技术领域
[0001] 本
发明涉及环境中重金属污染的
植物修复技术领域，尤其是涉及喀斯特山地矿区土壤中重金属铜污染后的修复技术领域，具体为雀稗在修复喀斯特山地矿区土壤重金属铜污染中的应用。
背景技术
[0002] 西部矿产资源开发引发的一系列生态环境问题—地表植被和土壤的破坏，土地荒漠化，对地表
水造成的污染等问题使得当地
生态系统变得更加脆弱，
生物多样性减少、生态逆向演替严重。
[0003] 采取植物修复技术是符合贵州喀斯特山地矿区自然条件和经济条件的可行性方法。其中对于植物修复，发现适合的超富集植物、适合的耐受性植物以及采取的合理方案是关键。目前已经发现的植物物种大多数是镍超富集植物，筛选合适物种用于本土的土壤治理是首要条件。由于不同地区重金属污染土壤的原始条件不同，
气候条件不同，自然经济条件不同，因此合适的修复物种和技术方案都是带有地域性特征的研究结果。
[0004] Cu是植物生长发育必须的微量元素，又是环境污染物，通常植物的正常生理代谢与生长发育对它的需要量不大，过多的铜离子对植物代谢将会起到不利影响。Cu是一种有-1毒重金属元素，其在正常植物中的含量仅有10 mg·kg ，因此开展铜污染土壤的治理和生态修复的研究很有必要。Cu的超富集植物的筛选比较困难。外地已经发现的Cu的耐性植物有海洲香薷（Elsholtzia splendens）、杠板归（Polygonum perfoliatum L.）和鸭拓草（Rhoeo spathacea (Sw.) Stearn）等。
[0005] 贵州喀斯特山区是我国乃至世界喀斯特分布面积最大的片区之一,由于其生态系统的脆弱性,加之人类活动的干扰,使得该区的植被退化较为严重。喀斯特是贵州最大和最基本的环境特点，受到喀斯特环境脆弱性的影响，贵州社会经济发展与生态环境的协调差、可持续能
力弱。喀斯特环境下广泛发育的自然土壤是石灰石，属于富
钙、自然肥力较低的土类、土层零星少薄且不连续，保水保肥能力差，植被生境条件恶劣，喀斯特环境中的植物适生种类少，群落结构简单、食物链易于受干扰而中断、生态系统稳定度低、脆弱性强，植被生长慢，生物生产力与生物量都低于全国其他湿热的亚热带地区。
[0006] 因此研究适合贵州本土喀斯特山地矿区污染
土壤修复技术的植物物种，能够适应土壤零星零星少薄，土壤呈强酸性的环境，生态系统脆弱的特点，兼顾环境效益的同时还要经济效益，使用经济的草本物种，便于在喀斯特山地矿区实施修复工程使用。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种具有一定的抗旱、抗盐
碱能力，适应性、生长势和扩展性强，耐践踏，适合于土层零星少薄，土壤呈强酸性的喀斯特山地矿区，可以同时提高该地的绿化水平，
播种和管理简单，便于工程化实施的雀稗植物，具体为雀稗在修复喀斯特山地矿区土壤重金属铜污染中的应用。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0009] 雀稗（Paspalum scrobiculatum Linn．）在修复喀斯特山地矿区土壤重金属铜污染中的应用，该应用方法为先往金属铜污染的土壤中
覆盖2-4cm的周边
森林凋落物和土壤
种子库，然后种植雀稗，采用雀稗修复贵州喀斯特山地矿区铜污染土壤，利用其对铜的富集特性吸收积累重金属铜，并将其转移到地上部分，雀稗生命力旺盛，在其生长过程中不需要特殊管理，待长到6厘米以上后，每年9-10月收割，留茬继续生长，因此成本低，可操作性强。对收割的部分进行灰化处理，灰化后的物质可以用于提取重金属。以达到修复铜污染的目的，实现对重金属铜污染的土壤进行修复的效果。
[0010] 贵州喀斯特山地矿区的重金属铜污染的土壤，该地区的土壤特点为地表干旱、地形崎岖、土壤零星少薄，生态环境低劣、土壤pH呈强酸性，一般的植物无法在此存活。所述的土壤零星少薄是指土壤厚度为1cm以下的不连续土壤；土壤呈强酸性是指土壤的pH值为5以下的土壤。
[0011] 雀稗的种植方法为播种，先在污染土壤上覆盖一层2-4cm的周边森林凋落物和土壤
种子层，然后直播种植雀稗种子。种子在日均温大于18℃时发芽最好，因此要根据当地当时的
气候变化规律确定播种时间。雀稗种子的播种量为30-40克/平方米；在
水培状态-1下，雀稗对铜的吸收量达到1211.054mg·kg 。在土培状态下，在降解螯合剂EDDS的作用-1
