保藏名称PTA-10448保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,Virginia,20110-2209 USA。ATCC已于2009年11月4日测试该保藏物的活力，所述培养物是存活的。

[0071] 另一方面，本发明提供了用于改善植物转化效率的方法。在此方法中，将胚性愈伤组织与农杆菌菌株在含有NADPH氧化酶抑制剂的培养基中共培养。在一个实施方案中，所述NADPH氧化酶抑制剂为二亚苯基碘(DPI)，约1μM至约50μM，优选约1μM至约10μM。

[0072] 用于将胚性愈伤组织与农杆菌共培养的技术为本领域公知的。可使用任何携带含有感兴趣的基因或核酸的DNA构建体的菌株。优选的用于共培养的方法为在国际公开号WO2005/103271中公开的方法。

[0073] 根据本发明插入至植物中的多核苷酸(感兴趣的多核苷酸)对转化过程不是关键的。一般引入植物的感兴趣的多核苷酸是构建体的一部分。感兴趣的多核苷酸可为感兴趣的基因，例如蛋白的编码序列，或它可为能够调控基因表达的序列，例如反义序列、有义抑制序列或miRNA序列。构建体一般包括可操作地连接于感兴趣的DNA的5'侧和/或感兴趣的DNA的3'侧的调控区域。含有所有这些元件的盒在本文中还称为表达盒。表达盒可在表达盒构建体中额外含有5'前导序列。调控区域(即启动子、转录调控区域和翻译终止区域)和/或编码信号锚的多核苷酸对宿主细胞或其彼此可为天然的/类似的。此外，调控区域和/或编码信号锚的多核苷酸对宿主细胞或其彼此可为异源的。见美国专利号7,205,453和美国专利申请公开号2006/0218670和2006/0248616。表达盒可额外含有可选择标记基因。见美国专利号7,205,453和美国专利申请公开号2006/0218670和2006/0248616。

[0074] 通常，表达盒将包含用于选择转化的细胞的可选择标记基因。可选择标记基因有利于对转化的细胞或组织的选择。通常，植物可选择标记基因将通过适当的基因编码抗生素抗性，所述适当的基因包括至少一套编码抗生素壮观霉素抗性的基因、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(spt)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(hpt或aphIV)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因。此外，植物可选择标记基因将编码除草剂抗性，例如硫脲型除草剂、草铵膦、草甘膦、铵、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，包括编码通过抑制谷氨酰胺合酶功能起作用的除草剂(例如草丁瞵或Basta)抗性的基因(例如bar基因)。大体上见国际公开号WO 02/36782、美国专利号7,205,453和美国专利申请公开号2006/0248616和2007/0143880，和其中引用的那些参考文献。此可选择标记基因列表并非意味限制。可使用任何可选择标记基因。

[0075] 在本发明的实施中可使用多种启动子。可基于所需的效果选择启动子。即，可将核酸与组成型的、组织偏好的或其它用于在感兴趣的宿主细胞中表达的启动子相组合。这样的组成型启动子包括，例如，Rsyn7的核心启动子(国际公开号WO 99/48338和美国专利号6,072,050)；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，1985)；水稻肌动蛋白(McElroy等人，1990)；泛素蛋白(Christensen和Quail，1989和Christensen等人，1992)；pEMU(Last等人，1991)；MAS(Velten等人，1984)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其它组成型启动子包括，例如，在美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；
5,399,680；5,268,463；和5,608,142中公开的那些。麻风树启动子包括在美国临时专利申请号61/184,416中公开的那些。

[0076] 其它启动子包括可诱导的启动子，尤其是病原体诱导的启动子。这样的启动子包括那些来自病程相关蛋白质(PR蛋白)的启动子，其在病原体感染后被诱导；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。其它启动子包括在病原体感染位点或其附近局部表达的启动子。在另外的实施方案中，启动子可为伤害诱导的启动子。在其它的实施方案中，可使用化学调控的启动子以通过在植物中施用外源的化学调节剂调节基因的表达。启动子可为化学诱导的启动子，其中施用化学物质诱导基因的表达，或化学抑制的启动子，其中施用化学物质抑制基因表达。此外，可利用组织偏好的启动子以使感兴趣的核苷酸的增高表达靶向于特定的植物组织中。在美国专利号6,506,962、6,575,814、6,972,349和7,301,069以及美国专利申请公开号2007/0061917和2007/0143880中描述了这些启动子。
组织偏好的麻风树启动子包括在美国临时专利申请号61/184,416中公开的那些。

