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一种快速检测曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的引物及方法

阅读：712发布：2024-02-19

专利汇可以提供一种快速检测曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的引物及方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及分子生物学领域，针对现有技术无法高效评价及筛选曼氏无针乌贼胚胎质量的问题，公开了一种快速检测曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的引物及方法，制备步骤：1）提取曼氏无针乌贼胚胎的RNA；2）反转录合成cDNA；3）以cDNA作为模板，用所述的caspase3引物序列和p53引物序列进行实时荧光定量PCR扩增，扩增得到caspase3和p53基因的相对表达量水平。本发明首次公开了一种适用于曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的检测方法及其引物序列，填补了头足类受精卵质量快速检测的技术空白，能够及时准确获取胚胎的染色体和细胞核的质量情况，为头足类胚胎质量变化提供有效方法，极大提高了曼氏无针乌贼繁殖效率。，下面是一种快速检测曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的引物及方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于快速检测曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的引物，其特征在于，选用表示凋亡水平的标记基因包括caspase3和p53；所述caspase3扩增用引物序列分别如SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2所示：5’-TGCAAAAACGGTTCCTGGTT-3’；5’- AGTCAACATAGAGGCAACGCA -3’；所述p53扩增用引物序列分别如SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:4所示：5’- CCAACCGACGGCCTATACAA -3’；5’- TTTGGGCTTGGAGGCTTTGA -3’。
2.一种利用权利要求1所述引物快速检测曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1）提取曼氏无针乌贼胚胎的RNA；
2）反转录合成cDNA；
3）以cDNA作为模板，用所述的caspase3引物序列和p53引物序列进行实时荧光定量PCR扩增，扩增得到caspase3和p53基因的相对表达量水平。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）RNA提取过程为将组织样品研磨，加入0.6-0.8mL Trizol溶液，然后在频率3-5kHz、强度8-10mW/cm2的超声波下进行超声波循环刺激后再离心。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2）中反转录合成cDNA的体系为5-6μl RNase-free Water、1-1.5μl Anchored Oligo（dT）18 Primer、1-1.5μl gDNA Remover、10-
12μl 2×TS Reaction Mix、1-1.5μl TransScript RT/RI Enzyme Mix、1-2μl mRNA模板。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2）中反转录合成cDNA条件为42-45℃孵育40-42min，84-86℃加热5-8min使得所述TransScript RT/RI Enzyme Mix和所述gDNA Remover失活，所得cDNA于-20 -18℃保存。
~
6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3）中实时荧光定量PCR扩增反应体系为
7.6-8.0μl ddH2O、0.5-0.8μl 20μM Forward Primer、0.5-0.7μl 20μM Reverse Primer、
10-12μl 2×TransScript Top Green qPCR Super Mix、1-1.2μl Passive Reference Dye I、1-1.5μl cDNA模板。
7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3）中实时荧光定量PCR扩增反应条件为：
94-96℃预变性4-6min，随后94-96℃变性45-50s，60-65℃退火30-35s，71-73℃延伸45-
50s，共进行45-48个循环，最后进行71-73℃延伸10-12min，4-6℃条件下保存。
8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3）所述caspase3扩增片段大小为154bp，扩增序列如SEQ ID NO:5所示：TGCAAAAACGGTTCCTGGTTTATTCAAAGTCTGTGTTGTATACTGGAAAAATACGGGAACGAATTGGAAATACAACAACTAATGACAAAAGTGAATTTCCAAGTTGCCTACGAGTTCGAATCAAGAGCCAATGATTTTAGAATGAATCGTATGAAACAAGTTCCATGCGTTGCCTCTATGTTGACT。
9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3）所述p53扩增片段大小为154bp，扩增序列如SEQ ID NO:6所示：CCAACCGACGGCCTATACAATTGGTATTTACCTTAGAAAAAGACAACCAGGTTTTGGGCCGAAGAGCTGTTGAAGTGCGGATATGTGCCTGCCCTGGAAGAGACAGAAAAGCAGATGAAAAGGCTAGTTTGGTTTCAAAGCCTCCAAGCCCAAA。

