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一种猪源乳酸芽孢杆菌、微生态制剂及制备方法与应用

阅读：942发布：2024-02-23

专利汇可以提供一种猪源乳酸芽孢杆菌、微生态制剂及制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种猪源乳酸芽孢杆菌、微生态制剂及其制备方法与应用，属生物工程及饲料领域。该菌种的生物保藏编号为CCTCC NO：M 2017596，分类命名为乳酸芽孢杆菌Q-21，其容易定植肠道并迅速生长繁殖，确保肠道有益菌的数量优势，预防肠道菌群的失调，具有适应胃肠道酸性环境、能产生孢子、抗逆性强的特点。微生态制剂包括上述菌种，制备方法包括接种上述菌种于发酵培养基中，发酵。该制备方法简单有效，可在生产应用中广泛推广。由此制得的微生态制剂含有较高活性的猪源乳酸芽孢杆菌，将其应用于仔猪养殖中，能降低仔猪胃肠道pH值，杀灭肠道病原微生物，此外还能促进饲料营养物质的消化吸收，提高仔猪生长性能。，下面是一种猪源乳酸芽孢杆菌、微生态制剂及制备方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种猪源乳酸芽孢杆菌，其特征在于，其生物保藏编号为：CCTCC NO：M 2017596，分类命名为乳酸芽孢杆菌Q-21。
2.一种微生态制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的猪源乳酸芽孢杆菌；
优选地，所述微生态制剂中所述猪源乳酸芽孢杆菌的菌含量为1.8×108cfu/g-2.2×
108cfu/g；
更优地，所述微生态制剂中所述猪源乳酸芽孢杆菌的菌含量为2.0×108cfu/g。
3.如权利要求2所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
接种如权利要求1所述的猪源乳酸芽孢杆菌于发酵培养基中，发酵；
优选地，所述猪源乳酸芽孢杆菌为处于生长对数期的菌体；
所述发酵培养基的碳源包括玉米粉、麸皮、糊精、蔗糖、葡萄糖、淀粉、甘露醇或乳糖中的至少一种；
所述发酵培养基的氮源包括豆饼粉、花生饼粉、酵母粉、硫酸铵、大豆蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨或尿素中的至少一种；
所述发酵培养基的无机盐由含有至少一种以下无机离子的盐提供：Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mn2+或Mg2+。
4.根据权利要求3所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述碳源为玉米粉，所述氮源为豆饼粉，所述无机盐含有Mn2+；
优选地，所述玉米粉、所述豆饼粉及含Mn2+的所述无机盐在所述发酵培养基中的重量百分比分别为0.5-2％、0.5-2％及0.01-0.07％；
更优地，所述玉米粉、所述豆饼粉及含Mn2+的所述无机盐在所述发酵培养基中的重量百分比分别为1％、1.5％及0.07％。
5.根据权利要求3所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，发酵是于31-40℃的条件下进行至少32h；
优选地，发酵是于34-37℃的条件下进行32-48h；
更优地，发酵是于37℃的条件下进行34h。
6.根据权利要求3所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，发酵是于振荡条件下进行；
优选地，发酵于摇床中进行，所述摇床的转速为100-250r/min；
更优地，所述摇床的转速为200r/min。
7.根据权利要求3所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述猪源乳酸芽孢杆菌经以下步骤得到：
以胆酸盐平板法及产酶平板法对染有腹泻病的猪群中健康仔猪的粪便进行初筛，得到能在胆酸盐培养基中存活且对产酶平板法中所用酶系均具有酶解能力的初筛菌；以病原菌平板法对所述初筛菌进行复筛，得到对病原菌平板法所用病原菌均具有抑菌作用的复筛菌；对所述复筛菌进行人工胃液耐受性测试、人工肠液耐受性测试、温度耐受性测试，得到综合耐受性最佳的所述猪源乳酸芽孢杆菌；
所述酶系包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶；
所述病原菌包括大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌。
8.根据权利要求7所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，人工胃液耐受性测试于pH值为2.0-4.0的条件下进行和/或人工肠液耐受性测试的时间为0-6h和/或温度耐受性测试于80-100℃的条件下进行。
9.如权利要求2所述的微生态制剂在仔猪养殖中的应用。
10.根据权利要求9所述的微生态制剂在仔猪养殖中的应用，其特征在于，将所述微生态制剂按重量百分比为0.05-0.2％加入至仔猪饲料中；
优选地，所述微生态制剂按重量百分比为0.1％加入至所述仔猪饲料中。

说明书全文

一种猪源乳酸芽孢杆菌、微生态制剂及制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程及饲料领域，且特别涉及一种猪源乳酸芽孢杆菌、微生态制剂及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 随着养猪业集约化和早期断奶行为的推广，仔猪呼吸道疾病、腹泻、链球菌等成为了当前最流行的仔猪疾病，抗生素的使用被推为最经济有效的治疗手段之一，但是，抗生素的过度使用导致的细菌耐药性和药物残留等一系列的问题，造成了严重的环境污染，并且严重危害人类健康，最终被欧盟及北美国家禁止使用，我国亦列出了各种抗生素的禁用清单，且有在不久的将来全面禁止抗生素使用的趋势，因此，寻找抗生素的替代物成为了当前畜牧业发展的重要方向，肠道有益菌等微生态制剂的开发被誉为可替代抗生素的重要研究方向之一。