[0077] 如果合适，可优化感兴趣的多核苷酸以在转化的植物中提高表达。即，可使用植物偏好的密码子合成编码序列以改善表达。用于合成植物偏好的基因的方法是本领域可获得的。例如，见美国专利号5,380,831、5,436,391和7,205,453，和美国专利申请公开号2006/0218670和2006/0248616。

[0078] 除非另有说明，本发明的实施采用常规化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学技术，其在本领域的技术范围内。例如，见Maniatis等人，1982，Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook 等人，1989，Molecular Cloning，
2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；
Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Ausubel等人，1992)，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，including periodic updates)；Glover，1985，DNA Cloning(IRL Press，Oxford)；Russell，1984，Molecular biology of plants:a laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)；Anand，Techniques for the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press，New York，1992)；Guthrie 和 Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press，New York，1991)；Harlow 和 Lane，1988，Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription和Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Methods In Enzymology，Vols.154and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology(Mayer 和Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)；Riott，Essential Immunology，
6th Edition，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1988；Fire 等人，RNA Interference Technology:From Basic Science to Drug Development，Cambridge University Press，Cambridge，2005；Schepers，RNA Interference in Practice，Wiley–VCH，2005；Engelke，RNA Interference(RNAi):The Nuts & Bolts of siRNA Technology，DNA Press，2003；Gott，RNA Interference，Editing，and Modification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)，Human Press，Totowa，NJ，2004；Sohail，Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application，CRC，2004。
实施例

[0079] 通过参考下述实施例描述本发明，所述实施例通过说明的方式提供，而不是为了以任何方式限制本发明。利用了本领域公知的标准技术或下文明确描述的技术。

[0080] 实施例1

[0081] 培养基配方

[0082] J20P:无NH4NO3的MS盐、MS维生素、20g/l蔗糖、50g/l的PEG 8000、0.5g/l谷氨酰胺、0.25g/l天冬酰胺、0.2mg/l的2,4-D钠盐，pH 5.8

[0083] IM(Chilton等人，1974；de Groot等人，1998)：2.05g/l 的K2HPO4、1.45g/l 的KH2PO4、0.6g/l 的 MgSO4-7H2O、0.5g/l 的 (NH4)2SO4、0.5g/l 的 NH4NO3、0.01g/l 的 CaCl2、0.5mg/l 的 ZnSO4-7H2O、0.5mg/l 的 CuSO4-5H2O、0.5mg/l 的 H3BO3、0.5mg/l 的 MnSO4-H2O、
0.5mg/l的NaMbO4-2H2O、1mg/l的FeSO4、0.5%的甘油、0.5g/l的2-[N-吗啉]乙磺酸(MES)、
0-100μM的乙酰丁香酮、2g/l的葡萄糖，pH 5.7-5.8

[0084] JIM2：IM培养基添加：维生素B5、2mg/l的2,4-D、1-50μM二亚苯基碘(DPI)。

[0085] 固体JIM2：含2g/l的植物凝胶的JIM2。

[0086] JIM2H：添加了0.3g/l组氨酸的JIM2培养基。

[0087] 固体JIM2H(用于共培养)：添加2g/l植物凝胶的JIM2H。

[0088] Bd2：Gamborg B5盐、维生素B5、30g/l蔗糖、2.2g/l植物凝胶、2mg/l的2,4-D钠盐，pH5.8。

[0089] DGA：无NH4NO3的MS盐、Gamborg B5维生素、30g/l蔗糖、2.4g/l植物凝胶、1g/l谷氨酰胺、0.5g/l天冬酰胺，pH 5.8。

[0090] M9-2：无NH4NO3的MS盐、Gamborg B5维生素、20g/l蔗糖、20g/l麦芽糖、1g/l谷氨酰胺、0.5g/l天冬酰胺、2.4g/l植物凝胶、0.1g/l酪蛋白水解物，pH 5.8。