下，雀稗对铜的吸收量达到1632.205mg·kg 。
[0012] 螯合剂EDDS具有较强的溶解土壤痛和增加植物吸收累积铜的能力，螯合剂EDDS-1的使用浓度为5mmol·kg 为宜。
[0013] 采用本应用可使Shannon-Winer多样性指数从0增加到0.5-0.7。
[0014] 雀稗，多年生、簇生草本，高30－100厘米，有一定的抗旱、抗盐碱能力，适应性、生长势和扩展性强，耐践踏，适合于土层零星零星少薄，pH值高的喀斯特山区，可以同时提高该地的绿化水平，播种和管理简单，便于工程化实施。该应用方法为直接将雀稗种子播种在覆盖了凋落物和土壤种子库的重金属铜污染的贵州喀斯特山区。
[0015] 土培方法和水培方法具体步骤如下：
[0016] 第一步、在六盘水市盘县红果镇
银河
煤矿和贵阳花溪麦坪乡的煤矿
尾矿库污染区域的修复示范点，播种雀稗种子后一年，采集雀稗和对应的表层土，带回实验室。
[0017] 第二步、水培实验，采用Hoagland
营养液进行培养。将
采样回来的植株用
自来水洗干净，选取大小一致的苗进行水培，预培养20天后进行Cu处理，营养液用-1 -1 -1 -10.1mol·L NaoH或 0.1mol·L HCL 调PH 至 5.8，浓 度 为 0μmol·L 、25μmol·L 、-1 -1 -1 -1
50μmol·L 、75μmol·L 、100μmol·L 、150μmol·L ，每三天换一次营养液，处理30天后
收获，做根系活力测定实验。
[0018] 样品用自来水洗干净，用去离子水冲洗干净，再用吸水纸把表面水吸干，将样品分地上部分和根系测定各部分鲜重，然后自然
风干，测定其干物质
质量，用
粉碎机
磨碎，供分析测定。
[0019] 第三步、土培实验。土壤取自贵州师范大学生命科学学院花圃内的0-10cm的表层黄棕壤。花盆高20厘米，直径20里面，每盆装土1.5kg，Cu以CuSO4溶液的形式加入，施Cu-1水平为100mg·kg ，装盆前和土混均，调节土壤
含水量至50%，将花盆至于花圃内平衡20天，雀稗是生长30天后，用不同浓度的螯合剂EDDS处理，30天后收获植株，把地上部分和根系用自来水和去离子水清洗干净，自然风干，测定其干物质质量及Cu含量。
[0020] 第四步、样品分析，用
电子天平取24植物样品各0.5g左右加入到对应编号的锥形瓶中。分别在24个锥形瓶中加入12ml纯
硝酸和3ml高氯酸。将24个锥形瓶放在ML型可调试电热板上加热。将锥形瓶中的消解液转移定容。在
原子吸收分光光度计上测量植物Cu含量。
[0021] 雀稗根系对Cu的浓度呈现明显的低浓度促进，高浓度抑制的特征。水培营养液Cu浓度在75μmol/L以下时，雀稗根系活力随Cu浓度的增加而增加，当水培营养液Cu浓度超过75μmol/L时，雀稗根系活力明显受到抑制。
[0022] 土壤种子库指土壤及其表面凋落物中所有具有生命活力种子的总和，作为植被潜在更新能力的重要组成部分，种子库很重要，自然力无法完全恢复时，种子库在人工进行恢复或促进恢复过程中起关键作用。土壤种子库的种子通过萌发、生长参与自然更新，它在很大程度上它代表了当地乡土植被被特有的遗传基因和变异特性。由于种子本身的生物学特性或小环境对种子造成的生理生态学作用，使得一些种子暂时处于一种休眠或者静止的状态，当休眠被打破或小环境发生改变，这些种子就能迅速萌发并入侵到环境条件适合于他们的地段，甚至在局部地区形成优势种群，对整个群落的更新和演替
进程产生重大影响。
[0023] 贵阳花溪麦坪乡的煤矿尾矿库污染区域样地在经过土壤种子库参与的修复实验4个月后发现有白茅（Imperata cylindrica (Linn.) Beauv）、五节芒（Miscanthus floridulu (Labnll.)Warb）和
马尾松（Pinus massoniana Lamb）的
幼苗生长。
[0024] 六盘水市盘县红果镇银河煤矿样地在经过土壤种子库参与的修复实验5个月后发现有五节芒（Miscanthus floridulu (Labnll.)Warb）的幼苗生长。
[0025] 从图2可以知道，覆盖凋落物和土壤的厚度达到2-4cm时候，植被盖度已经达到极大值35%，以较少的凋落物和土壤量达到了极好的修复效果。
[0026] 与
