细菌在人类世界中普遍存在。由于其频繁引起食物腐败或诱发疾 病，所以如何有效、快速并可靠地检测细菌具有重大的意义。
常导致食物腐败的微生物包括肉毒梭菌(Clostridium botulinum)， 肉毒致病菌，弯曲菌属(Campylobacter jejuni)，梭菌属(Clostridium perfringens)，似隐孢菌属(Cryptosporidium parvum)，肠道致病埃希氏 菌属(Escherichia-coli)，志贺菌属(Shigella)，李斯特菌属(Listeria monocytogenes)，沙门氏菌(Salmonellen Spezies)，金色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)，弧菌(Vibrio vulnificus)，耶尔森氏菌(Yersinia enterolytica)。美国统计总局(General Accounting Office)1996年的报告 显示，美国每年发生650万到8100万起食物中毒事件。美国食品和 药品管理局(FDA)估计，2-3％食物中毒事件会导致慢性疾病。另据估 计，美国每年有200万到400万例疾病是由2000多种沙门氏菌种引 起的。若将其它可导致食品腐败的病菌一并考虑在内，则此统计数据 更令人触目惊心。食物中毒不仅会引起肉体的痛苦甚至导致死亡，还 会造成巨大的经济损失。据估计，美国1991年因此遭受的损失高达 56亿到94亿美元。众所周知，微生物作为传染病源所带来的危害是 无法估量的。这在世界卫生组织的世界健康报告中得到了充分的反 映。例如1998年传染病菌(包括寄生虫)导致980万人死亡(不包 括出生前后由感染引起的死亡)，占因病死亡人数的18.2％。如此危 险的传染病菌并不象导致食物腐败的细菌那样容易归类，因为它们是 由分类学上的多种真细菌构成的。其中肠道菌群即具有特别强的“感 染潜力”。
在与致病菌的斗争过程中，确定病原体是重要的一步。通常，只 有在确定了病原体后方可采取相应的治疗措施。此外，有效的细菌鉴 定方法同样也可作为保证食品质量的有效工具。
传统的细菌鉴定方法是微生物学的方法，即通常在选择性琼脂平 皿上进行细菌分离。这种方法有两个明显的缺陷。一是其鉴定通常不 可靠或不特异。二是许多细菌至少需要18个小时的成长期才能分离 出单个菌落。而在很多情况下还需要进行二次分离或鉴定。总之，一 周的鉴定时间并不鲜见。此外，很多病原体根本无法培养(J.J.Byrd et al.1991，Appl.Environ.Microbiol.57，875-878)。在交通快捷和商品流 通全球化的今天，快速的鉴定方法最好不超过24小时，这对于防止 病原体的扩散或食物中毒的蔓延至关重要。
为了满足当前的需要，近年来出现了许多可快速可靠地鉴别病原 体的常规方法。例如免疫学的方法，即利用了单克隆或多克隆抗体与 细菌表面抗原的特异性结合。这些方法尤其被用于例如对沙门氏菌的 血清定型。一般来说，ELISA方法虽然比较快捷，但其对相关抗原 进行处理和分离的要求可能会引起很多问题。而采用DNA探针的细 菌鉴定方法便显得十分有效，因为其非常敏感，相对特异并可在2至 3天内鉴定出微生物。
本发明包括提供特定的DNA序列和如何选择特别的DNA区域用 于鉴别细菌。这种方法是以借助微生物的遗传信息对其进行鉴定为基 础的。在特定DNA区域的核酸序列中，一个碱基上的差异就可用于 区分细菌种类。
过去，核糖体RNA基因已经被用于细菌的种系分类。不同细菌的 5S和16S核糖体基因序列比较分析已导致对种系分类进行了重大修 正并可籍此发现新的古细菌门。由于其大小和过高的测序费用，23S RNA仅在近几年才被用于进行细菌的系统分类。
在实际使用中，直接分析基因序列来鉴别微生物的方法既昂贵又 费时。因此在八十年代，人们使用核酸探针来鉴别细菌。此法虽具有 高特异性，但其检测阈值时常太低。核酸探针技术与DNA扩增技术 的结合使得人类鉴别细菌的能力有了大幅度的提高，因为后者可以增 加需要检测的核酸序列数，并可由此显著提高鉴别的灵敏度。人们因 此甚至可以鉴别从一个细胞中分离出的基因组。在实践中，在分离提 取DNA过程中出现的损失可以使检测阈值提高到100到10,000。
在基础研究工作的基础上，5S-，16S-和23S-基因中的DNA探针 被应用于实践中。例如Nietupski等人的用于检测沙门氏菌(Salmonella) 的专利(US5,147,778)，Mann & Wood的用于检测耶尔森氏菌 (Yersinia)的专利(US6,554,144)，Leong的用于检测各种革兰氏阴性 菌和革兰氏阳性菌的专利(EP0479117A1)，Carico等人的用于检测不 同肠道细菌的专利(EP133671B1)，Shah等人的用于检测耶尔森氏肠 道菌的专利(EP0339783B1)，Carrico用于检测埃希氏菌的专利(BP 0163220B1)，Hogan等人的用于检测肠道细菌(Enterobakteria)，分枝 杆菌(Mycobacteria)，支原体菌(Mycoplasma)和军团菌(Legionella)的专 利(WO88/03957)，Leiser等人的用于检测不同微生物的专利(WO 97/41253)，Grosz & Jensen的用于检测沙门氏菌(Salmonelle)的专利 (WO95/33854)，Stackebrandt & Curiaie的用于检测李斯特菌(Listeria monocytogenes)的专利(EP0314294A2)，Wolffet等人(EP0408077A2) 和Hogan & Hammond(US5681698)用于检测分枝杆菌(Mycobacteria) 的专利，Hogan等人用于检测不同细菌的专利(US5,679,520)，Kohne 特别用于检测细菌的mRNA的专利(US5,567,587)，Kohne用于检测 不同细菌的专利(US5,714,324)，Pelletier用于检测军团菌(Legionella) 的专利(WO94/28174)Kohne用于检测不同细菌的专利(US 5,601,984)。以上专利大多数是关于16S rDNA基因，一部分还是关于 23S rDNA的。
但实践表明，以上基因由于其序列太保守而不适合用于很多细菌 的鉴别，尤其不适于区分亲缘关系很近的微生物。另一方面，5S rDNA 虽然由于其本身较小而最初被用于种系发育研究，但其在实际应用中 序列变化太大，鉴别能力很低。
因为5S，16S和23S rDNA基因作为鉴别方法存在许多缺陷，人 们正努力寻找可以鉴定所有真细菌的DNA序列。这样的DNA序列 应该既具有易变性又具有很强的保守性。变化的范围应适合区分亲缘 关系很近的菌种。而保守的序列则可用于鉴别亲缘关系比较远的细菌 或分类学上关系较远的菌株。
在有关核糖体操纵子的研究中，最近的文献也讨论到了16S-23S 转录间隔区，但对其在系统细菌学上的应用却提出了质疑。例如 Nagpal等人(J.Microbiol.Meth.33，1998，第212页)即对这种转录间 隔区的应用能力持强烈的怀疑态度：这个rDNA转录间隔区的主要问 题在于经常有tRNA插入其中。这种插入可以引起转录间隔区内剧烈 的序列偏差，但却与种系发育的距离没有必然的联系。过去，人们应 用这些tRNA的插入以确定由其引起的长度多变性来作为种系特征。 (Jensen et al.1993，Appl.Envir.Microb.59，945-952，Jensen，WO 93/11264，Kur et al.1995，Acta Microb.Pol.44，111-117)。
用于鉴别细菌的另一种目标序列是23S和5S rDNA之间的转录 间隔区。例如Zhu等人(J.Appl.Bacteriol.80，1996，244-251)就用这一 DNA区域鉴别出伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)。但是从以上工作并 不能推断出这一转录间隔区能否用于鉴定其它细菌。非常多的例子表 明一个DNA区域只适用于检测一种或少数几种细菌。个别的专利暗 示了23S-5S转录DNA区域用于细菌鉴定的可能性，但其应用范围是 有限的。它们的共性在于其可应用性只与一种细菌有关，而且是用于 鉴定军团菌(Legionellen)(见Heidrich et al.EP0739988A1)，假单孢菌 (Pseudomonas aeruginosa)(见Berghof et al.，DE19739611A1)和金色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(见Berghof et al.，WO99/05159)。

本发明旨在解答仅用一种实验材料即可鉴定任意一种细菌(特别 是肠道菌群)所需的材料及方法的技术问题。
在本发明中，此问题通过使用核酸分子作为探针和/或引物来鉴别 细菌而得到解决。作为探针和/或引物的核酸分子选自：
a)一个核酸分子，其至少包括带有从SEQ ID No.1到530的一 个序列，和/或位于2667到2720，2727到2776，2777到 2801，2801到2832，2857到2896，2907到2931，2983到2999 位置之间的一个序列，和/或SEQ ID No.1中的3440到3032 位置之间的序列，以及与上述核酸分子同源的核酸分子；
b)一个与a)中核酸分子进行特异性杂交的核酸分子；
c)一个与a)或b)中的核酸分子具有70％，最好是90％相同性的 核酸分子；
d)一个可与a)到c)项中的核酸分子互补的，和/或a)到d)项中定 义的核酸分子的组合，但不包括SEQ ID No 1.。
其它的权利要求涉及本发明的优选的实施方法。
在本发明的优选实施方法中，可通过将分析样品与可鉴定肠道细 菌23S/5S-rDNA基因片段中核酸的存在的探针接触，从而证明肠道 细菌的存在。
权利要求1中所陈述的1号序列来自E.coli。与其同源的DNA序 列源于与所描述的E.coli.序列不同的其它细菌，但是这些细菌的基因 片段是与SEQ ID No.1序列的基因片段相对应的。具体细节可参考 下文中同源DNA序列的定义。
本发明中涉及的核酸分子应优先包括至少10个核苷酸，最佳情况 下至少14个核苷酸。此长度的核酸分子主要作为引物使用，而作为 探针使用的核酸分子最好至少包括50个核苷酸。
在本发明其它优选的实施方案中，探针和引物的核苷酸可由其被 修饰的核酸分子代替，例如其包含了用于鉴定反应的新增的基团。主 要的衍生物参见权利要求4。
在本发明其它优选的实施方案中使用了上述的核酸分子的组合。 核酸分子的组合方式使得人们可以判定鉴定反应的可选择性。人们可 以通过选择引物组合和/或探针组合来确定鉴别反应的条件，从而鉴 定样品中有无细菌的存在或鉴别何种细菌存在。
本发明中的试剂盒包括至少上述的一种核酸，连同其它核酸鉴定 中常用的试剂。这些常用的试剂包括适合的缓冲剂和象酶这样的鉴定 物质。人们可以使用它们鉴别生物素化的杂交分子。
在本发明另一种优选的实施方案，即Consensus PCR中，可按照 权利要求8中规定的方法进行。在此先通过使用保守引物(其能与分 类学上的多种细菌杂交)扩增一个核酸分子片段，然后通过使用其它 特异性的核酸(其仅与少数分类学上单位或某个特定的菌种杂交)来 鉴定特异性的核酸片段。后者可以反推出分析样品中含有特定的菌 属、类和种。
在鉴定核酸的过程中可使用不同的方法，例如DNA印迹技术， PCR技术以及LCR技术等。
在一份全面的研究报告中，人们探讨了介于23S和5S-rDNA的 转录间隔区作为鉴别目标分子的一般适用性。为此，人们对很多菌种 的基因组DNA进行了分离，提纯，克隆，测序和广泛的序列比较分 析。令人吃惊的是，这一序列片段几乎可用于鉴别所有的细菌种类。 受此成果鼓舞，人们扩展分析了转录间隔区的相邻区域，并对所有的 细菌类别或小的种系发育单位的DNA片段都进行了研究。这些DNA 片段在400bp到750bp之间，并包括末端，即具有菌株特异性的 23S-rDNA基因的最后的330-430个核苷酸、转录间隔区和完整的5S rDNA基因。该片段的大小总计为400-750bp。实验表明，几乎所有 细菌种类的23S rDNA和5S rDNA基因都是相邻的。这一发现是应 用本发明的一个重要先决条件。
本发明尤其要求所选择的用来鉴别微生物的DNA区域可包含至 少两个相邻基因的主要部分。实践中，该区域的可使用性尤其取决于 其种系发育的多样性。根据是否需要鉴别种系关系较远的细菌和分类 学上单位或特定细菌的种类的不同，所要求的条件可能完全相反。如 23S-5S-重复序列所示，该区域的易变性和保守性出现的频率，在两 个基因的情况下比在单个基因的情况下大。使用两个相邻基因，包括 可变的插入序列，体现出明显的优势。
此外，23S rDNA基因末端、5S rDNA基因和介于两者之间的转录 间隔区都包含了涵盖从最多变到最保守的核酸序列。对这一区域的详 细分析得出了有关不同种系发育菌体区分能力的非常有趣的启示(见 图2，表6)。几乎所有的分类学上单位均可通过使用亚区域来加以鉴 定和/或区分。图2中的片段1至9表示变化性大小不一的范围，而 高保守区域则间或其中或与之相邻。后者特别适于鉴定分类学上较高 的菌株，如所有的真细菌或其纲目。
图1中的种系发育系谱进一步说明了这一区域的实用性。从此图 可看出，23S rDNA-5S rDNA区域非常适合用于细菌的粗略划分。因 为蛋白细菌(Proteobacteria)被列成1-2组，而硬细菌(Firmicutes)则被 从中划分出来。此外，近亲细菌因在系谱上的长度不同而相互间易于 区分。在此，对系谱中的近亲细胞进行种系发育的系谱排列是不必要 的。那样的话，它们就会被排在一个关系紧密的群体里，反而可能更 难区分。
附图说明
图1：本发明鉴定的一些细菌的种系发育系谱。从图可知，蛋白 细菌和硬细菌在系谱上构成了不同的分枝。
图2：本发明所描述的由23S rDNA末端、转录间隔区和5S rDNA 构成的核糖体区域的图形表示。此区域及其部分用于细菌的鉴别。单 个功能区域的详细描述见表6。
图3-7：用PCR方法鉴别肠道细菌。图中所示为经溴化乙锭染色 的琼脂胶。图中显示的条带表明肠道细菌的存在。图的上半部为阳性 对照，下半部是阴性对照。引物的应用见表7。由BglI和HinfI酶 切pBR328载体DNA(Boehringer Mannheim公司生产)形成的混合物 作为DNA标准。DNA梯级包括酶切片段154，220，234，298，394， 453，517，653，1033，1230，1766和2176bp。
图8：Consensus-PCR的图示。保守程度高的引物位于图的外围， 保守程度低的引物位于图的里面。Consensus-PCR可首先扩增分类学 上较高的细菌的DNA，甚至所有细菌的DNA。此后还可以进行多次 扩增，亦可在单独的反应管中使用对于分类学上较低的菌株具有特异 性的引物。最后可使用探针。该探针同样有助于菌株特异性的鉴别， 并通过使用例如染料等材料支持鉴别。在图8中使用的概念如下：
引物A＝鉴定系统中最保守的并位于外围的引物；
引物[A，B，C...]＝如上所示的连锁引物系列；
引物[大写字母]1＝正向引物
引物[大写字母]2＝反向引物
引物[大写字母][数字][小写字母]＝小写字母表示相似的引物
或在一个目标DNA当中在同源位置或在可比性的位置上进行
杂交的引物。在细菌的种属需要鉴定的情况下，应优先使用位 于中心高变区域内的探针。
                      示例1
                 肠道细菌目的鉴定
用标准的方法从表1中列出的细菌纯培养物中分离基因组DNA。 然后，从所制备的DNA当中取1--100ng用于每个PCR反应。反应 配方如下：
  基因组DNA                -1.00μl
  水                       -19,80μl
  缓冲液(10x)*1            -2,50μl
  dNTP(10mM)*2             -0,25μl
  正向引物(10μM)*3        -0,20μl
  反向引物(10μM)*3        -0,20μl
  MgCl2                   -0,75μl
  Taq聚合酶(5U/μl)*1      -0,30μl
*1：缓冲液和酶可由Biomaster公司或其他供货商提供
*2：核苷酸由Boehringer Mannheim公司或其他供货商提供
*3：引物的量应相同。若为混合引物，其正向引物和反向引物的 浓度均为10μM。
PCR在Perkin Elmer 9600热循环器中按如下说明进行：
  起始变性           95℃            5min
  扩增(35个循环)     92℃            1min
                     62℃            1min
