技术领域
[0001] 本
发明涉及肉用西门塔尔牛6号染色体上与脾脏重相关的SNP位点及应用。
背景技术
[0002] 肉用西门塔尔牛是中国最流行的牛杂交群体配套品种，具有生长速度快、产肉率高的特点，因此在育种生产中常作为终端父本使用。牛脾脏，在中国常用作中药用，具有健脾开胃、消积除痞的功效。当前，对肉用西门塔尔牛的育种主要以提高产肉率、生长速度等生长性状为主，而对脾脏重的选育则关注较少。此外，脾脏重是受多个基因控制的数量性状，基因组上存在大量与其相关的数量性状基因座(quantitative trait loci，QTLs)。因此，采用常规育种方法难以快速准确的提高目标性状的育种进展。而分子标记技术的快速发展则为此类性状的精准选择提供了可能。
[0003] 过去，人们通过候选基因法(Candidate gene approach)和QTL
定位(QTL Mapping)进行QTL检测。候选基因法虽然具有方法简单、操作方便等优点，但只能针对
生物学功能已知的基因；而QTL定位方法所鉴定的候选
位置基因的置信区域同样较大，这极大地限制了复杂性状分子标记在
家畜遗传育种中的应用。随着高通量测序技术的发展及全基因组芯片的出现，使得全基因组关联分析(Genome-wide Association Study，GWAS)在复杂性状遗传解析中效果显著，也打破了牛胴体相关性状分子标记
鉴别的
瓶颈。
发明内容
[0004] 为了实现上述目标，本发明的首要目的在于提供牛6号染色体上与肉用西门塔尔牛脾脏重相关的SNP位点，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中序列中的M是G或A，导致牛脾脏重的不同。
[0005] 所述分子标记位于肉用西门塔尔牛的6号染色体上的核苷酸序列上，所述分子标记的SNP位点为SEQ ID NO：1序列标注位置为69位的G69-A69的核苷酸突变；所述的分子标记的SNP位点对应于国际牛基因组UMD3.1版本参考序列6号染色体上第38852378位G＞A突变。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述的分子标记在筛选高脾脏重的牛个体的方法，具体为，检测牛6号染色体上
权利要求1所述的分子标记，所述分子标记的5’端第69位单核苷酸是G还是A，淘汰A保留G。具体体现在所述牛选自内蒙古
锡林郭勒盟乌拉盖管理区牧场的肉用西门塔尔牛资源群体。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种用于鉴定上述影响牛脾脏重的分子标记的引物对，所述引物对的核酸序列如下所示：
[0008] 正向引物序列如SEQ ID NO：2所示；
[0009] 反向引物序列如SEQ ID NO：3所示。
[0010] 上述的引物对在鉴定影响牛脾脏重中的应用。
[0011] 上述的引物对在牛基因组选择中的应用。
[0012] 上述的引物对在提高牛脾脏重中的应用。
[0013] 本发明的目的在于提供一种牛的遗传改良的方法，所述方法包括：确定种牛资源群体中的种牛的上述的影响牛脾脏重的分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述种牛资源群体中选择国际牛参考基因组UMD3.1版本6号染色体上第38852378位点为GG和AG、AA基因型的种牛个体，淘汰在第38852378该位点为AA基因型的牛个体，以逐代提高该位点的等位基因G的
频率，从而提高后代牛的脾脏重。
[0014] 本发明相对于
现有技术具有如下的优点及效果：
[0015] 本发明研究并确定与牛脾脏重相关的分子标记，验证其对脾脏重的影响效应，最终建立高效准确的基因组选择育种技术，将其应用于种牛提高脾脏重的遗传改良中，从而提高后代牛的脾脏重，进而增加养殖企业市场竞争
力。
附图说明
[0016] 图1为肉用西门塔尔牛在6号染色体上关于脾脏重的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示牛的染色体编号；纵坐标表示-logP值。
[0017] 图2为不同基因型肉用西门塔尔牛的脾脏重。
具体实施方式
[0018] 下面结合
实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0019] 本发明的上述发明目的具体是这样实现的：
[0020] 实施例1
[0021] 1、实验动物
[0022] 本发明所使用的实验牛群群体均来自内蒙古锡林郭勒盟乌拉盖管理区牧场中国肉用西门塔尔牛1093头，为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牛遗传育种创新团队组建的肉用西门塔尔牛资源群体。
[0023] 本实验共选取该资源群体中1093头肉用西门塔尔牛。肉用西门塔尔牛资源群体每年进行扩群，新增个体一般经历出生、育肥和屠宰3个阶段。每年3-5月出生的犊牛经过一段时间的放养管理后，在同年7月份由牛遗传育种创新团队进行统一初生重和体尺测量，并同时对
基础母牛进行测量。同年10月份将5～9月龄的青年牛进行统一集中育肥，并收集生长发育性状的表型数据，同时左右用于Illumina BovineHD芯片基因分型获得基因型数据。当所有个体育肥期达10-12个月时，即来年的11月份左右，对所有肉用西门塔尔牛进行分批屠宰。屠宰过程严格按照《肉类采购规范》执行，屠宰数据、胴体数据和肉质数据严格按照GB/G 27643-2011《屠宰后胴体性状和肉质性状测定指南》的要求进行测定。