发明内容

[0003] 本发明的目的之一在于提供一种猪源乳酸芽孢杆菌，该猪源乳酸芽孢杆菌的生物保藏编号为CCTCC NO：M 2017596，分类命名为乳酸芽孢杆菌Q-21。该猪源乳酸芽孢杆菌能容易定植肠道并迅速生长繁殖，确保肠道有益菌的数量优势，预防肠道菌群的失调，具有产酶丰富、适应胃肠道酸性环境、能产生孢子、抗逆性强的特点。

[0004] 本发明的目的之二在于提供一种微生态制剂，该微生态制剂含有较高活性的猪源乳酸芽孢杆菌，具有猪源乳酸芽孢杆菌的所有性质与作用。

[0005] 本发明的目的之三在于提供一种上述微生态制剂的制备方法，该制备方法简单有效，条件可控性好，生产成本低，所得产品的性能稳定性好，可在生产应用中广泛推广。

[0006] 本发明的目的之四在于提供一种上述微生态制剂在仔猪养殖中的应用，能降低仔猪胃肠道pH值，杀灭肠道病原微生物，调节肠道免疫能力，预防腹泻的发生，此外还能促进饲料营养物质的消化吸收，提高平均日增重、降低料重比，从而提高仔猪的生长性能。

[0007] 本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：

[0008] 本发明提出一种猪源乳酸芽孢杆菌，其生物保藏编号为：CCTCC NO：M 2017596，该猪源乳酸芽孢杆菌于2017年10月23日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉的武汉大学。

[0009] 本发明还提出一种微生态制剂，其包括上述猪源乳酸芽孢杆菌。

[0010] 本发明还提出一种上述微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：接种上述猪源乳酸芽孢杆菌于发酵培养基中，发酵。

[0011] 本发明还提出一种上述微生态制剂在仔猪养殖中的应用，例如将微生态制剂按重量百分比为0.05-0.2％加入至仔猪饲料中。

[0012] 本发明较佳实施例提供的猪源乳酸芽孢杆菌、微生态制剂及其制备方法与应用的有益效果是：

[0013] 1)含有猪源乳酸芽孢杆菌的微生态制剂可减少仔猪饲料或养殖场抗生素的使用；

[0014] 2)本发明较佳实施例提供的猪源乳酸芽孢杆菌能快速占位、定植，产酸，降低胃肠道pH值，抑制有害菌繁殖；

[0015] 3)本发明较佳实施例提供的猪源乳酸芽孢杆菌能够产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶，提高肠道营养物质的消化利用率；

[0016] 4)本发明较佳实施例提供的猪源乳酸芽孢杆菌能够调节肠道免疫机能，预防腹泻的发生，显著降低腹泻率；

[0017] 5)本发明较佳实施例提供的猪源乳酸芽孢杆菌能够提高平均日增重及降低料重比；

[0018] 6)制备方法简单，条件可控性好，生产成本低，性能稳定性好，适于替抗产品，具有很好的应用前景。附图说明

[0019] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0020] 图1为本发明实施例提供的猪源乳酸芽孢杆菌的生物保藏信息及存活证明。

具体实施方式

[0021] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0022] 下面对本发明实施例的猪源乳酸芽孢杆菌、微生态制剂及其制备方法与应用进行具体说明。

[0023] 本发明实施例提供的乳酸芽孢杆菌来源于猪的粪便，为猪肠道内源性有益微生物。此乳酸芽孢杆菌具有乳酸菌和芽孢杆菌的双重特征，其可在仔猪肠道内迅速占位、定植、产酸、产酶，抑制有害菌生长，促进肠道微生态平衡，降低病原微生物入侵，从而降低疾病发生率。此外，该乳酸芽孢杆菌还可提高肠道营养物质消化吸收利用率，降低养殖成本，提高生产效率。

[0024] 该猪源乳酸芽孢杆菌的生理生化特征如下：芽孢囊膨大，芽孢椭圆形，端生，革兰氏染色呈阳性，葡萄糖不产气，水解淀粉，不形成吲哚，65℃生长。接触酶反应有气泡产生，呈阳性；V-P试验出现红色即呈阳性反应；厌氧检测呈阳性；50℃条件下培养，能使营养肉汤培养基变浑浊；不耐7％NaCl。

[0025] 经鉴定，本发明实施例中的菌种属于乳酸芽孢杆菌，具体分类命名为乳酸芽孢杆菌Q-21(Bacillus coagulans Q-21)，并于2017年10月23日在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2017596。本实施例所用的乳酸芽孢杆菌的生物保藏信息以及存活证明请参见图1。

[0026] 本发明实施例还提供了一种微生态制剂，其包括上述猪源乳酸芽孢杆菌，并具有猪源乳酸芽孢杆菌的所有性质及作用。作为可选地，微生态制剂中猪源乳酸芽孢杆菌的菌含量例如可以为1.8×108cfu/g-2.2×108cfu/g，优选为2.0×108cfu/g，以使猪源乳酸芽孢杆菌在微生态制剂中活性更高，所起的作用更加突出。