现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0027] 雀稗的抗盐碱能力强，适应性强、生长势和扩展性强，耐践踏，适合于土层零星零星少薄，土壤呈强酸性的喀斯特山地矿区，可以同时提高该地的绿化水平，播种和管理简单，便于工程化实施。
附图说明
[0028] 图1为不同Cu浓度的处理条件下，雀稗的根系的活力变化曲线图；
[0029] 图2为覆盖凋落物和土壤的厚度与植被盖度的关系变化曲线图；
[0030] 图3为雀稗在7个浓度梯度的
硫酸铜溶液胁迫实验中根系活力变化曲线图；
[0031] 图4为雀稗在7个浓度梯度的硫酸铜溶液胁迫实验中叶绿素变化曲线图。
具体实施方式
[0032] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
[0033] 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述
实施例。
[0034] 实施例1：
[0035] 实验地在贵州六盘水市盘县红果镇银河煤矿废弃地周边铜污染土壤，凋落物和土壤种子库取至周边森林。盘县红果镇银河煤矿样地土壤pH值范围达到3.04—5.04，呈强-1酸性，土壤铜离子含量65.86 mg·kg ，超过了土壤环境治理标准（GB15618-1995）中的二-1
级标准50 mg·kg ，达到了铜污染的标准。
[0036] 实验分为七组，实验开始时间是10月份，将实验地划分为1m*1m的方
块，分别覆盖凋落物，厚度为0cm、2cm、2-4cm、4-6cm、6-8、8-10cm、10-12cm，每个厚度重复五次。然后播撒雀稗种子。
[0037] 播种后每隔三天，浇灌一次水，两周之后停止人工浇灌。
[0038] 一年后收割雀稗，对其根系和地上部分的铜离子含量进行测定，实验结果表明，雀-1稗对土壤铜污染有超富集性。雀稗地上部分对铜含量的吸收平均值为1058.119mg·kg 。
富集系数达到1.4-3.2。根据Brooks对铜超富集植物的定义，植物地上部分能富集的1000 -1
mg·kg 的铜则称之为超富集植物。
[0039] 如图2所示，实验样地在修复实验后一年，植被盖度从修复前的0%增加到了平均值35%，凋落物和土壤种子层厚度达到2-4cm时候（图2）已经达到较好的修复效果，实验样地的Shannon-Winer多样性指数从0增加到了0.5。多样性指数是用来描述一个群落的多样性的统计量。在生态学中，它被用来描述生态系统中的生物多样性，Shannon-Winer多样性指数用来估算群落多样性的高低。公式如下：
[0040]
[0041] 其中S表示总的物种数，pi表示第i个种占总数的比例(Pielou 1975)。当群落中只有一个居群存在时，Shannon-Winer多样性指数达最小值0；当群落中有两个以上的居群存在，且每个居群仅有一个成员时，Shannon-Winer多样性指数达到最大值lnk。
[0042] 雀稗对土壤铜污染有超富集性。雀稗地上部分对铜含量的吸收平均值为-1
1058.119mg·kg 。实验样地在修复实验后一年，植被盖度从修复前的0%增加到了平均值35%，凋落物和土壤种子层厚度达到2-4cm时候，已经达到较好的修复效果，实验样地的Shannon-Winer多样性指数从0增加到了0.5。
[0043] 水培实验的条件下，雀稗根系对Cu的响应呈现明显的低浓度促进，高浓度抑制的特征。水培营养液Cu浓度在75μmol/L以下时，雀稗根系活力随Cu浓度的增加而增加，当水培营养液Cu浓度超过75μmol/L时，雀稗根系活力明显受到抑制。具体的在水培实验不同处理浓度下，雀稗对铜的吸收效率和转运效率如下表所示：
[0044] 表1.水培Cu离子胁迫实验
[0045]
[0046] 从表1可以知道，水培营养液中Cu浓度在75μmol·L-1以下时，随着Cu浓度的增-1加，雀稗的吸收效率和转运效率明显增加，在Cu浓度达到7575μmol·L 以上时，雀稗的吸收效率和转运效率增加趋缓。
[0047] 实施例2：
[0048] 实验地在贵州贵阳市花溪区麦坪乡煤矿废弃地周边铜污染土壤，实验过程同实施例1。实验结果表明，雀稗对土壤铜污染有超富集性。其中，雀稗地上部分对铜含量的吸收-1平均值为1223.412mg·kg 。富集系数达到1.1-2.4。实验样地在修复实验后一年，植被盖度从修复前的0%增加到了平均值30%，实验样地的Shannon-Winer多样性指数从0增加到了0.7。
