检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法
阅读：74发布：2020-05-11
专利汇可以提供检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法，应用 氧 气猝灭型 荧光 探针，针对加入有候选药物的肝脏线粒体有氧呼吸功能中的 基础 呼吸功能以及ADP驱动型的氧化磷 酸化 水 平上的 耗氧速率 进行检测，进而判断候选药物是否为对肝脏线粒体功能存在影响的药物。与 现有技术 相比，本方法具有快速(3.5个小时以内得到结果)，结果稳定，准确度高等优势，并可用于大规模化合物库筛选评价小分子药物对线粒体呼吸功能的影响，这将促进在早期药物研发阶段评价候选药物，从而降低药物开发总的研发时间和投资成本，具有潜在的应用推广前景。，下面是检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法专利的具体信息内容。
1.一种检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法，其特征在于，应用氧气猝灭型荧光探针，针对加入有候选药物的肝脏线粒体有氧呼吸功能中的基础呼吸功能以及ADP驱动型的氧化磷酸化水平上的耗氧速率进行检测，进而判断候选药物是否为对肝脏线粒体功能存在影响的药物。
2.根据权利要求1所述检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法，其特征在于，所述氧气猝灭型荧光探针为已知的可以从市售渠道获取的氧气猝灭型荧光探针。
3.根据权利要求1所述检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法，其特征在于，应用氧气猝灭型荧光探针，针对加入有候选药物的肝脏线粒体有氧呼吸功能中的基础呼吸功能的耗氧速率进行检测，进而判断候选药物是否为肝脏线粒体基础呼吸功能的解偶联剂。
4.根据权利要求3所述检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法，其特征在于，具体方法如下：
1)将检测化合物用DMSO梯度稀释为化合物溶液，所述检测化合物即为候选药物；
2)提前预热所需缓冲液，96孔板，酶标仪；
3)在96孔微孔板中，每孔加入梯度稀释后的化合物溶液；
4)每孔加入含有氧气猝灭型荧光探针的呼吸功能缓冲液；
5)每孔加入含有肝脏线粒体的基础呼吸功能缓冲液；
6)快速向每孔加入预热的矿物油，去除气泡；
7)将96孔板置于酶标仪内，开始检测20分钟内的基础呼吸功能的氧消耗速率动力学曲线；
8)使用氧消耗速率动力学曲线实验测量所述氧气猝灭型荧光探针的氧消耗速率并计算检测化合物的半数解偶联浓度UC50，若半数解偶联浓度UC50小于20微摩尔/升，则所述检测化合物为肝脏线粒体基础呼吸功能的解偶联剂。
5.根据权利要求1所述检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法，其特征在于，应用氧气猝灭型荧光探针，针对加入有候选药物的肝脏线粒体有氧呼吸功能中的ADP驱动型的氧化磷酸化水平上的耗氧速率进行检测，进而判断候选药物是否为肝脏线粒体氧化磷酸化作用抑制剂。
6.根据权利要求5所述检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法，其特征在于，具体方法如下：