[0091] G35-2：MS盐、维生素、20g/l蔗糖、5g/l琼脂、0.1g/l酪蛋白水解物、2mg/l赤霉酸(GA3)，pH 5.8。

[0092] W9：MS盐、MS维生素、20g/l蔗糖、1mg/l的FeSO4、0.1g/l酪蛋白水解物、0.01mg/l的α-萘乙酸(NAA)、5.5g/l琼脂，pH 5.8。

[0093] W15：1/2MS盐,1/2MS维生素、15g/l蔗糖、1mg/l的FeSO4、0.1g/l活性炭、0.1g/l酪蛋白水解物、0.01mg/l的NAA、5g/l琼脂，pH 5.8。

[0094] 实施例2

[0095] 胚性愈伤组织与农杆菌的共培养

[0096] 通过每周将约3g细胞物质转移入20ml的J20P培养基中传代胚性细胞系，例如JS4细胞系，其源自印度尼西亚麻风树收集的合子胚。传代后3-5天，收集胚性愈伤组织细胞。

[0097] 将约30ml的JIM2H固体培养基倒在每个90mm培养皿上制作共培养平板。另外，可用JIM2H液体培养基浸泡3-4片纤维素滤纸，然后放入90mm培养皿中。将一片82mm的Hybond尼龙膜覆盖于培养基浸泡的纤维素滤纸或固体JIM2H培养基上。将约0.75g胚性愈伤组织与200μl农杆菌细胞在膜上混合。室温孵育1小时后，去除含有农杆菌细胞的过量的液体培养基。盖上平皿，用3M带密封并在昏暗的灯光下于24℃孵育2-3天。

[0098] 实施例3

[0099] 制备农杆菌培养物

[0100] 将携带pCambia1305.1的AGL2或AGL3的新鲜菌落接种于30ml LB培养基中，该培养基添加有25mg/l利福平和50mg/l卡那霉素。28℃，200-230RPM培养细胞至OD600达到0.8-2.0。用含适当的抗生素的LB培养基将培养物稀释至OD600 0.3单位，并在28℃相同的条件下孵育2-3小时直至OD600约0.6单位。将25ml的农杆菌培养物转移至50ml的Falcon管中并在具有甩平式转头的桌面离心机中15℃，3000 RCF 20分钟将细胞沉降。移除LB培养基并用25ml JIM2H培养基将沉淀重悬。室温下无晃动使细胞诱导2小时并且使用同样的培养基将农杆菌制备物调节至约OD600 0.5。

[0101] 对野生型AGL1菌株的转化体，在农杆菌MinAB培养基中培养细胞并在与植物细胞共培养之前在含AS的诱导培养基(IM)中预诱导6小时。

[0102] 实施例4

[0103] 转化体的选择和再生

[0104] 用添加有5-10mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的Bd2培养基在膜上将共培养的体细胞胚性愈伤组织洗涤3次。将愈伤组织转移至添加有5-10mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的固体Bd2培养基上。将平板放置于26℃的组织培养房间中的架子上，用一个36W的Phillips Lifemax灯管(暖光)每天光照16小时。2-3周后在同样的新鲜培养基中进行传代。另外4-6周之内，将抗性愈伤组织转移至添加有7mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的DGA培养基上。在约3-4周内，出现小的绿色子叶期胚。将它们转移至添加有7mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的M9-2培养基上。

[0105] 在约3周内，将胚转移至含10mg/l潮霉素的G35-2培养基上。在此阶段，可以使用多至4盏36W的灯管。光照保持每天16小时。在约3-4周内，将萌发的胚转移至含7mg/l潮霉素的W9培养基上。在约2-3周内，将小植株转移至W15培养基(不含潮霉素)上。在2-3周内，生根的小植株即可种植于土壤中。

[0106] 还可用除草剂(例如草铵膦)和其它抗生素(例如卡那霉素)进行转化体的选择。

[0107] 在固体培养基上的选择总是伴随有严重的农杆菌过度生长，其杀死了大多数转基因愈伤组织/体细胞胚。表1概括了使用此方法选择的大量的实例。

[0108] 表1

[0109] 在不同培养基上的转基因麻风树植物的选择

[0110]

[0111]

[0112]

[0113]

[0114]

