专利汇可以提供降血糖功效的植物乳杆菌及其筛选方法和应用药剂及食品专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供一种 植物 乳杆菌,该植物乳杆菌的保藏编号为CCTCC M 2019591,拉丁文名称为Lactobacillus plantarum CT152;提供一种具有降血糖功能的药剂,该药剂采用上述的植物乳杆菌。并提供一种植物乳杆菌的筛选方法,包括如下步骤:S1:进行益生指标测定;S2:进行抗 氧 化能 力 测定;S3:进行乳酸菌的抗糖尿病特性的检测;S4:进行体内实验的验证。本发明系统地建立起降糖乳酸菌的体外高效筛选方法,通过PCA和AHP结合的方式筛选得到一株有较好降糖效果的发明菌株CCTCC M 2019591,并得到了体内实验的效果验证。,下面是降血糖功效的植物乳杆菌及其筛选方法和应用药剂及食品专利的具体信息内容。
1.一种植物乳杆菌,其特征在于:该植物乳杆菌的保藏编号为CCTCC M 2019591,拉丁文名称为Lactobacillus plantarum CT152。
2.一种具有降血糖功能的药品及食品,其特征在于:采用权利要求1所述的植物乳杆菌。
3.一种植物乳杆菌的筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1:进行益生指标测定,包括模拟的胃肠液中的存活率测定、胆盐耐受力测定、对Caco-
2细胞的粘附能力测定及抗生素耐药性检测;
S2:进行抗氧化能力测定;
S3:进行乳酸菌的抗糖尿病特性的检测,包括大鼠肠道α-glucosidase活力抑制率的测定和乳酸菌干预高糖刺激胰岛细胞分泌胰岛素实验。
4.根据权利要求3所述的植物乳杆菌的筛选方法,其特征在于:所述进行抗氧化能力测定的步骤,具体包括:乳酸菌清除DPPH能力的测定、乳酸菌清除羟自由基能力测定、乳酸菌抗脂质过氧化能力测定、乳酸菌的还原能力测定及乳酸菌的GSH-Px和T-SOD的酶活测定。
5.根据权利要求3所述的植物乳杆菌的筛选方法,其特征在于:还包括进行体内实验验证的步骤,具体包括2型糖尿病模型大鼠的构建及进行灌胃治疗。
6.根据权利要求3所述的植物乳杆菌的筛选方法,其特征在于:所述模拟的胃肠液中的存活率测定的具体步骤包括:将乳酸菌用0.85%生理盐水重悬后,在pH为3的模拟胃液中将其菌液密度调节为1×109CFU/mL,混匀后将其放置于37℃培养1,2和3h后分别计活菌数,在模拟胃液中培养3h后,取1mL培养液加入至9mL pH为8的模拟肠液中,混匀后于37℃培养,分别于2、4和8h检测活菌数,用MRS固体培养基37℃培养24-48h,计算其存活率,存活率(%)=[log CFU N1/log CFU N]×100%
N1=经过模拟胃肠液处理之后的乳酸菌活菌数,N0=未处理前乳酸菌的活菌数。
7.根据权利要求3所述的植物乳杆菌的筛选方法,其特征在于:所述胆盐耐受力测定的步骤包括:培养18h-24h的乳酸菌按2-5%分别接种于含有或不含有0.3%胆盐的MRS-THIO培养基中,混合物于37℃培养16-24h,每隔一段时间在600nm;处测吸光值,记录不加胆盐和加了胆盐的培养基吸光值达到0.3个单位时各自所需的时间,这两个时间差即为乳酸菌在胆盐中生长的延迟时间,延迟时间设为LT,LT越短说明乳酸菌,耐受胆盐的能力越强;所述MRS-THIO培养基中中的MRS含有0.2%的巯基乙酸钠。
8.根据权利要求3所述的植物乳杆菌的筛选方法,其特征在于:所述对Caco-2细胞的粘附能力测定的步骤包括:Caco-2细胞生长在含有20%胎牛血清,1%L-谷氨酰胺,1%非必需氨基酸和1%双抗的高糖DMEM培养液中,37℃,5%CO2的培养箱中进行培养,隔天更换一次培养液,等细胞增殖融合率达80%左右时,以含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化细胞,按1:2-
1:3传代,取对数生长期细胞进行试验;
将新鲜培养的乳酸菌用PBS洗两次,调节细菌浓度为1×109CFU/mL,悬浮于100mg/mL异硫氰酸荧光素中,37℃暗处作用0.5-1h,用PBS洗涤4次去除未结合的FIFC,将Caco-2细胞以
4×105-5×105cell/孔接种于6孔板,37℃培养16-24h,将FIFC标记的乳酸菌重悬于DMEM培
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养基中,调整其密度为1×10 CFU/mL,将此菌悬液加入到Caco-2细胞单层中,37℃作用1-
2h,用无菌PBS洗涤3次,将未粘附的菌洗脱掉,之后每个培养的孔中加入胰酶作用,待细胞完全脱落,加入0.4mL完全培养基终止反应,收集液体,用多功能酶标仪测定其荧光强度来计算其细菌的黏附率;
粘附率(%)=Log A/Log A0×100%;
其中,A和A0分别表示乳酸菌粘附细胞前后的荧光强度。
9.根据权利要求3所述的植物乳杆菌的筛选方法,其特征在于:所述乳酸菌清除DPPH能力测定的步骤包括:反应体系中加入1mL乳酸菌的菌悬液,无细胞提取物或者发酵上清液,再加入1mL0.2mmol/L DPPH的无水乙醇,震荡充分混匀,在室温下避光反应30min,再于
6000rpm离心10min,取其上清,517nm波长处测定样品吸光度既OD值,用等体积的生理盐水代替样品溶液作为对照组,并以等体积的生理盐水和无水乙醇的混合液作为空白调零,按照以下公式计算:
DPPH自由基的清除率=[1-A517(样品)/A517(对照)]×100%;
所述乳酸菌抗脂质过氧化能力测定的步骤包括:0.5mL pH 7.4的PBS中加入1mL亚油酸乳化液,加入0.2mL0.01%的硫酸亚铁和0.01%的抗坏血酸,再加入0.5mL发酵上清,菌悬液或者细胞提取物,混匀后放置于37℃水浴中反应12h,取2mL反应液加入0.2mL0.4%的三氯乙酸,2mL0.8%的硫代巴比妥酸和0.2mL0.4%BHT,震荡充分混匀后,在100℃下反应30min,直至样品冷却后再加入2mL三氯甲烷进行抽提,离心10min后,收集上清,532nm波长下测定样品OD值,以PBS作为空白对照,按照下式计算乳酸菌抗脂质过氧化的能力:
抗脂质过氧化率=[1-A532(样品)/A532(空白)]×100%;
所述乳酸菌的还原能力测定的步骤包括:0.5mL菌悬液或细胞提取物中加入1%铁氰化钾0.5mL,0.5mLph为6.6的PBS,震荡充分混匀,于50℃中水浴20min,样品替换为蒸馏水后可作为对照组,在冰浴中急速冷却后,加入0.5mL10%的三氯乙酸,3000rpm离心10min,取其
1mL上清后加入1mL0.1%的FeCL3,反应10min后在700nm波长下测定样品的OD值,结果采用半胱氨酸作为标准表征还原力,计算公式如下:
还原能力=[A700(样品)-A700(对照)/A700(对照)]×100%。
10.根据权利要求3所述的植物乳杆菌的筛选方法,其特征在于:所述大鼠肠道α-glucosidase活力抑制率测定的步骤包括:在150μL PBS(0.1M pH6.8)中加入75μL20mM的PNPG溶液及25μL,PBS为0.1M ph值为6.8。待测乳酸菌的发酵上清,无细胞提取物和完整细胞,将混合物于37℃水浴10min,加入50μL大鼠肠道提取的α-glucosidase溶液,α-glucosidase溶液为0.17U/mL,继续反应10min,加入1mL0.1M Na2CO3作为反应终止液,并将反应液于405nm处测其吸光值,吸光值与对硝基酚的游离量成正比,反应体系中采用pH6.8的0.1M PBS作为α-glucosidase溶液及待测样品的空白对照,采用以下公式计算样品的抑制活性,
酶抑制率(%)=[1-(C-D)/(A-B)]×100%;
其中:A为含有α-glucosidase溶液但不含样品的测定吸光;
B为不含α-glucosidase溶液及待测样品的测定吸光值;
C为含有α-glucosidase溶液及待测样品的测定吸光值;
D为不含α-glucosidase溶液但含待测样品的测定吸光值。
11.根据权利要求3所述的植物乳杆菌的筛选方法,其特征在于:所述乳酸菌干预高糖刺激胰岛细胞分泌胰岛素实验的步骤包括:乳酸菌在MRS液体培养基中厌氧传代2次,每次
37℃下孵育18h,使菌株活力达到最高值,对菌悬液以灭菌的PBS缓冲液进行梯度稀释,采用平板倾注法,在MRS固体培养基上37℃培养24-48h,测定活菌数,并保证每个平板30-300的活菌菌落,根据菌粉活菌数,配制1×109CFU/mL的菌悬液,经过120kw超声破碎,然后65℃、
30-60min灭活处理,8000×g离心获得菌体混合物沉淀,用不含双抗的INS-1细胞培养液进行重悬,作为GSIS实验刺激细胞的培养液,储存于4℃待用,
INS-1细胞以4×105-5×105cells/mL的密度接种于6孔板,孵育过夜待细胞贴壁,然后换用含有灭活菌液的细胞培养液孵育16-24h,对细胞进行不同益生菌株的干预作用,各组细胞处理结束后,细胞用磷酸盐缓冲液洗2次,加入葡萄糖浓度16.7mmol/L的高糖INS-1完全培养液,37℃下孵育0.5-1h,然后收集细胞上清液,用ELISA法检测各组在高葡萄糖刺激下的胰岛素的分泌量,ELISA检测步骤按照试剂盒说明书进行,吸光度采用酶标仪在450nm处进行检测,以OD值为纵坐标Y,标准物浓度为横坐标X,绘制标准曲线,并根据此计算其他样品的浓度。
12.根据权利要求3所述的植物乳杆菌的筛选方法,其特征在于:所述2型糖尿病模型大鼠的构建的步骤包括:将70只雄性6-8周龄的Wistar大鼠,用基础饲料适应性喂养5天后随机分为低脂组和高脂组,前四周,除低脂组喂食基础饲料外,其它各组均喂食高脂饲料,并于每周固定时间进行大鼠的体重测量记录;
第五周,所有大鼠禁食不禁水12-18h,除低脂组外,其余各组大鼠均按照30-40mg/kg体重注射新鲜配制的链脲霉素STZ,将一定量STZ溶于pH为4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,现配现用,冰浴保存,低脂组注射ph为4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,造模后72h期间保证充足的无菌水及高脂饮食,并每日更换垫料,72h后随机血糖高于16.7mmol/L或者空腹血糖高于11.7mmol/L的为造模成功的糖尿病大鼠;
将成模大鼠随机分为模型组、LGG组、CT152组,模型组用0.85%的生理盐水作为对照,LGG和CCTCCM2019591以1×109CFU/day进行为期6-8周的灌胃治疗。
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