技术领域
[0001] 本
发明涉及一种细胞内胆固醇敏感度和定位的测量方法及其诊断试剂。
背景技术
[0002] 心脑
血管疾病是人类健康的第一杀手，而血脂代谢紊乱，特别是
血浆胆固醇
水平增高，是目前公认的致动脉硬化、心脑
血管疾病的重要危险因素，因此检测血浆胆固醇水平目前已经成为临床上广泛使用的
风险评估方式之一。然而我们也不能忽视这样一个事实：临床上很多患者血脂并不高，也并不肥胖，但照样患动脉硬化(心梗)；另外，患有其它疾病人群，比如慢性肾脏疾病、糖尿病、
自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮等)等，这些患者特点是都合并有慢性
炎症，血胆固醇水平并不高，但患心血管疾病的风险比正常人群要高30-50倍。由于我国糖尿病、慢性肾脏疾病、自身免疫病等发病率逐年增高，2型糖尿病患者的发病率达到了11.8％，慢性肾脏病的发病率也达10％，还有自身免疫疾病等，导致这些血胆固醇水平并不高，但可能发生心血管疾病的总人数接近3亿(叫‘隐匿发病人群’)。对于隐匿发病人群，由于血胆固醇不高，根据传统的风险评估手段，很多人并没有针对血脂紊乱的
治疗措施，而事实上我们的研究发现：该类病人由于细胞胆固醇敏感器(SCAP)功能异常，导致代谢稳态的异常，细胞内胆固醇异常增高(胆固醇异常分布)，并可出现降脂药物的抵抗现象。因此这类患者不但需要降脂治疗，而且还需要强化降脂治疗。遗憾的是目前对这一现象没有足够的重视，还没有一个针对这类‘隐匿发病人群’的早期预测和风险评估的指标，从而耽误了这类人群的心脑血管疾病的
预防和治疗。因此明确为什么有的个体血胆固醇水平不高，但确有严重的动脉硬化发生？有的个人血胆固醇水平高，但动脉硬化的危险度也不一定与血液中胆固醇含量成正比，这不但是个一直没有被解决重大科学问题，同时也是困惑临床医生和病人的重大临床难题。
[0003] 我国重大代谢紊乱性疾病，包括动脉硬化引起的心脑血管疾病发病率逐年上升，由于该病致死、致残率高，诊疗成本高，已经给家庭和社会造成巨大的经济负担。事实上很多病人由于血脂不高，或者不肥胖，患病之前并没有引起重视，没有得到有效的预防和治疗措施，这类患者要占到总心血管事件50％以上，因此是个重大临床问题。
[0004] 由于胆固醇敏感器功能的不同，不同的个体对胆固醇毒性的敏感性有差异；另外炎症应激可以干扰胆固醇敏感器的表达和功能，导致胆固醇从血循环向组织重新分布，导致了血循环中胆固醇降低而细胞内(细胞器)胆固醇增加。这样一方面解释了为什么有些患者血浆胆固醇水平不高，但心血管死亡率增加的原因；同时提出新的理论：没有一个安全的血胆固醇浓度；细胞对胞内胆固醇水平的敏感度，而不是单纯的血脂浓度，是决定脂质介导的器官损害的决定因素；定位检测细胞内胆固醇水平(而不是单纯的测量血液胆固醇浓度)具有更重要的意义。
[0005] Brown和Goldstein首先报道:细胞是通过一个依赖于胞内胆固醇水平的
负反馈调节系统的控制，使LDL受体(LDLr)的活性始终处于一个正常状态，并由此荣获1985年度诺贝尔医学奖。目前，有关该反馈调节系统的分子机制已经阐明得比较清楚，即通过Insig-SCAP-SREBPs进行的细胞内脂质稳态平衡调节。胆固醇调节元件结合蛋白(Sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)是LDLr基因的转录因子，能与LDLr基因启动子上的胆固醇调节元件1(SRE-1)发生特异性结合的蛋白，从而增强LDLr的转录。SREBPs的活化受胞内胆固醇水平调节，而SREBP的分解活性蛋白SCAP(SREBP cleavage-activating protein，SCAP)和胰岛素诱导基因(Insulin Induced Gene，Insig)在SREBPs的活性调节中又起重要作用。SCAP是内质网的一种膜蛋白，它与SREBPs在细胞内质网结合成复合物，对SREBPs起稳定作用，并通过控制SREBPs在亚细胞上定位而调节其活性。Insig-