                     72℃            30s
  终合成             72℃            5min
肠道细菌目的鉴别使用表1中所列细菌种类。所应用的引物组合 和引物的特异性参数见表7。若表7中给出多个正向或反向引物，则 使用其相应的混合物。
PCR的结果通过琼脂胶上电泳和溴化乙锭染色进行分析。pCR产 物的存在即可证明肠道细菌的存在。
合成的PCR产物大小多位于400bp到750bp之间。此时有可能 会出现多条色带，因为很多细菌的核糖体等位基因是杂合的。实验结 果归纳为表1。其显示了肠道细菌完全区别于其它类别的代表物。
                         示例2
           泛细菌(Pantoea dispersa)鉴定的示例
用标准的方法可从细菌的纯培养物中分离基因组DNA。从所制备 的DNA当中可取1--100ng用于每个PCR反应。反应配方如下：
  基因组DNA                -1.00μl
  水                       -19,80μl
  缓冲液(10x)*1            -2,50μl
  dNTP(10mM)*2             -0,25μl
  正向引物A(10mM)*3        -0,20μl
  反向引物(10mM)*3         -0,20μl
  MgCl2                   -0,75μl
  Taq聚合酶(5U/μl)*1      -0,30μl
*1：缓冲液和酶由Biomaster公司提供
*2：核苷酸由Boehringer Mannheim公司或其他供货商提供
*3：引物的量应相同。若为混合引物，其正向引物和反向引物的 浓度均为10μM。
为鉴定泛细菌(Pantoea dispersa)，可使用引物组合SEQ ID 2+引 物x1，SEQ ID(3-6)+引物x1或引物x1的互补序列+SEQ ID 147的 互补序列。此处，引物x1的对应序列为CGT TGC CCC GCT CGC GCC GCT CAG TCA C。引物1是SEQ ID 108的部分序列。
PCR在Perkin Elmer 9600热循环器中按如下说明进行：
  起始变性          95℃            5min
  扩增(35个循环)    92℃            1min
                    62℃            1min
                    72℃            20s
  终合成            72℃            5min
PCR的结果通过琼脂胶上电泳和溴化乙锭染色进行分析。合成的 PCR产物大小为370bp，320bp和70bp。扩增产物的缺失即证明无 弧细菌(Pantoea dispersa)的存在。用此方法可得出表2所示的结果。
                      示例3
         Consensus-PCR在芯片技术上的应用
              3a)Consensus-PCR的原理
图8所示的Consensus-PCR至少应用了两种可至少鉴定两个种系 发育菌株同源区域的引物(A1，A2)。在此，可能涉及细菌的菌株和 种，或如门、纲这样分类学上较高的单位。在鉴定体系中，至少需要 进行第二步鉴定以区分扩增的分类学单位，为此，可能需要使用第二 步PCR和/或探针。对第二步及以后的扩增步骤的PCR引物(B1，B2) 的选择应使它们位于扩增产物当中，并具有鉴别分类学上特异菌株的 能力。通过使用其它引物(C，D，E....)可同时区分许多分类学上单 位的集合。此外，通过使用多种引物的混合物(如A1a，A1b，A1c，...)， 可提高鉴别多种分类学上单位的能力。后者出现在一个引物中的单个 核苷酸发生变化或引物完全不同的情况下。Consensus引物的概念也 可参见图8。
扩增产物的鉴定可通过引物完成。当引物识别并成功扩增目标 DNA就会产生阳性结果。此外，探针也可提供特殊的鉴定。它们与 已扩增的DNA进行特异性杂交，通过直接或间接与染料偶合而证明 特定的DNA序列的存在。总之，探针可用于专业人员熟知的多种实 验，例如DNA印迹、使用荧光探针的lightcycler技术或将许多探针 进行微排阵列(Microarray)的芯片技术。
Consensus-PCR的一个显著优点在于序列A，B，C...中引物的特异 性递增。此优点可通过依图2选取DNA目标区域得以保证。
Consensus-PCR的另一优点在于它只需少量的核酸样品便可同时 鉴别两个以上分类学上单位。可鉴别的微生物样品的数量可通过不同 途径得以增加，例如，Consensus系统的鉴别能力可如图8所定义的 那样，随引物类型A，B，C，...或者A1a，A1b，A1c...而提高。一个PCR 反应混合物在与一引物对A1，A2反应后可被分离，并在分开的PCR 反应混合物中与其它的引物对B1a+B2a及B1b+B2b进行扩增。最后， PCR扩增产物的特性可通过使用探针与其杂交确定。
               3b)肠道细菌属鉴定的示例
用标准的方法可从细菌的纯培养物中分离基因组DNA。从所制备 的DNA当中可取1--100ng用于每个PCR反应。反应配方如下：
  基因组DNA              -1.00μl
  水                     -19,80μl
  缓冲液(10x)*1          -2,50μl
  dNTP(10mM)*2           -0,25μl
  正向引物(10μM)*3      -0,20μl
  反向引物(10μM)*3      -0,20μl
  MgCl2                 -0,75μl
  Taq聚合酶(5U/μl)*1    -0,30μl
*1：缓冲液和酶由Biomaster公司提供
*2：核苷酸由Boehringer Marmheim公司或其他供货商提供
*3：引物的量应相同。若为混合引物，其正向引物和反向引物的 浓度均为10μM。
鉴于在芯片技术领域通常反应用量很小，上述反应配方可相应减 少。有时，也会需要调整PCR的循环时间。
对于Consensus-PCR，首先可扩增一核糖体片段。这一过程对分 类学上较高的菌株具有特异性，并如例1所述，也应用了与例1中相 同的引物。另一种可能是扩增所有细菌的核糖体片段。细菌的范围广 阔的系谱中的核糖体DNA提供了诸如SEQ ID 211+SEQ ID 212的引 物组合。
对扩增的DNA按标准方法进行变性，使其变成单链DNA。这种 形式的单链DNA适合于与一个DNA、RNA或PNA探针结合。然 后，根据芯片的制作，可判定扩增物与探针的杂交。另一种可能是根 据ELISA进行判定。所需探针应具有所要求的特性。相应地，种、 属或较高的分类学上单位均可鉴别。
表3是通过使用SEQ ID 164部分序列GTT CCG AGA TTG GTT 作为探针识别肠道细菌属的范例。当多种细菌群的鉴别结果相互重叠 时，这种对细菌群的鉴别在芯片技术领域就很有意义。通过相互重叠 部分的数值，可鉴别出，如与食品检测有关的，一种或多种细菌。
          3c)使用Consensus-PCR鉴别所有细菌
为鉴别所有细菌，人们在第一步扩增过程中使用高保守性的 Consensus-引物。图2所示位于外围的核糖体片段适于被选作引物的 序列。这个序列与起于2571、终于3112的SEQ ID 1序列同源。这一 片段中最适合于一般扩增的引物为SEQ ID 211(例如作为引物A1a) 和SEQ ID 212(例如作为引物A2a)。此外就很容易推出Multiplex-PCR 中的其它引物(A1b，A1c，...及A2b，A2c，...)，这些引物包括真细菌的 任意大小的分类学范围。在这个概念中，引物A1和引物A2组成了 引物对，B和C......等连锁引物即A1a和A1b是同源的或者相似的。
第一步的区分可通过应用连锁引物(B，C，D，....)来实现。这一过 程可通过将主PCR混合物分开，然后在分开后的每个PCR混合物中 添加诸如B，C，D等的引物对。这些连锁引物之所以具有特别的优势， 是因为如图8所示，核糖体区域从外到里可变性递增，也如表6所描 述的那样。探针可优先用于菌种的最终的区别和鉴定。例如，如果需 要鉴定菌的菌株或种，那么探针应在如图2所示的区域7中心杂交。
在表8中，许多多聚核苷酸被用于一个Consensus-PCR中以鉴别 细菌的属和种或菌株。表8中1号引物的应用在实例1中已做了详细 的说明。
多聚核苷酸的特性符合表6和图2中的描述。这意味着，引物A1 可归入表6和图2中的1号区域，引物A2归入2号区域......引物B2 归入8号区域，引物A2归入9号区域。与这一构想相应，表8中的 引物A1-G1可用作正向引物，引物B2和A2可用作反向引物。上述 后两种引物的序列为此而必须是反向的(表8中序列1例外)。引物 H1特别适用于作为种属特异性的探针。
此处描述的Consensus-PCR并非鉴别细菌所必需。原则上，表8 中所列的多聚核苷酸可用于任意组合。实践中，应首先明确何种细菌 是鉴定过程中所不需要而应排除的。根据问题的不同，可不按图例所 示而选择使用一个简单的PCR版本。最简单的Consensus-PCR仅由 两个符合表8中序列及其相应互补序列的引物构成。
表8中所列出的许多保守引物均可被用于鉴别如门、纲、目那样 的分类学上高的单位。由表6可知，这特别适用于外围引物A或与 SEQ ID 211+SEQ ID 212同源的序列。对于一个或多个细菌属或细菌 种，更广的鉴别能力在表8中特别通过序列的重复列举而显示出来。 如果对于一个属只有一个序列被明确列举出来，则可从这个序列当中 选出两个引物用于鉴别细菌。此外，也可为涉及的细菌纲选用一般的 引物，如具有亲缘关系的菌属的引物A，并由一诸如引物H1的特异 性的序列来设计一个探针。若序列很长，则可从中选用至少15个碱 基长度的核酸片段。
           3d)Consensus-PCR对于芯片技术的应用
Consensus-PCR的具体实施主要取决于待鉴定的分类学上单位的 数目。由于Multiplex-PCR即为最复杂形式的Consensus-PCR，在一 个反应当中仅能确定有限的细菌数目。按经验，此数目小于20。因 此，在相同的样品中加入不同的引物A、B等(见图8中的概念)， 实施不同的PCR反应可能效果较好。
首先，增加天然样品中的细菌数目或用标准的方法从中直接分离 基因组DNA。从所制备的DNA当中可取1--100ng用于每个PCR反 应。反应配方相应如下：
  基因组DNA              -1.00μl
  水                     -19.80μl
  缓冲液(10x)*1          -2.50μl
  dNTP(10mM)*2           -0.25μl
  正向引物(10mM)*3       -0,20μl
  反向引物(10mM)*3         -0.20μl
  MgCl2                   -0.75μl
  Taq聚合酶(5U/μl)*1      -0.30μl
*1：缓冲液和酶由Biomaster公司提供
*2：核苷酸由Boehringer Mannheim公司或其他供货商提供
*3：引物的量应相同。若为混合引物，其引物的浓度均为10μM。 例如，引物可按3c的描述进行设计和组合。
鉴于在芯片技术领域反应用量通常很小，上述反应配方可相应减 少。有时，也需要调整PCR的循环时间。
扩增完成后将DNA纯化。将探针固定在芯片上。在一特殊的实 施方法中，上述探针可由表8“引物H1”列中选出。其技术过程为 专业人员熟知。纯化的DNA与变性缓冲液(例4)按1∶1稀释并在 室温下培养一小时。然后加入十倍体积的杂交缓冲液并用此溶液在 37-60℃间缓慢地覆盖芯片，即附着了探针的表面。将经处理的芯片 表面用洗涤缓冲液(例4)在37-60℃间洗涤3次，每次至少2分钟。 最后进行检测。为此，可使用与荧光染料偶连的引物。此荧光可通过 诸如CCD相机的探测器检测。当然，也还有许多其它的检测方法， 例如可通过表面质子共振(SPR)来检测和定量单链的扩增产物与探针 的结合。此方法的优点是不需使用染料。在应用SPR时，可将实验 过程设计成，其芯片表面含有相同探针的区域可同时进行探测。如果 芯片上排列了100或1000个以上单独的检测区域，此方法就具特别 的优势。这些区域上的核酸杂交引起的SPR信号增加即表示结果阳 性。由此可通过表8所列出的引物对相应的细菌或原则上所有的细菌 进行鉴别、甚至可能定量。
                     示例4
                用探针鉴别微生物
作为诸如DNA、RNA和PNA或专业人员熟知的类似结构的多聚 核苷酸探针，原则上可用于浓缩和鉴定DNA或RNA。它们以单链分 子形式存在，或可通过类似加热或加碱的标准变性方法变为单链分 子。
为鉴别微生物，必须从中分离出DNA或RNA并进行纯化。用以 下不同方法可高效获得核酸：
1)可用物理方法，例如使用磁颗粒与抗体偶连的方法或离心，浓 缩微生物
2)可通过一个PCR或类似的扩增反应来扩增微生物的DNA或 RNA
3)使用市场上可购得的常用材料，在进行纯化的过程中，浓缩扩 增的微生物的DNA或RNA
提高核酸分离的效率，特别是通过扩增方法，可大大有助于细菌 鉴别的特异性。
下一步是培养细菌。在此，探针和待鉴别的核酸(如果待鉴定的 微生物存在)构成杂交分子。杂交分子在一定的实验条件下形成。在 允许核酸特异性杂交的特定条件下(pH，温度，离子浓度)用缓冲 液洗涤的步骤同上。此时，特异性小的和不需要的杂交分子被洗脱掉 了。
最后一步是检测杂交分子。对此有许多专业人员所熟知的方法。 在这些方法中会用到染料，甚至可能是荧光染料。这些染料直接或间 接地偶合或结合在探针或待鉴定的DNA上。在芯片技术或Lightcycler 技术领域尤其如此。此外，还有一些物理学的方法，例如在界面上运 用两个可适用于检测杂交分子的不同强度光波以增强光的总反射 (attenuated total reflection)。
对鉴定的评估有很多方式。在只需判定“有或无”的情况下，只 有在微生物存在时才可鉴别出杂交分子。若以上提到的微生物核酸的 扩增反应并未导致核酸的增加，则检测不到杂交分子。若所不期望的 核酸被扩增或已大量存在，这些核酸可通过杂交过程中的严格条件而 被排除。此外，对杂交分子的定量分析，可通过确定一个阳性结果的 阈值来精确确定鉴定结果的特异性。
---本专利中所有列出的核酸原则上均可作为探针。表3 中特别列出了节选出的可能的探针。这些核酸用于鉴别表中  列出的细菌属，并将它与真细菌的其它所有属区分开来。
下面举例说明，如何将此处的特异性DNA区域作为探针来鉴定 微生物。在该例中使用ELISA方法。此时，可通过在微量滴定板上 进行的酶联染色反应来鉴别核酸。
在下例中，DNA被首先通过PCR反应扩增。在此使用的是与 Digoxygenin偶连的引物。然后，在一个涂有Streptavidin的微量滴定 板内加入经生物素标记的探针，以使探针在微量滴定板的表面偶连。 碱性变性的PCR扩增物与微量滴定板上的探针杂交30分钟。用 5’-Digoxigenin标记的扩增物的末端作为抗原与过氧化物酶偶连的特 异性抗体进行反应。在加入四甲基联苯胺后会出现蓝色。此蓝色反应 可用0.5M的硫酸使其停止。同时，颜色由于ph值的变化会变为黄色。 吸收光的强度可在波长450nm处用ELISA检测器进行测量。
在ELISA方法中使用下列试剂：
               杂交缓冲液(2.5×SSC) 2.5×SSC                          62.5ml 20×SSC(见下文) 2×Denhardts                      20ml 50×Denhardts(见下文) 10mM Tris(Gibco，Nr.15504-038)    5ml 1M Tris 1mMEDTA(Fluka，Nr.03699)          1ml 0.5M EDTA 加双蒸水至0.5升，并将pH值调为7.5。
                 清洗缓冲剂1 1×SSC                            50ml 20×SSC(见下文) 2×Denhardts                      40ml 50×Denhardts(见下文) 10mM Tris(Gibco，Nr.15504-038)    10ml 1M Tris 1mM EDTA(Fluka，Nr.03699)    2ml 0,5M EDTA 加双蒸水至0,5升，并将pH值调为7,5。