[0115] 注：含AS的IM：含200μM乙酰丁香酮的农杆菌诱导培养基。Kan：卡那霉素。Hyg：潮霉素。GLF：草铵膦。SE：体细胞胚。SEC：体细胞胚性愈伤组织。MSO：甲硫氨酸磺酸盐。

[0116] 或者，用添加有5-10mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的Bd2培养基在膜上将共培养的体细胞胚性愈伤组织洗涤3次。将约0.1g共培养愈伤组织低密度地铺在添加有5-10mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的固体Bd2培养基上。将10ml含有低熔点(LMP)琼脂糖(0.6%)的添加有5-10mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的Bd2培养基覆盖于含相同选择剂的Bd2固体培养基平板上。将平板放置于26℃的组织培养房间中的架子上，用一个36W的Phillips Lifemax灯管(暖光)每天光照16小时。愈伤组织以低密度包埋于LMP琼脂糖培养基中会使平板污染率从>99%减少至约50%(TE61)。

[0117] 在LMP培养基中进行8-10星期选择直至生产子叶期胚。小心地收集抗性愈伤组织，放置于新鲜Bd2培养基上并用LMP Bd2培养基覆盖进行传代。将处于鱼雷期和子叶期的抗性胚转移至添加有7mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的DGA培养基上。在约3-4周内，小的绿色子叶期胚出现。将它们转移至添加有10mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的M9-2培养基上。在约3周内，将胚转移至含10mg/l潮霉素的G35-2培养基上。在此阶段，可以使用多至4盏36W的灯管。光照保持每天16小时。在约3周内，将萌发的胚转移至含10mg/l潮霉素的W9培养基上。在约2-3周内，将小植株转移至W15培养基(不含潮霉素)上。在2-3周内，生根的小植株即可种植于土壤中。

[0118] 当用培养基包埋法进行选择的时候，将胚性愈伤组织与携带pCambia1305.1的农杆菌菌株共培养，观察到大量潮霉素抗性体细胞胚。

[0119] 实施例5

[0120] 根癌农杆菌突变体AGL2和AGL3的构建

[0121] AGL1-ΔvirA菌株：使用C58virA基因作为探针将pUC18-Sfil中的包含AGL1 virA基因的约10-kb的片段从AGL1基因组文库中分离。通过用AscI和KpnI消化并亚克隆进pUC18-SfiI以产生pUC18-virA来制造包含整个AGL1 virA基因的4.6-kb的片段。将两侧具有loxP位点的1.4-kb的潮霉素盒克隆入用NheI和BglII切开的pUC18-virA以产生pUC18-ΔvirA-Hyg，通过用SfiI消化从其释放整个ΔvirA盒并插入pUT-mini-Tn5-sp中，产生pTn5-ΔvirA-Hyg。

[0122] 通过电穿孔将两种质粒 pPZP200-virB::LacZ(壮观霉素抗性) 和pRi15A-Tac::RecA(卡那霉素抗性，含有来自根癌农杆菌C58的RecA基因)共同引入超毒力根癌农杆菌菌株AGL1(pTiBo542在C58染色体背景中)(Lazo等人，1991)中，获得的菌株命名为AGL1(LacZ RecA)。virB::LacZ融合基因用作监测AGL1的virA基因功能性的报告基因，而RecA基因保留了AGL1的重组功能使得可实现virA缺失。通过在28℃的二亲本交配将自杀载体pTn5-ΔvirA-Hyg从供体菌株大肠杆菌S17-1(λpir)传递至受体菌株AGL1(LacZ RecA)。在含潮霉素(100μg/ml)和利福平(50μg/ml)以及5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖甘(X-Gal；40μg/l)的MiniAB琼脂上选择接合体。将9个随机选择的无色克隆转移至含同样的抗生素的液体MiniAB或2YT中。Southern分析确定了virA的缺失(没有显示)。

[0123] 通过在36℃，不含抗生素的液体MiniAB中连续生长细胞6天，期间传代3次来去除AGL1-ΔvirA中的两种质粒。在2YT培养基上划线后，分别在含壮观霉素(50ug/ml)、卡那霉素(25μg/ml)或潮霉素(100μg/ml)的培养基中测试84个菌落的生长。仅发现1个菌落(命名为8D12)丢失了壮观霉素和卡那霉素抗性,但其保持了潮霉素抗性。