[0027] 上述微生态制剂的制备方法可以包括以下步骤：于发酵培养基中接种猪源乳酸芽孢杆菌并进行发酵。作为可选地，微生态制剂可以直接为发酵后的物质，也可以由发酵后的物质与载体等物质混合而得。

[0028] 较佳地，接种过程所取猪源乳酸芽孢杆菌为处于生长对数期的菌体，接种量例如可以控制在2wt％±0.5wt％，优选为2wt％。此时期的猪源乳酸芽孢杆菌具有旺盛的增殖能力，能在发酵培养基中保持较高的菌体浓度，并且处于生长对数期的猪源乳酸芽孢杆菌细胞大小较为一致，生活力强，尤其适于制作种子液用于发酵。

[0029] 作为可选地，发酵培养基的碳源例如可以包括玉米粉、麸皮、糊精、蔗糖、葡萄糖、淀粉、甘露醇或乳糖中的至少一种。发酵培养基的氮源例如可以包括豆饼粉、花生饼粉、酵母粉、硫酸铵、大豆蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨或尿素中的至少一种。发酵培养基的无机盐例如可以由含有至少一种以下无机离子的盐提供：Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mn2+或Mg2+。

[0030] 优选地，本发明实施例中的发酵培养基所用的碳源为玉米粉，所用的氮源为豆饼粉，所用的无机盐含有Mn2+。以上述优选的碳源、氮源和无机盐作为发酵培养基的成分，可较其它可选成分使发酵液中菌体浓度及芽孢形成率均更高。

[0031] 作为可选地，上述玉米粉、豆饼粉及含Mn2+的无机盐在发酵培养基中的重量百分比分别为0.5-2％、0.5-2％及0.01-0.07％。优选地，玉米粉、豆饼粉及含Mn2+的无机盐在发酵培养基中的重量百分比分别为1％、1.5％及0.07％。此比例下，发酵培养基中的碳源、氮源及无机盐含量最优，配比最为恰当，最利于菌体的生长繁殖以及芽孢的形成。

[0032] 作为可选地，发酵可以采用摇瓶发酵。摇瓶装液量为影响发酵液中溶解氧的重要因素之一，一般来说，摇瓶装液量越小，其单位体积发酵所具有的气液接触面积越大，溶解氧供应越快越充足。

[0033] 较佳地，装液量可以为25-100mL/250mL，更佳地，装液量可以为50-75mL/250mL，最佳地，装液量为50mL/250mL。此条件下，发酵液中溶解氧较为充足，更利于提高菌体浓度及芽孢产率。

[0034] 本发明实施例中的发酵优选于振荡条件下，如摇床中进行。摇床的转速例如可以为100-250r/min，更优地，摇床的转速为200r/min。转速越高，菌体的浓度越大，但超过200r/min，菌体浓度与200r/min条件下的浓度基本无差别。

[0035] 作为可选地，本发明实施例中发酵可以于31-40℃的条件下进行至少32h。优选地，发酵于34-37℃的条件下进行32-48h，更优地，发酵是于37℃的条件下进行34h。在上述优选条件下发酵所得的菌体浓度及菌体的芽孢产率均较高，但在更优条件下发酵所得的菌体浓度及菌体的芽孢产率均最佳，其中芽孢产率大于95％。

[0036] 具体地，本发明实施例所用的猪源乳酸芽孢杆菌例如可以经以下步骤得到：

[0037] 以胆酸盐平板法及产酶平板法对染有腹泻病的猪群中健康仔猪的粪便进行初筛，得到能在胆酸盐培养基中存活且对产酶平板法中所用酶系均具有酶解能力的初筛菌；以病原菌平板法对初筛菌进行复筛，得到对病原菌平板法所用病原菌均具有抑菌作用的复筛菌；对复筛菌进行人工胃液耐受性测试、人工肠液耐受性测试、温度耐受性测试，得到综合耐受性最佳的猪源乳酸芽孢杆菌。

[0038] 本发明实施例中的初筛方法主要是模拟猪消化道环境中胆汁、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等各种消化酶对进入消化道各种物质的消化分解等作用。

[0039] 具体地，初筛例如可以按以下方式进行：取新鲜仔猪粪便10g放入含90mL无菌水和玻璃珠的250mL三角瓶中，摇床200r/min旋转摇动10min，制备得到稀释至10-1倍的菌悬液，于80℃的条件下水浴20min，然后进行逐级十倍稀释。选取10-3、10-4、10-5、10-6四个稀释度的菌悬液涂布于含0.3wt％猪胆酸盐的LA平板。于37℃的条件下培养，2-5天后观察并挑取能够在含0.3wt％胆酸盐LA平板上生长良好的菌落，经纯化后转入NA斜面并编号，37℃培养1-2天后冰箱保存备用。