                  清洗缓冲剂2 10mM Tris(Gibco，Nr.15504-038)        12.15g 150mM NaCl(Merck，Nr.6404.5000)       8.78g 0.05％Tween 20(Serva，Nr.37470)       0.50g 0.5％的阻断剂(Boehringer)5g在60℃的条件下溶于D1中，10μg/ml Herring sperm，10mg/ml储存液10ml，加入双蒸水至1升，并将pH 值调为7.5。
                    变性缓冲剂 125mM NaOH(Fluka，Nr.71690)                0.500g 20mM EDTA(Fluka，Nr.03699)                 0.745g 加双蒸水至0.1升。
                     偶合缓冲剂 10mM Tris(Gibco，Nr.15504-038)             10ml 1M Tris 1mM EDTA(Fluka，Nr.03699)                  2ml 0.5M EDTA 100mM NaCl(Merck，Nr.6404.5000)            5.88g 0.15％Triton×100(Chemikalienlager)        15ml 加双蒸水至1升，并将ph值调为7.5。
                       终止试剂 95％H2SO4                                     14ml 加双蒸水至0.5升。
                       50xDenhardts Ficoll 400(Pharmacia Biotech，Nr.17-0400-01)    5g 聚乙烯吡咯烷酮(Sigma，Nr.P-2307)                5g 牛血清蛋白                                      5g 加双蒸水至0.5升。
                        20×SSC NaCl(Merck，Nr.106404.1000)                     350.36g 柠檬酸钠(二水化柠檬酸三钠，Fluka，Nr.71404)     176.29g 加双蒸水至2升，并将pH值调为7,0。
                          D1 100mM马来酸(Fluka，Nr.63190)                    11.62g 150mM NaCl(Merck，Nr.106404.1000)               8.76g NaOH(Fluka，Nr.71690)                           约7.5g 加双蒸水至2升，并将pH值调为7.0。
                  ELISA方法的实施
在每孔中加入200μl结合缓冲液和1μl探针。用保鲜膜将微量滴 定板封闭，在室温下放置两小时。将待检测的PCR扩增物在室温下解 冻，按1∶1的比例与变性缓冲液稀释并在室温下培养10分钟。将 10ml试剂加入此前清空的孔中。然后，在每孔中再加入100μl的杂 交缓冲液并在37-60℃的条件下培养30分钟。将孔清空清洗，然后 用200ml预热至37-60℃的洗涤缓冲液1将其注满，并在同样温度 下培养2分钟。将此洗涤步骤重复进行三次。
在仔细清除洗涤缓冲液后，将Anti-Dig-POD抗体(DAKO)按1∶ 3000(1ml在3ml洗涤缓冲液)稀释并将100ml此试剂注满干的孔。 将此板在37℃的恒温箱中培养30分钟。
然后，将微量滴定板用200ml清洗缓冲液2深度清洗三次。每孔 加100ml BM blue(Boehringer)染料。15分钟后，用100ml 0,5M  H2SO4使反应停止。在ELISA检测器中对此样品的消光进行定量。
在上述的方法中，可使用表4列出的探针鉴定所列举出的细菌种 类。
                        示例5
       本专利中DNA区域对细菌鉴定的普遍适用性
本专利中特指的核糖体DNA区域，特别是当其与23S-5S核糖体 间隔区组合后，特别适于真细菌的鉴别。专业人员借助SEQ ID 1-530 序列或在专注与上述核糖体DNA区域的情况下，可很快鉴别出其选 择的细菌分类学菌株。下面示例展示本发明对所有真细菌种鉴别的普 遍适用性。
这里所介绍的方法主要包括三步。第一步，扩增大约包括23S基 因的330-430核苷酸、其后的转录间隔区和核糖体5S基因的核糖体 区域。由于不同真细菌种的这一区域的长度不同，此区域大约包括 400至约750个核苷酸的范围。若DNA序列不明，那么此法对于确 定待鉴别的和其它一些待区分的亲缘关系近的菌种的DNA序列具 有优势。由此序列比较分析，专业人员可轻易确定最佳的单聚核苷酸 作为PCR引物或探针用于鉴别。在上例中，引物和探针都是以此方 式选出的。此外，这里提及的序列也可直接用于多种细菌的鉴别，特 别是在适当地选择PCR和/或杂交的严格条件的情况下。
              A)核糖体DNA的扩增
所用的DNA片段由蛋白细菌和其它很多细菌种类的基因组DNA 通过引物SEQ ID 211和212来扩增。若扩增其它细菌种类的DNA出 现问题，则由与SEQ ID 211和212相应的DNA区域得出的引物也可 用于进行扩增。
用标准方法从表5所列的细菌的纯培养物中分离基因组DNA。从 所制备的DNA当中可取1--100ng用于每个PCR反应。反应配方如 下：
  基因组DNA                   -1.00μl
  水                          -19.80μl
  缓冲液(10x)*1               -2.50μl
  dNTP(10mM)*2                -0.25μl
  正向引物A(10μM)*3        -0.20μl
  反向引物(10μM)*3         -0.20μl
  MgCl2                    -0.75μl
  Taq聚合酶(5U/μl)*1       -0.30μl
*1：缓冲液和酶由Biomaster公司或其他供货商提供
*2：核苷酸由Boehringer Mannheim公司或其他供货商提供
*3：引物的量应相同。若为混合引物，其正向引物和反向引物的 浓度均为10μM。
PCR在Perkin Elmer 9600热循环器中按如下说明进行：
  起始变性          95℃           5min
  扩增(35个循环)    92℃           1min
                    52℃           1min
                    72℃           30s
  终合成            72℃           5min
可用于扩增的基因组DNA见表5。
            B)A)中产品的属种特异性扩增
A)中扩增得的DNA产品可直接用于鉴别细菌，尤其是在使用特 异性探针的情况下。在应通过这一过程将鉴别的结果限制为较小的细 菌的系统分类单位，如种、属、目时，对此序列的部分区域进行第一 级扩增更为合适。扩增引物至少已经可以完成部分鉴别。A)中扩增的 区域提供了很多具有特异性鉴别能力的亚区域。专业人员通过比较待 鉴别的细菌和亲缘关系相近的细菌的序列，将会很容易识别出这些区 域。
在本例中，23S-5S转录间隔区的首端和末端被选为特异性引物的 区域。具体的序列及引物的来源见表5。通过对序列的比较可以看出， 它们基本上都具有种特异性的鉴别能力。一个例外是弧细菌的引物。 此引物也已经具有属特异性鉴别能力。尤其对肠道细菌而言，正向引 物的序列CGAAG...TTTT和反向引物序列AACAGAATTT都是保守 的。现在，有两种可能可将(如肠道细菌)引物的特异性扩展到属或 属的群：一是将PCR的退火温度降低。二是将正向引物的序列朝23S 基因方向和将反向引物的序列朝5S基因方向移动。其结果是出现序 列种性变化较小的引物。具体操作可根据鉴别的要求相应变化。以下 是用表5中的引物通过PCR扩增进行种特异性鉴别的示例。
用标准方法从表5所列的细菌的纯培养物中分离基因组DNA。从 所制备的DNA当中可取1--100ng用于每个PCR反应。反应配方如 下：
  基因组DNA              -1.00μl
  水                     -19.80μl
  缓冲液(10x)*1          -2.50μl
  dNTP(10mM)*2           -0.25μl
  正向引物A(10mM)*3      -0.20μl
  反向引物(10mM)*3       -0.20μl
  MgCl2                 -0.75μl
  Taq聚合酶(5U/ml)*1     -0.30μl
*1：缓冲液和酶由Biomaster公司或其他供货商提供
*2：核苷酸由Boehringer Mannheim公司或其他供货商提供
*3：正向引物和反向引物见表5。引物的量应相同。若为混合引 物，其引物的浓度均为10μM。反向引物具有表5中反向引物的互补 序列。
PCR在Perkin Elmer 9600热循环器中按如下说明进行：
  起始变性          95℃            5min
  扩增(35个循环)    92℃            1min
                    45-72℃         1min
                    72℃            30s
  终合成            72℃            5min
扩增的结果见表5，即用表5中的引物进行的细菌种特异性的鉴 别，可确定其引物被排列在此表中的细菌。相反，使用其设计此前已 提到的一般引物可确定所有肠道细菌的属或蛋白细菌γ-分支的所有 属。
    C)使用源于23S-5S核糖体转录间隔区的引物或探针
                   进行进一步区分
在经过A)和/或B)两步对分类学上较高菌株的DNA扩增后，可通 过选择探针进行进一步的鉴别。可变性的DNA区域，例如23S-5S核 糖体转录间隔区的中心区域可用于种特异性的鉴别。在此，探针可置 入芯片中或用于Lightcycler技术或ELISA方法中。在后者中，可应 用实例4中的ELISA方案。细菌种特异性鉴别的结果与23S-5S转录 间隔区的选择有关，因为大部分23S-5S转录间隔区具有种特异性的 序列范围。使用表5中的引物和相应的间隔区(表5中SEQ ID列) 可鉴别此表中所列出的细菌种。
                     概念解释
                   DNA序列的衍推
为了发现和发展可用于分类学菌株鉴别的单聚或多聚核苷酸，可 将其从一个或多个DNA序列中衍推出来。在多个序列的情况下进行 序列比较就具有优势。所衍推出的单聚核苷酸可能与原序列相同。它 也可能是一些可变性序列的共有区域。此时，多聚核苷酸由已分析序 列上特定位置的最常见的或占优势的碱基选出。此外，也可以根据“核 苷酸”的定义从一个待发展的序列中选出可变性序列。由此可变序列 得出的DNA或RNA多聚物因此是一种分子混合物。它在所有可能 的核苷酸可变序列的位置上显示出来。
              类似的DNA序列
类似的DNA区域具有与给出的序列相同的功能或类似的位 置，但却来源于不同的种系，例如与待比较的相同位置上的转录间隔 区不具有相似性时的5S rDNA和23S rDNA之间的转录间隔区。这之 所以可能，是因为其在远亲细菌中差异性巨大，以至于对其无法进行 种演变的分类和同源性比较。然而，上述作为DNA序列的转录间隔 区就其作为转录间隔区的功能或其位置而言是可明确定义的，因为其 始于23S rDNA编码区域的末端，终于5S rDNA的起点。
                     相邻基因
相邻基因是指不为其它基因分割的或对大多数待检测的菌种 而言两个确定的基因。分割是指另一个基因位于两个基因之间。
                     肠道细菌
肠道细菌是蛋白细菌γ分支的一个目。此概念包括了此目中的所 有分类学单位，尤其包括以下的菌属：Alterococcus，Aquamonas， Aranicola，Arsenophonus，Brenneria，Budvicia，Cedecea，Calymmatobacterium， Citrobacter，Edwardsiella，Enterobacter，Erwinia，Escherichia，Ewingella， Hafnia，Klebsiella，Kluyvera，Koserella，Leclercia，Moellerella，Morganella， Pantoea，Phlomobacter，Photorhabdus，Plesiomonas，Proteus，Providencia， Rahnella，Salmonella，Serratia，Shigella，Wigglesworthia，Xenorhabdus， Yersinia，Yokenella。
                         真细菌
真细菌和古细菌共同构成原生动物门。此处，“细菌”和“真细菌” 是同意语。真细菌指此门中的所有分类学单位。其包括die Aquificales， Aquificaceae，Desulfurobacterium-Gruppe，Chlamydiales， Verrumicrobia-Gruppe，Chlamydiaceae，Simkaniaceae，Waddliaceae， Verrumicrobia，Verrumicrobiales，Coprothermobacter-Gruppe，Cyanobacteria， Chroococcales，Nostocales，Oscillatoriales，Pleurocapsales，Prochlorophytes， Stigonematales，Cytophagales，Gruppe der grünen Schwefelbakterien， Bacteroidaceae，Cytophagaceae，Flavobacteriaceae，Flexibacter-Gruppe， Hymenobacter-Gruppe，Rhodothermus-Gruppe，Saprospira-Gruppe， Sphingobacteriaceae，Succinovibrionaceae，Grüine Schwefelbakterien， Fibrobacter，Acidobacterium-Gruppe，Fibrobacter-Gruppe，Firmicutes， Actinobacteria，Acidomicrobidae，Actinobacteridae，Coriobacteridae， Rubrobacteridae，Sphaerobacteridae，Bacillus-Gruppe，Clostridium-Gruppe， Lactobacillus-Gruppe，Streptococcus-Gruppe，Clostridiaceae，Haloanaerobiales， Heliobacterium-Gruppe，Mollicutes，Sporomusa-Zweig， Syntrophomonas-Gruppe，Thermoanaerobacter-Gruppe，Flexistipes-Gruppe， Fusobacteria，Grüne Nicht-Schwefelbakterien，Chloroflexaceae-Gruppe， Chloroflexaceae，photosynthetische Flexibakterien，Holophaga-Gruppe， Nitrospira-Gruppe，Planctomycetales，Planctomycetaceae，Proteobacteria， Purpur-Nichtschwefelbakterien，Alpha-Unterabteilung der Proteobakterien， Beta-Unterabteilung der Proteobakterien，Gamma-Unterabteilung der Proteobakterien，Delta/Epsilon-Unterabteilung der Proteobakterien， Spirochetales，Leptospiraceae，Spirochaetaceae，Synergistes-Gruppe， Thermodesulfobacterium-Gruppe，Thermotogales，Thermus-Gruppe oder Deinococcus-Gruppe.