[0049] 本研究认为，雀稗对铜污染土壤有较强的修复潜力，是铜污染土壤治理的超富集植物。播种前，采用周边森林凋落物和土壤种子库对污染土壤进行覆盖对于播种后续的生长比较有利。种子在日均温大于18℃时发芽最好，因此要根据当地当时的气候变化规律确定播种时间。播种量为每平方米30～40克。
[0050] 雀稗对土壤铜污染有超富集性。其中，雀稗地上部分对铜含量的吸收平均值为-11223.412mg·kg 。富集系数达到1.1-2.4。实验样地在修复实验后一年，植被盖度从修复前的0%增加到了平均值30%，实验样地的Shannon-Winer多样性指数从0增加到了0.7。
[0051] 逆境条件（重金属铜污染）下雀稗根系活力的变化研究：
[0052] 雀稗在实验前进行水培
[0053] 1、用自来水洗净雀稗；
[0054] 2、将准备好的雀稗放入装有Hoagland营养液的塑料小桶内，并在
接触塑料桶盖的
位置用海绵固定植株，预培养一周，营养液每7天更换一次；
[0055] 3、设定7个浓度梯度的CuSO4溶液处理植物（用0.1mol/lNaOH或 HCl调节PH至5.8），每个浓度梯度两个重复处理，观察并测定植物的生理变化（实验一——根系活力和实验二——叶绿素测定）；浓度梯度设定为：
[0056]
[0057] 实验原理：氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准
氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色、不溶于水的三苯甲腙（TTF），生成的TTF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入
琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被
丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。
[0059] （一）实验材料：根系。
[0060] （二）试剂 1、乙酸乙酯（分析纯）。 2、次硫酸钠（Na2S2O4，分析纯，又名保险粉），粉末。 3、0.4%TTC溶液：准确称取TTC 0.4g，溶于少量水中，定容到100mL。 4、
磷酸缓冲液（1/15mol/L，pH7.0）。
[0061] A液：称取Na2HPO4.2H2O 11.876g（Na2HPO4.12H2O 23.876g）溶于蒸馏水，定容至1000ml。
[0062] B液：称取KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水，定容至1000ml。
[0063] 用时取A液60ml, B液40ml混合即可。 5、1mol/L硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55mL，边搅拌边加入盛有500mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000 mL。
[0064] （三）仪器设备
[0065] 小烧杯，研钵，移液管，刻度试管6支，分光光度计，分析天平，温箱，试管架，药勺，
石英砂适量，
滤纸。
[0066] 三、实验步骤 2.定量测定
[0067] （1）TTC标准曲线的制作：取0.4％TTC溶液0.2mL放入大试管中，加9.8mL乙酸乙酯，再加少许Na2S2O4粉末摇匀，则立即产生红色的TTF。此溶液浓度为每毫升含有TTF80??g。分别取此溶液0.25mL、0.50mL、1.00 mL、1.50mL、2.00mL置10 mL刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF 20??g、40??g、80??g、120??g、160??g的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参比，在485nm
波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
