[0001] 技术领域：
[0002] 本
发明涉及一种低档茶叶及制茶下脚料高效综合利用的绿色方法，特别涉及的是一种从低档茶叶中提取生物活性物质的方法。
[0003] 背景技术：
[0004] 茶叶作为中华民族的传统保健饮料，已有四五千年的历史。自改革开放以来，在茶叶产业快速发展的同时，传统的茶叶产品出现供过于求的状况，并日渐突出，每年有相当数量滞销的低档茶叶（春茶、夏茶）和大量的制茶下脚料被废弃，急待开发茶叶的新用途和综合利用的绿色技术，不能有资源的巨大浪费。
[0005] 多学科的交叉与渗透开展大量研究的结果已证实，在低档茶叶及制茶下脚料中，都含有丰富的茶多糖、茶多酚、茶
氨酸、γ—氨基丁酸、叶绿素、叶黄素酯、咖啡
碱等具有明显药理保健功能的生物活性物质，开发出一种高效综合利用的绿色方法，把这些生物活性物质都提取分离出来，实现原料的综合全利用，不仅会产生显著的经济效益、社会效益和环境效益，还有助于茶叶产业的持续发展。
[0006] 目前，国内有关茶叶及制茶下脚料中茶多酚等生物活性物质的提取分离方法的
专利申请，有CN1344748A、CN1379044A、CN1431226A、CN1176748A，这些专利中：一是多数专利申请都只从原料中提取分离了一种、二种、三种生物活性物质，综合利用程度很差；二是在提取分离过程中都使用了毒性大的三氯甲烷、都使用了在操作过程中容易分解为乙酸和
乙醇的
醋酸乙酯，存在污染环境和
溶剂耗量大的问题；三是在提取分离过程中使用的有关辅料循环套用的程度也很差；四是都还没有采用能大幅度节能降成本、产品
质量有保证、符合GMP要求的国内外领先的成套设备，诸如低温亚临界萃取设备、膜分离浓缩设备、双效降膜
蒸发器、
真空低温
微波干燥机等。另有CN1557841A，虽然提取分离出了茶多糖、茶多酚和咖啡碱，但综合利用的程度还是差，且在辅料中仍用了毒性大的三氯甲烷和容易分解的醋酸乙酯。
[0007] 发明内容：
[0008] 针对上述不足，本发明的目的是为了提供一种成本低，绿色环保，适合规模化生产的从低档茶叶及制茶下脚料中提取生物活性物质的方法。
[0009] 本发明的目的是这样来实现的：
[0010] 本发明从低档茶叶及制茶下脚料中提取生物活性物质的方法，包括以下步骤：
[0011] 1）将原料
粉碎成20～40目粗粉，加重量为粗粉重量8～12倍的
水，于pH值5～6、70～90℃进行提取与分离，得到水提取液和湿料渣，水提取液，用732大孔阳离子交换
树脂吸附与分离，得到咖啡碱和未被732大孔阳离子交换树脂吸附的水溶液；
[0012] 2）步骤1）中未被732大孔阳离子交换树脂吸附的水溶液，调pH值为3～3.5后，经3500Da膜
超滤和离心过滤，得到滤液和固形物，滤液用大孔吸附树脂进行吸附与分离，得到茶多酚和未被大孔吸附树脂吸附的酸性水溶液；
[0013] 3）未被大孔吸附树脂吸附的酸性水溶液，经真空低温蒸馏，得到蒸馏水和浓缩液，浓缩液经醇沉与分离，得到茶多糖和乙醇水溶液；
[0014] 4）从乙醇水溶液中回收乙醇后，用732大孔阳离子交换树脂吸附与分离，得到茶氨酸和一氨茶丁酸；
[0015] 5）在步骤1）中得到的湿料渣和步骤2）中的固形物合并，采用亚临界萃取设备，用萃取剂进行低温萃取，得到萃取物和萃余物（蛋白
饲料，干品）；
[0016] 6）步骤5）中得到的萃取物，用
氧化铅柱层析分离，得到高纯叶黄素酯（橙黄色固体粉末）和叶绿素（墨绿色固体分末）。