说明书全文

一种快速检测曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的引物及方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种快速检测曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的引物及方法。

背景技术

[0002] 凋亡是生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下，其死亡途径被激活，并在相关基因的调控下发生的程序性死亡过程。已知凋亡是生物发育过程中的必经之路，如蝌蚪的变态发育，昆虫的蜕变，高等哺乳动物胚胎发育时期指间蹼的消失，眼玻璃体和晶状体的形成等。大量研究结果表明，在胚胎发育过程中凋亡进程的紊乱会直接导致胚胎发育受阻，引起胚胎死亡。目前尚缺乏包括曼氏无针乌贼在内的海洋生物胚胎凋亡水平快速检测方法，给曼氏无针乌贼胚胎质量的高效评价及筛选带来一定困难。

[0003] 专利号CN201310108915X，专利名称“一种快速检测小鼠卵母细胞凋亡的方法”，对卵母细胞和胚胎的凋亡开展研究，有助于把握胚胎发育的规律，从而有目的地调控凋亡，使其向着人类需要的方向发展。本发明提出了一种检测小鼠卵母细胞凋亡的方法，采用了改进的TUNEL法对成熟后小鼠卵母细胞的凋亡进行检测，为获得大量的优良胚胎在临床上治疗不孕、衰老等疾病，提供理论和实验依据。

[0004] 上述专利的检测方法仅限于对小鼠的母细胞的检测，而不适用于海洋生物，尤其是曼氏无针乌贼，因此需要探寻有效的方法来对曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平加以检测，以达到实时监测乌贼胚胎质量的目的。

发明内容

[0005] 本发明是为了克服现有技术的无法高效评价及筛选曼氏无针乌贼胚胎质量的问题，提供了一种快速检测曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的引物及方法。本发明首次公开了一种适用于曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的荧光定量检测方法及其引物序列，填补了头足类受精卵质量快速检测的技术空白，同时为检测环境及胁迫因子引起的头足类胚胎质量变化提供有效方法。

[0006] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用于快速检测曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的引物，选用表示凋亡水平的标记基因包括caspase3和p53；所述caspase3扩增用引物序列分别如SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2所示：5’-TGCAAAAACGGTTCCTGGTT-3’；5’- AGTCAACATAGAGGCAACGCA -3’；所述p53扩增用引物序列分别如SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:4所示：5’- CCAACCGACGGCCTATACAA -3’；5’- TTTGGGCTTGGAGGCTTTGA -3’。

[0007] 一种利用所述引物快速检测曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的方法，具体包括如下步骤：1）提取曼氏无针乌贼胚胎的RNA；
2）反转录合成cDNA；
3）以cDNA作为模板，用所述的caspase3引物序列和p53引物序列进行实时荧光定量PCR扩增，扩增得到caspase3和p53基因的相对表达量水平。

[0008] 提取待测曼氏无针乌贼胚胎的RNA，并以曼氏无针乌贼胚胎的RNA作为模板，获得的总RNA用核酸定量仪检测浓度并用琼脂糖凝胶电泳检测后，先反转录合成cDNA，再以cDNA为模板，用所述的有关曼氏无针乌贼胚胎的特异性的引物在标记基因点caspase3和p53处进行荧光定量PCR扩增，得到扩增片段；通过对荧光定量数据分析采用△△Ct方法，得到目的基因的相对表达量，评估乌贼胚胎的质量水平。

[0009] 作为优选，步骤1）RNA提取过程为将组织样品研磨，加入0.6-0.8mL Trizol溶液，然后在频率3-5kHz、强度8-10mW/cm2的超声波下进行超声波循环刺激后再离心。

[0010] 作为优选，步骤2）中反转录合成cDNA的体系为5-6μl RNase-free Water、1-1.5μl Anchored Oligo（dT）18 Primer、1-1.5μl gDNA Remover、10-12μl 2×TS Reaction Mix、1-1.5μl TransScript RT/RI Enzyme Mix、1-2μl mRNA模板。