[0040] 将以上保存菌株接种于NB培养基中，于37℃且180r/min的条件下摇床培养24h。在产酶鉴别培养基平板上按“十”字法打孔(牛津杯法，共4个孔)，于每个孔中分别加入NB发酵液50μL，同时用无菌水作为生长对照，在超净台中放置20min后，转入37℃的恒温箱中培养24h，测量酶解圈直径。筛选酶解圈较大且酶系较全的菌株进入复筛。

[0041] 其中，LA平板的培养基配方及pH值如下：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g 氯化钠，15g琼脂，加蒸馏水至1000mL，用5moL/L氯化钠调pH值至7.0。NA平板的培养基配方及pH值如下：10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g氯化钠，15g琼脂，加蒸馏水至1000mL，pH值为7.2-7.4。NB培养基配方及pH值如下：10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g氯化钠，加蒸馏水至1000mL，pH值为7.2-7.4。

[0042] 作为可选地，上述产酶平板法所用的酶系例如可以包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶。对应地，产酶鉴别培养基分别设置为5类，包括淀粉酶鉴别培养基、蛋白酶鉴别培养基、纤维素鉴别培养基和脂肪酶鉴别培养基。

[0043] 其中，淀粉酶鉴别培养基的配方及pH值如下：2.0g可溶性淀粉，0.3g牛肉膏，1.0g蛋白胨，1.0g氯化钠，0.02g台盼兰，1.5g琼脂粉，100mL蒸馏水，pH值为7.0-7.2。蛋白酶鉴别培养基的配方如下：1-4g干酪素(高温煮沸溶解)，1g磷酸氢二钾，0.5g硫酸镁，0.5g氯化钾，0.01g硫酸铁，30g蔗糖，20g琼脂，1000mL蒸馏水。纤维素酶鉴别培养基的配方如下：20gCMC-Na，20g硫酸铵，1.0g磷酸二氢钾，0.5g氯化钠，0.5g七水硫酸镁，0.2g刚果红，1000mL蒸馏水，20g琼脂。脂肪酶鉴别培养基的配方如下：3.0g硝酸钠，1.0g磷酸氢二钾，0.5g氯化钾，
0.5g七水硫酸镁，0.01g七水硫酸亚铁，30g蔗糖，15-20g琼脂、30g橄榄油，1000mL蒸馏水。

[0044] 具体地，复筛例如可以按以下方式进行：将无菌水依次倒入活化好的各种病原菌的斜面试管内，将病原菌刮下后分别倒入盛有100mL、50℃的NA培养基的三角瓶中，混匀后分别立刻倒入双碟平板，每个平板倒入约15mL，冷却后标记病原菌平板种类。作为可选地，上述病原菌例如可以包括大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌。

[0045] 将活化后的初筛菌接种于NB培养液中，37℃条件下培养48h后，于4℃的条件下离心(10000r/min)5min，取上清液。采用牛津杯法在病原菌平板上打孔，于每个孔中分别加入50μL上清液，静置20min后置于37℃的条件下恒温培养24-48h，观察抑菌圈的大小。筛选出在三种病原菌平板上均产生抑菌圈的菌株作为复筛菌。

[0046] 进一步地，本发明实施例中的人工胃液耐受性测试于pH值为2.0-4.0的条件下进行；人工肠液耐受性测试的测定时间为0-6h；温度耐受性测试于80-100℃的条件下进行。

[0047] 其中，人工胃液耐受性测试中人工胃液的配制：9.5-10.5wt％的盐酸16.4mL，加水稀释，使pH值分别达到2.0、3.0、4.0；每100mL液体中加入1.0g胃蛋白酶，混匀，用0.2μm的无菌滤头过滤待用。

[0048] 试验方法：将活化好的乳酸芽孢杆菌按1.0wt％的接种量分别接人上述不同的pH的人工胃液，37℃，140r/min摇床培养，在0h、2h、4h进行活菌平板菌落计数。

[0049] 人工肠液耐受性测试中人工肠液的配制：取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL溶解，用0.4wt％的氢氧化钠溶液调pH值到6.8，加水稀释至1000mL，每100mL上述液体中加入1.0g胰蛋白酶，混匀，用0.20μm的无菌滤头过滤待用。

[0050] 试验方法：将活化好的乳酸芽孢杆菌按1.0wt％的接种量接入到上述人工肠液，37℃，140r/min摇床培养，在0h、2h、4h、6h进行活菌平板菌落计数。

[0051] 温度耐受性测试方法例如可以如下：将复筛菌接种于LB培养基，37℃培养48h形成大量芽孢后进行下列试验：置于80℃水浴中温育，分别于温育前、温育40min后取样测定细菌芽孢存活率；置于90℃水浴中温育，分别于温育前、温育20min后取样测定细菌芽孢存活率；置于100℃水浴中温育，分别于温育前、温育10min后取样测定细菌芽孢存活率。

[0052] 值得说明的是，本发明实施例中的培养基的配方可根据实际情况进行适当调整。

[0053] 此外，本发明实施例还提供了上述微生态制剂在仔猪养殖中的应用。具体地，可将上述微生态制剂按重量百分比为0.05-0.2％加入至仔猪饲料中。优选地，上述微生态制剂按重量百分比为0.1％加入至仔猪饲料中。