[0017] 本发明从低档茶叶及制茶下脚料中提取生物活性物质的方法，具体包括以下步骤：
[0018] 1）将原料（低档茶叶及制茶下脚料）粉碎成20—40目粗粉，加重量为粗粉6～8倍重量的水（
自来水，蒸馏水），在提取容器中开始搅拌下加热升温，同时加重量百分浓度为25～35%的
磷酸水溶液调pH值5～6，容器内保温70～90℃搅拌提取1.5～2小时，停止加热与搅拌，吸滤出一次水提取液，在容器内另加重量为粗粉6～8倍重量的水，重复同样操作出料过滤，得到湿料渣和两次合并的清亮，pH5～6的水提取液。
[0019] 水提取液，用事先处理成H型的732大孔阳离子交换树脂，于常温慢速搅拌下进行吸附；732大孔阳离子交换树脂的用量，根据水提取液中咖啡碱（CAF）的含量和732大孔阳离子交换树脂的交换容量，进行测算后过量10～15%，吸附1～2小时，用非水滴定法快速检测达到吸附终点即溶液中几乎无咖啡碱（CAF）时，停止搅拌，出料过滤，得到吸附有咖啡碱（CAF）的732大孔阳离子交换树脂和未被732大孔阳离子交换树脂吸附的水溶液；
[0020] 吸附有咖啡碱（CAF）的732大孔阳离子交换树脂、用乙醇（如95%乙醇，无水乙醇）于60～65℃慢速搅拌下进行洗脱，乙醇用量为732大孔阳离子交换树脂体积的2倍体积，1～2小时后，停止加热与搅拌，出料过滤，得到732大孔阳离子交换树脂和乙醇洗脱液，乙醇洗脱液于60～70℃真空蒸馏与干燥，得到乙醇，馏出液和咖啡碱（CAF）；
[0021] 2）将步骤1）中未被732大孔阳离子交换树脂吸附的水溶液，于常温搅拌下用重量百分浓度为25～35%的磷酸水溶液调pH3—3.5，经3500Da带负电荷的的膜超滤，得到膜透过液和截留液，截留液经离心机过滤得到滤液（与膜透过液合并）和固形物（用于蛋白饲料中）；
[0022] 含有滤液的膜透过液于常温慢速搅拌下，加大孔吸附树脂进行吸附，大孔吸附树脂的用量为茶多酚（TP）含量的2～2.5倍重量并过量10～15%，吸附1～2小时，取溶液看几乎无色时为吸附终点，停止搅出料过滤，适量蒸馏水洗涤大孔吸附树脂1～2次，得到吸附有茶多酚（TP）的大孔吸附树脂和未被大孔吸附树脂吸附的含洗水的酸性水溶液；
[0023] 吸附有茶多酚（TP）的大孔吸附树脂加到乙醇中，于40～50℃慢速搅拌下进行洗脱，乙醇用量以慢速搅拌下能混匀物料为宜，1～1.5小时后停止搅拌，吸滤出一次洗脱液，另加乙醇重复同样操作1～2次，直到洗脱液几乎无色为止，得到大孔吸附树脂和几次合并的乙醇洗脱液；
[0024] 乙醇洗脱液用
反渗透膜分离与过滤，得到乙醇膜透过液和截留液；截留液经低温真空干燥，得到乙醇馏出液和茶多酚（TP）；
[0025] 3）步骤2）中未被大孔吸附树脂吸附的pH3—4酸性水溶液，于常温60～70℃高真空蒸馏浓缩，得到蒸馏水馏出液和浓缩液，浓缩液用体积为浓缩液体积2～3倍的乙醇，于常温搅拌混匀、静置、过滤分离，得到
滤饼和乙醇滤液。滤饼于60～70℃真空干燥得到乙醇馏出液和茶多糖（TPS）；
[0026] 4）步骤3）中得到的乙醇滤液，先回收乙醇，后用732大孔阳离子交换树脂柱层析分离，得到茶氨酸（TAA）和γ—氨基丁酸（GABA）；
[0027] 5）在步骤1）中得到的湿料渣，经
造粒或压片后，用萃取剂于40～50℃、0.6～0.7MPa进行低温亚临界萃取与分离，得到固形物和液体，二者分别在排压至常压的同时、其中的萃取剂被蒸发成气体、再被压缩
