技术领域
[0001] 本
发明涉及生物方法合成活性物质领域，特别是涉及一种α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法。
背景技术
[0002] α-硫辛酸是一种具有生物活性的天然物质，其化学名称是1，2-二硫戊环-3-戊酸，结构式如式Ⅰ。它作为一种辅助因子广泛地存在于生物体中，通常与
蛋白质分子中赖
氨酸的ε-氨基共价结合，以酰胺键形式存在。硫辛酸具有旋光性，R-(+)-α-硫辛酸(右旋)是人体内硫辛酸的天然形式，S-(+)-α-硫辛酸在人体内不具有活性。
[0003]
[0004] α-硫辛酸可以作为食品口服，
生物组织很易吸收利用，并能透过血脑屏障发挥多功能的所谓“通用性抗
氧化剂”的作用，其毒性很低。因此，α-硫辛酸是一种安全有效的强
氧化剂，被誉为“万能抗氧化剂”。其优良的抗氧化性质表现在三方面：清除自由基和
活性氧；螯合
金属离子；再生其它抗氧化剂(VE，VC，谷胱甘肽等)。另外，硫辛酸具有氧化型(LA)和还
原型(DHLA)两种形式，它既溶于
水又溶于脂质，抗氧化的能
力是脂溶性维生素VE的100倍。
[0005] 由于硫辛酸具有缓解肌体过度疲劳，延缓衰老，
预防记忆力衰退等功效，而人体内含量非常少，且随着年龄的增长而减少，因此，在美国已成为热销的功能食品之一，日本也
修改了食品药品区分标准，规定硫辛酸不仅作为医药品，也可当食品使用。另外，硫辛酸不但具有美容养颜的功效，同时还可以达到减肥的目的。因此，硫辛酸在健康食品和
化妆品领域的用途值得关注，其市场前景也十分看好。
[0006] 同时，α-硫辛酸也应用于下列
疾病的预防与
治疗中：糖尿病及糖尿病慢性并发症、脑和神经退化性疾病、
辐射损伤、缺血
再灌注损伤和
艾滋病等。德国已批准α-硫辛酸作为糖尿病多发神经病的治疗药。
[0007] 目前硫辛酸主要通过化学合成生产，根据原料的不同分为两种：
己二酸法和环己
酮法(蔡怀勋等，2003；刘宇，2005)。其中，己二酸法为：氯化
铝催化乙烯和氯酰基己二酸一甲酯缩合，得到氯酮体，再经还原、卤化、二硫酚化和水分解得到二硫代
羧酸体，最后经碘氧化得到目的产物硫辛酸。环己酮法为：以环己酮为起始原料，经烯胺化、加成、过氧化、取代、氧化共5步反应得到硫辛酸。
[0008] 化学合成生产硫辛酸的缺点：步骤繁琐，工艺复杂，且均采用化工原料，并在合成过程中大量使用有毒催化剂，产品的安全性受到严重的质疑。同时对环境造成严重的污染，是环境非友好型工艺。另外，化学合成的硫辛酸是等量R-(+)-α-硫辛酸和S-(+)-α硫辛酸构成的混合体，需进一步拆分，才能得到有生物活性的R-(+)-α-硫辛酸。目前混旋硫辛酸的市场报价在550元/公斤，而R-硫辛酸达到2000-3000元/公斤，价格相差巨大。硫辛酸生产目前处于R-硫辛酸(右旋)取代混旋硫辛酸的过程之中，细菌转生产的硫辛酸是R-硫辛酸，因此，这将给细菌转化生产硫辛酸带来巨大的市场机遇。
发明内容
[0009] 基于此，本发明的目的在于提供一种α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法。
[0010] 解决上述技术问题的具体技术方案如下：
[0011] 一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：
[0012] (1)原核表达载体pET28-lipD的构建
[0013] 将含有lipD的质粒pGS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD；
[0014] (2)表达载体pSU18-lplA的构建
[0015] 克隆大肠杆菌lplA基因，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；
[0016] (3)重组载体pET28-lipD-tac-lplA的制备
[0017] A、扩增tac启动子基因：以质粒pGS331为模板，用引物PCR扩增得tac启动子基因；
[0018] B、扩增lplA基因
片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，用引物PCR扩增得lplA基因片段；
[0019] C、以等量的步骤(3)中A所述的tac启动子基因和步骤(3)中B所述的lplA基因片段为模板，用引物PCR扩增，得连接片段tac-lplA并纯化，连接至载体pMD19-T中，得表达载体pMD19-T-tac-lplA；
[0020] D、将步骤(3)中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤(1)所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切，并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-tac-lplA；用热激法，将重组载体pET28-lipD-tac-lplA转化至大肠杆菌表达菌株BL21中，得大肠杆菌重组转化子lipD-tac-lplA/BL21；
[0021] (4)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备
[0022] A、克隆载体pMD19-T-lipA的构建
[0023] 以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得pMD19-T-lipA；
[0024] B、表达载体pBAD34-lipA的构建
[0025] 将表达载体pBAD34和步骤(4)中A中所述的pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切连接，得表达载体pBAD34-lipA；
[0026] C、将pBAD34-lipA与pET28-lipD-tac-lplA共同导入BL21，得到生物合成α-硫辛酸的工程菌株。
[0027] 本发明还提供一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：