1)将检测化合物用DMSO梯度稀释为化合物溶液，所述检测化合物即为候选药物；
2)提前预热所需缓冲液，96孔板，酶标仪；
3)在96孔微孔板中，每孔加入梯度稀释后的化合物溶液；
4)每孔加入含氧气猝灭型荧光探针的呼吸功能缓冲液；
5)每孔加入含肝脏线粒体的氧化磷酸化作用缓冲液；
6)快速向每孔加入预热的矿物油，去除气泡；
7)将96孔板置于酶标仪内，开始检测20分钟内的氧化磷酸化作用的氧消耗速率动力学曲线；
8)使用氧消耗速率动力学曲线实验测量所述氧气猝灭型荧光探针的氧消耗速率并计算检测化合物的半数抑制浓度IC50，若半数抑制浓度IC50小于20微摩尔/升，则所述检测化合物为肝脏线粒体氧化磷酸化作用的抑制剂。
7.根据权利要求4或6所述检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法，其特征在于，所述呼吸功能缓冲液配制方法是：1)取34.4克蔗糖，0.40克氯化镁，0.45克氯化钾，
0.18克乙二醇二乙醚二胺四乙酸加入300毫升蒸馏水中，并调节pH值到7.4，定容至400毫升，并用0.2微米孔径的滤器过滤后备用，此为呼吸功能缓冲液。
8.根据权利要求4或6所述检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法，其特征在于，所述基础呼吸功能缓冲液配制方法是：取560微升0.5摩尔每升的谷氨酸与0.5摩尔每升的苹果酸加入15毫升呼吸功能缓冲液备用。
9.根据权利要求4或6所述检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法，其特征在于，所述氧化磷酸化作用缓冲液配制方法是：取560微升0.5摩尔每升的谷氨酸与0.5摩尔每升的苹果酸混合液，360微升100毫摩尔每升的5′-二磷酸腺苷溶液加入15毫升呼吸功能缓冲液备用。
10.根据权利要求4或6所述检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法，其特征在于，所述肝脏线粒体为分离提取的新鲜的肝脏完整线粒体。
检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法
技术领域
背景技术
[0002] 肝脏是体内药物代谢的主要场所，小分子药物可能会对肝脏有直接毒副作用。目前比较明确的肝功能损伤的作用机制有：脂质代谢异常、肝细胞线粒体损伤、肝脏胆汁生成和排泄异常、肝脏纤维化、氧化损伤机制等，其中线粒体损伤是药物引发的肝功能的主要机制。线粒体损伤又主要包括线粒体膜通透性的改变，线粒体脂质氧化和氧化磷酸化解偶联等。线粒体氧化磷酸化是机体的重要能量来源。正常生理状态下，人体80％以上的能量由线粒体氧化磷酸化供应。氧化磷酸化是细胞中重要的生化过程，是细胞呼吸的最终代谢途径。该过程位于糖酵解和三羧酸循环之后。氧化磷酸化过程可看作电子传递过程中偶联ADP磷酸化，生成ATP。氧化磷酸化发生在真核生物的线粒体内膜上。过程由两部分组成：电子传递链和ATP合酶，有些药物例如胺碘酮，首先在线粒体内膜中质子化，再通过线粒体跨膜电位进入线粒体机制中，这种通过线粒体内膜的转移能使线粒体膜电位降低甚至消失，该过程即为氧化磷酸化解偶联。线粒体氧化磷酸化解偶联会导致ATP的产生减少，进而导致线粒体功能受损。耗氧率是研究线粒体功能的一项重要指标，也是线粒体从氧化磷酸化向糖酵解转变的一个标志。众所周知，线粒体的完整性对有氧呼吸细胞的生存能力至关重要，然而许多药物对线粒体呼吸功能具有损害作用，进而导致了肝脏、心血管系统、骨骼肌、神经系统和肾脏的功能产生。因此，建立一个准确高效的线粒体功能评价体外筛选平台在药物的临床前研发中显得十分重要和急迫。