液化而套用，进而得到蛋白饲料萃余物和萃取物（浆状物）；
[0028] 6）步骤5）中得到的萃取物，经40～50℃蒸馏水洗涤分离，得到不溶于水的糊状物和洗水（加入步骤1的水提取水溶液中套用），不溶于水的糊状物，用其重量3倍的体积无水乙醇和石油醚混剂，于常温搅拌0.5～1小时后，另加脱水剂（如无水
硫酸钠），继续搅拌10～20分钟，停止搅拌，静置1～2小时，先吸出上层液，后过滤下层，得到固形物和滤液（含上层液），固形物如呈兰绿色则用少量无水乙醇洗1～2次（洗液与滤液合并）后，经干燥得到无水硫酸钠（套用）；
[0029] 滤液用中性氧化
铝柱进行分离：柱子Φ︰H=1︰20；氧化铝粉为100～200目；柱中氧化铝粉事先用石油醚润湿；滤液上完柱后，先用石油醚洗脱，直到洗脱液无色为止，得到含少量的乙醇的石油醚洗脱液；再用乙醇洗脱，直到洗脱液无色为止，得到乙醇洗脱液和氧化铝粉层析柱（套用）；
[0030] 石油醚洗脱液与上柱时的过柱液合并，于60～70℃真空蒸馏得到馏出液（含少量乙醇的石油醚，套用）和浓缩液，此浓缩液经重结晶得到叶黄素酯（橙黄色固体粉末）；
[0031] 乙醇洗脱液于60～70℃真空蒸馏与干燥，得到乙醇馏出液和叶绿素（墨绿色固体粉末）。
[0032] 上述的大孔吸附树脂采用D101大孔吸附树脂或AB—8大孔吸附树脂，萃取剂采用二甲醚或正
丁烷或丙烷，石油醚的沸点为60～90℃，乙醇采用体积百分浓度为95%的乙醇或无水乙醇。
[0033] 本发明具有以下优点:
[0034] 1、工艺流程短而简便，且从原料中分离出了咖啡碱、茶多酚、茶多糖、茶氨酸、γ—氨基丁酸、蛋白饲料、叶绿素、叶黄素酯，实现了原料的综合全利用和辅料的循环套用，成功地革除了辅料中毒性大的三氯甲烷和使用过程中易分解为乙酸和乙醇的醋酸乙酯。
[0035] 2、工艺流程中选用的低温亚临界萃取设备、膜分离浓缩机、双效降膜
蒸发器、真空低温微波干燥机，均为国内外先进的符合GMP要求的成套设备，不仅节能、产品质量有保证、生产能
力大，还对DME等溶剂的回收套用率可提升到99%，还可强化工艺流程的环境友好。继后又完成了放大试验。得到了成本低、效益高、绿色环保、适合规模化生产的有益效果。
[0036] 具体实施方式：
[0038] 本实施例1从低档茶叶中提取生物活性物质的方法，包括以下步骤：
[0039] 1）称取低档茶叶500克，粉碎成20目 ，加入5升提取容器中，加自来水3000ML，在水浴上搅拌下开始加热升温，同时用浓度30%左右磷酸水溶液调pH5.0，当容器内物料
温度达70℃时，保温70～75℃搅拌提取1.5小时，停止加热与搅拌，吸滤出一次水提取液。在容器内另加自来水3升，重复同样操作，出料过滤得到第二次水提取液和湿料渣（经大玻塞
挤压过）
731克。合并两次的水提取液有5583克，pH为5.0；
[0040] 水提取液，于常温和慢速搅拌下，把事先处理成H型的732大孔阳离子交换树脂加进去进行吸附（732大孔阳离子交换树脂用量230克，在计算量上过量15%），0.5小时后用非水滴定法快速检测，溶液中还有CAF，继续搅拌，又过0.5小时经检测到终点，停止搅拌出料抽滤，得到吸附有CAF的732大孔阳离子交换树脂和未被732大孔阳离子交换树脂吸附的水溶液5480克。