[0028] (1)原核表达载体pET28-lipD的构建
[0029] 将含有lipD的质粒pGS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD；
[0030] (2)表达载体pSU18-lplA的构建
[0031] 克隆大肠杆菌lplA基因，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；
[0032] (3)重组载体pET28-lipD-tac-lplA的制备
[0033] A、扩增tac启动子基因：以质粒pGS331为模板，用引物PCR扩增得tac启动子基因；
[0034] B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，用引物PCR扩增得lplA基因片段；
[0035] C、以等量的步骤(3)中A所述的tac启动子基因和步骤(3)中B所述的lplA基因片段为模板，用引物PCR扩增，得连接片段tac-lplA并纯化，连接至载体pMD19-T中，得表达载体pMD19-T-tac-lplA；
[0036] D、将步骤(3)中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤(1)所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切，并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-tac-lplA；用热激法，将重组载体pET28-lipD-tac-lplA转化至大肠杆菌表达菌株BL21中，得大肠杆菌重组转化子lipD-tac-lplA/BL21；
[0037] (4)重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建
[0038] A、表达载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建
[0039] 以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因和metK基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK；
[0040] B、表达载体pBAD34-lipA的构建
[0041] 将表达载体pBAD34和步骤(4)中A中所述的pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切，得表达载体pBAD34-lipA；
[0042] C、以步骤(4)中B中所述的表达载体pBAD34-lipA为模板，用引物PCR扩增得lipA-SD基因片段，将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切，得pSU18-lipA-SD，再将pSU18-lipA-SD和pBAD24经EcoRI和PstI双酶切，得pBAD24-lipA-SD；
[0043] D、将步骤(4)中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切，用连接酶连接，得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK；
[0044] E、将质粒pBAD34、步骤(4)中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK分别经Nsi和SalI双酶切并纯化回收，得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK；
[0045] (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备
[0046] 将步骤(4)中E所述的重组载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤(3)中D所述的重组载体pET28-lipD-tac-lplA，共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。
[0047] 在其中一些
实施例中，步骤(3)中A所述的引物为：
[0048] 上游引物(Ptacpromoter up)：
[0049] GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT；
[0050] 下游引物(Ptacpromoter down)：
[0051] GAGCAGGCGTAATGTGGACATGGATCCTGTTTCCTG；
[0052] 步骤(3)中B所述的引物为：
[0053] 上游引物(Promoter-lplA up)：
[0054] CAGGAAACAGGATCCATGTCCACATTACGCCTGCTC；
[0055] T7下游引物(T7)：GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG；
[0056] 步骤(3)中C所述的引物为：
[0057] 上游引物(Ptacpromoter up)：
[0058] GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT；
[0059] 下游引物(T7)：GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG。
[0060] 在其中一些实施例中，步骤(4)中C所述的引物为：
[0061] 上游引物：GAACACGCACGTCATGAGTAAAC；
[0062] 下游引物：
[0063] GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCATCCCTTTCG。
[0064] 本发明还提供一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：
[0065] (1)原核表达载体pET28-lipD的构建