[0054] 通过将上述微生态制剂用于仔猪养殖中，第一，可补充仔猪消化道中的双歧杆菌、乳酸菌等有益菌群，改善消化道菌群平衡，预防和防治菌群失调症；第二，可有效促进仔猪体产生干扰素，提高免疫球蛋白浓度和巨噬细胞活性，从而调节仔猪机体的细胞免疫和体液免疫功能，增强抗病能力；第三，可参与菌群生存竞争，协助机体清楚毒素和代谢产物；第四，能够分泌有机酸、细菌素等杀菌物质，杀死病原微生物。可产生挥发性脂肪酸和乳酸，降低肠道pH值，从而抑制病原微生物的生长繁殖；第五，能合成B族维生素、赖氨酸、蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶等，补充仔猪自身体内消化酶的不足的缺陷，消除抗营养因子，促进营养物质的消化、吸收和利用，从而促进仔猪生长。

[0055] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0056] 实施例1

[0057] 本实施例提供一种微生态制剂在仔猪养殖中的应用，即将微生态制剂按重量百分比为0.05％加入至仔猪饲料中。微生态制剂中猪源乳酸芽孢杆菌的菌含量为1.8×108cfu/g。

[0058] 实施例2

[0059] 本实施例与实施例1的区别在于：将微生态制剂按重量百分比为0.2％加入至仔猪8
饲料中。微生态制剂中猪源乳酸芽孢杆菌的菌含量为2.2×10cfu/g。

[0060] 实施例3

[0061] 本实施例与实施例1的区别在于：将微生态制剂按重量百分比为0.1％加入至仔猪饲料中。微生态制剂中猪源乳酸芽孢杆菌的菌含量为2.0×108cfu/g。

[0062] 实施例4

[0063] 本实施例提供一种微生态制剂的制备方法，于发酵培养基中按接种量为1.5wt％接种猪源乳酸芽孢杆菌，于31℃、100r/min转速的条件下发酵52h，干燥。

[0064] 上述发酵采用摇瓶发酵，装液量为25mL/250mL。发酵培养基中含有重量百分比为0.5％的麸皮、0.5％的花生饼粉以及0.01％的含Fe2+的无机盐。

[0065] 猪源乳酸芽孢杆菌经以下步骤得到：以胆酸盐平板法及产酶平板法对染有腹泻病的猪群中健康仔猪的粪便进行初筛，得到能在胆酸盐培养基中存活且对产酶平板法中所用酶系均具有酶解能力的初筛菌；以病原菌平板法对初筛菌进行复筛，得到对病原菌平板法所用病原菌均具有抑菌作用的复筛菌；对复筛菌进行人工胃液耐受性测试、人工肠液耐受性测试、温度耐受性测试，得到综合耐受性最佳的猪源乳酸芽孢杆菌。

[0066] 其中，产酶平板法所用的酶系例如可以包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶；病原菌平板法所用的病原菌包括大肠杆菌、沙门氏菌和魏氏梭菌。人工胃液耐受性测试于pH值为2、3和4的条件下进行；人工肠液耐受性测试于0h、2h、4h和6h四个时间点测定；温度耐受性测试于80℃、90℃和100℃的条件下进行。

[0067] 实施例5

[0068] 本实施例与实施例4的区别在于：于发酵培养基中按接种量为2.5wt％接种猪源乳酸芽孢杆菌，于40℃、250r/min转速的条件下发酵32h，与载体混合。

[0069] 上述发酵采用摇瓶发酵，装液量为100mL/250mL。发酵培养基中含有重量百分比为2+ 2+
2％的蔗糖和葡萄糖的混合物、2％的酵母粉和硫酸铵的混合物以及0.07％的含Cu 和Ca的无机盐。

[0070] 实施例6

[0071] 本实施例与实施例4的区别在于：于发酵培养基中按接种量为2wt％接种猪源乳酸芽孢杆菌，于34℃、150r/min转速的条件下发酵48h，与载体混合。

[0072] 上述发酵采用摇瓶发酵，装液量为75mL/250mL。发酵培养基中含有重量百分比为1.5％的淀粉、甘露醇和乳糖的混合物、1％的大豆蛋白胨、牛肉膏和蛋白胨的混合物以及
0.04％的含Cu2+、Zn2+和Mg2+的无机盐。

[0073] 实施例7

[0074] 本实施例与实施例4的区别在于：于发酵培养基中按接种量为2wt％接种猪源乳酸芽孢杆菌，于35℃、180r/min转速的条件下发酵40h，与载体混合。

[0075] 上述发酵采用摇瓶发酵，装液量为50mL/250mL。发酵培养基中含有重量百分比为1.5％的糊精、1％的尿素以及0.03％的含Cu2+、Zn2+和Mn2+的无机盐。

[0076] 实施例8

[0077] 本实施例与实施例4的区别在于：于发酵培养基中按接种量为2wt％接种猪源乳酸芽孢杆菌，于37℃、200r/min转速的条件下发酵34h，与载体混合。

[0078] 上述发酵采用摇瓶发酵，装液量为50mL/250mL。发酵培养基中含有重量百分比为1％的玉米粉、1.5％的豆饼粉以及0.07％的含Mn2+的无机盐。

[0079] 试验例1

[0080] 以实施例8为例，初筛后所得的初筛菌共12株，该12株初筛菌的产酶情况如表1所示。

[0081] 表1初筛菌的产酶情况

[0082]