[0041] 吸附有CAF的732大孔阳离子交换树脂，加到搅拌下的95%乙醇中（95%乙醇300毫升，能使物料混匀），保温60℃慢速搅拌洗脱1小时，吸滤出一次洗脱液。另加95%乙醇300毫升，重复同样操作，0.5小时后达到洗脱终点，停止加热与搅拌出料过滤，少量95%乙醇洗树脂一次，得到732大孔阳离子交换树脂（套用）和合并两次的乙醇洗脱液（含洗涤液）。乙醇洗脱液，于60℃真空蒸馏与干燥，得到馏出液（乙醇，套用）和咖啡碱（CAF）5.1克，淡黄白色固体粉末；纯度88%，GB8312—87方法）；
[0042] 2）步骤1）中未被732大孔阳离子交换树脂吸附的水溶液5480克，于常温搅拌下用重量百分浓度30%左右的磷酸水溶液调pH值3～3.5，用3500Da带负电荷的膜超滤机分离与浓缩，得到膜透过液和截留液。截留液经抽滤得到滤饼和滤液（与膜透过液合并）。滤饼中含
植物蛋白、植物胶、鞣质、
纤维素等，经干燥后与蛋白饲料合并；
[0043] 膜透过液（含滤液）5380克，于常温和慢速搅拌下，加D101大孔吸附树脂150克进行吸附：D101大孔阳离子交换树脂用量为TP含量的2～2.5倍重量并过量15%；TP含量用GB8313—2002方法测定；1小时后取溶液看为淡黄色；再过0.5小时后取溶液已无色，停止搅拌出料抽滤，并用蒸馏水洗涤2次，得到吸附有TP的D101树脂和未被D101树脂吸附的酸性水溶液（含洗水，pH3.5）4630克；
[0044] 吸附有TP的D101树脂，用95%乙醇于40～～45℃慢速搅拌下进行洗脱（95%乙醇用量以慢速搅拌下能混匀物料为宜），保温40～45℃0.5小时后停止搅拌，15分钟后吸滤出液体，另加95%乙醇重复同样操作1～2次，直到洗脱液几乎无色为止，停止加热出料过滤，得到D101树脂（套用）和几次合并的乙醇洗脱液；
[0045] 乙醇洗脱液，用
反渗透膜分离与浓缩，得到膜透过液（乙醇，套用）和截留液。截留液于60℃0.095mPa蒸馏与干燥，得到馏出液（乙醇，套用）和茶多酚（TP）56克，橙黄色固体粉末，ECG.EGCG.GCG、3种
儿茶素含量为93.26%，型HPLC法）；
[0046] 3）步骤2）中的未被D101树脂吸附的酸性水溶液（pH3.5）4630克，用玻璃
旋转蒸发器于70℃0.095mPa蒸馏浓缩，得到馏出液（蒸馏水，套用）和浓缩液（608克）；
[0047] 浓缩液加到搅拌下的1200毫升无水乙醇中，10分钟后停止搅拌，于常温静置1.5小时，先吸出上层液，下层抽滤，得到乙醇滤液（含上层清液）和滤饼。滤饼用无水乙醇转入蒸馏瓶中，于60℃0.095mPa旋转蒸馏与干燥，得到馏出液（乙醇，套用）和茶多糖（TPS）1.6克，灰白色固体粉末，总糖含量60.1%，
苯酚—硫酸法；
[0048] 4）步骤3）中得到的乙醇滤液，于60℃0.095mPa蒸馏回收乙醇后得到的浓缩液，直接上事先处理成H型的732树脂层析柱，用PH8～9
磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集在多个容器内，由TLC法检测，分别合并TAA单一组分、GABA单一组分、TAA和GABA交叉组分的洗脱液；
[0049] TAA单一组分，经60～70℃0.095mPa蒸馏与浓缩得到馏出液（蒸馏水，套用）和膏状物，后者经无水乙醇重结晶得到茶氨酸（TAA）纯品3.8克，白色结晶性粉末，纯度96.3%，HPLC法；
[0050] GABA单一组分，按TAA单一组分同样方法，得到γ—氨基丁酸（GABA）纯品0.9克，白色结晶性粉末，纯度95.6%，HPLC法；