[0066] 将含有lipD的质粒pGS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD；
[0067] (2)表达载体pSU18-lplA的构建
[0068] 克隆大肠杆菌lplA，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；
[0069] (3)重组载体pET28-lipD-lplA的制备
[0070] A、扩增lipD基因片段：以重组载体pET28-lipD为模板，用引物PCR扩增得lipD基因片段；
[0071] B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，用引物PCR扩增得lplA基因片段；
[0072] C、以等量的步骤(3)中A所述的lipD基因片段和B所述的lplA基因片段为模板，用引物PCR扩增连接lipD和lplA基因片段，进行TA克隆，并转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆，经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA；将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NocI和BamHI双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-lplA；
[0073] (4)重组载体pBAD34-lipA的构建
[0074] 以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因，并与pBAD34载体连接，构建重组载体pBAD34-lipA；
[0075] (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备
[0076] 将步骤(3)中C所得的pET28-lipD-lplA和步骤(4)所得的pBAD34-lipA共同导入大肠杆菌表达菌株BL21中，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。
[0077] 本发明还提供一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：
[0078] (1)原核表达载体pET28-lipD的构建
[0079] 将含有lipD的质粒pGS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD；
[0080] (2)表达载体pSU18-lplA的构建
[0081] 克隆大肠杆菌lplA基因，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；
[0082] (3)重组载体pET28-lipD-lplA的制备
[0083] A、扩增lipD基因片段：以重组载体pET28-lipD为模板，用引物PCR扩增得lipD基因片段；
[0084] B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，用引物PCR扩增得lplA基因片段；
[0085] C、以等量的步骤(3)中A所述的lipD基因片段和B所述的lplA基因片段为模板，用引物PCR扩增连接lipD和lplA基因片段，进行TA克隆，并转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆，经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA；将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NocI和BamHI双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-lplA；
[0086] (4)重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建
[0087] A、克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建
[0088] 以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因和metK基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK；
[0089] B、表达载体pBAD34-lipA的构建
[0090] 将表达载体pBAD34和步骤(5)中A中所述的克隆载体pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切，得表达载体pBAD34-lipA；
[0091] C、以表达载体pBAD34-lipA为模板，用引物PCR扩增得lipA-SD基因片段，将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切，得pSU18-lipA-SD，再将pSU18-lipA-SD和表达载体pBAD24经EcoRI和PstI双酶切，得pBAD24-lipA-SD。所述引物包括lipA的3’末端序列(23bp)XbalI位点、载体pBAD43的SD序列(14bp)、Ndel和BamHI位点；
[0092] D、将步骤(4)中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切，用连接酶连接，得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK；
[0093] E、将质粒pBAD34、步骤(4)中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK经Nsi和SalI双酶切并纯化回收，得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK；