[0024] 2、样本采集
[0025] 用
采血管收集上述牛群体所有个体静脉血50ml，置于-80℃
冰箱保存备用。
[0026] 3、牛全基因组770K高
密度芯片SNP判型
[0027] 从上述资源群体中选取的1093头肉用西门塔尔牛中的每个个体采集静脉血50ml，用标准
苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μl已提取好的待测DNA样品与2μl Loading Buffer混合，上样到1％的琼脂糖凝胶中，150V
电压下
电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。
[0028] DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，根据公司标准流程进行牛全基因组Illumina BovineHD芯片770K SNP芯片(Illumina，美国)基因型判定。利用PLINK v1.90
软件对所有样本770K芯片扫描分型数据进行
质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性
水平高于10-6的SNP，最终得到671,204个SNP的有效基因型数据。
[0029] 4、全基因组关联(GWAS)分析
[0030] 为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R语言GenABEL
软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferrini法确定SNP与脾脏重关联程度的显著性
阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组显著水平阈值为7.45e-8，即0.05/671,204(有效SNP数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为1.49e-6，即1/671,204(有效SNP数量)。
[0031] GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在肉用西门塔尔牛6号染色体中存在显著影响脾脏重的位点，最强关联的SNP为g.69G＞A(P＝4.91E-17)。
[0032] 5、不同基因型与脾脏重表型的
关联性分析[0033] 根据表1可知，分子标记的SNP位点g.69G＞A与脾脏重极显著相关(P＜0.001)，说明此分子标记显著影响牛的脾脏重，可以通过对牛的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体的脾脏重，进而加快目标性状的育种
进程。
[0034] 另外根据表1可知，GG型、AG型比AA型的脾脏重高，说明AA型牛个体对筛选脾脏重高不利，故优先保留GG、AG型的种牛。因此，在育种过程中需要逐步淘汰AA型的种牛，以逐代提高该位点的等位基因G的频率。
[0035] 表1分子标记的SNP位点g.69G＞A与脾脏重的相关性
[0036]
[0037] 6、目的DNA序列扩增及测序
[0038] (1)引物设计
[0039] 通过Ensembl
网站(hGGp：//asia.ensembl.org/index.hGml)下载牛的6号染色体上SEQ ID NO：1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。
[0040] 设计的引物的DNA序列如下所示：
[0041] P001正向：5’-ATCTCCAGTTGCCATACCGAG-3’，
[0042] P002反向：5’-ACTAGAACAGTACATCAAGCGGC-3’；
[0043] (2)PCR扩增
[0044] 10uL的反应体系中加入DNA模板1uL，双蒸水3.4uL，2×AGg PCR StanMix with Loading Dye 5uL，引物P001和P002各0.3ul。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、56℃
退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。
[0045] (3)DNA序列测定
[0046] DNA序列测序鉴定：在北京生工科技有限公司进行，基因
片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示：
[0047]
[0048] 注：
序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变
碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。
[0049] 7、分子标记的SNP位点g.69G＞A效应分析
[0050] 通过对分子标记辅助选择，对群体内基因型为AA的牛进行淘汰，可显著提高群体的脾脏重，为企业带来更多经济效益。
[0051] 本发明通过对SEQ ID NO：1序列中的第69个碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与牛的脾脏重之间的关联分析的应用，为牛的分子标记辅助选择及基因组选择提供了一个新的分子标记。
[0052] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