[0083] 由表1可以看出，上述12株初筛菌得到的酶解圈直径均较大，且酶系较全。

[0084] 将上述初筛菌进行复筛后，共得3株复筛菌，该3株复筛菌对病原菌的抑制情况如表2所示。

[0085] 表2复筛菌的对病原菌的抑制情况

[0086]

[0087] 由表2可以看出，上述3株复筛菌在大肠杆菌平板、沙门氏菌平板和魏氏梭菌平板上均有抑菌圈产生，且抑菌圈直径均较大。

[0088] 对上述3株复筛菌进行生理生化鉴定，其结果如表3所示。

[0089] 表3菌株的生理生化鉴定结果

[0090]

[0091]

[0092] 注：“+”表示生化反应(或革兰氏染色)为阳性；“-”表示生化反应(或革兰氏染色)为阴性，“A”表示石蕊的酸性反应，“R”表示还原石蕊，“C”表示凝乳。

[0093] 由表3可以看出，该3株复筛菌均具有芽孢杆菌的生理生化特征。

[0094] 对上述3株复筛菌进行人工胃液耐受性测试、人工肠液耐受性测试、温度耐受性测试，其结果如表4-6所示。

[0095] 表4复筛菌经人工胃液作用后的存活菌数(lgcfu/mL)

[0096]

[0097] 由表4可以看出，在pH＝2.0条件下，各菌株的生长都受到不同程度的抑制，能够检测到的活菌数也明显低于较短时间内的活菌数，但3个菌株在4h的存活菌数于0h比较相差仅一个数量级，说明存活能力很强。在pH＝3.0和pH＝4.0时，人工胃液对Q-3、Q-5、Q-21影响很小，活菌数与0h比较基本保持稳定并有缓慢增长的趋势。因此，经过人工胃液实验，表明Q-3、Q-5、Q-21对胃液环境均有较强的耐受能力。但Q-21较Q-3、Q-5在相同条件下存活菌数更多。

[0098] 表5复筛菌经人工肠液作用后的存活菌数(lgcfu/mL)

[0099]

[0100] 由表5可以看出，人工肠液对3株乳酸芽孢杆菌几乎都没有影响，都能够在肠液中生长，这说明菌株Q-3、Q-5、Q-21对人工肠液的耐受能力都很强。但Q-21较Q-3、Q-5在相同条件下存活菌数更多。

[0101] 表6复筛菌温度耐受情况(lgcfu/mL)

[0102]

[0103] 由表6可以看出，3株乳酸芽孢杆菌经80℃水浴40min后几乎全部存活，90℃水浴20min有70-80％存活，100℃水浴10min后仍有40-50％存活，显示所筛选的3株乳酸芽孢杆菌对高温有较强的耐受性。但Q-21较Q-3、Q-5在相同条件下存活菌数更多。

[0104] 因此，综合耐受性最佳的猪源乳酸芽孢杆菌为Q-21菌株，即为本实施例中的猪源乳酸芽孢杆菌。

[0105] 另，对上述猪源乳酸芽孢杆菌Q-21进行饲喂安全性试验，经灌胃乳酸芽孢杆菌16h培养物的小白鼠，饲养观察4周均健康，无一死亡。迅速解剖后观察，各组小白鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、子宫、卵巢、睾丸等脏器均无病变，表明分离筛选的猪源乳酸芽孢杆菌Q-21对小白鼠安全无毒。

[0106] 试验例2

[0107] 对猪源乳酸芽孢杆菌Q-21的发酵条件进行优化试验，其结果如表7-14所示。

[0108] 表7碳源对猪源乳酸芽孢杆菌Q-21的发酵影响

[0109]碳源活菌数(108cfu/mL) 芽孢产率(％)
玉米粉 3.6 86.2
葡萄糖 1.8 72.5
蔗糖 2.3 4.7
乳糖 0.3 1.2
淀粉 1.7 4.4
糊精 2.5 3.2
甘露醇 0.6 1.5
麸皮 3.2 81.4

[0110] 由表7可以看出，8种碳源对Q-21菌株发酵液菌浓的影响依次是玉米粉>麸皮>糊精>蔗糖>葡萄糖>淀粉>甘露醇>乳糖，其中以玉米粉为碳源时所达到的菌浓最高，为3.6×108cfu/mL，麸皮为碳源时次之。对芽孢形成率的影响依次为：玉米粉>麸皮>葡萄糖>其他几种碳源，其中玉米粉为碳源的芽孢形成率最高，为86.2％，麸皮和葡萄糖的芽孢形成率次之。因此，玉米粉为发酵过程中的最佳碳源。

[0111] 表8氮源对猪源乳酸芽孢杆菌Q-21的发酵影响

[0112]

[0113]