[0003] 在新药研发中，困扰医药研发公司在临床申报后期被迫退市的一个较为普遍的原因即药物诱导的线粒体功能障碍。因此，开发一个在临床申报前即可检测到潜在药物是否存在诱导线粒体功能障碍的方法至关重要。目前，体外线粒体功能评价方法多使用市售试剂盒来完成，其检测均是针对细胞水平上的线粒体功能进行评价，由于细胞实验通常具有周期性长等特点，因此构建一个快速，高通量的体外线粒体功能评价平台至关重要。
发明内容
[0005] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0006] 本发明提供一种检测对肝脏线粒体功能存在影响的候选药物的方法，应用氧气猝灭型荧光探针，针对加入有候选药物的肝脏线粒体有氧呼吸功能中的基础呼吸功能以及ADP驱动型的氧化磷酸化水平上的耗氧速率进行检测，进而判断候选药物是否为对肝脏线粒体功能存在影响的药物。
[0007] 所述氧气猝灭型荧光探针为已知的可以从市售渠道获取的氧气猝灭型荧光探针，例如可以是 Xtra reagent(MX-400,Luxcel Biosciences)。
[0008] 具体而言，应用氧气猝灭型荧光探针，针对加入有候选药物的肝脏线粒体有氧呼吸功能中的基础呼吸功能的耗氧速率进行检测，进而判断候选药物是否为肝脏线粒体基础呼吸功能的解偶联剂。
[0009] 判断候选药物是否为肝脏线粒体基础呼吸功能的解偶联剂具体方法如下：
[0010] 1)将检测化合物用DMSO梯度稀释为化合物溶液，所述检测化合物即为候选药物；
[0011] 2)提前预热所需缓冲液，96孔板，酶标仪；
[0012] 3)在96孔微孔板中，每孔加入梯度稀释后的化合物溶液；
[0013] 4)每孔加入含有氧气猝灭型荧光探针的呼吸功能缓冲液；
[0014] 5)每孔加入含有肝脏线粒体的基础呼吸功能缓冲液；
[0015] 6)快速向每孔加入预热的矿物油，去除气泡；
[0016] 7)将96孔板置于酶标仪内，开始检测20分钟内的基础呼吸功能的氧消耗速率动力学曲线；
[0017] 8)使用氧消耗速率动力学曲线实验测量所述氧气猝灭型荧光探针的氧消耗速率并计算检测化合物的半数解偶联浓度UC50，若半数解偶联浓度UC50小于20微摩尔/升，则所述检测化合物为肝脏线粒体基础呼吸功能的解偶联剂。
[0018] 优选地，判断候选药物是否为肝脏线粒体基础呼吸功能的解偶联剂的方法步骤1)所述化合物溶液的配制方法是，取最高浓度为20毫摩尔/升的检测化合物溶液，用DMSO按照二倍稀释的方法稀释至6个浓度梯度。所述的化合物所用终浓度根据检测化合物的特性和实验设计而不同，最高终浓度为100微摩尔/升。
[0019] 本发明还提供了一个优选了工艺参数的判断候选药物是否为肝脏线粒体基础呼吸功能的解偶联剂的方法，具体如下：
[0020] 1)将检测化合物用DMSO梯度稀释为化合物溶液，所述检测化合物即为候选药物；
[0021] 2)提前预热所需缓冲液，96孔板，酶标仪至30℃；
[0022] 3)在96孔微孔板中，每孔加入1微升梯度稀释后的化合物溶液；
[0023] 4)每孔加入100微升含1毫克/升氧气猝灭型荧光探针呼吸功能缓冲液；