[0094] (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备
[0095] 将步骤(4)中E所述的表达载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤(3)中C所述的重组载体pET28-lipD-lplA,共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株。
[0096] 在其中一些实施例中，步骤(3)中A所述的引物为：
[0097] 上游引物(pET28forward)：TAATACGACTCACTATAGGGG；
[0098] 下游引物(lipD-lplANdeI)：
[0099] GCGTAATGTGGACATATGTTACGCAGGAGCTGC；
[0100] 步骤(3)中B所述的引物为：
[0101] 上游引物(lipD-lplANdeI)：
[0102] GCAGCTCCTGCGTAACATATGTCCACATTACGC；
[0103] 下游引物(lplADown)：CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC；
[0104] 步骤(3)中C所述的引物为：
[0105] 上游引物(pET28forward)：TAATACGACTCACTATAGGGG；
[0106] 下游引物(lplADown)：CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC；
[0107] 在其中一些实施例中，步骤(4)中C所述的引物为：
[0108] 上游引物：GAACACGCACGTCATGAGTAAAC；
[0109] 下游引物：
[0110] GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCATCCCTTTCG；
[0111] 根据上述的制备方法制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株。
[0112] 本发明还提供一种α-硫辛酸的制备方法，将上述制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株于LB培养基、2YT+Fe培养基或2YT培养基中培养5-7h后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达2-4h，即可。
[0113] 本发明所述的α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法的原理如下：
[0114] 硫辛酸的合成是在Apo-lipD上进行的，为了提高硫辛酸的产量，本发明通过测定Apo-lipD的表达量，筛选出表达量最高的载体，以其为
基础作进一步研究；为了使表达过量的Apo-lipD完全辛酰基化，首次使用克隆有大肠杆菌lplA基因的pSU18(pYS1)质粒转化菌株pSU18-lplA(YS17)，在含有IPTG和辛酸的LB培养基中诱导结构域蛋白表达，并通过非变性凝胶
电泳检测apo domain蛋白的辛酰基化程度，结果表明在BL21(DE3)菌株同时表达lipD和lplA基因能使apo domain蛋白完全转化为辛酰基化结构域蛋白octanoylated domain。为了减少质粒载体的使用和便于下一步操作，本研究尝试采用串连lipD和lplA的方式，完成apo domain蛋白的辛酰基化。为此构建了两种辛酰化载体，一种是将两个基因直接
串联，另一种是先在lplA前连接一个tac启动子，后与lipD串连。为了使lplA和lipD的表达量达到最佳平衡，本研究尝试在lplA之前增加一个稍弱的启动子。通过比较本实验室所有载体的启动子，最终选择tac启动子做进一步的实验，因为该启动子与T7启动子同属IPTG诱导，但表达效率比T7低。通过softberry
网站在线的启动子预测
软件分析得到ptac85的启动子区域，根据ptac85的启动子序列设计了引物。
[0115] 又由于lipA是将octanoylated-lipoyl domain转变为lipoylated-lipoyl domain的关键基因，本发明在初步实验中，将lipA基因克隆到pBAD34载体上与辛酰化质粒pET28-lipD-lplA导入同一个BL21(DE3)宿主菌，发现octanoylated-lipoyldomain能转
化成lipoylated-lipoyl domain；获得菌株lipD-lplA&lipA/BL21、菌株lipD-tac-lplA&lipA/BL21；
[0116] 另外，由于lipA在将两个硫
原子插入到硫辛酸的6和8位
碳原子上，需要S-腺苷甲硫氨酸协助作用(Cicchillo,Iwig et al.2004)，为了补充细胞中S-腺苷甲硫氨酸的量，因此，本实验将S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK基因前增加一个SD序列，后与lipA采用两种方法串联表达，获得菌株lipD-lplA&lipA-SD-metK/BL21、菌株lipD-tac-lplA&lipA-SD-metK/BL21。即采用辛酸为底物，硫辛酸结构域为合成载体，通过共同导入lplA和lipA或共同导入lplA、lipA与metK，获得高效硫辛酸生产菌株。
[0117] 通过比较上述4种菌株apo-lipD的表达量，筛选出表达量最高的菌株。
[0118] 本发明所述的α-硫辛酸的制备方法和生物合成α-硫辛酸的工程菌株及其制备方法具有如下优点和有益效果：
[0119] (1)本发明所述α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法，采用生物制法，将硫辛酸结构域lipD大量表达，从而为大量合成α-硫辛酸奠定基础，继而以硫辛酸结构域lipD为基础，经大量实验，构建和比较不同的表达载体，发现将lipD与lplA，lipA共同表达，或将硫辛酸结构域lipD与lplA，lipA及metK共同表达，获得可合成R-(+)-α-硫辛酸的工程菌株。