                       基因
基因包括DNA的可读框或编码区。此区域只编码蛋白。顺反子 也是一个基因，但它和其它顺反子一起位于一个mRNA上。调节 基因转录的DNA区域，如启动子、终止子和增强子，同样属于基因。 当本发明简化使用23S rDNA基因和5S rDNA基因时，其应与一般概 念作相同理解。但根据我们的定义，23S rDNA基因或5S rDNA基因 却不是基因，而是一个功能独立的DNA片段，因为它不编码一个蛋 白，而且也不能被分成密码子。
                       转录间隔区
本发明中重点论述的转录间隔区位于23S rDNA基因编码区域和 5S rDNA基因编码区之间。其在系统编排中占了一个特殊的位置。由 于它经过转录，也就是说它是mRNA和生物学上不活跃的RNA前体 的组成部分，所以不属于基因间的范围。此前体通过切除转录间隔区 而被转化为核糖体意义上的、生物学上活跃的分子。另一方面，它在 功能上或在种系发育上不能明确地归于23S基因或5S基因。因为基 因概念在此明显不能用于进行分类，所以核糖体操纵子的“转录间隔 区”与“基因”及“基因间区域”同等，是一个功能上独立的DNA-(RNA) 级。
                 同源DNA序列
DNA或RNA序列只有在具有相同的种系发育上的来源时，它们 才是同源的。这可以由一个DNA片段中至少40％的核苷酸是相同的 这一现象而判断出。在一个较大的DNA片段中可能存在可变区域。 此时，当种系发育的亲缘关系通过25个核苷酸长的序列的存在而表 现出来就足够了。此25个核苷酸长的序列至少与一待比较的DNA 的另一个25个核苷酸长的序列有60％是相同的。此外，通过与亲缘 关系近的细菌进行比较，经常可很容易地识别出同源序列。为识别亲 缘关系远的细菌的同源性，需与种的序列进行顺序上的比较。这些种 在种系发育的意义上消除了亲缘关系远的细菌的差异
           相同的DNA序列/相同性百份比
为确定DNA或RNA序列的相同性(若全部相同即为100％)，需观 察一个较大的多聚核苷酸的部分序列。这些部分序列包括10个核苷 酸。如果两个被比较序列的所有10个碱基都是相同的，这些部分序 列就具有相同性。胸腺嘧啶和尿嘧啶是相同的。一个较大的多聚核苷 酸的所有可能片段均可作为被观察的部分序列。
当两个被比较的序列在10个核苷酸中有9个相同，或在20个中 有18个相同，即具有90％的相同性。
例如两个包括20个核苷酸并在第5个碱基不同的多聚核苷酸。在 序列比较中可发现6个相同的10-er的核苷酸和5个只是在一个碱基 上不同的10-er的核苷酸。
此外，相同性可通过将单位以百分比表示等级来逐级确定。为确 定相同性的程度也可对部分序列进行观察，这些部分序列包括至少事 实上被使用的序列(比如作为引物)的长度或20个核苷酸。
作为示例，将长度为100个核苷酸的A和长度为200个核苷酸的 B进行比较。从多聚核苷酸B中可衍推出一长度为14个核苷酸的引 物。为确定相同性的程度，将多聚核苷酸A和引物在它的整个长度 上进行比较。若引物的序列在多聚核苷酸A中出现，但有一个碱基 不同，即表示相同程度为13∶14(即92.3％)。
在第二个示例中，将上述的多聚核苷酸A和B进行总体比较，此 时，将所有比较窗口的长度设置为20个核苷酸并确定它们的相同程 度。若多聚核苷酸A和B的50-69号核苷酸除了55号外完全相同， 则此片段的相同程度为19∶20(即95％)。
                   保守的和可变的引物
保守引物是指在保守的DNA或RNA区域杂交的核苷酸。保守这 一概念描述了不同分类学菌株的核苷酸顺序在进化过程中的易变性。 因此它是一个比较单位。由于用于比较的序列不同，一个区域和引物 可能是保守的或可变的。借助就杂交目标而言相邻或重叠的、具有和 引物相同长度的区域，可将引物定义为“保守的”和“可变的”。例 如，在此可选择相同细菌的比较序列或其它细菌的同源的或类似的序 列。在比较时，如一个序列与比较序列至少95％是相同的，则该序列 是保守的；如两者的相同性小于95％，则该序列是可变的。
                       连锁引物
连锁引物尤其被用于Consensus-PCR。此处涉及扩增一已被扩增 的多聚核苷酸的引物。连锁引物与一个已经扩增的DNA或RNA目 标分子内的一个区域进行杂交。在此，与连锁引物的扩增可进行任意 次，以使更小的扩增产品出现。
                   DNA或RNA的杂交
两个相同或相似的核苷酸片段可以相互杂交成为双链。此杂交不 仅可发生在DNA、RNA或PNA单链之间，而且还可以在DNA与 RNA、DNA与PNA以及RNA和PNA等等之间形成杂交分子。有 许多因素影响到两个多聚核苷酸是否杂交。一种杂交可优先发生在 37-60℃之间。另一种杂交可发生在严格的杂交和洗涤步骤下。确定 特异性杂交条件的实验参数见例4。若使用的探针只与所希望的目标 序列，而不与同样存在于样品中的其它DNA杂交，那么就是特异性 杂交。
                   核酸利用的组合
引物、探针、DNA片段、多聚核苷酸的子区域或单聚核苷酸可用 于多种组合。例如，引物群中的两种引物的任意组合、由序列群中任 意选择一探针和由同样的序列群中选择引物。在后一种情况下，引物 和探针可能相同，也可能不同。引物或探针也可由两个或多个DNA 片段构成。在此，应将所有可能的构成形式考虑在内。组合也可能发 生在使用各种引物和探针的PCR步骤中。
                    Consensus-PCR
Consensus-PCR用Consensus引物进行。Consensus引物可以扩增 至少两个、在理想状况下甚至所有的分类学上单位的DNA。在下面 的分析中将确定扩增的DNA的相同性。为此，需进行其它的PCR步 骤。这些步骤可能通过使用可变的连锁引物区别出分类学上较小的单 位。对分类学上单位的最终确定除了使用可变的引物外，也可通过特 异性的探针完成。
                    核苷酸
核苷酸是DNA或RNA的碱基。在此适用下列缩写： G＝Guanosine，A＝Adenosine，T＝Thymidine，C＝Cytidine，R＝G oder A，Y ＝C oder T，K＝G oder T，W＝A oder T，S＝C oder G，M＝A oder C， B＝C，G oder T，D＝A，G oder T，H＝A，C oder T，V＝A，C oder G，N＝A， C，G oder T，I＝Inosine.
                     分类学上的单位
细菌分类学上的单位指所有已知的分类学上的划分，例如门、纲、 目、科、属、种、诸如亚纲、亚目、亚科等的分类学划分的亚单位或 分类学单位的集合。
                     发明的具体描述
本发明主要包括5个部分。这5个部分反映了本发明的一般性和 特殊性。
使用相邻基因时DNA目标区域的选择
使用23S rDNA末端、转录间隔区和部分5S rDNA的核糖 体DNA区域鉴别所有细菌的说明
准备用于多种细菌的引物和探针
鉴别肠道细菌目及其组成菌株
使用Consensus-PCR鉴别所有的细菌
           使用相邻基因时DNA目标区域的选择
本发明使用相邻基因的部分以鉴别细菌分类学上单位，如门、纲、 目、科、属、种及其亚单位。其优点在于可发现一些DNA区域。这 些区域在可变性方面介于两个基因之间。该优点可在核糖体操纵子， 尤其是23S/5S rDNA片段上显现出来。通过很保守的和次保守的区域 的存在，专业人员可以鉴别所有可能的亲缘关系近的和远的细菌菌 株。
使用23S rDNA末端、转录间隔区和部分5S rDNA的核糖体DNA
              区域鉴别所有细菌的说明
为鉴别细菌，尤其可以使用大约包括400-750个核苷酸的23S r DNA区域。后一个区域由大约330-430个23S rDNA末端的核苷酸、 转录间隔区和部分5S rDNA基因构成。在具体情况下，一t-RNA基 因被插入间隔区一同用于鉴别。因此，上述的区域相对于SEQ ID 1 的2571-3112核苷酸。SEQ ID 1即大肠埃希氏菌的23S和5S rDNA 基因。通过专业人员熟悉的序列比较，可确定同源的片段和其它细菌 与其相应的片段。尤其对于相同科、目或亚纲的成员而言，上述起于 23S rDNA基因终点的区域的起端和5S rDNA基因的末端，可通过对 种A和B的核糖体DNA区域进行比较而轻易确定。若种A和与其 关系较远的种C不易于比较的话，则可通过比较种系关系较近的种B 和种C的序列得到所需的结果。通过一系列独立的序列比较，可由 此确定与上述区域相应的所有真细菌的23S rDNA、转录间隔区和5S rDNA同源的核糖体区域。基于单个亚区域的可变性，在此完全可能 出现多达几百个核苷酸的长度差异。此外，本发明还可使用上述区域 的亚区域。这些区域的大部分见表6。
              准备用于多种细菌的引物和探针
除了可适用的rDNA序列的一般描述外，也准备好可用于鉴别细 菌的序列(SEQ ID 1-530)。在此，根据任务的不同，可能会使用SEQ ID 1-530中选出的全部多聚核苷酸或其中的一部。此时，SEQ ID 1-530 中特异的序列来源于此前描述的23S rDNA基因、转录间隔区和5S rDNA基因的区域。
在技术实施过程中，细菌的鉴别可借助于此处选出的DNA区域 和序列，通过探针和/或引物来完成。引物是用作扩增起始分子的核 苷酸。在此，它们聚集在目标序列上，并借助聚合酶被重新合成。其 特异性通过引物与目标序列的相同程度来调节。分类学的特异性可以 通过从此处描述的核糖体区域中选出目标序列而决定(也见表6)。 与此相应，引物可以各种形式使用：如可将整个区域根据图2扩增， 或用SEQ ID 211和212的引物与SEQ ID 1(大肠埃希氏细菌)的 2571-3112核苷酸进行同源扩增。为了完善扩增，也可使用两种以上 引物构成的混合物。此外，也可通过引物只扩增特定细菌的DNA。 此时，它们传递了两个信息：其一，它们表明了细菌的存在；其二， 当扩增是阳性的情况下，它们表明待检细菌的种类。通过使用连锁引 物的有序的扩增步骤，可在DNA合成物终止时根据需要调节所需的 信息量。
在一个单独的步骤中，可将DNA与探针结合、浓缩和鉴别。对 此DNA最好先进行预扩增。探针是可与单链DNA片段结合的单聚 或多聚核苷酸。探针与目标序列的亲合性由其与目标序列的相同程度 决定。此外，杂交条件也具有显著的影响，也就是说，缓冲液的盐浓 度和培育的时间与温度必须调节得恰到好处。专业人士可用常用的方 法迅速调节这些参数。示范性的杂交条件在示例中已给出。探针可以 完全象引物一样有两方面的作用：一是可以显示细菌DNA或扩增产 物的存在；二是可以检测特定细菌的DNA.。它们功能的二元性也与 引物相同。因此，在鉴定微生物时可以在引物和探针之间进行分工合 作。此外，探针可象引物一样来源于23S rDNA的末端区域、转录间 隔区和5S rDNA三者的自由选择区域或全部的区域。
本发明的一个特别的优点在于，根据图2所选出的核糖体区域由 非常可变和非常保守的、范围宽泛的区域异源构成。因为亚区域的使 用如表6所示有很多组合，本发明为所有的细菌序列和分类学单位提 供了鉴别的可能性。
                鉴别肠道细菌目及其组成菌株
诸如肠道细菌科的细菌可借助于本发明中所描述的DNA目标区 域进行鉴别(示例1)。肠道细菌是蛋白细菌(Proteobacteria)或紫细 菌(Purpurbacteria)的γ分支的相同的分类学单位。该类细菌非常重要， 因为它们包括很多致病菌，如大肠埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌和 耶尔森氏菌。它们适于作为检测食品卫生状况的标识细菌。在临床微 生物学中，鉴别肠道细菌是界定致病体的第一步。在本发明所列出的 引物中，如SEQ ID 2-25引物的各种组合适于鉴别肠道细菌科。此外， 很多本发明所列出的序列可用于鉴别肠道细菌的菌株，如属、种。其 它的序列也可用于鉴别硬细菌和蛋白细菌的其它分类学单位，特别是 其全部的γ分支。图2中对核糖体区域的描述表明了专业人员如何轻 易获得其它用于鉴别真细菌的序列的另一种方法。
             使用Consensus-PCR鉴别所有的细菌
本发明的一个特别优点，正如图2所描述的那样，在于DNA目 标区域的理想的鉴别方法是Consensus-PCR。本方法实验应用的一个 主要前提是待扩增的目标区域内的序列的可变性递增。这一要求在我 们所描述的核糖体操纵子的区域内，对于所有需鉴别的种类而言都得 到了满足。
Consensus-PCR的图示详见图8。通常情况下，首先扩增“主片段”。 此片段可等同于图2所表示的所有片段，或仅是其一部分。若在样品 中存在各种需鉴别的菌体，则对所有的菌体都扩增此片段。最后，单 个菌体用特异性的探针和/或另外的PCR步骤组合来鉴别。用探针进 行的鉴别可小型化从而在芯片上进行。另外也可用传统ELISA的方 法进行鉴别。细菌鉴别的配方可制成试剂盒。
荧光染色剂特别适用于鉴别，它可被偶合在引物或探针上。然而， 在ELISA或DNA印迹法中，却经常使用非荧光染料。另一种检测 的方法是Genetrak和Lightcycler技术。原则上，所有的这些方法均 可用于定量鉴别。通过最后分析检测信号，可确定样品中存在的细菌 数目。
用本发明所述方法鉴别细菌，可用专业人员所熟知的方法进行。 例如可首先在适合的培养液中扩增细菌。在涉及食品的样品鉴定中可 优先使用物理的分离方法，如离心沉淀。而且，也可通过特殊的扩增 方法反推出样品中最初的细菌数。此外，可进行细菌数的阈值确定。 总之，此时均可对细菌鉴别进行定量或半定量。
为了分离基因组DNA，须将扩增的细菌裂解。物理的(玻璃珠 或加热)和化学的(NaOH)影响常常是以专业人员所熟知的细胞裂 解方法为基础的。然而，也可将细菌直接用于检测DNA的PCR方法 中。此外，纯化基因组DNA，特别是当它存在于食品母体中时，此 法更具优势。这种方法也为专业人员熟知。所需的DNA纯化试剂盒 可在市场上购得。 表1.肠道细菌的区分与鉴定(例1)  序号.  种  菌株  鉴定结果  1  Budvicia aquatilis  DSM 5025     +  2  Buttiauxella agrestis  DSM 4586     +  3  Cedecea davisae  DSM 4568     +  4  Citrobacter koser  DSM 4595     +  5  Erwinia carotovora  DSM 30168     +  6  Erwinia chrysanthemi  DSM 4610     +  7  Ewingella americana  DSM 4580     +  8  Enterobacter agglomerans  B-5081-i     +  39  Enterobacter aerogenes  DSM 30053     +  10  Enterobacter sakazakii  DSM 4485     +  11  Enterobacter intermedius  DSM 4581     +  12  Enterobacter cloacae  DSM 30054     +  13  E.coli  BC 7883     +  14  E.coli  H123     +  15  E.coli  BC 7884     +  16  E.coli  BC 7885     +  17  E.hermanii  B-4943a     +  18  E.coli  ATCC 8739     +  19  Hafnia alvei  DSM 30163     +  20  Klebsiella pneumoniae  ATCC 13883     +  21  Klebsiella pneumoniae  DSM 2026     +  22  Klebsiella planticola  DSM 4617     +  23  Klebsiella oxytoca  DSM 5175     +  24  Kluyvera cryocrescens  DSM 4583     +  25  Morganella morganii  DSM 30164     +  26  Plesiomonas shigelloides  DSM 8224     +  27  Pantoea ssp.  B-5200     +  28  Pantoea dispersa  DSM 30073     +  29  Proteus rettgeri  DSM 1131     +  30  Proteus rettgeri  ATCC 14505     +  31  Providenoia stuartii  DSM 4539     +  32  Rahnella aquatilis  DSM 4594     +  33  Rahnella aquatilis  DSM 4594     +  34  Serratia proteamaculans  DSM 4487     +  35  Serratia ficaria  DSM 4509     + 表1.肠道细菌的区分与鉴定(例1)-续- 序号.  种  菌株 鉴定结果 36  Serratia plymutica  DSM 49     + 37  Serratia rubidea  DSM 4480     + 38  Serratia marcescens  DSM 1636     + 39  Salmonella bongori  DSM 7952     + 40  Yersinia pseudotuberculosis  DSM 8992     + 41  Yersinia pseudotuberculosis  DSM 8992     + 42  Yersinia enterolytica  DSM 4790     + 43  Acinetobacter calcoaceticus  DSM 590     - 44  Aeromonas hydrophila  DSM 6173     - 45  Aeromonas enteropelogenes  DSM 6394     - 46  Fransilla tularensis Isolat  F16     - 47  Franzisella philomiragia  DSM 7535     - 48  Moraxella catarrhalis  DSM 9143     - 49  Pasteurella pneumotropica  B-2397A13     - 50  Pseudomonas beyjerinkii  DSM 7218     - 51  Vibrio fischeri  DSM 507     - 52  Vibrio alginolyticus  DSM 2171     - 53  Vibrio proteolyticus  DSM 30189     - 54  Vibrio paramaemolytiucs  DSM 10027     - 55  Vibrio harveyi  DSM 6104     - 56  Xanthomonas maltophila  BC 4273     - 57  Achromobacter xylosa  DSM 2402     - 58  Alcaligenes spp  DSM 2625     - 59  Alcaligenes latus  DSM 1122     -  60  Brucella neotomae  ATCC 25840 -  61  Brucella ovis  ATCC 23459 -  62  Enterococcus casseliflavus  DSM 20680 -  63  Flavobacterium sp.  ATCC 27551 -  64  Flavobacterium resinovorum  DSM 7438 -  65  Flavobacterium johnsonii  DSM 2064 -  66  Flavobacterium flavense  DSM 1076 -  67  Lactobacillus bifermentans  BC 8463 -  68  Pseudomonas paucimobilis  DSM 1098 -  69  Pseudomonas cepacia  DSM 3134 -  70  Sphingobacterium multivorans  DSM 6175 - 表2.Pantoea dispersa细菌的区别鉴定(例.2) 序 号.  种 鉴定结果 1  Pantoea dispersa     + 2  Budvicia aquatica     - 3  Buttiauxella agrestis     - 4  Enterobacter agglomerans     - 5  Erwinia carotovora     - 6  Erwinia crysanthemi     - 7  Escherichia coli     - 8  Escherichia vulneris     - 9  Escherichia hermannii     - 10  Hafnia alvei     - 11  Klebsiella oxytoca     - 12  Kluyvera cryoescens     - 13  Morganella morganii     - 14  Proteus mirabilis     - 15  Proteus rettgeri     - 16  Proteus stuartii     - 17  Providencia stuartii     - 18  Rahnella aquatilis     - 19  Serratia ficaria     - 20  Serratia fonticola     - 21  Serratia marcescens     - 22  Serratia plymuthica     - 23  Serratia proteamaculans     -  24  Serratia rubidea -  25  Yersinia enterolytica -  26  Yersinia peudotuberculosis -  27  Acinetobacter calcoaceticus -  28  Aeromonas enteropelogenes -  29  Aeromonas hydrophila -  30  Cedecea davisae -  31  Haemophilus influenzae -  32  Moraxella catarrhalis - 表2.Pantoea dispersa细菌的区别鉴定(例.2) -续-  序  号.  种  鉴定结果  33  Pasteurella pneumotropica     -  34  Stenotrophomonas multophila     -  35  Vibrio alginolyticus     -  36  Vibrio fisheri     -  37  Vibrio harveyi     -  38  Vibrio parahaemolyticus     -  39  Alcaligenes sp.     -  40  Bacillus subtilis     -  41  Brucella abortus     -  42  Brucella ovis     -  43  Flavobacterium resinovorum     -  44  Pseudomonas paucimobilis     -  45  Pseudomonas cepacia     -  46  Ralstonia pickettii     -  47  Sphingobacterium multivorum     -  48  Sphingomonas paucimobilis     -  49  Streptococcus faecalis     - 表3：用探针GTTCCGAGATTGGTT鉴定多个菌属  序  号.  种  鉴定结果  1  Rahnella aquatilis     +  2  Serratia ficaria     +  3  Serratia fonticola     +  4  Serratia marcescens     +  5  Serratia plymuthica     +  6  Serratia proteamaculans     +  7  Serratia rubidea     +  8  Yersinia enterolytica     +  9  Yersinia peudotuberculosis     +  10  Budvicia aquatica     -  11  Buttiauxella agrestis     -  12  Enterobacter agglomerans     -  13  Erwinia carotovora     -  14  Erwinia crysanthemi     -  15  Escherichia coli     -  16  Escherichia vulneris     -  17  Escherichia hermannii     -  18  Hafnia alvei     -  19  Klebsiella oxytoca     -  20  Kluyvera cryoescens     -  21  Morganella morganii     -  22  Pantoea dispersa     -  23  Proteus mirabilis -  24  Proteus rettgeri -  25  Proteus stuartii -  26  Providencia stuartii -  27  Acinetobacter calcoaceticus -  28  Aeromonas enteropelogenes -  29  Aeromonas hydrophila - 表3：用探针GTTCCGAGATTGGTT鉴定多个菌属