[0011] 作为优选，步骤2）中反转录合成cDNA条件为42-45℃孵育40-42min，84-86℃加热5-8min使得所述TransScript RT/RI Enzyme Mix和所述gDNA Remover失活，所得cDNA于-
20 -18℃保存。
~

[0012] 作为优选，步骤3）中实时荧光定量PCR扩增反应体系为7.6-8.0μl ddH2O、0.5-0.8μl 20μM Forward Primer、0.5-0.7μl 20μM Reverse Primer、10-12μl 2×TransScript Top Green qPCR Super Mix、1-1.2μl Passive Reference Dye I、1-1.5μl cDNA模板。

[0013] 在PCR反应体系中加入荧光染料Passive Reference Dye I，未结合的Passive Reference Dye I只具有弱的荧光效应，当引物发生退火后，少部分Passive Reference Dye I可以与cDNA双螺旋结构中的小沟部分结合，结合后Passive Reference Dye I的荧光信号大大加强，在荧光定量PCR仪的光源照射下，会发射出强的荧光信号而被仪器所检测，在PCR延伸阶段，越来越多的Passive Reference Dye I与新合成的DNA结合，荧光信号强度会随新合成DNA数量的增加而增加，来实现荧光定量PCR扩增。

[0014] 作为优选，步骤3）中实时荧光定量PCR扩增反应条件为：94-96℃预变性4-6min，随后94-96℃变性45-50s，60-65℃退火30-35s，71-73℃延伸45-50s，共进行45-48个循环，最后进行71-73℃延伸10-12min，4-6℃条件下保存。

[0015] 作为优选，步骤3）所述caspase3扩增片段大小为154bp，扩增序列如SEQ ID NO:5所示：TGCAAAAACGGTTCCTGGTTTATTCAAAGTCTGTGTTGTATACTGGAAAAATACGGGAACGAATTGGAAATACAACAACTAATGACAAAAGTGAATTTCCAAGTTGCCTACGAGTTCGAATCAAGAGCCAATGATTTTAGAATGAATCGTATGAAACAAGTTCCATGCGTTGCCTCTATGTTGACT。

[0016] 作为优选，步骤3）所述p53扩增片段大小为154bp，扩增序列如SEQ ID NO:6所示：CCAACCGACGGCCTATACAATTGGTATTTACCTTAGAAAAAGACAACCAGGTTTTGGGCCGAAGAGCTGTTGAAGTGCGGATATGTGCCTGCCCTGGAAGAGACAGAAAAGCAGATGAAAAGGCTAGTTTGGTTTCAAAGCCTCCAAGCCCAAA。因此，本发明具有如下有益效果：
（1）首次公开了一种适用于曼氏无针乌贼胚胎凋亡水平的荧光定量检测方法及其引物序列，填补了头足类受精卵质量快速检测的技术空白；
（2）能准确检测环境及胁迫因子引起的头足类胚胎质量问题，并提供有效指导方法，具有极高的准确性与灵敏度；
（3）能够及时准确获取胚胎的染色体和细胞核的质量情况并及时做出相应的调整策略，节约时间，极大提高了曼氏无针乌贼繁殖效率。
附图说明

[0017] 图1是本发明的2细胞期基因相对表达量示意图。

[0018] 图2是本发明的4细胞期基因相对表达量示意图。

具体实施方式

[0019] 下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。

[0020] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

[0021] 实施例1提取待测曼氏无针乌贼胚胎的RNA，并以曼氏无针乌贼胚胎的RNA作为模板，获得的总RNA用核酸定量仪检测浓度并用琼脂糖凝胶电泳检测后，先反转录合成cDNA，再以cDNA为模板，用所述的有关曼氏无针乌贼胚胎的特异性的引物在标记基因点caspase3和p53处进行荧光定量PCR扩增，得到扩增片段；通过对荧光定量数据分析采用△△Ct方法，得到目的基因的相对表达量，评估乌贼胚胎的质量水平。具体步骤如下：
1、提取曼氏无针乌贼胚胎的RNA；
RNA提取过程为将组织样品研磨，加入0.7mL Trizol溶液，然后在频率3.2kHz、强度
9mW/cm2的超声波下进行超声波循环刺激后再离心。