[0120] (2)本发明所制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株，其生产R-(+)-α-硫辛酸的产量比野生大肠杆菌的产量高上百倍的菌株，其产生的α-硫辛酸最高达500ng/mg细胞干重，产量比野生型高200倍以上。
[0121] (3)本发明所述α-硫辛酸的制备方法，生产过程中有毒物质少，对环境无污染，其合成硫辛酸安全性高，无毒且均为有活性的R-(+)-α-硫辛酸。
附图说明
[0122] 图1-A为质粒pGS331构建示意图；
[0123] 图1-B为重组载体pET28-lipD构建示意图；
[0124] 图1-C为lipD基因结构图；
[0125] 图2为质粒pBAD24-lipD和质粒pET15-lipD构建示意图；
[0126] 图3为重组载体pET28-lipD-lplA构建示意图；
[0127] 图4为重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建示意图；
[0128] 图5为重组载体pET28-lipD-tac-lplA的构建示意图；
[0129] 图6为实施例1制得的菌种YS56和野生型大肠杆菌BL21生产制得的硫辛酸样品测定HPLC图，其中，A：YS56处理样品与标样比较图；B：BL21的处理样品与标样比较图；
[0130] 图7为实施例5中不同培养基中4种菌株的硫辛酸产量。
具体实施方式
[0131] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学
试剂，均为市售产品。
[0132] 本发明所述丙
酮酸脱氢酶E2亚基硫辛酸结构域基因，英文名称为apo-lipoyl domain，简称Apo-lipD或lipD；
[0133] 所述硫辛酸蛋白连接酶基因，简称lplA；
[0134] 所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，简称metK；
[0135] 所述硫辛酸合成酶基因，简称lipA；
[0136] 所述辛酰化结构域蛋白，英文名称为octanoylated-lipoyl domain；
[0137] 所述硫辛酰化结构域蛋白，英文名称为lipoylated-lipoyl domain。
[0138] 本发明选用的质粒pGS331由美国伊利诺斯大学Cronan教授馈赠；所述质粒pGS331可按本领域的常规方法，由ptac85在其Nco I和Sal I酶切位点之间克隆
丙酮酸脱氢酶E2亚基lipD基因构建而成(Ali,S.T.,Guest,J.R.,1990,Isolation And Characterization Of Lipoylated And Unlipoylated Domains Of the E2p Subunit Of the Pyruvate-Dehydrogenase Complex Of Escherichia-Coli,271,1,139-145)，参见图1-C；
[0139] 本发明选用的表达载体pET28、大肠杆菌DH5α、野生型大肠杆菌MG1655、大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、表达载体pBAD34、质粒pSU18、表达载体pMD19-T或表达载体pBAD24均为市售产品；
[0140] 本发明所述的TM136的硫辛酸代谢突变菌株由美国伊利诺斯大学Cronan教授馈赠；(Morris,T.W.,Reed,K.E.,Cronan,J.E.,1995.Lipoic Acid Metabolism In Escherichia-Coli-the Lpla And Lipb Genes Define Redundant Pathways for Ligation Of Lipoyl Groups To Apoprotein,177,1,1-10)；
[0141] LB培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，
酵母提取物(Yeast extract)5g/L，
氯化钠(NaCl)10g/L；
[0142] 2YT+Fe培养基：2YT培养基添加50μM FeCl3，20μM CaCl2，10μM的MnCl2和ZnSO4,2μM的CoCl2、CuCl2、NiCl2、Na2MoO4、Na2SeO3和H3BO3
[0143] 2YT培养基：细菌蛋白胨16g；酵母提取物5g；NaCl 5g；H2O 800ml调整pH＝7.2加H2O到1L，高压灭菌。
[0144] 实施例1
[0145] 一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：
[0146] (1)原核表达载体pET28-lipD的构建
[0147] 将含有lipD的质粒pGS331和表达载体pET28经Nco I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD，参见图1-A和图1-B；
[0148] 重组载体pET28-lipD经Nco I和Sal I双酶切检测，表明pET28-lipD携带的lipD基因片段与pGS331上的一致。经DNA测序和DNAstar软件分析表明lipD编码的蛋白包括丙酮酸脱氢酶E2亚基的N末端33个氨基酸残基(1-33)和中部52个氨基酸残基(238-289)共85个氨基酸残基组成，为一个杂合硫辛酸结构域(Miles and Guest 1987)；在该DNA片段的3’端还有部分编码丙酮酸脱氢酶E3-binding结构域的序列，参见图1-C；经实验证明，该部分序列对lipD的表达、结构和功能没有影响。
[0149] 用Nco I和Sal I酶切pET28-lipD，将lipD连接到pBAD24上，得质粒pBAD24-lipD；用Nco I和Xho I酶切pET28-lipD，将lipD连接到pET15上，得到质粒pET15-lipD，载体构建过程如下图2所示。