[0024] 5)每孔加入100微升含2毫克/毫升大鼠肝脏线粒体基础呼吸功能缓冲液；
[0025] 6)快速向每孔加入100微升预热的矿物油，去除气泡；
[0026] 7)将96孔板置于酶标仪内，尽可能快开始检测20分钟内的基础呼吸功能的氧消耗速率动力学曲线；
[0027] 8)使用氧消耗速率动力学曲线实验测量所述氧气猝灭型荧光探针的氧消耗速率并计算检测化合物的半数解偶联浓度UC50，若半数解偶联浓度UC50小于20微摩尔/升，则所述检测化合物为大鼠肝脏线粒体基础呼吸功能的解偶联剂。
[0028] 本发明提供了应用氧气猝灭型荧光探针，针对加入有候选药物的肝脏线粒体有氧呼吸功能中的ADP驱动型的氧化磷酸化水平上的耗氧速率进行检测，进而判断候选药物是否为肝脏线粒体氧化磷酸化作用抑制剂。
[0029] 判断候选药物是否为肝脏线粒体氧化磷酸化作用抑制剂具体方法如下：
[0030] 1)将检测化合物用DMSO梯度稀释为化合物溶液，所述检测化合物即为候选药物；
[0031] 2)提前预热所需缓冲液，96孔板，酶标仪；
[0032] 3)在96孔微孔板中，每孔加入梯度稀释后的化合物溶液；
[0033] 4)每孔加入含氧气猝灭型荧光探针的呼吸功能缓冲液；
[0034] 5)每孔加入含肝脏线粒体的氧化磷酸化作用缓冲液；
[0035] 6)快速向每孔加入预热的矿物油，去除气泡；
[0036] 7)将96孔板置于酶标仪内，开始检测20分钟内的氧化磷酸化作用的氧消耗速率动力学曲线；
[0037] 8)使用氧消耗速率动力学曲线实验测量所述氧气猝灭型荧光探针的氧消耗速率并计算检测化合物的半数抑制浓度IC50，若半数抑制浓度IC50小于20微摩尔/升，则所述检测化合物为肝脏线粒体氧化磷酸化作用的抑制剂。
[0038] 优选地，判断候选药物是否为肝脏线粒体氧化磷酸化作用抑制剂的方法步骤1)所述化合物溶液的配制方法是，取最高浓度为7.5毫摩尔/升的检测化合物溶液，用DMSO按照二倍稀释的方法稀释至6个浓度梯度。所述的化合物所用终浓度根据检测化合物的特性和实验设计而不同，最高终浓度为100微摩尔/升。
[0039] 本发明还提供了一个优选了工艺参数的判断候选药物是否为肝脏线粒体氧化磷酸化作用抑制剂的方法，具体如下：
[0040] 1)将检测化合物用DMSO梯度稀释为化合物溶液；
[0041] 2)提前预热所需缓冲液，96孔板，酶标仪至30℃；
[0042] 3)在96孔微孔板中，每孔加入1微升梯度稀释后的化合物溶液；
[0043] 4)每孔加入100微升含1毫克/升的氧气猝灭型荧光探针的呼吸功能缓冲液；
[0044] 5)每孔加入100微升含0.5毫克/毫升大鼠肝脏线粒体的氧化磷酸化作用缓冲液；
[0045] 6)快速向每孔加入100微升预热的矿物油，去除气泡；
[0046] 7)将96孔板置于酶标仪内，尽可能快开始检测20分钟内的氧化磷酸化作用的氧消耗速率动力学曲线；
[0047] 8)使用氧消耗速率动力学曲线实验测量所述氧气猝灭型荧光探针的氧消耗速率并计算检测化合物的半数抑制浓度IC50，若半数抑制浓度IC50小于20微摩尔/升，则所述检测化合物为大鼠肝脏线粒体氧化磷酸化作用的抑制剂。
[0048] 所述呼吸功能缓冲液配制方法是：1)取34.4克蔗糖，0.40克氯化镁，0.45克氯化钾，0.18克乙二醇二乙醚二胺四乙酸加入300毫升蒸馏水中，并调节pH值到7.4，定容至400毫升，并用0.2微米孔径的滤器过滤后备用，此为呼吸功能缓冲液。