[0051] TAA与GABA交叉组分，下批上柱时套用。上柱时的过柱液（pH3.5水液）供步骤1）进行水提取时套用；
[0052] 5）在步骤1）中得到的731克湿料渣，经造粒后用DME萃取剂于40～50℃0.7mPa进行萃取与分离得到固形物和液体，二者分别在排压至常压的同时、其中的DME被蒸发成气体、再被压缩液化而套用，得到萃余物（即蛋白饲料，浅黄白色细粒，346克）和萃取物（黄绿色，380克）；
[0053] 6）步骤5）中得到的萃取物中，加200克50℃蒸馏水，慢速搅拌混匀5分钟，于45～50℃保温静置分层，约1小时放出下层水（加入下批的水提取液中套用）；
[0054] 上层不溶于水的糊状物有63克加到180毫升混合剂（含少量无水乙醇的石油醚）中，于常温搅拌下溶解0.5小时，另加脱水剂（无水硫酸钠）（加入量以溶液变清亮为宜），继续搅拌0.5小时后停止搅拌，静置大约2小时，吸出上层，下层过滤，得到固形物和滤液。固形物如有
颜色，用无水乙醇洗1～2次（洗液与滤液合并）后，经干燥得到无水硫酸钠（白色固体粉末，套用）；
[0055] 上层液、滤液、洗液合并，用中性氧化铝粉层析柱进行分离：中性氧化铝粉100～200目、用量为200～300克（是叶绿素含量的50倍）、事先用石油醚润湿，玻璃柱Φ：H为1：20；
上柱完后先用BP60～90℃石油醚洗脱，直到洗脱液几乎无色为止；然后用无水乙醇洗脱，直到洗脱液几乎无色为止。得到氧化铝粉层析柱（套用）、乙醇洗脱液、过柱液与石油醚洗脱液的合并液；
[0056] 乙醇洗脱液，用反渗透膜分离浓缩，得到膜透过液（乙醇，套用）和截留液。截留液于60℃真空干燥得到馏出液（乙醇，套用）和4.2克叶绿素（墨绿色固体粉末，纯度98%，紫外可见分光光度法）；
[0057] 合并液于60℃0.095mPa蒸馏得到馏出液（含少量乙醇的石油醚，套用）和浓缩液。浓缩液经重结晶得到0.8克叶黄素酯（橙黄色固体粉末，纯度81.3%，紫外可见分光光度法）。
[0058] 实施例2：
[0059] 本实施例2从低档绿茶中提取生物活性物质的方法，除低档绿茶500克改为绿茶末500克外，其他条件与实施例1相同。所提取分离得到的咖啡碱有3.9克、茶多酚35.2克、茶多糖有0.9克、茶氨酸有2.3克、γ—氨基丁酸0.36克、叶绿素3.1克、叶黄素酯0.3克、蛋白饲料
330克。
[0060] 实施例3：
[0061] 本实施例3从低档绿茶中提取生物活性物质的方法，包括以下步骤：
[0062] 1、称取低档绿茶50公斤，粉碎成20目，加入500升搪瓷反应罐中，另加自来水300升，开始搅拌下加热升温，同时用浓度30%左右磷酸水溶液调PH5.0。当罐内温度达70℃时，保温70～75℃搅拌提取1.5小时，停止加热与搅拌，经安装在罐内的有滤层头的管子吸滤出第一次水提取液。在罐内另加300升自来水，重复同样操作，从罐底正中料口出料，经自动
排渣过滤机过滤，得到72公斤湿料渣和两次合并的水提取液560公斤（清亮，pH5.0）；
[0063] 560公斤水提取液，在1M3的搪瓷反应罐中，于常温和慢速搅拌下，把23公斤事先处理成H型的732大孔阳离子交换树脂加进去进行吸附，1.5小时达终点，停止搅拌，出料经离心机过滤，得到吸附有咖啡碱（CAF）的732大孔阳离子交换树脂和未被732大孔阳离子交换树脂吸附的水溶液542公斤；
