技术领域
[0001] 本
发明涉及一种微量生物组织简易快速研磨方法，可以广泛应用于
植物、动物和
真菌等微量组织的研磨，属于生物化学与分子生物学研究技术领域。
背景技术
[0002] 在生物化学与分子生物学研究领域，微量生物组织的研磨大多是用来制备活性蛋白或核酸等生物大分子时的必要阶段。研磨为一个物理摩擦产热过程，较长时间的研磨极易造成生物大分子活
力下降或丧失，为防止其活力下降或丧失，微量生物组织的研磨，一般实验室采用液氮研磨方法，由于液氮冷冻能将组织冻脆，且超低温能有效抑制核酸酶和蛋白酶的活性，研磨效果最好。传统的研磨方法是将样品装入离心管，经过液氮冷冻离心管后，利用研磨棒进行手工研磨。此类传统方法一次只能研磨一个样品，对于几百个甚至更多的样品，不仅效率低，还费时费力，操作人员往往在研磨几十个样品之后，由于左手一直扶着离心管，长时间处于冷冻状态，而右手反复旋转研磨棒，容易起
水泡，所以操作人员手部最易受到损伤。因处于一个开放式的工作状态，样品不仅容易被污染，且在研磨过程中样品容易溅出，导致了样品的损失，同时为保证样品不被解冻，需用液氮频繁冷冻离心管，如此不仅费时且浪费液氮。针对传统研磨方法，一些学者对研磨棒进行了改造，或发明了新的研磨装置，但还是一次只能研磨一个样，工作效率仍无法得到很好的提高，实用性不强。目前，也有一些公司出售相应的生物组织研磨仪，但这些研磨仪价格不仅昂贵，而且许多研磨仪的研磨方式，易引起离心管破裂，导致研磨失败，对于稀缺样品是不可逆的损失。另外，虽然上机前后，样品都可用液氮冷冻，但研磨仪里不能加液氮，每份样品需各自独立上机和下机，对于大量样品，如此操作所需时间长，样品容易解冻，易造成样品的降解。
[0003] 因此，针对活性生物大分子的提取，开发一种微量生物组织简易快速研磨方法，降低样品在研磨中的损失程度，减少样品的交叉污染，提高研磨效率是很有必要的。
发明内容
[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种微量生物组织简易快速研磨方法，它能使样品损耗量小，操作简单方便，实用性强，既能提高效率，又能避免样品交叉污染。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] 一种微量生物组织简易快速研磨方法，包括以下步骤：
[0007] (1)研磨耗材的准备；
[0008] (2)将液氮倒入冷冻纸盒，使冷冻纸盒装满液氮且不溢出，将需研磨的生物样品加入已灭菌的离心管中，每个离心管内放入已灭菌的
钢珠球1～2粒，盖上离心管
盖子，将离心管放入冷冻纸盒格子内，期间补充挥发的液氮使冷冻纸盒装满液氮且不溢出，加完所有样品后，用冷冻纸盒盖子盖好冷冻纸盒；
[0009] (3)待样品冷冻0.5～1min后，从冷冻纸盒的一个
角把液氮倒回液氮罐中，再盖好冷冻纸盒盖子；
[0010] (4)手动上下以每秒不低于2次的速度快速摇动冷冻纸盒，使样品
破碎；所述每秒不低于2次以手动连续一上一下为1次；
[0011] (5)揭开冷冻纸盒盖子，将液氮再次倒入冷冻纸盒中装满冷冻纸盒且不溢出，然后盖上冷冻纸盒盖子，使样品处于液氮保护中，防止样品解冻降解，实验需要样品时打开冷冻纸盒盖子取出离心管即可，离心管内的样品直接用于后续核酸和蛋白的提取。
[0012] 进一步，步骤(2)中所述钢珠球的直径为所用离心管内径的0.5～0.7倍，例如可以是0.5倍、0.55倍、0.6倍、0.65倍、0.7倍。
[0013] 进一步，步骤(4)中摇动冷冻纸盒的总时间为0.5～1min，例如可以是0.5min、0.6min、0.7min、0.8min、0.9min、1min。
[0014] 进一步地，为
回收利用钢珠球及防止样品解冻降解，在步骤(5)中将液氮再次倒入冷冻纸盒中后，用
镊子取出离心管，倒出钢珠球，样品留在离心管中，盖上离心管盖子，将离心管放回冷冻纸盒格子内，再盖上冷冻纸盒盖子；将倒出的钢珠用清水洗净、灭菌、干燥备用。