              -续-  序  号.  种  鉴定结果  30  Cedecea davisae     -  31  Haemophilus influenzae     -  32  Moraxella catarrhalis     -  33  Pasteurella pneumotropica     -  34  Stenotrophomonas multophila     -  35  Vibrio alginolyticus     -  36  Vibrio fisheri     -  37  Vibrio harveyi     -  38  Vibrio parahaemolyticus     -  39  Alcaligenes sp.     -  40  Bacillus subtilis     -  41  Brucella abortus     -  42  Brucella ovis     -  43  Flavobacterium resinovorum     -  44  Pseudomonas paucimobilis     -  45  Pseudomonas cepacia     -  46  Ralstonia pickettii     -  47  Sphingobacterium multivorum     -  48  Sphingomonas paucimobilis     -  49  Streptococcus faecalis     - 表4：用于鉴别细菌属和种的特异性探针  序号.  探针  SEQ ID  鉴定属/种  1  96  Budvicia aquatica  2  97  Buttiauxella agrestis  3  98  Enterobacter agglomerans  4  99  Erwinia carotovora  5  100  Erwinia chrysanthemi  6  101  Escherichia coli  7  102  Escherichia hermannii  8  103  Escherichia vulneris  9  104  Hafnia alvei  10  105  Klebsiella oxytoca  11  106  Kluyvera cryoescens  12  107  Morganella morganii  13  108，109  Pantoea  14  110  Proteus mirabilis  15  111  Proteus rettgeri  16  112  Providencia stuartii  17  113  Rahnella aquatilis  18  114  Serratia ficaria  19  115  Serratia fonticola  20  116  Serratia marcescens  21  117  Serratia plymuthica  22  118  Serratia proteamaculans  23  119  Serratia rubidea  24  120  Yersinia enterolytica  25  121  Yersinia pseudotuberculosis  26  122  Acinetobacter calcoaceticus  27  123  Aeromonas enteropelogenes  28  124  Aeromonas hydrophila  29  125  Cedecea davisae  30  126  Haemophilus influenzae  31  127  Moraxella catharralis  32  128  Pasteurella pneumotropica  33  129  Stenotrophomonas multophila 表4：用于鉴别细菌属和种的特异性探针
 -续1/2-  序号.  探针  SEQ ID  鉴定属/种  34  130  Vibrio alginolyticus  35  131  Vibrio fisheri  36  132  Vibrio harveyi  37  133  Vibrio parahaemolyticus  38  134  Vibrio proteolyticus  39  432  Salmonella typhi  40  433  Buchnera aphidocola  41  434  Pseudomonas stutzeri  42  435  Thiobacillus ferrooxidans  43  436  Agrobacterium vitis  44  437  Adalia bipunctata  45  438  Amycocalatopsis orientalis  46  439  Brucella  47  440  Bradyrhyzobium japonicum  48  441  Pseudomonas paucimobilis  49  442  Rhodobacter sphaeroides  50  443  Rickettsia prowazekii  51  444  Pseudomonas cepacia  52  445  Ralstonia pickettii  53  446  Campylobacter jejuni  54  447  Helicobacter pylori  55  448  Actinoplanes utahensis  56  449  Bacillus halodurans  57  450  Bacillus subtilis  58  451  Clostridium tyrobutyricum  59  452  Frankia  60  453  Microbispora bispora  61  454  Mycobacterium leprae  62  455  Mycobacterium smegmatis  63  456  Mycobacterium tuberculosis  64  457  Mycoplasma gallisepticum 表4：用于鉴别细菌属和种的特异性探针
 -续2/2-  序号.  探针  SEQ ID  鉴定属/种  65  458  Propionibacterium freudenreichii  66  459  Rhodococcus erythropolis  67  460  Rhodococcus fascians  68  461  Staphylococcus aureus  69  462  Streptococcus faecalis  70  463  Streptomyces ambifaciens  71  464  Streptomyces galbus  72  465  Streptomyces griseus  73  466  Streptomyces lividans  74  467  Streptomyces mashuensis  75  468  Flavobacterium resinovorum  76  469  Sphingobacterium multivorans  77  470  Synechococcus  78  471  Synechocystis  79  472  Borrelia burgdorferi  80  473  Chlamydia trachomatis  81  474  Azotobacter vinelandii  82  475  Cowdria ruminantium  83  476  Mycobacterium intracellulare  84  477  Mycobacterium lufu  85  478  Mycobacterium simiae  86  479  Mycobacterium smegmatis  87  480  Saccharomonospora azurea  88  481  Saccharomonospora caesia  89  482  Saccharomonospora cyanea  90  483  Saccharomonospora glauca  91  484  Saccharomonospora viridis  92  485  Wolbachia pipientis  93  525  Sphingomonas paucimobilis  94  526  Zymomonas mobilis  95  527  Alcaligenes  96  528  Borrelia burgdorferi  97  529  Xanthomonas campestris  98  530  Cowduria ruminantium
                           序列表 <110>BioteCon Diagnostics GmbH <120>用于检测细菌群和细菌种系发育中单位的核酸分子 <130>PCT1217-066 <140>1 <141>1999-08-15 <160>530 <170>PatentIn Ver.2.1 <210>1 <211>3118 <212>DNA <213>Escherichia coli <400>1 ggttaagcga ctaagcgtac acggtggatg ccctggcagt cagaggcgat gaaggacgtg 60 ctaatctgcg ataagcgtcg gtaaggtgat atgaaccgtt ataaccggcg atttccgaat 120 ggggaaaccc agtgtgtttc gacacactat cattaactga atccataggt taatgaggcg 180 aaccggggga actgaaacat ctaagtaccc cgaggaaaag aaatcaaccg agattccccc 240 agtagcggcg agcgaacggg gagcagccca gagcctgaat cagtgtgtgt gttagtggaa 300 gcgtctggaa aggcgtgcga tacagggtga cagccccgta cacaaaaatg cacatgctgt 360 gagctcgatg agtagggcgg gacacgtggt atcctgtctg aatatggggg gaccatcctc 420 caaggctaaa tactcctgac tgaccgatag tgaaccagta ccgtgaggga aaggcgaaaa 480 gaaccccggc gaggggagtg aaaaagaacc tgaaaccgtg tacgtacaag cagtgggagc 540 acgcttaggc gtgtgactgc gtaccttttg tataatgggt cagcgactta tattctgtag 600 caaggttaac cgaatagggg agccgaaggg aaaccgagtc ttaactgggc gttaagttgc 660 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agcttgactg cgagcgtgac ggcgcgagca ggtgcgaaag caggtcatag tgatccggtg 2400 gttctgaatg gaagggccat cgctcaacgg ataaaaggta ctccggggat aacaggctga 2460 taccgcccaa gagttcatat cgacggcggt gtttggcacc tcgatgtcgg ctcatcacat 2520 cctggggctg aagtaggtcc caagggtatg gctgttcgcc atttaaagtg gtacgcgagc 2580 tgggtttaga acgtcgtgag acagttcggt ccctatctgc cgtgggcgct ggagaactga 2640 ggggggctgc tcctagtacg agaggaccgg agtggacgca tcactggtgt tcgggttgtc 2700 atgccaatgg cactgcccgg tagctaaatg cggaagagat aagtgctgaa agcatctaag 2760 cacgaaactt gccccgagat gagttctccc tgactccttg agagtcctga aggaacgttg 2820 aagacgacga cgttgatagg ccgggtgtgt aagcgcagcg atgcgttgag ctaaccggta 2880 ctaatgaacc gtgaggctta accttacaac gccgaaggtg ttttggcgga ttgagagaag 2940 attttcagcc tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg 3000 cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc 3060 cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctcct catgcgagag tagggaactg ccaggcat   3118 <210>2 <211>20 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>2 ttcgggttgt catgccaatg                                     20 <210>3 <211>26 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>3 ctgaaagcat ctaagcgcga aacttg                                26 <210>4 <211>26 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>4 ctgaaagcat ctaagcggga aacttg                                26 <210>5 <211>26 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>5 ctgaaagcat ctaagcacga aacttg                               26 <210>6 <211>26 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>6 ctgaaagcat ctaagcagga aacttg                                26 <210>7 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>7 gggaggactc atctcgaggc aagtt                                 25 <210>8 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>8 gggaggactc atctcggggc aagtt                                 25 <210>9 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推山 <400>9 gggaggactc atctcaaggc aagtt                                 25 <210>10 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>10 gggaggactc atctcagggc aagtt                                 25 <210>11 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>11 gggaggactc atcttgaggc aagtt                                 25 <210>12 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>12 gggaggactc atcttggggc aagtt                                 25 <210>13 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>13 gggaggactc atcttaaggc aagtt                                 25 <210>14 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>14 gggaggactc atcttagggc aagtt                                 25 <210>15 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>15 gggagaactc atctcgaggc aagtt                                 25 <210>16 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>16 gggagaactc atctcggggc aagtt                                 25 <210>17 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>17 gggagaactc atctcaaggc aagtt                                 25 <210>18 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>18 gggagaactc atctcagggc aagtt                                 25 <210>19 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>19 gggagaactc atcttgaggc aagtt                                 25 <210>20 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>20 gggagaactc atcttggggc aagtt                                 25 <210>21 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>21 gggagaactc atcttaaggc aagtt                                 25 <210>22 <211>25 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>22 gggagaactc atcttagggc aagtt                                 25 <210>23 <211>18 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>23 ccgccaggca aattcggt                                        18 <210>24 <211>17 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>24 tcaggtggga ccaccgc                                       17 <210>25 <211>18 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>25 ccgccaggca aattctgt                                         18 <210>26 <211>54 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>26 ccggagtgga cgcaccactg gtgttcgggt tgtcatgcca atggcattgc ccgg     54 <210>27 <211>54 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Acinetobacter细菌属衍推出 <400>27 ccagagtgga cgaacctctg gtgtaccggt tgtgacgcca gtcgcatcgc cggg      54 <210>28 <211>54 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出 <400>28 ccggagtgaa cgaacctctg gtgttcgggt tgtcacgcca gtggcactgc ccgg      54 <210>29 <211>54 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Haemophilus细菌属衍推出 <400>29 ccggagtgga cgcatcactg gtgttccggt tgtgtcgcca gacgcattgc cggg      54 <210>30 <211>54 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Moraxella细菌属衍推出 <400>30 ccggagtgga cgcatcactg gtgttccggt tgtgtcgcca gacgcattgc cggg      54 <210>31 <211>54 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Pasteurella细菌属衍推出 <400>31 ccgggatgga cacaccgctg gtgtaccagt tgttctgcca agagcatcgc tggg      54 <210>32 <211>54 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：
 由肠道细菌属Stenotrophomonas种衍推出 <400>32 ccggagtgga cgaacctctg gtgtaccggt tgtcacgcca gtggcattgc cggg      54 <210>33 <211>54 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：