[0064] 吸附有CAF的732大孔阳离子交换树脂，加到100升的搪瓷反应罐内，另加95%乙醇30升，开始慢速搅拌下加热升温，当罐内温度达60℃时，保60～65℃慢速搅拌洗脱1.5小时，停止加热搅拌，出料加入离心机中过滤（先自然过滤、后离心甩干；再从罐内放入60～65℃的95%乙醇洗涤与甩干一次），得到乙醇洗脱液和732树脂（套用）；
[0065] 乙醇洗脱液，用5升玻璃旋转蒸发器于60℃、0.09mPa蒸馏浓缩，得到馏出液（乙醇，套用）和浓缩液。浓缩器装入盘内，于60℃真空微波干燥，得到馏出液（稀乙醇，套用）和咖啡碱（CAF）0.6公斤（微黄白色固体粉末，纯度90.5%，GB8312—87方法）；
[0066] 2）步骤1）中未被732大孔阳离子交换树脂吸附的水溶液542公斤，在1M3搪瓷反应罐中，于常温搅拌下，用浓度30%左右的磷酸水溶液调pH3.0～3.5，用3500Da带负电荷的膜超滤机分离与浓缩，得到膜透过液和截留液。截留液再经离心机过滤得到滤液和滤饼（有植物蛋白、植物胶、鞣质、
纤维素等）。滤饼经干燥后，与蛋白饲料合并；
[0067] 滤液与膜透过液合并共有538公斤，在1 M3搪瓷反应罐内，于常温和慢速搅拌下，加D101大孔吸附树脂15公斤进行吸附，1.5小时检测溶液几乎无色，停止搅拌出料离心过滤，并用适量蒸馏水洗涤D101树脂1～2次，得到吸附有TP的D101树脂和未被D101树脂吸附的酸性水溶液（含洗水）483公斤，pH3.5；
[0068] 吸附有TP的D101树脂，在1M3搪瓷反应罐内，加95%乙醇420升，在慢速搅拌下开始加热升温，当罐内温度达40℃时，保温40—45℃0.5小时，停止加热与搅拌，15分钟后，吸滤出第一次洗脱液。在罐内另加400升95%乙醇，重复同样操作1—2次，直到洗脱液几乎无色为止，出料离心过滤（先自然过滤，后甩于），得到D101树脂（套用）和几次合并的乙醇洗脱液；
[0069] 乙醇洗脱液，用反渗透膜分离与浓缩，得到膜透过液（乙醇，套用）和截留液。截留液装入盘内，于60℃真空微波干燥，得到馏出液（乙醇，套用）和茶多酚（TP）6公斤，橙黄色固体粉末，ECG、EGCG、GCG、3种几茶素含量93.8%，HPLCI法；
[0070] 3）步骤2）中的未被D101树脂吸附的酸性水溶液（PH35）483公斤，用双效降膜蒸发器于70℃0.09MP蒸馏与浓缩，得到馏出液(蒸馏水，套用)和浓缩液66公斤；
[0071] 在500升搪瓷反应罐中，加95%乙醇200升,于常温搅拌下把66公斤浓缩液加进去,10—15分钟后停止搅拌,常温静置1.5小时,吸出上层液,下层料液放入离心机内先自然过滤、后离心甩干，得到乙醇水溶液（含上层液和滤液）和湿滤饼。湿滤饼入盘内，于60℃真空微波干燥，得到馏出液（稀乙醇，套用）和茶多糖（TPS）0.2公斤，灰白色固体粉末，总糖含量
60%,苯酚—硫酸法；
[0072] 4）步骤3）中得到的乙醇水溶液，用双效降膜蒸发器于60℃0.09mPa蒸馏得到馏出液（乙醇，套用）和浓缩液（pH3.5）53公斤。此浓缩液，直接上事先处理成H型的732树脂层析柱，用PH8—9的磷酸盐缓冲液梯度洗脱，由TLC法检测，分别合并TAA单一组分、GABA单一组分、TAA与GABA交叉组分的洗脱液；
[0073] TAA单一组分洗脱液，用双效降膜蒸发器蒸馏浓缩，得到馏出液（乙醇，套用）和浓缩液。浓缩液用稀磷酸水溶液调pH5—6后，用无水乙醇重结晶2次，得到茶氨酸（TAA）纯品0.36公斤(白色结晶性粉末，纯度93.2%，HPCC法)；