[0015] 步骤(1)中所述研磨耗材包括塑料离心管、钢珠球、冷冻纸盒、液氮、防冻手套、镊子。
[0016] 当新鲜样品量大于120mg或干样大于60mg时，重复步骤(3)和步骤(4)1～2次，以保证样品研磨充分，所述样品研磨充分是指样品研磨成粉状，能用于后续核酸和蛋白的提取。
[0017] 与
现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0018] 1、样品损耗量小。本发明采用全封闭式研磨，只有钢珠球与样品分离时损耗了少量样品，若操作得当，几乎无损失，由于钢珠球在样品上面，冷冻状态下样品不易附着在钢珠上，将钢珠倒出时，样品不易随钢珠球带出。若不需要回收利用钢珠球，钢珠无需倒出，这样样品的损失几乎为零。所以对于稀缺样品，本发明方法尤为适用。
[0019] 2、液氮损耗量低。本发明操作过程中液氮不与样品直接
接触，使用完毕后可以回收利用，显著降低液氮的损耗。同时，操作过程中液氮处于较为封闭的环境，也减少了液氮的挥发，从而提高了液氮的利用率。
[0020] 3、操作安全简便。整个流程简单，不需要传统方法的研磨过程，减少了工作强度，而且操作人员不需要有特别熟练的技巧，同时操作过程中减少了操作人员与液氮的直接接触步骤，使得人员受伤的概率大大降低，提高了操作的安全性。
[0021] 4、工作效率高。经不同实验人员，多次操作统计，排除研磨耗材准备时间和样品称量时间，采用本发明方法完成100个样品的研磨(≤120mg的样品)，如果不回收钢珠球，需10～18min，如果需回收钢珠球，需17～30min。而传统研磨法，据统计研磨一个样品需2～4min(≤120mg的样品)，研磨100个样品需200～400min，相比传统方法，本发明方法比传统研磨法研磨100个样品(≤120mg的样品)可节省92％以上时间，本发明方法优势明显。
[0022] 5、无交叉污染。本发明采用全封闭式研磨，整个研磨过程中样品之间绝对独立，不会存在交叉污染，而且与液氮隔离，在保证钢珠清洁的前提下可以有效避免样品间及样品与液氮间的可能污染。
[0023] 6、可有效防止离心管破裂和样品降解。由于目前大多数市售研磨仪研磨力度较大，易引起离心管破裂，本发明采用人为控制摇动冷冻纸盒，可有效防止离心管破裂问题。另外，采用研磨仪，在样品上机后不能在研磨仪里加液氮，每份样品需各自独立上机和下机，对于大量样品，本发明可避免上机和下机过程中造成的样品解冻降解问题。
[0024] 7.本发明适用于各种植物组织(如根、茎、叶、花、果实等)、动物组织(如肌肉、内脏器官、
皮肤等)、真菌等微量新鲜样品或干燥样品的研磨破碎，适用范围广。
具体实施方式
[0025] 本发明提供了一种微量生物组织简易快速研磨方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。下面结合具体
实施例，对本发明做进一步说明。
[0026] 实施例1
[0027] 100份新鲜水稻
叶片的研磨，每个样品120mg。
[0028] (1)研磨耗材的准备。包括体积为2mL、内径10mm的塑料离心管、直径6mm的钢珠球、100格的冷冻纸盒(高51mm*长158mm*宽158mm)、液氮、防冻手套、镊子。这些研磨耗材均为市售。
[0029] (2)将液氮倒入冷冻纸盒，使冷冻纸盒装满液氮且不溢出。每个已灭菌的离心管中加入120mg新鲜水稻叶片样品，每个离心管内放入已灭菌的钢珠球1粒，盖上离心管盖子，离心管放入冷冻纸盒格子内。液氮易于挥发，期间补充液氮2次使冷冻纸盒装满液氮且不溢出，直到加完100份样品，用冷冻纸盒盖子盖住冷冻纸盒。
[0030] (3)待样品冷冻1min后，戴上防冻手套，小心平端冷冻纸盒，从冷冻纸盒的一个角把液氮倒回液氮罐中，再盖好冷冻纸盒盖子。
[0031] (4)液氮倒尽后，手动上下以每秒不低于2次的速度快速摇动冷冻纸盒，所述每秒不低于2次以手动连续一上一下为1次；1min后停止摇动，打开冷冻盒盖子，将液氮再次倒入冷冻纸盒中装满冷冻纸盒不溢出，检查样品已全部研磨好(粉状)。