1(Insulin Induced Gene，Insig)是结合在内质网上的一个膜蛋白，在细胞内胆固醇浓度高时，与SCAP固醇敏感区结合，使SCAP被
锁在内质网上。当细胞需要胆固醇时，SCAP就会与Insig-1分离，SCAP-SREBPs复合物从内质网转移至高尔基体，在两个蛋白酶(S1P，S2P)的作用下，SREBPs被裂解，具有转录活性的N-末端
片段进入细胞核内，促进LDLr和HMGCoAR基因的转录。当胞内胆固醇水平升高时，Insig-1与SCAP的固醇敏感区结合，使SCAP-SREBP复合物滞留在内质网，致使LDLr和HMGCoAR基因的表达受抑制，从而防止了细胞过多的摄取、合成胆固醇。SCAP对胆固醇的敏感性直接控制了细胞对外源胆固醇的摄取及内源胆固醇的合成，在维持细胞内胆固醇的内环境稳定起着非常重要作用。
[0006] 我们对胆固醇敏感度的认识首先原于一些被人们忽视但十分重要的临床现象:临床上很多患动脉硬化疾病的患者，其血脂浓度并不高。虽然有很多其他因素比如：
高血压，高半光
氨酸血症等可以解释部份病例，但没法回避这样一个事实：不管血胆固醇是否增高，动脉粥样硬化斑
块内均有大量
泡沫细胞形成和胆固醇的沉积。
[0007] 其次，虽然血脂代谢紊乱，特别是血浆胆固醇水平异常增高，目前公认是一重要致动脉粥样硬化的危险因素，也是心血管疾病发病率明显增加的主要原因之一,临床的一些研究也曾表明血液LDL胆固醇或总胆固醇与动脉硬化的发生之间存在着一定的相关性，但这种相关性是非常微弱的，而且主要是集中在极端高胆固醇血症的个体被发现，并局限在白人、男性、
冠状动脉；而在黑人、女性、或其他动脉壁没有发现有显著的相关性(1-4)。进一步分析发现：这种微弱的相关性是由于临床研究对象选择的局限性导致的，表现在很多临床研究只选择高胆固醇血症的病人，如果将血胆固醇浓度大于350mg/ml(9mmol/l)的个体从临床实验中去掉，或者随机选择人群做研究，血胆固醇和AS相关性也随之消逝(11)。这些证据表明：血液中胆固醇含量与主动脉和冠状动脉组织内的胆固醇浓度以及动脉粥样硬化的程度没有明确的正相关性。
[0008] 再者，患有其它慢性炎症性疾病人群，比如慢性肾脏疾病，糖尿病，自身免疫性疾病等，这些患者血胆固醇水平也不高，但心血管疾病的风险比正常人群要高30-50倍，这些研究结果证明了在慢性炎症状态下(CRP增加为特征)，患心血管疾病的风险是明显增高的，映证了Ross等(12)于1999年提出的动脉粥样硬化是一种炎症性疾病的理论；同时提示：很大一部分患者中，一些因素(比如炎症反应)可能改变了胆固醇的代谢和分布，从而导致了血胆固醇水平与心血管疾病的风险不成正相关。血胆固醇正常，不等于没有患动脉硬化的风险。因此单纯的血胆固醇水平(尤其在慢性炎症状态下)，不是评估心血管疾病/动脉硬化的风险和指导临床降脂治疗的有效指标！
[0009] 那么炎症指标是否可以用来衡量心血管风险呢？CRP是一重要的炎症指标，近年来大量的研究提示CRP可能是心血管疾病重要的危险因子，然而进一步的研究表明：CRP与心血管疾病的特异的相关性非常低，目前没有任何证据说明CRP的增高能预测心血管疾病的发生和发展(13)。PEPYS等通过人CRP转基因鼠和注射超纯的CRP证明：人的CRP只是一个急性反应蛋白，并不加重炎症反应，也不加重动脉硬化板块的形成(14)；同时最近也有人明确提出CRP并不是动脉硬化的特异的危险因子(15)。因此，寻找和建立新的特异的评估心血管疾病/动脉硬化的风险指标是我们面临的新课题。