[0049] 所述基础呼吸功能缓冲液配制方法是：取560微升0.5摩尔每升的谷氨酸与0.5摩尔每升的苹果酸加入15毫升呼吸功能缓冲液备用。
[0050] 所述氧化磷酸化作用缓冲液配制方法是：取560微升0.5摩尔每升的谷氨酸与0.5摩尔每升的苹果酸混合液，360微升100毫摩尔每升的5′-二磷酸腺苷溶液(ADP)加入15毫升呼吸功能缓冲液备用。
[0051] 所述肝脏线粒体为分离提取的新鲜的肝脏完整线粒体。
[0052] 进行动物实验室，优选选用分离提取的新鲜大鼠的肝脏完整线粒体。
[0053] 所述肝脏线粒体的分离提取采用本领域常规技术手段就可以实现。
[0054] 本发明中提供了一种可以实施的A.新鲜大鼠肝脏完整的线粒体分离提取方法，具体如下：
[0055] a.将100克-180克的大鼠使用二氧化碳迅速安乐死后，剖腹取出肝脏，将4克左右的肝脏置于100毫升烧杯中，加入适量预冷的缓冲液A。用剪刀剪碎，使用预冷的线粒体分离缓冲液反复冲洗直至没有血液残留，此时缓冲液应保持清澈。
[0056] b.倒出残留的线粒体分离缓冲液。此时按照每1克肝脏需加入20毫升预冷的线粒体分离缓冲液，将80毫升预冷的线粒体分离缓冲液加入烧杯中。
[0057] c.将一半剪碎的肝脏混合物倒入玻璃匀浆机中，缓慢移动电钻研磨棒，中速匀浆3至4次，充分研磨后，将匀浆组织倒入1个50毫升离心管中，用20毫升预冷的线粒体分离缓冲液洗涤玻璃匀浆机中的残留匀浆组织，收集到50毫升离心管中，拧紧盖子。重复操作，将另一半剪碎的肝脏混合物充分匀浆后，用20毫升预冷的线粒体分离缓冲液洗涤玻璃匀浆机中的残留匀浆组织，收集到50毫升离心管中，盖好离心管。使用4℃离心机，700xg离心10分钟。
[0058] d.将漏斗置于预先使用线粒体分离缓冲液冲洗过的300毫升烧杯中，并在漏斗上放置双层棉布。离心后的匀浆组织用新的棉布依次过滤。离心得到的沉淀物弃于生物危害垃圾桶中。将过滤得到的组织上清液移至同样预先使用线粒体分离缓冲液冲洗过的离心管中。使用4℃离心机，14,000xg离心10分钟。
[0059] e.离心后，将离心管置于冰上。用纸巾擦去每个离心管上清液顶部的脂肪。废弃上清液，再一次擦去离心管中脂肪残留物。
[0060] f.每一个离心管中的沉淀物，用移液枪加入2毫升线粒体保存缓冲液，并用移液枪轻微重悬沉淀物。用线粒体保存缓冲液将每个离心管加至40毫升，盖好盖子。使用4℃离心机，10,000xg离心10分钟。倒出废弃上清液，重复重悬沉淀物。使用4℃离心机，10,000xg离心10分钟。
[0061] g.倒出废弃上清，每管沉淀物用1000微升线粒体保存缓冲液重悬。
[0062] h.将分离提取的线粒体转移至微量离心管并置于冰上保存。使用BCA蛋白定量检测方法对分离提取的线粒体蛋白浓度定量检测。计算出分离纯化后的线粒体浓度。
[0063] 所述新鲜大鼠肝脏完整的线粒体分离制备所用的线粒体分离缓冲液配制方法是：1)取15.31克甘露醇，9.59克蔗糖，0.48克HEPES，0.187克乙二醇二乙醚二胺四乙酸，2.0克牛血清白蛋白加入300毫升蒸馏水中，调节pH值到7.4，定容至400毫升，并用0.2微米孔径的滤器过滤后备用，此为线粒体分离缓冲液。
[0064] 所述新鲜大鼠肝脏完整的线粒体分离制备所用的线粒体保存缓冲液配制方法是：取15.31克甘露醇，9.59克蔗糖，0.81克氯化镁，0.35克磷酸氢二钾，0.84克3-(N-吗啉基)丙磺酸，0.19克乙二醇二乙醚二胺四乙酸加入300毫升蒸馏水中，调节pH值到7.4，定容至400毫升，并用0.2微米孔径的滤器过滤后备用，此为线粒体保存缓冲液。