[0022] 2、反转录合成cDNA；所述反转录合成cDNA的体系为5.5μl RNase-free Water、1.3μl Anchored Oligo（dT）
18 Primer、1.3μl gDNA Remover、11μl 2×TS Reaction Mix、1.2μl TransScript RT/RI Enzyme Mix、1.5μl mRNA模板。

[0023] 2.1）、先加入mRNA模板和Anchored Oligo（dT）18 Primer，混合后离心，加热温度72℃，反应10min后取出，冰浴4min；
2.2）、往上述体系中加入RNA处理液、RNase-free Water、gDNA Remover、2×TS Reaction Mix及TransScript RT/RI Enzyme Mix等，置于PCR仪内，所述反转录合成cDNA条件为43℃孵育41min，84-86℃加热6min使得所述TransScript RT/RI Enzyme Mix和所述gDNA Remover失活，所得cDNA于-19℃保存。

[0024] 3、以cDNA作为模板，用所述的caspase3引物序列和p53引物序列进行实时荧光定量PCR扩增，扩增得到caspase3和p53基因的相对表达量水平。

[0025] 3.1）、所述实时荧光定量PCR扩增反应体系为7.8μl ddH2O、0.7μl 20μM Forward Primer、0.6μl 20μM Reverse Primer、11μl 2×TransScript Top Green qPCR Super Mix、1.1μl Passive Reference Dye I、1.3μl cDNA模板。

[0026] 3.2）、所述实时荧光定量PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性48s，63℃退火33s，72℃延伸48s，共进行46个循环，最后进行72℃延伸11min，5℃条件下保存。

[0027] 3.3）、分析荧光定量数据：采用2-△△CT 数据处理的方法进行计算分析，比较目标基因与内参基因的相对表达量，内参基因引物序列：β-actin F TGAGAGGGAGATTGTGCGTC，β-actin RGAACATAGATTCTGGAGCACGG准确地对大量基因和样品中的相对基因表达进行定量分析，得到目的基因的相对表达量，评估乌贼胚胎的质量水平。

[0028] 实施例2与实施例1的区别在于：
1、提取曼氏无针乌贼胚胎的RNA；
RNA提取过程为将组织样品研磨，加入0.6mL Trizol溶液，然后在频率3kHz、强度8mW/
2
cm的超声波下进行超声波循环刺激后再离心。

[0029] 2、反转录合成cDNA；所述反转录合成cDNA的体系为5μl RNase-free Water、1μl Anchored Oligo（dT）18 Primer、1μl gDNA Remover、10μl 2×TS Reaction Mix、1μl TransScript RT/RI Enzyme Mix、1μl mRNA模板。

[0030] 2.1）、先加入mRNA模板和Anchored Oligo（dT）18 Primer，混合后离心，加热温度72℃，反应10min后取出，冰浴4min；
2.2）、往上述体系中加入RNA处理液、RNase-free Water、gDNA Remover、2×TS Reaction Mix及TransScript RT/RI Enzyme Mix等，置于PCR仪内，所述反转录合成cDNA条件为42℃孵育40min，84℃加热5min使得所述TransScript RT/RI Enzyme Mix和所述gDNA Remover失活，所得cDNA于-20℃保存。

[0031] 3、以cDNA作为模板，用所述的caspase3引物序列和p53引物序列进行实时荧光定量PCR扩增，扩增得到caspase3和p53基因的相对表达量水平。

[0032] 3.1）、所述实时荧光定量PCR扩增反应体系为7.6μl ddH2O、0.5μl 20μM Forward Primer、0.5μl 20μM Reverse Primer、10μl 2×TransScript Top Green qPCR Super Mix、1μl Passive Reference Dye I、1μl cDNA模板。