[0010] 自LDLr发现以来，LDLr在调节血脂以及在动脉粥样硬化的发生、发展中起的作用一直倍受关注。LDLr也成为临床降血脂治疗的靶点。
他汀类药物是目前国内外使用最多的降脂药物，它是HMGCoAR的一个
抑制剂，其作用机理是通过抑制HMGCoAR的活性而降低细胞内胆固醇的合成，通过负反馈调节，增加
肝细胞细胞LDLr的表达，这样肝细胞能增加对血循环中LDL胆固醇的摄取，降低血LDL胆固醇浓度，从而有效的降低心血管疾病的发病率。目前大量的临床研究表明，在一般人群中，他汀类药物能降低血浆中胆固醇达30-50％，并能有效的降低27％的心血管疾病的发病率，然而在患有慢性炎症性疾病如糖尿病，慢性肾脏疾病的患者中，他汀类药物的心血管保护作用却受到质疑。最近一个名为4D的大规模、多中心前瞻性临床研究表明，atorvastatin(20mg/day)并不能有效的降低糖尿病、血液
透析病人心血管疾病的风险(16)。这个临床实验让我们思考：为什么他汀类药物在部份人群中工作，但在大部分人群中不工作？由此，我们进行了深入的研究，结果提示：具有慢性炎症性疾病的人群可能对他汀类药物有某种程度的抵抗。
[0011] 我们的研究也进一步表明：在慢性炎症状态下，外周细胞LDLr的这种敏感的反馈调节失调，从而外周细胞LDLr从“下调易感型”转化为“下调抵抗型”，使外周细胞表面的LDLr对胆固醇介导的抑制作用变得不敏感(类似肝细胞)，这样就使外周细胞摄取过多的胆固醇，形成泡沫细胞，并导致他汀药物的抵抗。这种敏感度的变化可以用50％的抑制率(IC50)来量化(7)。这可能也是他汀类药物在这类高危人群中不工作的主要原因之一。我们的这个发现，引起了血脂研究领域的关注，被美国肾脏病基金会纳入了全球Cardio Kidney Diabetes降脂治疗的指南。更重要的是，这个研究还提出了胆固醇敏感度的概念和可能的检测方法。
[0012] 目前，糖耐量实验广泛用与糖尿病/代谢综合症的早期诊断，但很少有关于脂肪耐量的实验的报道，主要原因是由于脂质成分的多样性及脂肪代谢的复杂性。脂肪耐量这个名字最早是Fahmay在1952年提出。他们通过给病人一个高胆固醇饮食，然后测定餐后3，5，7小时血胆固醇的含量，动态观测了血脂的变化，后来也有应用脂肪耐量试验分析人富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)清除延迟发生率及其对血浆脂质的影响。研究发现脂肪负荷餐后，血脂的变化主要是乳靡颗粒已经富含甘油三酯(TG)的脂质变化比较明显，清除明显延缓，脂肪餐后高TG应答与血浆高
密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低呈负相关(P<0.01)。也有研究表明：脂肪餐后游离
脂肪酸(FFA)水平在动脉硬化患病组有显著升高，提示混乱的FFA代谢可能用于评估血脂正常的CAD的风险，并可能作为代谢综合症的一个早期指标(17)。这些方法，通过动态的监测血脂谱的变化来反映
机体对脂肪代谢的耐受性，主要是对TG和FFA的代谢的影响，然而胆固醇是致动脉硬化的“第一杀手”，这种单纯的脂肪耐量实验没有对胆固醇的代谢及其动脉硬化的风险关系做出判断，单纯的动态测量血脂的变化，也不能有效地说明机体组织细胞对胆固醇的敏感性。