[0124] 为了从菌株8D12中去除潮霉素抗性，通过电穿孔将含有位点特异性DNA重组基因Cre的质粒pRi15A-Tac::Cre引入菌株8D12中。在添加有卡那霉素(25μg/ml)和利福平(50μg/ml)的2YT中将转化体28℃孵育2天。选择丢失了潮霉素抗性的菌落。根据上述提及的方法恢复质粒pRi15A-Tac::Cre。选择一个这样的菌落，ΔA4-4，作为AGL1-ΔvirA菌株，其对壮观霉素、卡那霉素和潮霉素敏感。

[0125] AGL2菌株：已显示含有突变G665D的virA蛋白质在缺乏乙酰丁香酮和单糖的情况下强烈地活化vir基因表达(McLean等人，1994)。该工作在非超毒力章鱼碱菌株中进行并且在相应位点的virA功能性和效果是未知的。

[0126] 为了将突变的virA基因重新引入AGL1-ΔvirA中，通过融合两个在G665D残基重叠的PCR片段(如通过引物定点诱变制备)创建含有整个virA基因启动子，含有G665D突变的编码序列和3'侧序列(包括virJ启动子)的~3.5-kb的片段。将融合的PCR产物克隆入pUC18-SfiI载体以生产pUC18-virA-on。接下来，将含两侧loxP位点的1.4-kb的潮霉素盒插入virA-on基因的下游以生产pUC18-virA-on-Hyg。同时，通过电穿孔将质粒pRi15A-Tac::RecA重新引入农杆菌菌株ΔA4-4中以制备菌株ΔA4-4R。将pUC18-virA-on-Hyg引入ΔA4-4R并在添加了潮霉素(100μg/ml)和利福平(50μg/ml)的MiniAB琼脂上选择含有组成型virA突变的转化体。挑取了一个潮霉素和利福平抗性菌落并且通过在引入pPZP200-virB::LacZ之后的X-gal染色确认了组成型virA基因的存在。

[0127] 恢复pRi15A-Tac::RecA之后，将pRi15A-Tac::Cre引回所述菌株中，由此去除潮霉素抗性基因盒。恢复潮霉素敏感菌株后，产生AGL2菌株。分子分析显示，virA-on基因整合在缺失的virA旁边的loxP位点。

[0128] 为确认AGL2获得了vir基因诱导的完整的超毒性和AS不依赖性，将pPZP200-virB::LacZ引入菌株中并且比较其在不含AS的培养基中的lacZ活性与用
100μM的AS诱导的AGL1的活性。结果显示，AGL2在不含AS的IM培养基中表达与野生型AGL1在含100μM的AS中可比的LacZ(没有显示)。

[0129] 在AGL1背景下制备了若干版本的virA突变体，例如与大肠杆菌强tac启动子或AGL1 virG启动子相连接的C58 virA G665D突变体和AGL1 virAG665D突变体。所有的都若干倍地弱于AGL2。

[0130] 为了进一步确认AGL2能够将T-DNA传递如宿主细胞，用pEX2测试此菌株在玉米黑粉菌(Ustilago maydis)中的转化效率。令人吃惊的是，在产生转基因细胞方面AGL2优于AGL1(表2)。在转化甘蔗黑穗病菌(U.scitaminae)和黑曲霉菌(Aspergillus niger)时见到了相似的增强效果。Southern印迹分析显示关于T-DNA转化的保真度和拷贝数方面与野生型AGL1没有显著的差异。

[0131] 表2

[0132] 不存在vir诱导剂的玉米黑粉菌的转化

[0133]CFU/平板平均CFU/平板
AGL1+AS 110/115/211 145
AGL2+AS(菌落No.1) 80/105/91 92
AGL2+AS(菌落No.2) 107/120/115 114
AGL1 No AS 500/506/640 549
AGL2 No AS(菌落No.1) 840/590/660 696
AGL2 No AS(菌落No.2) 590/580/667 612

[0134] 注：在与玉米黑粉菌孢子(100μl，OD600=0.7)共培养48小时之前，将用pEX2转化的农杆菌细胞(100μl，OD600=0.3)在IM培养基(de Groot等人，1998)中培养6小时。通过将膜放置于含150μm/ml潮霉素B和300μm/ml头孢噻肟的YPD培养基上进行对转化体的选择。