[0065] 本发明还提供了一种更为具体的线粒体基础呼吸功能氧消耗速率检测法：
[0066] a.沿着96孔板底部边缘向每孔加入1微升药物化合物，尽量避免气泡产生。
[0067] b.将1管氧气猝灭型荧光探针加入15毫升呼吸功能缓冲液中，颠倒离心管多次充分混合，向96孔板中每孔加入100微升含有氧气猝灭型荧光探针的呼吸功能缓冲液，将96孔板置于30摄氏度恒温加热器上预热。
[0068] c.在15毫升基础呼吸功能缓冲液中加入适量的线粒体。轻微旋转离心管混匀后，倒入加样槽。快速向置于30摄氏度恒温加热器上预热的96孔板每孔加入100微升含有线粒体的基础呼吸功能缓冲液。
[0069] d.快速向每孔加入100微升预热的矿物油，去除气泡。
[0070] e.将96孔板置于酶标仪内，尽可能快开始检测20分钟内的基础呼吸功能氧消耗速率动力学曲线。
[0071] 本发明还提供了一种更为具体的线粒体氧化磷酸化作用氧消耗速率检测法：
[0072] a.沿着96孔板底部边缘向每孔加入1微升药物化合物，尽量避免气泡产生。
[0073] b.将1管氧气猝灭型荧光探针加入15毫升呼吸功能缓冲液中，颠倒离心管充分混匀，向96孔板中每孔加入100微升含有氧气猝灭型荧光探针的呼吸功能缓冲液，将96孔板置于30摄氏度恒温加热器上预热。
[0074] c.在15毫升氧化磷酸化作用缓冲液中加入适量的线粒体。轻微旋转离心管混匀后，倒入加样槽。快速向置于30摄氏度恒温加热器上预热的96孔板每孔加入100微升含有线粒体的氧化磷酸化作用缓冲液。
[0075] d.快速向每孔加入100微升预热的矿物油，去除气泡。
[0076] e.将96孔板置于酶标仪内，尽可能快开始检测20分钟内的氧化磷酸化作用的氧消耗速率动力学曲线。
[0077] 与现有技术相比，本发明建立的线粒体功能评价方法可以检测候选药物对分离纯化的大鼠肝脏线粒体氧消耗速率的影响来评估是否存在线粒体功能损伤。本方法分为两个方向对线粒体氧消耗速率进行评价，即线粒体基础呼吸功能与ADP驱动的氧化磷酸化作用。通过线粒体基础呼吸功能评价候选药物是否为线粒体电子传递链的解偶联剂；以谷氨酸和苹果酸为作用底物对ADP驱动的线粒体呼吸功能评价候选药物是否为氧化磷酸化作用的抑制剂。
[0078] 该方法利用一种特异型氧气结合型荧光探针，对分离提取的新鲜大鼠肝脏线粒体进行有氧呼吸氧消耗速率评估，从而计算出候选的小分子化合物对线粒体两个主要功能的影响，即糖酵解途径上的解偶联作用以及氧化磷酸化水平上的抑制作用。该方法成功的构建了一个体外模拟体内线粒体功能的评价模型，从而为筛选和鉴定针对完整的线粒体的功能检测提供了方法学平台。使用本发明可以高效的筛选线粒体呼吸功能中的潜在解偶联剂和抑制剂，从而预测对肝脏功能的毒副影响，避免小分子化合物潜在的线粒体功能危害，与现有技术相比，具有快速(3.5个小时以内得到结果)，结果稳定，准确度高等优势，并可用于大规模化合物库筛选评价小分子药物对线粒体呼吸功能的影响，这将促进在早期药物研发阶段评价候选药物，从而降低药物开发总的研发时间和投资成本，具有潜在的应用推广前景。附图说明
[0079] 图1为检测线粒体基础呼吸功能解偶联剂氧消耗速率图；
[0080] 图2检测化合物对基础呼吸功能的半数解偶联浓度(UC50)分析图；
