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一种大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法

阅读：833发布：2024-01-01

专利汇可以提供一种大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法，所述合成方法以苯丙氨酸为原料，大肠杆菌工程菌为宿主菌，经过宿主菌体内若干酶的催化而完成；所述宿主菌至少能够表达苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸 -4-羟基化酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、双键还原酶和查尔酮合成酶。本发明的优点：1)以苯丙氨酸为原料，工艺原材料成本低。2)以改造微生物为技术基础，在微生物体内进行生物酶的催化合成，避免大规模的提取、分离、纯化过程，从生产成本和对环境友好方面容易控制。3)本工艺在生产设备的规模和数量上比其他方法要少，易于产业转化。4)本工艺仅在生产的最后步骤有分离纯化工序，产品纯化工艺简单，产品质量比一般方法纯度更好、含量更高。，下面是一种大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法，其特征在于，所述合成方法以苯丙氨酸为原料，大肠杆菌工程菌为宿主菌，经过宿主菌体内若干酶的催化而完成；
所述宿主菌至少能够表达苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟基化酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、双键还原酶和查尔酮合成酶。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法，其特征在于，所述合成方法的合成路线如下：
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法，其特征在于，所述合成方法中的苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟基化酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、双键还原酶和查尔酮合成酶的表达基因分别来源于向日葵、刺苞菜蓟、拟南芥、苹果和灯盏花。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法，其特征在于，所述4-香豆酸辅酶A连接酶和查尔酮合成酶的表达基因构建于载体pET-28a上，苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟基化酶和双键还原酶的表达基因构建于载体pET-22b上，同一载体上的表达基因共用T7启动子，每个酶的表达基因在终止密码子前都有6×his标签，酶与酶的表达基因之间有RBS序列间隔，RBS序列与最近的酶的表达基因的终止密码子和起始密码子之间分别间隔3和7个碱基。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法，其特征在于，所述合成方法步骤如下：
1)按照苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟基化酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、双键还原酶和查尔酮合成酶的氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏好性，优化出相应酶的核酸序列，合成相关表达基因；
2)将表达基因构建于相应载体，其中4-香豆酸辅酶A连接酶和查尔酮合成酶的表达基因构建于载体pET-28a，苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟基化酶和双键还原酶的表达基因构建于载体pET-22b；
3)将构建完成的载体转入大肠杆菌中，将大肠杆菌培养，诱导表达；
4)在表达后的菌液中添加苯丙氨酸底物，继续反应20-26h。
5)将反应液中的根皮素提取、分离纯化。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法，其特征在于，利用甲醇将根皮素从发酵液中萃取出来，甲醇与发酵液的体积比1∶1。

说明书全文

一种大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种根皮素的生物合成方法，具体的说为一种大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法。

背景技术

[0002] 根皮素分子式：C15H14O5；英文名称：Phloretin；CAS：60-82-2；分子量：274.28；物理性质：易溶于甲醇、乙醇和丙酮，微溶于氯仿、难溶于水、石油醚和苯，方棱形或片状结晶(乙醇或甲醇)。

[0003] 根皮素是国外新近研究开发出来的一种新型天然皮肤美白剂，继熊果苷又一天然美容产品，主要分布于苹果、梨等多汁水果的果皮及根皮枝叶中。其主要用作皮肤天然美白剂，它能抑制酪氨酸酶活性、黑色素活性，对各种皮肤色斑有淡化作用。据最新研究发现其还有抗炎、免疫抑制，心血管保护等作用。全球每年用量不少于20吨，需求每年以20％速率增加，具有较大市场需求。

[0004] 目前，现有提取根皮素的工艺，有酸水解、酶解和直接提取。实际生产中多以柚皮苷为原料，兰尼镍为催化剂，在氢氧化钠溶液中，催化氢化合成柚皮苷二氢查耳酮，然后在盐酸溶液中，柚皮苷二氢查耳酮水解得到根皮素。该法存在化学废液的排放，化学污染严重。还有是以苹果皮为原材料，通过乙醇溶液为提取剂、浓缩后酸水解再萃取干燥，得到根皮素，该法采用酸水解，污染严重。本发明旨在解决这一技术问题，提供一种条件反应温和、合成效率高的根皮素生物合成方法。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法。

[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0007] 一种大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法，所述合成方法以苯丙氨酸为原料，大肠杆菌工程菌为宿主菌，经过宿主菌体内若干酶的催化而完成；

[0008] 所述宿主菌至少能够表达苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟基化酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、双键还原酶和查尔酮合成酶。

[0009] 大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法，所述合成方法的合成路线如下所示：

[0010]

[0011] 优选的，所述合成方法中的苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟基化酶、4- 香豆酸辅酶A连接酶、双键还原酶和查尔酮合成酶的表达基因分别来源于向日葵、刺苞菜蓟、拟南芥、苹果和灯盏花。