[0032] (5)用镊子分别取出每个离心管，打开离心管盖子，小心倒出钢珠球，样品留在离心管中，盖上离心管盖子，将离心管放回冷冻纸盒格子内，液氮易于挥发，期间补充液氮1次使冷冻纸盒装满液氮且不溢出，再盖上冷冻纸盒盖子，使样品处于液氮保护中。倒出的钢珠用清水洗净、灭菌、干燥后备用。
[0033] 本实施例1经不同实验人员，多次操作统计，排除研磨耗材准备时间和样品称量时间，完成100份样品研磨，耗时为17～30min，经检查所有样品都研磨成粉状，可直接用于核酸和蛋白的提取。
[0034] 实施例2
[0035] 本实施例2除步骤(5)没有取出钢珠球的操作外，其余步骤与实施例1相同。
[0036] 本实施例2经不同实验人员，多次操作统计，排除研磨耗材准备时间和样品称量时间，完成100份样品研磨(不回收钢珠球)，耗时为10～18min，经检查所有样品都研磨成粉状，可直接用于核酸和蛋白的提取。
[0037] 实施例3
[0038] 100份干燥水稻叶片的研磨，每个样品60mg。
[0039] 本实施例3中除以下步骤及条件不同外，其余步骤及条件与实施例1相同。
[0040] 步骤(1)中加入的样品是60mg干燥水稻叶片样品。
[0041] 步骤(3)中样品冷冻的时间是0.5min。
[0042] 步骤(4)中摇动冷冻纸盒时间为0.5min。
[0043] 本实施例3排除研磨耗材准备时间和样品称量时间，完成100份样品研磨(干样品、回收钢珠球)，耗时为16～29min，经检查所有样品都研磨成粉状，可直接用于核酸和蛋白的提取。
[0044] 实施例4
[0045] 100份新鲜水稻叶片的研磨，每个样品150mg(大于120mg的样品)
[0046] 本实施例4中除以下步骤及条件不同外，其余步骤及条件与实施例1相同。
[0047] 步骤(2)中每个已灭菌的离心管中加入150mg新鲜水稻叶片样品。
[0048] 重复步骤(3)和步骤(4)一次。
[0049] 本实施例4排除研磨耗材准备时间和样品称量时间，完成100份样品研磨(新鲜大样品、回收钢珠球)，耗时为19～32min，经检查所有样品都研磨成粉状，可直接用于核酸和蛋白的提取。
[0050] 对比例1
[0051] 采用传统研磨法研磨新鲜水稻叶片样品，具体操作如下：
[0052] (1)研磨耗材的准备。包括体积为2mL、内径10mm的塑料离心管、离心管双面板、100格的冷冻纸盒(高51mm*长158mm*宽158mm)、研磨棒、液氮、防冻手套。这些研磨耗材均为市售。
[0053] (2)将液氮倒入冷冻纸盒，使冷冻纸盒装满液氮不溢出。取1个已灭菌的离心管，加入120mg新鲜水稻叶片样品，用镊子取出已灭菌的研磨棒，将研磨棒放入离心管内，将离心管放入装满液氮的冷冻纸盒，待样品冷冻0.5～1min后，取出离心管放入离心管双面板上，迅速旋转研磨棒，期间补充挥发的液氮5～7次。
[0054] (3)离心管再次放入装满液氮的冷冻纸盒，样品冷冻0.5～1min后，取出离心管放入离心管双面板上，迅速旋转研磨棒。
[0055] (4)拿走研磨棒，盖好离心管盖子，将离心管放入装有液氮的冷冻纸盒内，待后续用于核酸和蛋白的提取，即完成一个样品的研磨。
[0056] 其它样品研磨，重复上述步骤(2)至步骤(4)。
[0057] 经统计，研磨一个样品耗时2～4min，研磨完100个样品，排除实验耗材准备时间及样品称量时间，耗时200～400min，而且实验操作人员由于左手长时间直接接触被液氮冷冻过的离心管，被冻红，右手反复旋转研磨棒，被磨起水泡，且后续实验发现有部分样品被污染，剩余的液氮里也有很多碎叶片，无法回收利用。
[0058] 通过上述实施例和对比例可看出，相对传统研磨方法，本发明方法具有样品损耗量小，操作简单方便，实用性强，可避免样品交叉污染，工作效率高，技术优势突出的特点。
[0059] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