[0013] 有研究表明正常人PBMC上LDLr的水平及功能调节与其他外周组织细胞LDLr类似(21；22)。由于血循环中的PBMC容易获取，具有很好的可操作性，在动脉硬化的预测、诊断中有广阔的应有前景。为了探讨其可行性，我们分离健康正常人的PBMC(n＝5)，并与不同浓度的LDL在体外共同培养，测量细胞LDLr mRNA和蛋白的水平，然后计算出使50％LDLr受抑制的LDL的浓度(IC50)。预实验结果表明：健康人PBMC与血管平滑肌细胞一样，在正常生理状态下，LDLr对LDL的反映非常敏感，表现为“下调易感型”，IC50小于25μg/ml。同时，我们也能在PBMC上检测到在LDLr调节中起重要作用的SCAP的表达。为了探讨是否本方法比单纯血脂更敏感，更准确的反映动脉硬化的危险性，我们采用血胆固醇正常，但患有动脉硬化患者的PBMC，用同样的方法测量IC50。预实验的结果表明：发现这类患者IC50显著升高，提示IC50比血胆固醇与动脉硬化有更好地相关性。
[0014] 由于高脂状态下，细胞LDLr/HMGcoAR水平受抑制的敏感度直接反映了细胞对胆固醇的敏感性，也反映了SCAP的功能。
[0015] 传统的单纯以血胆固醇做为心脑血管风险评估的指标存在‘盲区’。因此如何消除胆固醇风险评估的盲区，发现新的针对隐匿发病人群的风险评估指标，从而使得3亿隐匿发病人群得到有效的早期风险评估，早期干预和治疗，已经成为国际和国内重大临床需求。
发明内容
[0016] 本发明所要解决的技术问题是提供一种采用安全的血浆胆固醇浓度，细胞对胞内胆固醇水平的敏感度，而不是单纯的血脂浓度，是决定脂质介导器官损害的关键因素，我们希望测量LDL胆固醇对LDLr/HMGcoAR的抑制率来测量细胞对胆固醇的特异敏感度，能够彻底改变传统的关于血脂测量和风险评估的方式，具有非常重要的临床应用价值。
[0017] 本发明是通过以下技术方案来实现的：一种胆固醇敏感度的测量方法，包括LDL标准品的制备、细胞培养方法、RNA提取方法以及一步法
荧光定量RT-PCR四大步骤；
[0018] 其中，LDL标准品的制备具体步骤如下：
[0019] 一、取健康自愿者血浆，加入抗
氧化剂；
[0020] 二、10000g以下离心30min，去除乳糜微粒；
[0021] 三、然后加溴化钠将血浆以密度调整为1.006kg/L，40000r/min超速离心18h，吸出上层乳白色液体及次层淡黄色液体，收集下层液体；
[0022] 四、再加入溴化钠(NaBr)调整其终密度为1.063gkg/L，再次40000r/min超速离心24h，吸出上层橙黄色液体即获LDL；
[0023] 其中，细胞培养方法具体步骤如下：
[0024] 一、将分离健康人和疾病人群的PBMC，小部分细胞直接用于检测PBMC内胆固醇敏感器SCAP的表达水平；
[0025] 二、大部分细胞用含10％的无脂血清的RPMI1640培养基，种在12孔板中，培养12小时；
[0026] 三、然后与用上述方法制备的不同浓度的LDL胆固醇，浓度分别为0、25、50、100、200μl/ml，共孵育24小时，然后按照下列方法提取mRNA；
[0027] 其中，RNA提取方法为采用Trizol来提取PBMC的RNA，然后分离RNA；
[0028] 其中，一步法荧光定量RT-PCR，采用一步法完成反转录和PCR两个过程，不必再取出cDNA；
[0029] 试剂包括经过优化的缓冲液、RT-PCR MIX，dNTP、Sybr green I染料和MgCl2溶液混合物，并拟使用定量荧光PCR检测PBMC的SCAP的表达水平，以及不同浓度LDL刺激下LDLr和HMGCoAR的mRNA水平,并计算50％LDLr和HMGCoAR被抑制时LDL胆固醇的浓度，反映细胞/机体对胆固醇的敏感度，根据不同浓度LDL状态下，LDLr和HMGCoAR mRNA的水平，计算出IC50。