[0081] 图3为检测线粒体氧化磷酸化水平抑制剂的氧消耗速率图；
[0082] 图4为检测化合物对线粒体氧化磷酸化水平的半数抑制浓度(IC50)分析图。
具体实施方式
[0083] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0084] 实施例1
[0085] 线粒体分离实验中的缓冲液与线粒体氧消耗速率实验中的反应溶液和化合物溶液配制方法
[0086] 1)取15.31克甘露醇，9.59克蔗糖，0.48克HEPES，0.187克乙二醇二乙醚二胺四乙酸，2.0克牛血清白蛋白加入300毫升蒸馏水中，调节pH值到7.4，定容至400毫升，并用0.2微米孔径的滤器过滤后备用，此为线粒体分离缓冲液。
[0087] 2)取15.31克甘露醇，9.59克蔗糖，0.81克氯化镁，0.35克磷酸氢二钾，0.84克3-(N-吗啉基)丙磺酸，0.19克乙二醇二乙醚二胺四乙酸加入300毫升蒸馏水中，调节pH值到7.4，定容至400毫升，并用0.2微米孔径的滤器过滤后备用，此为线粒体保存缓冲液。
[0088] 3)取34.4克蔗糖，0.40克氯化镁，0.45克氯化钾，0.18克乙二醇二乙醚二胺四乙酸加入300毫升蒸馏水中，并调节pH值到7.4，定容至400毫升，并用0.2微米孔径的滤器过滤后备用，此为呼吸功能缓冲液。
[0089] 4)取560微升0.5摩尔每升的谷氨酸与0.5摩尔每升的苹果酸混合液加入15毫升呼吸功能缓冲液备用，此为基础呼吸功能缓冲液。
[0090] 5)取560微升0.5摩尔每升的谷氨酸与0.5摩尔每升的苹果酸混合液，360微升100毫摩尔每升的5′-二磷酸腺苷溶液(ADP)加入15毫升呼吸功能缓冲液备用，此为氧化磷酸化作用缓冲液。
[0091] 6)取浓度最高为20毫摩尔/升的化合物溶液，用DMSO按照两倍稀释的方法稀释至6个浓度梯度，放置备用，此为化合物溶液。
[0092] 实施例2
[0093] 大鼠肝脏线粒体的制备方法
[0094] 1)将100克-180克的大鼠使用二氧化碳迅速安乐死后，剖腹取出肝脏，将4克左右的肝脏置于100毫升烧杯中，加入适量预冷的缓冲液A。用剪刀剪碎，用预冷的线粒体分离缓冲液反复冲洗直至没有血液残留，此时缓冲液应保持清澈。
[0095] 2)倒出残留的线粒体分离缓冲液。此时按照每1克肝脏需加入10毫升预冷的线粒体分离缓冲液，将40毫升预冷的线粒体分离缓冲液加入烧杯中。
[0096] 3)将一半剪碎的肝脏混合物倒入玻璃匀浆机中，缓慢移动电钻研磨棒，中速匀浆3至4次，充分研磨后，将匀浆组织倒入1个50毫升离心管中，用20毫升预冷的线粒体分离缓冲液洗涤玻璃匀浆机中的残留匀浆组织，收集到50毫升离心管中，拧紧盖子。重复操作，将另一半剪碎的肝脏混合物充分匀浆后，用20毫升预冷的线粒体分离缓冲液洗涤玻璃匀浆机中的残留匀浆组织，收集到50毫升离心管中，盖好离心管。使用4℃离心机，700xg离心10分钟。
[0097] 4)将漏斗置于预先使用线粒体分离缓冲液冲洗过的300毫升烧杯中，并在漏斗上放置一个双层棉布。离心后的匀浆组用新的棉布依次过滤。离心得到的沉淀物弃于生物危害垃圾桶中。将过滤得到的组织上清液移至同样预先使用线粒体分离缓冲液冲洗过的离心管中。使用4℃离心机，14,000xg离心10分钟。
[0098] 5)离心后，将离心管置于冰上。用纸巾擦去每个离心管上清液顶部的脂肪。废弃上清液，再一次擦去离心管中脂肪残留物。