[0012] 优选的，所述4-香豆酸辅酶A连接酶和查尔酮合成酶的表达基因构建于载体pET-28a上，苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟基化酶和双键还原酶的表达基因构建于载体pET-
22b上，同一载体上的表达基因共用T7启动子，每个酶的表达基因在终止密码子前都有6×his标签，酶与酶的表达基因之间有RBS序列间隔，RBS序列与最近的酶的表达基因的终止密码子和起始密码子之间分别间隔3和7个碱基。

[0013] 大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法步骤如下：

[0014] 1)按照苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟基化酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、双键还原酶和查尔酮合成酶的氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏好性，优化出相应酶的核酸序列，合成相关表达基因；

[0015] 2)将表达基因构建于相应载体，其中4-香豆酸辅酶A连接酶和查尔酮合成酶的表达基因构建于载体pET-28a，苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟基化酶和双键还原酶的表达基因构建于载体pET-22b；

[0016] 3)将构建完成的载体转入大肠杆菌中，将大肠杆菌培养，诱导表达；

[0017] 4)在表达后的菌液中添加苯丙氨酸底物，继续反应20-26h。

[0018] 5)将反应液中的根皮素提取、分离纯化。

[0019] 优选的，利用甲醇将根皮素从发酵液中萃取出来，甲醇与发酵液的体积比1∶1。

[0020] 本专利涉及到的基因为At4CL、EbCHS、MdDBR、HaPAL和CcC4H (见表1)。

[0021] 表1 专利中用到的物种和基因简介

[0022]

[0023]

[0024] 本发明的有益效果是：本发明制备根皮素与现有技术不同之处在于：

[0025] 1)以苯丙氨酸为原料，工艺原材料成本低。

[0026] 2)以改造微生物为技术基础，在微生物体内进行生物酶的催化合成，避免大规模的提取、分离、纯化过程，从生产成本和对环境友好方面容易控制。

[0027] 3)本工艺在生产设备的规模和数量上比其他方法要要少，操作简单，易于产业转化。

[0028] 4)本工艺仅在生产的最后步骤有分离纯化工序，产品纯化工艺简单，产品质量比一般方法纯度更好、含量更高。

[0029] 5)合成过程没有废液排放，环境友好，无污染，可持续生产，本发明工艺从经济、环境和职业健康角度均为优良的工业化生产指路线。附图说明

[0030] 图1(a)本发明中质粒pET-28a-EbCHS-Eb4CL图谱；

[0031] 图1(b)本发明中质粒pET-22b-Pal-C4H-DBR图谱；

[0032] 图1(c)本发明中表达基因结尾处6×his标签图；

[0033] 图1(d)本发明中RBS接头图；

[0034] 图2本发明的根皮素合成路线图。

具体实施方式

[0035] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

[0036] 实施例1质粒构建方法。

[0037] 本专利根据相应表达基因的氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏好性，优化出基因的核酸序列，送商业基因合成公司将表达基因合成，将2个或多个基因整合到表达载体pET-28a或者pET-22b上，具体的说，4-香豆酸辅酶 A连接酶和查尔酮合成酶的表达基因构建于载体pET-28a上，如图1(a)，苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟基化酶和双键还原酶的表达基因构建于载体pET-22b上，如图1(b)，同一载体上的表达基因共用一个T7启动子，表达基因末尾处、终止子之前在N端引物进行修饰，在引物上添加6×his基因序列(CAT CAT CAT CAT CAT CAT)，见附图1(c)，表达基因之间用 RBS序列(AAGGAG)连接，RBS序列与上一个表达基因的终止密码子之间间隔3个bp(TAA)，RBS与下一个表达基因的起始密码子(MET)之间间隔7个bp(ATATACC)，见附图1(d)。基因片段与片段之间用商业试剂盒(一步克隆试剂盒)连接，转化进入大肠杆菌细胞，挑取单克隆验证，验证正确的质粒，转化进入表达细胞中，后续进行诱导表达。

[0038] 实施例2全细胞催化合成根皮素

[0039] 一种大肠杆菌全细胞催化生产根皮素的方法：

[0040] 1)37℃，220rpm，在添加了相应抗性的LB培养基中，隔夜培养细胞大肠杆菌；

[0041] 2)转接20mL，37℃，220rpm，LB培养基中，培养至OD600＝1左右；

[0042] 3)转800mL大瓶2YT培养基中，37℃，220rpm培养至OD600＝0.8左右；

[0043] 4)16℃，220rpm，IPTG诱导，16h-18h，收菌；

[0044] 5)用磷酸盐buffer悬浮，20倍浓缩；

[0045] 6)添加底物，37℃，220rpm反应24h，收集产生的根皮素。

[0046] 注：LB(Luria-Bertani)培养基：

[0047] 液体培养基：胰化蛋白胨：1％，酵母抽提物：0.5％，NaCl：1％，pH7.5[0048] 固体培养基：在LB液体培养基中加入1.5％的琼脂粉

[0049] 2YT培养基：胰化蛋白胨：1.6％，酵母抽提物：1％，NaCl：0.5％。

[0050] 所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应在本发明的保护范围之列。

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