[0135] 还测试了AGL2在植物转化中的AS-不依赖性。在存在或不存在100μM的AS的情况下将棉花体细胞胚性愈伤组织与AGL2(pST2-EGFP)或AGL1(pST2-EGFP)共培养。通过将愈伤组织小块转移至如在PCT申请WO/2005/103271中所描述的固体培养基上进行转化体的选择。当不添加AS使用AGL2(pST2-EGFP)共培养时，约60-70%的愈伤组织产生了卡那霉素抗性的体细胞胚。这与用添加有100μM的AS的AGL1实现的是基本相同的。

[0136] AGL2的营养缺陷菌株：通过将pUC-miniTn5-sp-eGFP中的壮观霉素抗性基因替换成含两侧loxP位点的1.4-kb的潮霉素盒构建了转座子质粒pTn5-Hyg。将pRi15A-Tac::RecA引入AGL2并且通过在28℃的二亲本接合将转座子pTn5-Hyg从大肠杆菌S17-1(λpir)转移至农杆菌菌株。在含潮霉素(100μg/ml)和氯霉素(20μg/ml)的
2YT琼脂上选择接合体。将抗性菌落重复转移至2YT培养基和MS培养基上。在2ml含潮霉素和氯霉素的3YT培养基上接种不能在MS培养基上生长的菌落。将过夜培养物沉淀、用MS培养基洗涤并重新接种入添加有不同氨基酸，例如精氨酸(R)、天冬酰胺(R)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)和脯氨酸(P)的MS培养基中。从5000个转座子接合体中分离出5个营养缺陷型的菌株。在它们中14号和22号在MS培养基中生长需要组氨酸。将菌株14恢复pRi15A-Tac::RecA并且通过如之前描述的Cre重组酶去除潮霉素抗性盒，将该潮霉素敏感的衍生物称为AGL3。

[0137] 实施例6

[0138] 在选择阶段使用营养缺陷型农杆菌菌株有效地控制农杆菌过度生长

[0139] 如在实施例2中所描述，将胚性愈伤组织与AGL2(pCambia1305.1)或AGL3(pCambia1305.1)共培养。在共培养阶段之前或过程中，所有的培养基中添加有
0.3mg/l的组氨酸。将充分洗涤后的愈伤组织以小块转移至添加有7mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的固体Bd2培养基上并且在相同的条件下培养4周。8个愈伤组织区域中仅1个无农杆菌细胞而其余的覆盖有厚层的农杆菌细胞。相反，所有10个与AGL3共培养的愈伤组织区域不显示农杆菌污染的迹象，并且愈伤组织在选择培养基下显示了健康的生长，表明产生了转化的体细胞胚(图2)。

[0140] 实施例7

[0141] 组成型virA菌株的改善的转化效率

[0142] 如实施例2中描述，在含有(200μM)或不含AS的培养基中将胚性愈伤组织与AGL1(pCambia1305.1bar)或AGL2(pCambia1305.1bar)共培养53小时。立即用X-gluc染色愈伤组织。在所有与AGL2共培养的愈伤组织中观察到较强的蓝色着色并且AS进一步增强了AGL2中的转化效率(图3)。

[0143] 实施例8

[0144] 通过使用DPI改善转化效率

[0145] 将来自4个不同的细胞系的体细胞胚性愈伤组织与AGL2(pCambia1305.1)共培养并且通过LMP Bd2包埋法进行选择。共培养培养基JIM2添加有1μM的DPI、5μM DPI或抗氧化剂混合物，其终浓度为1mM硫代硫酸钠、8.8mM L半胱氨酸和1mM的DTT。2个月的选择后，检测记录潮霉素抗性的体细胞胚。在每个细胞系的转化中，将源自与不含DPI的JIM2共培养的体细胞胚(CK)的数目设定为100，并且通过将实际数目除以CK的数目计算其它共培养条件的体细胞胚的相对数目。结果(图4)清楚地表明，约10μM的DPI改善转化效率超过2倍，而1mM硫代硫酸钠、8.8mM的L-半管氨酸、1mM的DTT的组合几乎不导致改善。