[0099] 6)每一个离心管中的沉淀物，用移液枪加入2毫升线粒体保存缓冲液，并用移液枪轻微重悬沉淀物。用线粒体保存缓冲液将每个离心管加至40毫升，盖好盖子。使用4℃离心机，10,000xg离心10分钟。倒出废弃上清液，重复重悬沉淀物。使用4℃离心机，10000xg离心10分钟。
[0100] 7)倒出废弃上清，每个沉淀物用1000微升线粒体保存缓冲液重悬。
[0101] 8)将分离提取的线粒体转移至微量离心管并置于冰上保存。使用BCA蛋白定量检测方法对分离提取的线粒体蛋白浓度定量检测。计算出分离纯化后的线粒体浓度。
[0102] 实施例3
[0103] 大鼠肝脏线粒体基础呼吸功能的解偶联剂的评价方法
[0104] 1)将1管氧气猝灭型荧光探针加入15毫升基础呼吸功能缓冲液中，颠倒离心管充分混匀，向96孔板中每孔加入100微升含有氧气猝灭型荧光探针的基础呼吸功能缓冲液，将96孔板置于30摄氏度恒温加热器上预热。
[0105] 2)沿着96孔板底部边缘向每孔加入1微升药物化合物，尽量避免气泡产生。
[0106] 3)在15毫升基础呼吸功能缓冲液中加入24毫克分离提取的大鼠肝脏线粒体。轻微旋转离心管混匀后，倒入加样槽。快速向置于30摄氏度恒温加热器上预热的96孔板每孔加入100微升含有线粒体的基础呼吸功能缓冲液。
[0107] 4)快速向每孔加入100微升预热的矿物油，去除气泡。
[0108] 5)将96孔板置于酶标仪内，尽可能快开始检测20分钟内的基础呼吸功能氧消耗速率动力学曲线(如图1所示)并计算化合物的半数解偶联浓度(UC50，图2)。
[0109] 使用氧消耗速率动力学曲线实验测量所述荧光标记探针的氧消耗速率并计算检测化合物的半数解偶联浓度UC50，如半数解偶联浓度UC50小于20微摩尔/升，则所述检测化合物为大鼠肝脏线粒体基础呼吸功能的解偶联剂。从图2可以看出，FCCP、DMSO都不是大鼠肝脏线粒体基础呼吸功能的解偶联剂。
[0110] 实施例4
[0111] 大鼠肝脏线粒体氧化磷酸化作用抑制剂的评价方法
[0112] 1)将1管氧气猝灭型荧光探针加入15毫升呼吸功能缓冲液中，颠倒离心管充分混匀，向96孔板中每孔加入100微升含有氧气猝灭型荧光探针的呼吸功能缓冲液，将96孔板置于30摄氏度恒温加热器上预热。
[0113] 2)沿着96孔板底部边缘向每孔加入1微升药物化合物，尽量避免气泡产生。
[0114] 3)在15毫升氧化磷酸化作用缓冲液中加入6毫克线粒体。轻微旋转离心管混匀后，倒入加样槽。快速向置于30摄氏度恒温加热器上预热的96孔板每孔加入100微升含有线粒体的氧化磷酸化作用缓冲液。
[0115] 4)快速向每孔加入100微升预热的矿物油，去除气泡。
[0116] 5)将96孔板置于酶标仪内，尽可能快开始检测20分钟内的氧化磷酸化作用的氧消耗速率动力学曲线(图3)并计算化合物的半数抑制浓度(IC50，图4)。
[0117] 使用氧消耗速率动力学曲线实验测量所述荧光标记探针的氧消耗速率并计算检测化合物的半数抑制浓度IC50，如半数抑制浓度IC50小于20微摩尔/升，则所述检测化合物为大鼠肝脏线粒体氧化磷酸化作用的抑制剂。从图4可以看出，Nefazodne为大鼠肝脏线粒体氧化磷酸化作用的抑制剂。
[0118] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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