[0114] 由表8可知，8种氮源对菌株菌浓的影响依次为：豆饼粉>花生饼粉>酵母粉>硫酸铵>大豆蛋白胨>牛肉膏>蛋白胨>尿素。对芽孢形成率的影响依次为：豆饼粉>花生饼粉>酵母粉>蛋白胨>大豆蛋白胨>硫酸铵>牛肉膏>尿素，其中豆饼粉为氮源时的菌浓和芽孢形成率最高，分别为6.73×108和91％。因此，豆饼粉为发酵过程中的最佳氮源。

[0115] 表9无机离子对猪源乳酸芽孢杆菌Q-21的发酵影响

[0116]无机离子活菌数(108cfu/mL) 芽孢产率(％)
Fe2+ 4 72
Zn2+ 7 86
2+
Cu 0.9 66
Ca2+ 6 86
Mn2+ 10 95
Mg2+ 5 85

[0117] 由表9可知，Mn2+对Q-21菌株发酵的促进作用最强，菌浓可达1.0×109cfu/mL，芽孢形成率可达95％。因此，含Mn2+的无机盐(如MnSO4·H2O)为发酵过程中的最佳无机盐。

[0118] 综合以上各单因素试验结果，选择玉米粉、豆饼粉、MnSO4·H2O、初始pH、接种量，按正交试验表L16(45)设计正交试验。试验结果见表10。其中，K代表均值，R代表极差。

[0119] 表10正交试验设计及结果

[0120]

[0121]

[0122] 由表10可以看出，极差值R豆饼粉>RpH>R接种量>RMnSO4，因此，豆饼粉为主要影响因素，pH影响次之。7号试验组的发酵液的生物量最高，为1.76×109个芽孢/mL，条件为A2B3C4D1E2。而由均值K得出的最佳组合为A2B3C4D2E2，即玉米粉的重量百分数为1.0％、豆饼粉的重量百分数为1.5％、MnSO4·H2O的重量百分数为0.07％、起始pH为7.0、接种量为2.0％。由于正交试验表中无该组合，因此对该组合进行验证实验。验证结果表面该组合的菌浓为1.83×
109个芽孢/mL，比7号试验组合提高7.6％，且芽孢形成率达95％以上。

[0123] 按上述正交试验所得的发酵培养基的条件进行发酵，测定温度、摇床转速、装液量以及发酵周期对发酵结果的影响，其结果如表11-14所示。

[0124] 表11温度对猪源乳酸芽孢杆菌Q-21的发酵影响

[0125]9
温度(℃) 菌体浓度(10cfu/mL) 芽孢产率(％)
31 0.86 >95
34 1.24 >95
37 1.79 >95
40 1.74 >95

[0126] 表12摇床转速对猪源乳酸芽孢杆菌Q-21的发酵影响

[0127]

[0128]

[0129] 表13发酵周期对猪源乳酸芽孢杆菌Q-21的发酵影响

[0130]装液量(mL/250mL) 菌体浓度(109cfu/mL) 芽孢产率(％)
25 1.78 95
50 1.86 95
75 1.62 90
100 1.5 90

[0131] 表14装液量对猪源乳酸芽孢杆菌Q-21的发酵影响

[0132]发酵时间(h) 菌体浓度(109cfu/mL) 芽孢产率(％)
0 0 0
2 0.04 0
4 0.5 0
8 0.89 0
12 1.25 0
16 1.84 <5
20 1.86 30
24 1.88 50
28 1.85 75
32 1.83 90
34 1.8 >95
36-48 1.8 >95

[0133] 由表11-14可以看出，Q-21菌株的最佳培养条件为：玉米粉的重量百分数为1.0％、豆饼粉的重量百分数为1.5％、MnSO4·H2O的重量百分数为0.07％、NaH2PO4·2H2O的重量百分数为0.2％、NaHPO4·2H2O的重量百分数为0.4％、起始pH值为7、接种量为2.0％、最适温度37℃、摇床转速200r/min、摇瓶装液50mL/250mL、发酵周期34h。优化前后发酵液的菌浓差别明显，比基础培养基提高13.1倍，芽孢产率也从70.2％达到95％以上。

[0134] 试验例3

[0135] 将实施例8所得的微生态制剂用于仔猪养殖中：将体重相当的32日龄杜长大三元杂交仔猪36头，随机分为试验组和对照组，对照组饲喂551T保育猪料，试验组饲喂添加0.1wt％的含有Q-21的微生态制剂(活菌含量2.0×1010cfu/g)的551T保育猪料。采用人工管理模式，人工投料、自动饮水。每天定时投料，自由采食，适时采集至少4只仔猪的新鲜粪便样品，放入灭菌的牛皮纸袋中，及时送实验室检测。

[0136] 试验开始时(第0天)称取两组仔猪的始重，试验结束时(第45天)称取每组仔猪的末重。记录两组仔猪每天的采食量，观察并记录两组仔猪的腹泻情况和其他疾病的情况，历时45天。其中，腹泻发生率(％)＝腹泻头数×日/(猪头数×试验天数)×100％。其结果如表15所示。