[0150] 将上述重组载体pET28-lipD、质粒pBAD24-lipD和质粒pET15-lipD转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，分析不同菌株apo domain表达量，结果显示：携带pET28-lipD质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，积累的apo domain蛋白最多，因此选取pET28-lipD质粒作为后续改造的初始载体。
[0151] (2)表达载体pSU18-lplA的构建
[0152] 克隆大肠杆菌lplA基因，经Xba I和Sal I双酶切并纯化回收，用连接酶连接至载体pSU18，得表达载体pSU18-lplA；
[0153] (3)重组载体pET28-lipD-lplA的制备
[0154] A、扩增lipD基因片段：用pfuDNA聚合酶，以重组载体pET28-lipD为模板，pET28forward和lipD-lplANdeI为引物，PCR扩增300bp的lipD基因片段；
[0155] 其中，pET28forward为上游引物：TAATACGACTCACTATAGGGG(SEQ ID NO.1)；
[0156] lipD-lplANdeI(下游引物)：
[0157] GCGTAATGTGGACATATGTTACGCAGGAGCTGC(SEQ ID NO.2)；
[0158] B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，lipD-lplANdeI和lplADown为引物，PCR扩增lplA基因片段；
[0159] lipD-lplANdeI(上游引物)：
[0160] GCAGCTCCTGCGTAACATATGTCCACATTACGC(SEQ ID NO.3)；
[0161] lplADown(下游引物)：CTTGGATCCCTGCAGGTAACTACCTTACAGC(SEQ ID NO.4)；
[0162] C、纯化上述步骤(3)中A所述的lipD和B所述的lplA基因片段，以等量的lipD和lplA基因片段为模板，以pET28forward和lplADown为引物，PCR扩增连接lipD和lplA基因片段，纯化连接片段，并在TaqDNA聚合酶作用下，在片段3’端加尾，再次纯化片段，进行TA克隆，并转化到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆，经测序确定为读码框正确的重组载体DH5α-lipD-lplA；
[0163] 将重组载体DH5α-lipD-lplA和表达载体pET28经NoclI和BamHI双酶切并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-lplA(参见图3)；重组载体pET28-lipD-lplA转至大肠杆菌表达菌株BL21中，得大肠杆菌转化子lipD-lplA/BL21。
[0164] (4)重组载体pBAD34-lipA的构建
[0165] 以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因，TA克隆连接至载体pMD19-T，通过PstI和BspHI双酶切克隆至pBAD34载体，构建重组载体pBAD34-lipA；
[0166] (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备
[0167] 将步骤(3)中C所得的pET28-lipD-lplA和步骤(4)所得的pBAD34-lipA共同导入大肠杆菌表达菌株BL21，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS56)。
[0168] 一种α-硫辛酸的制备方法，具体为：将上述生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS56)的诱导表达：将步骤(5)所得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS56)于LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6h后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达2-4h，即得R-(+)-α-硫辛酸，产量参见图7。
[0169] 实施例2
[0170] 一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：
[0171] (1)原核表达载体pET28-lipD的构建：参见实施例1步骤(1)；
[0172] (2)表达载体pSU18-lplA的构建：参见实施例1步骤(2)；
[0173] (3)重组载体pET28-lipD-lplA的制备
[0174] A、扩增lipD基因片段：参见实施例1步骤(3)中A；
[0175] B、扩增lplA基因片段：参见实施例1步骤(3)中B；
[0176] C、参见实施例1步骤(3)中C；
[0177] (4)重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建(参见图4)
[0178] A、克隆载体pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK的构建
[0179] 以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因和metK基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得pMD19-T-lipA和pMD19-T-metK；
[0180] B、表达载体pBAD34-lipA的构建
[0181] 将表达载体pBAD34和步骤(4)中A中所述的pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切，得表达载体pBAD34-lipA；
[0182] C、以表达载体pBAD34-lipA为模板，
[0183] SEQ ID NO.5：GTAAGTAATTACTGCAGGATTAC为上游引物；
[0184] SEQ ID NO.6：