[0068] （2）称取根尖样品0.25g，放入小烧杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液（pH7.0）各2.5mL，使根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1.5h，此后立即加入1mol/L硫酸1mL，以停止反应。
[0069] （与此同时做一空白，先加硫酸，再加根样品，37℃暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上）
[0070] （3）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯1～2mL，充分压按，以提出TTF。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2～3次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为5mL，用分光光度计在波长485 nm下比色，以乙酸乙酯做空白对照测出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC还原量。
[0071] 统计CuSO4处理浓度与根系活力之间的关系，从图3可知，随着胁迫实验的进行，TTC还原量（根系活力）在降低，但是幅度不大，说明雀稗对铜离子有较强的耐受性。
[0072] 当铜离子浓度达到25ug/mL后，随着离子浓度的增加，TTC还原量（根系活力）变化幅度减缓，说明雀稗对铜离子有较强的耐受性。
[0073] 逆境条件（重金属铜污染）下雀稗叶绿素含量的变化实验：
[0074] 1. 叶绿素的提取
[0075] 称取新鲜（或干材料）的洗净擦于的雀稗
叶片 0.2g，剪碎后放入25ml容量瓶中，加4.5:4.5:1（丙
酮：无水
乙醇：水）定容至刻度，然后在低温避光条件下静止提取24h（中间振荡3次）。
[0076] 2. 测定
[0077] 以4.5:4.5:1（丙酮：无水乙醇：水）为空白对照采用分光光度计测定，在663nm波长下读取吸光度（OD）值测量叶绿素A，663nm波长下读取吸光度（OD）值测量叶绿素B。
[0078] 五、计算
[0079] 利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为：OD =Kbc
[0080] 式中：OD为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。
[0081] 叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶-1绿素a和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L 时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。
[0082] 根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（OD663和OD645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示：
[0083] OD 663=82.04×Ca+9.27×Cb （1）
[0084] OD 645=16.75×Ca+45.60×Cb （2）
[0085] 解方程（1）和（2）得：
[0086] Ca=12.7×OD 663—2.69× OD 645 (3)
[0087] Cb=22.9× OD 645—4.68×OD 663 (4)
[0088] Ca十b＝Ca十Cb(5)
[0089] 从公式（3）、（4）、( 5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）。
[0090] 从图4可以说明：
[0091] 随着胁迫实验的进行，叶绿素浓度在降低，但是幅度不大，说明雀稗对铜离子有较强的耐受性。当铜离子浓度达到50ug/mL后，随着离子浓度的增加，叶绿素变化幅度不大，说明雀稗对铜离子有较强的耐受性。