[0146] 还在大豆中测试了DPI的转化增强效果。将大豆胚性悬浮培养物(源自Peking18)与预诱导的AGL1(pCambia1305.1)于24℃在尼龙膜上共培养2.5天，该膜放置于添加有1μM的DPI或1mM硫代硫酸钠、8.8mM的L-半管氨酸和1mM的DTT的固体培养基(含20mg/l的2,4-D和维生素B5的IM)顶部。用10mg/l的潮霉素选择后，用X-gluc染色愈伤组织块。在约40%的在对照培养基(含20mg/l的2,4-D和维生素B5)中共培养的愈伤组织块中观察到GUS染色。相反，当向共培养培养基中添加1μM的DPI时，超过80%的愈伤组织块显示出GUS染色。令人吃惊的是，在我们的培养系统中，组合1mM硫代硫酸钠、8.8mM的L-半管氨酸和1mM的DTT并不改善转化效率。

[0147] 实施例9

[0148] 转基因植物的分析

[0149] 在共培养约2个月后选择在选择培养基上茁壮发育的体细胞胚，并且取下小片叶组织并将其放置于由200μl含1mM X-gluc的磷酸缓冲液(50mM)填充的微孔板的孔中。真空渗入后，将组织在37℃孵育过夜和用70%乙醇使组织澄清。通常，50-60%的体细胞胚为染色阳性的(图5)。由约1.5g共培养的胚性愈伤组织生产了超过140株潮霉素抗性植物。

[0150] 共培养后约4个月，完全发育的小植株可以移植入土壤中(图6A)。在10株染色的小植株中没有观察到嵌合体(图6B)。植物没有显示发育异常的迹象(图6C)而且产生正常的花和果实(图7)。如所预期的，T1代种子分离成GUS阳性和GUS阴性的后代，无转基因嵌合体的迹象。

[0151] 从潮霉素抗性植物提取总DNA并且使用hpt基因作为探针进行Southern印迹。17株植物中仅1株不含转基因(图8)。

[0152] 实施例10

[0153] 在液体培养基中选择

[0154] 将麻风树体细胞胚性愈伤组织与AGL3(pCambia1305.1)共培养2.5天并在含7mg/l潮霉素和300mg/l头孢噻肟的J20P培养基上选择3星期。在含减少的蔗糖(10g/l)的相似的培养基上额外传代2星期。抗性子叶期体细胞胚以及更早时期的胚开始出现(图9A)。这比在固体Bd2培养基(图9B)上或包埋进LMP Bd2中(图9C)的快3-4周。

[0155] 在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)，除非本文中另有说明或上下文明确的矛盾，术语“一(a)”和“一(an)”和“所述(the)”以及相似的代词的使用解释为覆盖单数和复数形式。除非另有注明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”解释为开放式的术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另有说明，本文中数值的范围仅用于作为对落在该范围内的每个独立的值的引用的简略表达方法，并且本文中每个独立的值就如其在单独地引用一样并入说明书中。例如，如果公开了范围10-15，那么也公开了11、12、13和14。本文描述的所有方法可以任何适当的顺序进行，除非本文另有说明或上下文明确地矛盾。本文中提供的任何和全部实施例，或示例性语言(例如，“例如”)的用途仅仅是为了更好地说明本发明并且不对本发明的范围作出限定，除非另有要求。说明书中任何语言都不应解释为暗示对本发明的实施必要的任何非要求性的元素。

[0156] 应理解，本发明的方法和组合物可以合并入不同形式的实施方案，本文仅公开了少数。本文描述了本发明的实施方案，包括发明人所知的实施本发明的最佳模式。对本领域普通技术人员，基于对前述说明的阅读，这些实施方案的变化将变得明显。发明人预期了技术人员适当地采用这样的变化，并且发明人预期了本发明以除本文明确描述之外的方式实践。因此，本发明包括在所附权利要求中引用的主题的适用法律所允许的所有的修改和等效物。另外，除非本文另有说明或上下文明确地矛盾，本发明涵盖上文描述的元素的所有可能变体的任何组合。

[0157] 本发明拥有若干实施方案并且依靠专利、专利申请和其它参考文献获取本领域人员已知的细节。因此，当本文引用或重复专利、专利申请或其它参考文献时，应理解其通过引用以其整体并入本文是为了引用的观点和所有的目的。

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