[0185] GAGCTGGATCCCATATGCGTTTCACTCCTCTAGATTACTTAACTTCCATCCCTTTCG为下游引物(该下游引物包括lipA的3’末端序列(23bp)、XbaI位点、载体pBAD43的SD序列(14bp)、NdeI和BamHI位点)，PCR扩增得lipA-SD基因片段，将lipA-SD基因片段和质粒pSU18经EcoRI和BamHI双酶切，得载体pSU18-lipA-SD，再将载体pSU18-lipA-SD和表达载体pBAD24经EcoRI和PstI双酶切，得pBAD24-lipA-SD；
[0186] D、将步骤(4)中A所述的pMD19-T-metK和C所述的pBAD24-lipA-SD经NdeI和SalI双酶切，用连接酶连接，得表达载体pBAD24-lipA-SD-metK；
[0187] E、将质粒pBAD34、步骤(4)中D所述的表达载体pBAD24-lipA-SD-metK经Nsi和SalI双酶切并纯化回收，得重组载体pBAD34-lipA-SD-metK；
[0188] (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备
[0189] 将步骤(4)中E所述的表达载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤(3)中C所述的重组载体pET28-lipD-lplA，共同导入BL21，得生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS59)；
[0190] 一种α-硫辛酸的制备方法，具体为：将上述步骤(5)所得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS59)于LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6h后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达3小时，即得R-(+)-α-硫辛酸，其产量能达到340ng/mg细胞干重，参见图7。
[0191] 实施例3
[0192] 一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：
[0193] (1)原核表达载体pET28-lipD的构建：参见实施例1步骤(1)；
[0194] (2)表达载体pSU18-lplA的构建：参见实施例1步骤(2)；
[0195] (3)重组载体pET28-lipD-tac-lplA的构建
[0196] 为使lplA和lipD的表达量达到最佳平衡，本实施例在lplA之前增加一个tac启动子。
[0197] A、扩增tac启动子基因：以pfuDNA为聚合酶，质粒pGS331为模板，Ptacpromoter down和Ptacpromoter up为引物，PCR扩增得105bp的tac启动子基因；
[0198] Ptacpromoter up(上游引物)：
[0199] GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT(SEQ ID NO.7)；
[0200] Ptacpromoter down(下游引物)：
[0201] GAGCAGGCGTAATGTGGACATGGATCCTGTTTCCTG(SEQ ID NO.8)；
[0202] B、扩增lplA基因片段：以重组载体pSU18-lplA为模板，Promoter-lplA up和T7为下游引物，PCR扩增得1.4kb的lplA基因片段；
[0203] Promoter-lplA up(上游引物)：
[0204] CAGGAAACAGGATCCATGTCCACATTACGCCTGCTC(SEQ ID NO.9)；
[0205] T7下游引物：GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG(SEQ ID NO.10)；
[0206] C、以等量的步骤(3)中A所述的tac启动子基因和步骤(3)中B所述的lplA基因片段为模板，用Ptacpromoter up和T7作为引物，用pfuDNA聚合酶将tac启动子PCR连接到lplA基因前，纯化连接片段tac-lplA，在TaqDNA聚合酶作用下，于tac-lplA基因片段加3’端加尾，并进行TA克隆，转化大厂杆菌DH5α，筛选阳性克隆，并连接至载体pMD19-T中，得表达载体pMD19-T-tac-lplA；
[0207] Ptacpromoter up上游引物：GTCTATGAATTCACTCCCCATCCCCCTGT(SEQ ID NO.7)；
[0208] T7下游引物：GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG(SEQ ID NO.10)。
[0209] D、将步骤(3)中C所述的表达载体pMD19-T-tac-lplA和步骤(1)所述的重组载体pET28-lipD经EcoRI和SalI酶切，并纯化回收，用连接酶连接，得重组载体pET28-lipD-tac-lplA(参见图5)；用热激法，将重组载体pET28-lipD-tac-lplA转化至大肠杆菌表达菌株BL21中，得大肠杆菌转化子lipD-tac-lplA/BL21；
[0210] (4)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备
[0211] A、克隆载体pMD19-T-lipA的构建
[0212] 以野生型大肠杆菌MG1655总DNA为模板，PCR扩增得到lipA基因，并分别TA克隆连接至表达载体pMD19-T，得pMD19-T-lipA；
[0213] B、表达载体pBAD34-lipA的构建
[0214] 将表达载体pBAD34和步骤(5)中A中所述的pMD19-T-lipA，经PstI和BspHI双酶切连接，得表达载体pBAD34-lipA；
[0215] C、将pBAD34-lipA与pET28-lipD-tac-lplA共同导入BL21，得到生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS61)；