[0030] 作为优选的技术方案，所述抗
氧化剂为100umol/L EDTA、20umol/L丁羟
甲苯。
[0031] 一种胆固醇敏感度的测量的检测
试剂盒，其中包括以上几部分的试剂，定量荧光RT-PCR试剂可适合任意荧光定量PCR仪。
[0032] 一种验证胆固醇敏感度IC50的准确性的方法，(一)U937细胞用含10％的无脂血清的RPMI1640培养基，种在12孔板中，培养12小时，与用上述方法制备的不同浓度的LDL胆固醇共孵育24小时，然后用Trizol提取细胞总RNA，一步法荧光定量RT-PCR，根据不同浓度LDL状态下，LDLr和HMGCoAR mRNA的水平，并用Excel
软件作出量效关系曲线，拟和线性回归方程计算mRNA IC50。
[0033] (二)用基因
转染的方法，在CHO细胞上建立不同表达水平SCAP超表达的细胞系，转染了不同浓度的SCAP的CHO细胞，用含10％的无脂血清的RPMI1640培养基，种在12孔板中，培养12小时，然后用Trizol提取细胞总RNA，使用定量荧光PCR检测SCAP的表达水平，与PBMC内胆固醇敏感器SCAP的表达水平比较，用此细胞作为阳性对照来检查试剂盒对PBMC内SCAP定量检测的上述方法的准确性和灵敏性，并根据检测结果对各种实验条件及生产工艺进行调整，使试剂盒的准确性和灵敏度达到技术要求的标准。
[0034] 本发明的有益效果是：根据前期工作
基础，我们提出：没有一个安全的血浆胆固醇浓度，细胞对胞内胆固醇水平的敏感度，而不是单纯的血脂浓度，是决定脂质介导器官损害的关键因素。我们希望测量LDL胆固醇对LDLr/HMGcoAR的抑制率来测量细胞对胆固醇的特异敏感度。如果开发成功，这将彻底改变传统的关于血脂测量和风险评估的方式，具有非常重要的临床应用价值。
具体实施方式
[0035] LDL标准品的制备
[0036] 取健康自愿者血浆，加入抗氧化剂(100umol/L EDTA、20umol/L丁羟甲苯)，10000g以下离心30min，去除乳糜微粒，然后加溴化钠将血浆以密度调整为1.006kg/L，40000r/min超速离心18h，吸出上层乳白色液体(VLDL)及次层淡黄色液体(IDL)，收集下层液体，再加入溴化钠(NaBr)调整其终密度为1.063gkg/L，再次40000r/min超速离心24h，吸出上层橙黄色液体即获LDL。
[0037] 细胞培养方法
[0038] 将分离健康人和疾病人群的PBMC，小部分细胞直接用于检测PBMC内胆固醇敏感器SCAP的表达水平；大部分细胞用含10％的无脂血清的RPMI1640培养基，种在12孔板中，培养12小时(同步化)，然后与用上述方法制备的不同浓度的LDL胆固醇(0，25，50，100，200μl/ml)共孵育24小时，然后按照下列方法提取mRNA。
[0039] RNA提取方法
[0040] 高
质量的RNA是检测SCAP基因表达的关键。目前从有限的细胞中提取足够的RNA的技术比较成熟，Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速
破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。我们拟采用Trizol来提取PBMC的RNA，然后分离RNA.[0041] 一步法荧光定量RT-PCR