 由肠道细菌属vibrio种衍推出 <400>33 ccggagtgga cgaacctctg gtgttcgggt tgtgtcgcca gacgcattgc ccgg      54 <210>34 <211>41 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>34 gagataaccg ctgaaagcat ctaagcggga aacttgcctc g                 41 <210>35 <211>41 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Acinetobacter细菌属衍推出 <400>35 gggataaccg ctgaaagcat ctaagcggga agcctacctc a                  41 <210>36 <211>41 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出 <400>36 tcgataaccg ctgaaagcat ctaagcggga agcgagccct g                 41 <210>37 <211>41 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Haemophilus细菌属衍推出 <400>37 gagataagtg ctgaaagcat ctaagcacga aacttgccaa g                  41 <210>38 <211>42 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Moraxella细菌属衍推出 <400>38 gggataaccg ctgaaagcat ctaagcggga agcccacctt aa                 42 <210>39 <211>42 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Pasteurella细菌属衍推出 <400>39 gggataagtg ctgaaagcat ctaagcacga agcccccctc aa                 42 <210>40 <211>42 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：
 由肠道细菌属Stenotrophomonas种衍推出 <400>40 gagataaccg ctgaaagcat ctaagcggga aacttgcctt ga                 42 <210>41 <211>42 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：
 由肠道细菌属vibrio种衍推出 <400>41 tcgataaccg ctgaaagcat ctaagcggga agcgagcctt ga                 42 <210>42 <211>24 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>42 agatgagtct tccctgggcc ttta                                 24 <210>43 <211>24 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Acinetobacter细菌属衍推出 <400>43 agataagatt tccctaggac ttta                                  24 <210>44 <211>24 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出 <400>44 agatgagtca tccctgaccc cttg                                  24 <210>45 <211>21 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Haemophilus细菌属衍推出 <400>45 agatgagtca tccctgactt t                                     21 <210>46 <211>13 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Moraxella细菌属衍推出 <400>46 agataagatt tcc                                             13 <210>47 <211>21 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Pasteurella细菌属衍推出 <400>47 agatgagatt tcccattacg c                                    21 <210>48 <211>23 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：
 由肠道细菌属Stenotrophomonas种衍推出 <400>48 agatgagatt tcccggagcc ttg                                  23 <210>49 <211>24 <212>DNA <213>Vibrio alginolyticus <400>49 agatgagttc tccctgatac ttta                                  24 <210>50 <211>13 <212>DNA <213>Vibrio fisheri <400>50 agattagatt tcc                                            13 <210>51 <211>24 <212>DNA <213>Vibrio harbeyi <400>51 agatgagtct tccctgggcc ttta                                 24 <210>52 <211>24 <212>DNA <213>Vibrio parahaemolyticus <400>52 agatgagtct tccctgatac ttta                                 24 <210>53 <211>24 <212>DNA <213>Vibrio proteolyticus <400>53 agatgagtct tccctggcac ttta                                  24 <210>54 <211>32 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>54 agggtcctga agggacgttg aagactacga cg                              32 <210>55 <211>32 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Acinetobacter细菌属衍推出 <400>55 tgtcctctaa agagccgttc gagactagga cg                            32 <210>56 <211>32 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出 <400>56 tgtcctctaa agagccgttc gagactagga cg                          32 <210>57 <211>31 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Haemophilus细菌属衍推出 <400>57 aagtcagtaa gggttgttgt agactacgac g                           31 <210>58 <211>26 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Moraxella细菌属衍推出 <400>58 ctaaagagcc gttgtagacg acgacg                                 26 <210>59 <211>31 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Pasteurella细菌属衍推出 <400>59 aagtaagtaa gatccctcaa agacgatgag g                           31 <210>60 <211>32 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：
 由肠道细菌属Stenotrophomomas种衍推出 <400>60 agctccttga agggtcgttc gagaccagga cg                          32 <210>61 <211>32 <212>DNA <213>Vibrio alginolyticus <400>61 agtatcctaa agggttgtcg tagmtacgac gt                          32 <210>62 <211>27 <212>DNA <213>Vibrio fisheri <400>62 ctaaagagcc gttcaagact aggacgt                                27 <210>63 <211>33 <212>DNA <213>Vibrio harbeyi <400>63 agtatcctaa agggttgttc gagactagaa cgt                          33 <210>64 <211>33 <212>DNA <213>Vibrio parahaemolyticus <400>64 agtatcctaa agggttgttc gagactagaa cgt                         33 <210>65 <211>33 <212>DNA <213>Vibrio proteolyticus <400>65 agtgtcctga agggttgttc gagactagaa cgt                         33 <210>66 <211>40 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>66 agcgatgcgt tgagctaacc agtactaatg acccgtgagg                  40 <210>67 <211>40 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Acinetobacter细菌属衍推出 <400>67 agtgatatgt gaagctgacc aatactaatt gctcgtgagg                  40 <210>68 <211>40 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出 <400>68 ggcgacgtgt tgagctaacc catactaatt acccgtgagg                  40 <210>69 <211>40 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Haemophilus细菌属衍推出 <400>69 tgtgagtcat tgagctaacc aatactaatt gcccgagagg                  40 <210>70 <211>40 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Moraxella细菌属衍推出 <400>70 agtgatacat gtagctaacc aatactaatt gctcgtttgg                  40 <210>71 <211>47 <212>DNA <213>Pasteurella pneumotropica <400>71 tggcgacacg tgcagctgac gaatactaat cgatcgagga cttaacc           47 <210>72 <211>40 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：
 由肠道细菌属Stenotrophomonas种衍推出 <400>72 agtaatgcat taagctaacc agtactaatt gcccgtacgg                  40 <210>73 <211>40 <212>DNA <213>Vibrio alginolyticus <400>73 tgtgaggcgt tgagctaacc tgtactaatt gcccgtgagg                  40 <210>74 <211>40 <212>DNA <213>Vibrio fisheri <400>74 agtgatgcgt gtagctaacc tgtactaatt gctcgtttgg                  40 <210>75 <211>40 <212>DNA <213>Vibrio harveyi <400>75 tgtgaggcgt tgagctaacc tgtactaatt gcccgtgagg                  40 <210>76 <211>40 <212>DNA <213>Vibrio paramaemolyticus <400>76 tgtgaggcat tgagctaact gatactaatt gcccgtgagg                  40 <210>77 <211>40 <212>DNA <213>Vibrio proteolyticus <400>77 tgtgaggcgt tgagctaacc tgtactaatt gcccgtgagg                  40 <210>78 <211>30 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>78 acccgtgagg cttaacctta caacaccgaa                             30 <210>79 <211>30 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Acinetobacter细菌属衍推出 <400>79 gctcgtgagg cttgactata caacacccaa                             30 <210>80 <211>30 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出 <400>80 acccgtgagg cttaaccata caacacccaa                             30 <210>81 <211>30 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Haemophilus细菌属衍推出 <400>81 gcccgagagg cttaactata caacgctcaa                             30 <210>82 <211>30 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Moraxella细菌属衍推出 <400>82 gctcgtttgg ctt9accata caacacccaa                             30 <210>83 <211>33 <212>DNA <213>Pasteurella pneumotropica <400>83 gctgacgaat actaatcgat cgaggactta acc                         33 <210>84 <211>30 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Stenotrophomonas细菌属衍推出 <400>84 gcccgtacgg cttgtcccta taaccttggt                             30 <210>85 <211>27 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>85 caacaccgaa ggtgttttgg aggaatc                                27 <210>86 <211>27 <212>DNA <213>Acinetobacter calcoaceticus <400>86 caacacccaa gcagttgtat ataaagc                                27 <210>87 <211>27 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出 <400>87 caacacccaa gaagtgttct aaggctt                                27 <210>88 <211>27 <212>DNA <213>Haemophilus influenzae <400>88 caacgctcaa gtgtttttgg gagctaa                                27 <210>89 <211>27 <212>DNA <213>Moraxella catarrhalis <400>89 caacacccaa gtggtttacc actgact                                27 <210>90 <211>27 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：
 由肠道细菌属Stenotrophomonas种衍推出 <400>90 taaccttggt agtccaaggt cgagtac                                27 <210>91 <211>27 <212>DNA <213>Vibrio alginolyticus <400>91 caacacccaa ggggttttga tggactc                                27 <210>92 <211>27 <212>DNA <213>Vibrio fisheri <400>92 caacacccaa gtggtttgta tcaagca                                27 <210>93 <211>27 <212>DNA <213>Vibrio harveyi <400>93 caacacccaa ggggttttga tggactc                                27 <210>94 <211>27 <212>DNA <213>Vibrio paramaemolyticus <400>94 caacacccaa ggggttttga tggactc                                27 <210>95 <211>36 <212>DNA <213>Vibrio proteolyticus <400>95 caacacccaa ggggttttga tggactcaat gaaaga                      36 <210>96 <211>118 <212>DNA <213>Budvicia aquatica <400>96 caacatccga ggtgttttaa ggaaagttga agagacgaaa gaataagtag aattccagct 60 tgaaccgaga ttgagttgat ggttgtgtga atgacacgac ggtcaataga cagaatat  118 <210>97 <211>111 <212>DNA <213>Buttiauxella agrestis <400>97 caacaccgaa ggtgttttgg ttgagagact aagatattga attttcagct tgaaccgaga 60 ttttaagtcg atggttgtgt gaacagcatg acggttgatg aaacagaata t         111 <210>98 <211>193 <212>DNA <213>Enterobacter aglomerans <400>98 caacgccgaa gatgttttgg cggattgaga agattttcag cattgattac agattttcgg 60 gaacgaaaga ttttacgctg aggcaaggcg gcaaatgaag taaaggaagg agcatacatg 120 agtatgtgac tgactttgcg aatgcagcca acgcagccac agtgaaaaag attcgtttct 180 ggcaacagaa ttt                                                    193 <210>99 <211>123 <212>DNA <213>Erwinia carotovora <400>99 caacaccgaa ggtgttttga gagtgactca aagagatgtt gataatcagc ttgttttagg 60 attggttctg atggttatgc gagagcgaaa gcgaagcatg acggttggga tgaaacagaa 120 ttt                                                               123 <210>100 <211>101 <212>DNA <213>Erwinia chrysanthemi <400>100 caacaccgaa ggtgttttag agagattggt ttgaattttc agtgaagttc cgagattggt 60 tctgatggct acggagtagc ggtcgggatg aaacaaaatt t                     101 <210>101 <211>92 <212>DNA <213>Escherichia coli <400>101 caacgccgaa gctgttttgg cggatgagag aagattttca gcctgataca gattaaatca 60 gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat tt                               92 <210>102 <211>104 <212>DNA <213>Escherichia hermannii <400>102 caacgccaga gtggttttgg tgttgcggtg tgagagacga ttttcagctt gaccggatag 60 acatctgtgg cggcgcgcga gcacgcagca ggtgaacaga attt                 104 <210>103 <211>92 <212>DNA <213>Escherichia vulneris <400>103 caacgccgaa gatgttttgg cggatttgaa agacgatttt cagctgatac agattaagtc 60 tgccgcctga cggcgtcaga cagacagaat tt                               92 <210>104 <211>119 <212>DNA <213>Hafnia alvei <400>104 caacaccgaa ggtgttttaa gacgcagaga cgcgaaaaca caaagagtaa gcttgttgaa 60 cagattggtt tgtatggcta gctgtagaaa tacagaaagc ggtacaaata acagaatat  119 <210>105 <211>195 <212>DNA <213>Klebsiella oxytoca <400>105 cgccgaagat gttttggcga tttgagaaga caacaatttc agcattgatt acagattttc 60 gggaacgaaa gattttacgc tgaggcaagg cggcaaatga aggaaaggaa ggagcatact 120 gaagtatgtg actgacttta cgaatgcagc caacgcagca tcggtgtaaa agattcgttt 180 ctgacaacag aattt                                                  195 <210>106 <211>90 <212>DNA <213>Kluyvera cryoescens <400>106 cgccaaagat gttttggtga aaagagacat caataatcag cttgatacag ataaattaac 60 tggccgaaag gcgggttaat aacagaattt                                  90 <210>107 <211>105 <212>DNA <213>Morganella morganii <400>107 caccgaaggt gttttgagtt gagagacgat taaagagatt