[0216] 一种α-硫辛酸的制备方法，具体为：将步骤(4)中C所得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株BL21/pET28-lipD-tac-lplA&pBAD34-lipA(YS61)于LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6h后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达2-4h，即得R-(+)-α-硫辛酸，产量能达到520ng/mg细胞干重，具体参见图7。
[0217] 实施例4
[0218] 一种生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备方法，包括如下步骤：
[0219] (1)原核表达载体pET28-lipD的构建：参见实施例1步骤(1)；
[0220] (2)表达载体pSU18-lplA的构建：参见实施例1步骤(2)；
[0221] (3)重组载体pET28-lipD-tac-lplA的构建
[0222] A：扩增tac启动子基因：参见实施例3步骤(3)中A；
[0223] B、扩增lplA基因片段：参见实施例3步骤(3)中B；
[0224] C、表达载体pMD19-T-tac-lplA的构建：参见实施例3步骤(3)中C；
[0225] D、参见实施例3步骤(3)中D；
[0226] (4)重组载体pBAD34-lipA-SD-metK的构建：参见实施例2步骤(4)；
[0227] (5)生物合成α-硫辛酸的工程菌株的制备
[0228] 将步骤(4)中E所述的重组载体pBAD34-lipA-SD-metK和步骤(3)中D所述的重组载体pET28-lipD-tac-lplA，共同转至大肠杆菌表达菌株BL21中，即得生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS58)。
[0229] 一种α-硫辛酸的制备方法，具体为：将上述步骤(5)制得的生物合成α-硫辛酸的工程菌株(YS58)转接至LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6小时后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达3小时，得出硫辛酸的产量能达到350ng/mg细胞干重，具体参见图7。
[0230] 实施例5
[0231] 将实施例1制得的菌株YS56、实施例2制得的菌株YS59，实施例3制得的菌株YS61和实施例4制得的菌株YS58分别转接至LB培养基、2YT+Fe培养基和2YT培养基中培养6小时后，以辛酸为底物，IPTG和阿拉伯糖诱导表达3小时，通过HPLC和生物学方法测定了各菌株硫辛酸的产量，结果参见图7。
[0232] 其中，HPLC的测定方法为：
[0233] 用0.45μM微孔滤膜过膜处理的KH2PO3(pH为2.0，浓度25mM)和HPLC级甲醇以25：75的体积比
混合液做为流动相，流速每分钟1ml，进样10μl，采用Waters公司的C18柱在330nm紫外吸收光
波长处测定硫辛酸的含量。具体操作：
[0234] (1)过夜洗柱平衡色谱柱：先以100％甲醇平衡30min，后25：75体积比的水与甲醇平衡60min，再用25：75体积比的KH2PO3与甲醇洗柱平衡60min，最后用25：75体积比的KH2PO3与甲醇低流速平衡过夜；
[0235] (2)样品测定：用25：75体积比的KH2PO3与甲醇平衡色谱柱20min，用330nm紫外波长检测基线成一条直线后，开始进样测定：进样10μl，25：75体积比的KH2PO3与甲醇做为流动相，1ml/min恒流测定样品；
[0236] (3)测定样品后洗柱：采用25：75体积比的KH2PO3与甲醇平衡洗柱30min，然后用25：75体积比的水与甲醇平衡30min，最后用100％甲醇60min处理色谱柱。
[0237] 标样的测定，分别配制了0.01mg/ml、0.025mg/ml、0.0500mg/ml、0.075mg/ml、0.1000mg/ml、0.2mg/ml的硫辛酸标样，然后根据各标样吸收面积测出硫辛酸的面积浓度比标准曲线，得到其线性回归方程，再根据方程推算出样品硫辛酸浓度。
[0238] 从图6可知：实施例1制得的菌株YS56的产量明显高于野生型大肠杆菌BL21。
[0239] 从图7中可知：2YT培养基培养所产生硫辛酸，产量远高于其它培养基，其中，实施例1制得的菌株YS56的产量为1.56mg/L、实施例2制得的菌株YS59的产量为1.06mg/L，实施例3制得的菌株YS61的产量达2.1mg/L、实施例4制得的菌株YS58的产量为1.44mg/L。
[0240] 而在LB和2YT添加微量元素Fe的培养基中，硫辛酸的最高产量也未超过1.4mg/ml。初步表明2×YT是一种适合积累硫辛酸的培养基。采用同样的方法测定了大肠杆菌BL21(DE3)和MG1655的硫辛酸产量，约为0.005mg/L。这表明菌株lipD-tac-lplA-lipA/BL21生物合成硫辛酸的量是野生大肠杆菌的100倍以上。
[0241] 实施例6硫辛酸活性测定
[0242] 使用TM136的硫辛酸代谢突变菌株进行定性鉴定。该突变株在添加活性硫辛酸的基础培养基上能正常生长，而在不添加硫辛酸的基础培养基上不能正常生长。分别在基础培养基中添加500ng/ml硫辛酸标准样品或
水解萃取的1ml硫辛酸样品25μl，同时做基础培养基空白对照。划线接种TM136于每种培养基平板，在37℃同样的条件培养过夜，检测其生长情况。
[0243] 结果表明：实施例1-4所述的
发酵菌株在添加活性硫辛酸的基础培养基上正常生长，且生产的硫辛酸具有很高的生物活性。
[0244] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明
专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附
权利要求为准。