[0042] 采用一步法完成反转录和PCR两个过程，不必再取出cDNA。试剂包括经过优化的缓冲液、RT-PCR MIX(由反转录酶和Taq DNA聚合酶组成的混合酶，既可cDNA合成又可PCR扩增)，dNTP、Sybr green I染料和MgCl2溶液混合物。我们拟使用定量荧光PCR检测PBMC的SCAP的表达水平，以及不同浓度LDL刺激下LDLr和HMGCoAR的mRNA水平,并计算50％LDLr和HMGCoAR被抑制时LDL胆固醇的浓度(IC50)，反映细胞/机体对胆固醇的敏感度。根据不同浓度LDL状态下，LDLr和HMGCoAR mRNA的水平，计算出IC50。
[0043] 根据以上技术平台，拟开发出胆固醇敏感度的测量的检测试剂盒，其中包括以上的几部分的试剂。定量荧光RT-PCR试剂可适合任意荧光定量PCR仪，如：lightcycler、ABI7000、roto-gene、FTC2000、icycler等。
[0044] 我们将用人的体外培养的单核细胞系(U937)来以及我们实验室已经建立标化的IC50的测量方法，来验证胆固醇敏感度IC50的准确性。U937细胞用含10％的无脂血清的RPMI1640培养基，种在12孔板中，培养12小时(同步化)，与用上述方法制备的不同浓度的LDL胆固醇(0，25，50，100，200μl/ml)共孵育24小时，然后用Trizol提取细胞总RNA，一步法荧光定量RT-PCR，根据不同浓度LDL状态下，LDLr和HMGCoAR mRNA的水平，并用Excel软件作出量效关系曲线，拟和线性回归方程计算mRNA IC50(50％抑制浓度)。
[0045] 同时，我们将用基因转染的方法，在CHO细胞上建立不同表达水平SCAP超表达的细胞系(注：用不同数量的SCAP cDNA，我们实验室拥有人的SCAP cDNA的表达质粒)，转染了不同浓度的SCAP的CHO细胞，用含10％的无脂血清的RPMI1640培养基，种在12孔板中，培养12小时(同步化)，然后用Trizol提取细胞总RNA，使用定量荧光PCR检测SCAP的表达水平，与PBMC内胆固醇敏感器SCAP的表达水平比较，用此细胞作为阳性对照来检查试剂盒对PBMC内SCAP定量检测的上述方法的准确性和灵敏性，并根据检测结果对各种实验条件及生产工艺进行调整，使试剂盒的准确性和灵敏度达到技术要求的标准。
[0046] 我们已经在细胞
生物学和动物实验上证明了胆固醇敏感器(度)与动脉硬化的发生、发展有密切关系。本
实施例中，将选择年龄在18-60岁的志愿者(注：同意参加本试验并签署书面知情同意书者)并分为4组：正常对照人群(体检中心)，正常血脂但确诊为AS组，高胆固醇血症但无AS组，高胆固醇血症并确诊为AS组，每组60人。
[0047] 高胆固醇血症的诊断标准采用国内普遍采用的我国于1997年制定的诊断标准，即每升血中的总胆固醇(TC)超过5.7毫摩尔(即>5.7mmol/L)为胆固醇水平升高。动脉粥样硬化以病史、体检和辅助检查为诊断依据，目前应用多谱勒超声技术检测颈动脉内膜中膜厚度(IMT)及斑块形成，已成为判断外周动脉粥样硬化病变的公认指标，颈动脉内中膜厚度(IMT)>1.0mm为内膜增厚，IMT>1.2mm视为斑块形成。
[0048] 拟采用定量荧光PCR技术，测量正常人群和疾病人群IC50以及SCAP基因表达的水平，建立正常健康人群胆固醇敏感度的基线；并探讨胆固醇敏感度以及SCAP基因表达的水平其与血胆固醇水平以及动脉硬化的相关性。
[0049] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以
权利要求书所限定的保护范围为准。