[0033] 3.2）、所述实时荧光定量PCR扩增反应条件为：94℃预变性4min，随后94℃变性45s，60℃退火30s，71℃延伸45s，共进行45个循环，最后进行71℃延伸10min，4℃条件下保存。

[0034] 3.3）、分析荧光定量数据：采用2-△△CT数据处理的方法进行计算分析，比较目标基因与内参基因的相对表达量，内参基因引物序列：β-actin F TGAGAGGGAGATTGTGCGTC，β-actin RGAACATAGATTCTGGAGCACGG准确地对大量基因和样品中的相对基因表达进行定量分析，得到目的基因的相对表达量，评估乌贼胚胎的质量水平。

[0035] 实施例3与实施例1的区别在于：
1、提取曼氏无针乌贼胚胎的RNA；
RNA提取过程为将组织样品研磨，加入0.8mL Trizol溶液，然后在频率3.5kHz、强度
10mW/cm2的超声波下进行超声波循环刺激后再离心。

[0036] 2、反转录合成cDNA；所述反转录合成cDNA的体系为6μl RNase-free Water、1.5μl Anchored Oligo（dT）18 Primer、1.5μl gDNA Remover、12μl 2×TS Reaction Mix、1.5μl TransScript RT/RI Enzyme Mix、2μl mRNA模板。

[0037] 2.1）、先加入mRNA模板和Anchored Oligo（dT）18 Primer，混合后离心，加热温度72℃，反应10min后取出，冰浴4min；
2.2）、往上述体系中加入RNA处理液、RNase-free Water、gDNA Remover、2×TS Reaction Mix及TransScript RT/RI Enzyme Mix等，置于PCR仪内，所述反转录合成cDNA条件为45℃孵育42min， 86℃加热8min使得所述TransScript RT/RI Enzyme Mix和所述gDNA Remover失活，所得cDNA于-18℃保存。

[0038] 3、以cDNA作为模板，用所述的caspase3引物序列和p53引物序列进行实时荧光定量PCR扩增，扩增得到caspase3和p53基因的相对表达量水平。

[0039] 3.1）、所述实时荧光定量PCR扩增反应体系为8.0μl ddH2O、0.8μl 20μM Forward Primer、0.7μl 20μM Reverse Primer、12μl 2×TransScript Top Green qPCR Super Mix、1.2μl Passive Reference Dye I、1.5μl cDNA模板。

[0040] 3.2）、所述实时荧光定量PCR扩增反应条件为： 96℃预变性6min，随后96℃变性45-50s， 65℃退火35s，73℃延伸50s，共进行48个循环，最后进行73℃延伸12min，6℃条件下保存。

[0041] 3.3）、分析荧光定量数据：采用2-△△CT数据处理的方法进行计算分析，比较目标基因与内参基因的相对表达量，内参基因引物序列：β-actin F TGAGAGGGAGATTGTGCGTC，β-actin RGAACATAGATTCTGGAGCACGG准确地对大量基因和样品中的相对基因表达进行定量分析，得到目的基因的相对表达量，评估乌贼胚胎的质量水平。

[0042] 结论：图1为受精卵2细胞期的基因相对表达量：caspase 3：1251.45、p53：834.91；
图2为受精卵4细胞期的基因相对表达量：caspase 3：1016.92、p53：657.27。

[0043] 根据每个细胞期的表达量即可判定出曼氏无针乌贼胚胎的质量的好坏，再与实际胚胎发育的质量进行形态学比较，从选取的100个胚胎试样结果看来，该判定方法零误差，判定全部正确，说明该检测方法简单高效，准确无误差。

[0044] 上述实施例均可通过相关的荧光标记及数据分析来检测出胚胎细胞的质量好坏，有效筛选高质量的曼氏无针乌贼胚胎。

[0045] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

[0046] 本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

[0047] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

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