tttcagcaca gtgaagaggc 60 agaagtcatt cactgtgaaa gcttattttg gattgaaatg aattt                 105 <210>108 <211>192 <212>DNA <213>Pantoea dispersa <400>108 cgccagaggc gttttggtct gagagaccna aagaattttc agcattgttc accggattac 60 ntccagtgga ttttgtgctg tgacaaggcg gcacgcgaga cgacgggaag gagcatacac 120 gagtatgtga ctgagcggcg cgagcggggc aacgcagtca gagcgcaaaa gacgcggtnt 180 aaaacaaaat tt                                                     192 <210>109 <211>190 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Pantoea细菌属衍推出 <400>109 cgccgaagat gttttggcgg aatgagaaga ttttcagcat tgattacaga ttttcgggaa 60 cgaaagattt tacgctgagg caaggcggca aatgaagtaa aggaaggagc atacatgagt 120 atgtgactga ctttkcggat gcagccaacg cagccacagt gaaaaagatt cgtttctggc 180 aacagaattt                                                        190 <210>110 <211>111 <212>DNA <213>Proteus mirabilis <400>110 caacaccgaa agtgttttgt cagagagacg aaacgatgaa gtcagcttgt tcaanattga 60 attactggcg acttaccgaa aggaaagaag cgagtgatta aaaccgaatt t          111 <210>111 <211>139 <212>DNA <213>Proteus rettgeri <400>111 caacaccgaa ggtgttttag agagatagag ttgttttcaa gaaagagtga gaagccaaaa 60 ggtgaaggac acgcagcttg tttgagattg aggttctggt ttagtgaaga aaaaactaaa 120 cgggaacaaa acagaattt                                              139 <210>112 <211>137 <212>DNA <213>Providencia stuartii <400>112 caacaccgaa ggtgttttag agagacgaag agacgaattg ttgaagcgca cgagatagag 60 tggtgcgaaa aaatcagctt gttcaagatt gcagttctgg tttgcggtgt agacgcgaac 120 gggaacgaac cgaattt                                                137 <210>113 <211>135 <212>DNA <213>Rahnella aquatilis <400>113 caacaccgaa ggtgtttttg atttgagaga cagactcgag agagtagatt ttcagcgaat 60 tgttccggta ttggttcgta tggcggcgtg tgatgagaaa ttatgacacg acgcggtatg 120 aatgaaacag aattt                                                  135 <210>114 <211>100 <212>DNA <213>Serratia ficaria <400>114 caacaccgaa ggtgttttag agagacgaat aattttcagc gaagttctta gattggttct 60 ggtggttacg cgagtaacgg ccaagaatga aacagaattt                       100 <210>115 <211>106 <212>DNA <213>Serratia fonticola <400>115 caacacccaa ggtgttttga agagattgaa gtagattttc agcgaagttc cgagattggt 60 ttcaatggcg acacgagagt gaagcggttg aaatgaaaca gaattt                106 <210>116 <211>97 <212>DNA <213>Serratia marcescens <400>116 caacaccgaa ggtgttttta gagagatttt cagcgaagtt ccgagattgg ttctgatggc 60 gacacgaaag tgaagcggtt ggaatgaaac agaattt                          97 <210>117 <211>99 <212>DNA <213>Serratia plynuthica <400>117 caacaccgaa ggtgttttag agagattaca gtagattttc agcgacgttc cgagattggt 60 ttcaatggcc caaaaggcgg ttggaatgaa acagaattt                        99 <210>118 <211>100 <212>DNA <213>Serratia proteamaculans <400>118 caacaccaaa ggtgttttag agagattgta gagattttca gcgagttccg agattggttt 60 caatggctgc gagagtagcg gttggaatga aacanaattt                       100 <210>119 <211>101 <212>DNA <213>Serratia rubidea <400>119 caacaccgaa ggtgttttag agagattggt ttgaattttc agtgaagttc cgagattggt 60 tctgatggct acggagtagc ggtcgggatg aaacagaatt t                    101 <210>120 <211>116 <212>DNA <213>Yersinia enterolytica <400>120 caacaccaaa ggtgttttgt atttgagaga tagatattga ttttcagcga atgttccgag 60 attgggctgg ctggctgtgt gaaagattgc atagcgggtt agtttagaca gaattt    116 <210>121 <211>104 <212>DNA <213>Yersinia pseudotuberculosis <400>121 caacaccgaa gtcttgaatt gagagagatt ttcagcgtcg ttccgagatt ggattgactg 60 gcgtcacaag cgctgtttgt gtgcgggtta attaaaacag attt                 104 <210>122 <211>179 <212>DNA <213>Acinetobacter calcoaceticus <400>122 caacacccaa gcagttgtat ataaagcatc aatcgattca ttaatatgca aagcaacttg 60 atttagttat acgcttagct aaaatgaaca aaatatagta agactcaatc agcccatctg 120 taaagatttg gaaaacgcat cggcaaccaa taagaccaat gcaagtatcc ataccagtt  179 <210>123 <211>118 <212>DNA <213>Aeromonas enteropelogenes <400>123 caacacccaa gaagtgtttn tggtgcttgt agcgaatgaa cgaactacgc attcagtgat 60 aacgacaagc cacgagcaac atcgttattc acgtcagctt tccaagattg aagatttt   118 <210>124 <211>81 <212>DNA <213>Aeromonas hydrophila <400>124 caacacccaa gaagtgttct aaggcttgta gcagataccg agaacgaaca acaaaatcag 60 ctttctcaga ttgaagaatt t                                           81 <210>125 <211>96 <212>DNA <213>Cedecea davisae <400>125 caacaccaaa ggtgttttgc gagacgcaat tttaattttc agcgaagttc aggattagac 60 tgatggtcac aaagtgacgg tcagtaaaca gaattt                           96 <210>126 <211>217 <212>DNA <213>Haemophilus influenzae <400>126 caacgctcaa gtgtttttgg gagctaagtg aagtaagaga tgaaaagcga agcaaataaa 60 agcagagcga aagagaagta aaagactaaa caaagaaaag taaatataga agacttaata 120 gaaagaaaat cggattcagc ttgtgaccaa taagaacgag tgaaaggtag aggaaagact 180 gagtaacgag agataaaaga gacgagagat aaaagag                          217 <210>127 <211>90 <212>DNA <213>Moraxella catarrhalis <400>127 caacacccaa gtggtttacc actgactgtg ttgattggta atatataaga tgaaccttaa 60 tcttgatttg gtaataaaca gactcataca                                  90 <210>128 <211>134 <212>DNA <213>Pasteurella pneumotropica <400>128 cgaggactta accaaatttg tttatcgtaa caatgtcgtt tatccagttt tgaaagaata 60 aatttttatt aaataactct tgcattattc tacagagttg ttataataaa acatgtcctt 120 caaaagtatt caag                                                   134 <210>129 <211>141 <212>DNA <213>Stenotrophomonas multophila <400>129 taaccttggt agtccaaggt cgagtacaac tgctcgatac aaaagctaca acccnactta 60 cttcttccag attcatggcc acgctgaaca aagcgtaggg tgggcggctg tnccgcccac 120 gcgtaactca agcgtagcca g                                           141 <210>130 <211>100 <212>DNA <213>Vibrio alginolyticus <400>130 caacacccaa ggggttttga tggactcaat gaaagaacat tgaatgtgta agaacgagaa 60 ttaaaaaaca gctttccaga ttaaagaatt tgcttggcga                      100 <210>131 <211>122 <212>DNA <213>Vibrio fisheri <400>131 caacacccaa gtggtttgta tcaagcatta tatcgatatc accgttatcc ttgattcagt 60 taggataagt gatacttaag tcattaagta aaacaaacac agactcatat ctaaccccct 120 tt                                                                122 <210>132 <211>122 <212>DNA <213>Vibrio harveyi <400>132 caacacccaa gtggtttgta tcaagcatta tatcgatatc accgttatcc ttgattcagt 60 taggataagt gatacttaag tcattaagta aaacaaacac agactcatat ctaaccccct 120 tt                                                                122 <210>133 <211>89 <212>DNA <213>Vibrio paramaemolyticus <400>133 caacacccaa ggggttttga tggactcgaa gcaagaacag aattgaatgt gtagagaaca 60 caaaaacagc tttccgaatt aaagaattt                                   89 <210>134 <211>169 <212>DNA <213>Vibrio proteolyticus <400>134 caacacccaa ggggttttga tggactcaat gaaagaacat tgaatgtgta agaacgagaa 60 ttaaaaaaca gctttccgaa tttaggaatt gaatttatta acgacatcca tgtcgttaac 120 ccttcgggcc gcactgaagt gcgttaaatt ttgttccaga caaaatttt             169 <210>135 <211>33 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属衍推出 <400>135 gcctggcggc actagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>136 <211>33 <212>DNA <213>Buttiauxella agrestis <400>136 gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>137 <211>33 <212>DNA <213>Enterobacter agglomerans <400>137 gcctggcggc tttagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>138 <211>33 <212>DNA <213>Erwinia carotovora <400>138 gcctggcggc gatagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>139 <211>33 <212>DNA <213>Erwinia chrysanthemi <400>139 gcctggcggc ggtagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>140 <211>33 <212>DNA <213>Escherichia coli <400>140 gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>141 <211>33 <212>DNA <213>Escherichia hermannii <400>141 gcctggcggc aagagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>142 <211>33 <212>DNA <213>Escherichia vulneris <400>142 gcctggcggc actagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>143 <211>33 <212>DNA <213>Hafnia alvei <400>143 gcctggcggc gatagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>144 <211>32 <212>DNA <213>Klebsiella oxytoca <400>144 gcctggcggc actagcgcgg tggtccacct ga                          32 <210>145 <211>33 <212>DNA <213>Kluyvera cryoescens <400>145 gcctggcggc aacagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>146 <211>33 <212>DNA <213>Morganella morganii <400>146 gcctggcggc cgtagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>147 <211>31 <212>DNA <213>Pantoea dispersa <400>147 gcctggcggc aacagccgcg gtggtcccac c                           31 <210>148 <211>33 <212>DNA <213>Proteus mirabilis <400>148 gcttggtggc catagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>149 <211>33 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Proteus，Providencia细菌属衍推出 <400>149 gtctggcggc aatagcacgg tggtcccacc tga                         33 <210>150 <211>33 <212>DNA <213>Rahnella aquatilis <400>150 gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>151 <211>33 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Serratia细菌属衍推出 <400>151 gcctggcggc aatagcgcgg tggtcccacc tga                         33 <210>152 <211>33 <212>DNA <213>Yersinia enterolytica <400>152 gcctggcggc catagcgcgg tggacccacc tga                         33 <210>153 <211>33 <212>DNA <213>Yersinia pseudotuberculosis <400>153 gtctggcggc catagcgcgg tggtcycacc tga                         33 <210>154 <211>51 <212>DNA <213>Acinetobacter calcoaceticus <400>154 aagtatccat accagttgtg ctggcgacca tagcaagagt gaaccacctg a        51 <210>155 <211>33 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Aeromonas细菌属衍推出 <400>155 gcctggcggc catagcgccg tggaaccacc tga                         33 <210>156 <211>51 <212>DNA <213>Haemophilus influenzae <400>156 aaaagacgag ttatcaaaga attatcctgg cggcgatagt gcggtggacc c     51 <210>157 <211>54 <212>DNA <213>Moraxella catarrhalis <400>157 acagcgttgt taatcctttt acgctgacga caatagcaag atggaaccac ctga   54 <210>158 <211>43 <212>DNA <213>Pasteurella pneumotropica <400>158 tctagtgatg atggcgaaga ggtcacaccc gttcccatac cga                   43 <210>159 <211>54 <212>DNA <213>Stenotrophomonas multophila <400>159 acaagtcaaa gcctgatgac catagcaagt cggtcccacc ccttcccatc ccga       54 <210>160 <211>33 <212>DNA <213>Vibrio alginolyticus <400>160 gcttggcgac catagcgttt tggacccacc tga                           33 <210>161 <211>51 <212>DNA <213>Vibrio fisheri <400>161 ctcatatcta accccctttg ctgacgacaa tagcacgatg gcaccacctg a       51 <210>162 <211>45 <212>DNA <213>Vibrio harveyi <400>162 gcttggcgac catagcgatt tggacccacc tgacttccat tccga              45 <210>163 <211>33 <212>DNA <213>Vibrio proteolyticus <400>163 gcttggcgac catagcgttt tggacccacc tga                         33 <210>164 <211>37 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Rahnella，Serratia，
 Yersinia细菌属衍推出 <400>164 agattttcag cgaagttccg agattggttt caatggc                     37 <210>165 <211>18 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属，Escherichia，