[0137] 表15 Q-21菌株微生态制剂对仔猪生长性能及腹泻率的影响

[0138]组别平均日采食量(g) 平均日增重(g) 料重比腹泻率(％)
对照组(18头) 623 417 1.49 2.38
试验组(18头) 642 461 1.39 0.45

[0139] 从表15可以看出，试验组比对照组平均日采食量提高了3.05％，日增重比对照组提高了10.55％，料重比降低了6.71％，腹泻率降低了1.93％。

[0140] 取1.0g新鲜猪粪便样品采用10倍梯度稀释法稀释至10-8，选择至少三种稀释度，涂布于EMB、MRS、BBL等鉴别培养基平板上，接种量为100μm/9cm平板，每个稀释度做至少3个平行，37℃恒温培养24-48h。选择菌落数为30-300的平板进行计数，分别检测粪便中大肠杆菌、乳酸菌、双歧杆菌的含量。其中BBL培养基平板在真空干燥器中(蜡烛熄灭后，将200mL 10wt％NaOH的溶液与焦性没食子酸20g混合)进行厌氧培养。

[0141] 将粪便放置2-3d，让芽孢杆菌充分形成芽孢，悬浮液80℃水浴10min，再应用10倍稀释平板法，无菌操作涂布接种于PCA培养基平板上，37℃恒温培养24-48h，同理检测芽孢杆菌的数量。

[0142] 其结果显示：用活菌稀释平板法培养的仔猪肠道菌群，试验组与对照组猪粪便中大肠杆菌数(0.81×107cfu/g，为试验期内第7天至第45天的平均数，下同)比对照组(1.56×107cfu/g)减少了48.08％(p<0.01)。试验组乳酸菌数和双歧杆菌数比对照组分别增加了7 7
54.34％(试验组为5.21×10cfu/g，对照组为3.38×10cfu/g)和34.19％(试验组为6.24×
109cfu/g，对照组为4.65×109cfu/g)；芽孢杆菌增加了85.55％(试验组为6.42×107cfu/g，对照组为3.46×107cfu/g)。

[0143] 另，称取对照组和试验组猪粪样品各三份，每份2.5g，加10.0mL蒸馏水(相当于5倍稀释)，8000r/min离心取上清液即为待测酶液。测定待测酶液的消化酶活力，包括蛋白酶活力、α-淀粉酶活力、纤维素酶活力和脂肪酶活力。其结果显示：在仔猪饲料中添加0.1wt％的含Q-21菌株的微生态制剂后试验组粪便中蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶及脂肪酶的活力比对照组均逐渐提高，并在第6天后两组的差异达到最大值，以后变化趋于平稳，因此从第7天开始计算试验组和对照组平均酶活力并进行比较。

[0144] 结果表明，试验组粪便中的蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶的平均活力及脂肪酶(从试验第7天至第45天的酶活力之和除以39，分别为(38.85U/g、24.67U/g、186.54U/g、17.18mg/g)比对照组(计算方法同上，22.31U/g、15.26U/g、73.28U/g、10.27mg/g)分别增加了74.14％(p<0.01)、61.66％(p<0.01)、154.56％(p<0.01)和67.28％(p<0.01)。

[0145] 此外，测定仔猪粪便中常规养分含量，包括水分含量、粗灰分含量、钙含量、总磷、粗脂肪、粗蛋白、淀粉、粗纤维，以上测得的含量，除水分外均为绝干物质含量(105℃，3h，置干燥器30min后测定)。

[0146] 结果表明，在饲料中添加0.1wt％的含Q-21菌株的微生态制剂后，仔猪粪便中粗蛋白、淀粉、粗脂肪和纤维素含量的变化由呈一定的规律：即从实验开始后到第6天，试验组的这些营养成分逐渐降低，之后保持一定的低水平；从测定数据可知，试验组粗蛋白、淀粉、粗脂肪和粗纤维的平均含量分别为6.87％、0.54％、13.69％和9.58％，与对照组分别为12.32％、0.89％、17.24％和13.65％相比下降了44.24％(p<0.01)、39.33％(p<0.01)、
20.59％(p<0.05)和29.82％(p<0.01)。即添加0.1wt％的含Q-21菌株的微生态制剂后仔猪粪便中的有机成分含量均有显著下降。

[0147] 综上所述，本发明实施例中猪源乳酸芽孢杆菌能容易定植肠道并迅速生长繁殖，确保肠道有益菌的数量优势，预防肠道菌群的失调，具有产酶丰富、适应胃肠道酸性环境、能产生孢子、抗逆性强的特点。提供的微生态制剂含有较高活性的猪源乳酸芽孢杆菌，具有猪源乳酸芽孢杆菌的所有性质与作用。上述微生态制剂的制备方法简单有效，条件可控性好，生产成本低，所得产品的性能稳定性好，可在生产应用中广泛推广。将上述微生态制剂应用于仔猪养殖中，能降低仔猪胃肠道pH值，杀灭肠道病原微生物，调节肠道免疫能力，预防腹泻的发生，此外还能促进饲料营养物质的消化吸收，提高平均日增重、降低料重比，从而提高仔猪的生长性能。

[0148] 以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

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一种猪源乳酸芽孢杆菌、微生态制剂及制备方法与应用

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