 Klebsiella，Pantoea衍推出 <400>165 ggaaggagca taciiiagtat                                     18 <210>166 <211>32 <212>DNA <213>Budvicia aquatica <400>166 aggtccctga aggaacgttt gagactaaga cg                         32 <210>167 <211>32 <212>DNA <213>Buttiauxella agrestis <400>167 agggtcctga aggaacgttg aagactacga cg                          32 <210>168 <211>32 <212>DNA <213>Enterobacter agglomerans <400>168 aggacactaa aggaacgttg aagacgacga cg                          32 <210>169 <211>32 <212>DNA <213>Erwinia carotovora <400>169 atgcccctga agggccgttg aagactacga cg                          32 <210>170 <211>32 <212>DNA <213>Erwinia chrysanthemi <400>170 aggcccctga agggacgttt aagacgaaga cg                          32 <210>171 <211>29 <212>DNA <213>Escherichia coli <400>171 agggtcctga aggaacgttg aagacgacg                              29 <210>172 <211>32 <212>DNA <213>Escherichia hermannii <400>172 agagtcctga aggaacgttg aagacgacga cg                          32 <210>173 <211>32 <212>DNA <213>Escherichia vulneris <400>173 agtctcctga aggaacgttg aagacgacga cg                          32 <210>174 <211>32 <212>DNA <213>Hafnia alvei <400>174 agtctcctaa aggaacgttt aagactaaga cg                          32 <210>175 <211>32 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Klebsiella，Kuyvera细菌属衍推山 <400>175 agggtcctga aggaacgttg aagacgacga cg                          32 <210>176 <211>32 <212>DNA <213>Morganella morganii <400>176 agggtcctga aggaacgttt gagactaaga cg                          32 <210>177 <211>32 <212>DNA <213>Pantoea dispersa <400>177 agggtcctga agggacgctg aagacgacga cg                          32 <210>178 <211>32 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Pantoea细菌属衍推出 <400>178 aggacactaa aggaacgtta aagacgatga cg                          32 <210>179 <211>32 <212>DNA <213>Proteus mirabilis <400>179 agtgacctaa aggaacgttt aagactaaga cg                          32 <210>180 <211>32 <212>DNA <213>Proteus rettgeri <400>180 agggtcctaa aggaacgttt aagactaaga cg                          32 <210>181 <211>32 <212>DNA <213>Providencia stuartii <400>181 agggtcctaa aggaacgttt aagacgaaga cg                          32 <210>182 <211>32 <212>DNA <213>Rahnella aquatilis <400>182 agccacctga agggacgttt aagactaaga cg                          32 <210>183 <211>32 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Serratia细菌属衍推出 <400>183 aggcccctga aggaacgttt aagactaaga cg                          32 <210>184 <211>32 <212>DNA <213>Yersinia enterolytica <400>184 agccccctga aggaacgtta aagactatga cg                          32 <210>185 <211>32 <212>DNA <213>Yersinia pseudotuberculosis <400>185 agccccctga gggaacgtta aagactatga cg                          32 <210>186 <211>32 <212>DNA <213>Cedecea davisae <400>186 agacccctga agggacgttg aagactacga cg                          32 <210>187 <211>24 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Buttiauxella，Escherichia，
 Klebsiella，Kluyvera，Pantoea细菌属衍推出 <400>187 agatgagttc tccctgaccc ttta                                  24 <210>188 <211>24 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由肠道细菌属和Pantoea细菌属衍推出 <400>188 agatgagttc tcccttgtcc ttta                                  24 <210>189 <211>24 <212>DNA <213>Erwinia carotovora <400>189 agatgagtct tccctgggca ccag                                  24 <210>190 <211>24 <212>DNA <213>Erwinia chrysanthemi <400>190 agatgagtct tccctgggcc cttg                                 24 <210>191 <211>24 <212>DNA <213>Escherichia hermannii <400>191 agatgagttc tccctgactc cttg                                 24 <210>192 <211>24 <212>DNA <213>Escherichia vulneris <400>192 agatgagttc tccctgagac ttta                                 24 <210>193 <211>24 <212>DNA <213>Hafnia alvei <400>193 agatgaqtct tccctgagac cttg                                  24 <210>194 <211>24 <212>DNA <213>Morganella morganii <400>194 agatgagtct tccctgaccc ttta                                  24 <210>195 <211>24 <212>DNA <213>Proteus mirabilis <400>195 agatgagtct tccctgtcac ttta                                  24 <210>196 <211>24 <212>DNA <213>Proteus rettgeri <400>196 agatgagtct tccctgaccc ttta                                  24 <210>197 <211>24 <212>DNA <213>Providencia stuartii <400>197 agatgagtct tccctgactc ttta                                  24 <210>198 <211>24 <212>DNA <213>Rahnella aquatilis <400>198 agatgagtct tccctgtggc ttta                                  24 <210>199 <211>24 <212>DNA <213>Yersinia enterolytica <400>199 agatgagtct tccctggggc ttta                                  24 <210>200 <211>24 <212>DNA <213>Yersinia pseudotuberculosis <400>200 agatgagtct tccctggggc ttaa                                   24 <210>201 <211>24 <212>DNA <213>Cedecea davisae <400>201 agatgaattc tccctgggtc cttg                                   24 <210>202 <211>199 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Citrobacter细菌属衍推出 <400>202 caacgccgaa gatgttttgg cggaattgag aagattttca gcattgattc agagtccgaa 60 ggattttgcg ctgagacaag gcggcawccc caccacggaa ggagcataca aaagtatgtg 120 actgaggttc gcaagcgcag ccaacgcagt atcagcacaa aagacacagg acagagcaca 180 aagaatttct ggcggccgt                                              199 <210>203 <211>199 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Citrobacter细菌属衍推山 <400>203 caacgccgaa gatgttttgg cggattgaga agattttcag tattgattac agattttgcg 60 aaaacgaaag attttacgct gaggcaaggc ggcaagtgaa gcgacggaag kggcatacaa 120 aagtatgtga ctgaggttcg caggcgcagc caacgcagca tcagtggaaa agattcgttt 180 taagagcaca aagaatttc                                              199 <210>204 <211>199 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出 <400>204 caacsccsaa gatgttttgg csgatsagag argattttca gcactgattc ckgattttcg 60 vgaacgaaag attttacgct gaggcaaggc rgcaavcgaa ggaaaggaag gagcatactg 120 aagtatgtga ctgactttac gagcgcagcc aacgctagca tcsgtgtaaa agattcgttt 180 ctggcaacag aatttcctg                                              199 <210>205 <211>201 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出 <400>205 caacgccgaa gctgttttgg cggatranaa sacgaacaat tttcagcact gattcagagt 60 tgagtacgca ataatttgcg cagcagcaag gcggcaagcg aaggaaagga aggagcatac 120 agaagtatgt gactgacttt acgagcgcag ccaacgccgc tgatgcgata aagaattgcg 180 tacagagcac aaaagaatat t                                           201 <210>206 <211>193 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出 <400>206 caacgccgaa gatgttttgg csgttgagaa gacgattttc agcagtgatt ccgrgttgag 60 trcgcmrtaa tttkcgcmgc wgcarggcgg cargcgaagg arrggaggga gcatccwgaa 120 gtatktgact gagttttcgr gcgcwggcam cgccgctgat gcgataaaga attgcgtach 180 gmgcacamag aat                                                    193 <210>207 <211>199 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出 <400>207 caacgccgaa gatgttttgg cggattgaga gacgattttc agcactgatt ccggattttc 60 gggaacgaaa gattttacgc tgaggcaagg cggcaaatgr aggaaaggaa ggagcatact 120 gaagtatgtg actgactttt cgaatgcagc cgacgcagca tcggtgtaaa agattcgttt 180 ccggcaacag aattgtcct                                              199 <210>208 <211>189 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出 <400>208 caacgccgaa gatgttttgg cggatgagag acgattttca gcactgattc agagttgagt 60 acgcaataat ttgcgcagca gcaaggcggc aagcgaagga aaggaaggag catacagaag 120 tatgtgactg agtttacgag cgcaggcaac gccgctgatg cgataaagaa ttgcgtactg 180 agcataaaa                                                         189 <210>209 <211>196 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推山 <400>209 caacgccgaa gatgttttgg cggattgaga agacaacaat tttcagcyca gattcagagt 60 ccgaaggatt ttacgctgag acaaggcggc aaacgcagcs mcsgaaggas cmycacagaa 120 gtatgtgact gacgctcgca agagcagcca acgccgtatc agtgtaaaag acacaggacg 180 grgcacaaag aaattt                                                 196 <210>210 <211>77 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Salmonella细菌属衍推出 <400>210 gagagacgat tttcagcact gattccggat tttcgggaac gaaagataaa agattcgttt 60 ccggcaacag aatttcc                                                77 <210>211 <211>24 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Eubakterien细菌属衍推出 <400>211 ggtacgcgag ctgggtttag aacg                                  24 <210>212 <211>19 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Eubakterien细菌属衍推出 <400>212 gbgagagtag gdmayygcc                                      19 <210>213 <211>54 <212>DNA <213>Pseudomonas stutzeri <400>213 ccggagtgga cgaacctctg gtgttccggt tgtcacgcca gtggcattgc cggg      54 <210>214 <211>53 <212>DNA <213>Thiobacilluc ferrooxidans <400>214 ccggagtgga cgtactctgg tgttccggtt gttctgccaa gggcattgcc ggg       53 <210>215 <211>54 <212>DNA <213>Agrobacterium vitis <400>215 ccgggatgga catatctctg gtggacctgt tgtcgtgcca acggcatagc aggg     54 <210>216 <211>54 <212>DNA <213>Adalia bipunctata <400>216 ccgaggtgga cgtacctctg gtggaccagt tgtcatgcca atggcacagc tggg     54 <210>217 <211>54 <212>DNA <213>Amycolatopsis orientalis <400>217 ccgggacgga cgaacctctg gtgtgccagt tgtcctgcca agggcatggc tggt     54 <210>218 <211>54 <212>DNA <213>Brucella ovis <400>218 ccgggatgga cgtatctntg gtggacctgt tgtggcgcca gccgcatagc aggg      54 <210>219 <211>54 <212>DNA <213>Bradyrhizobium japonicum <400>219 ccggggtgaa cgtacctctg gtggagctgt tgtcgcgcca gcggcagtgc agca      54 <210>220 <211>54 <212>DNA <213>Pseudomonas paucimobilis <400>220 ccgggatgga cgcaccgctg gtgtaccagt tgttctgcca agggcatcgc tggg      54 <210>221 <211>54 <212>DNA <213>Rhodobacter sphaeroides <400>221 ccgggatgga cgcaccgctg gtgtaccagt tgttctgcca agggcatcgc tggg      54 <210>222 <211>57 <212>DNA <213>Rickettsia prowazekii <400>222 ccgaggtgga cgtacccctg gtggaccagt tgtcgtgcca acggcaagct gggtagc   57 <210>223 <211>54 <212>DNA <213>Sphingomonas paucimobilis <400>223 ccggagtgga cgaacctctg gtgtaccggt tgtcacgcca gtggcattgc cggg      54 <210>224 <211>54 <212>DNA <213>Zymomonas mobilis <400>224 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<212>DNA <213>Zymomonas mobilis <400>300 agataagata tctc                                            14 <210>301 <211>24 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Alcaligenes细菌属衍推出 <400>301 agataagatt tccctaggac ttta                                  24 <210>302 <211>23 <212>DNA <213>Pseudomonas cepacia <400>302 agatgagatt tccatacacc ttg                                   23 <210>303 <211>24 <212>DNA <213>Ralstonia pickettii <400>303 agatgagatc tcactggaac cttg                                  24 <210>304 <211>24 <212>DNA <213>Campylobacter jejuni <400>304 agatgaatct tctctaagct ctct                                  24 <210>305 <211>13 <212>DNA <213>Helicobacter pylori <400>305 gataaacttt ccc                                              13 <210>306 <211>23 <212>DNA <213>Actinoplanes utahensis <400>306 agatgaggta tcccaccacc ttg                                   23 <210>307 <211>22 <212>DNA <213>Bacillus halodurans <400>307 agatgagatt tcccatggag ta                                    22 <210>308 <211>22 <212>DNA <213>Ciostridium tyrobutyricum <400>308 agattagatt tcccacagcg ta                                   22 <210>309 <211>23 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Frankia细菌属衍推出 <400>309 agatgaggtc tcccacaggg tag                                  23 <210>310 <211>23 <212>DNA <213>Microbispora bispora <400>310 agatgaggtc tccctccggg tta                                  23 <210>311 <211>22 <212>DNA <213>Mycobacterium leprae <400>311 agatcaggtt tcttacccac tt                                   22 <210>312 <211>22 <212>DNA <213>Mycobacterium smegmatis <400>312 agaccaggct tctcaccctc ta                                   22 <210>313 <211>22 <212>DNA <213>Mycobacterium tuberculosis <400>313 agatcaggtt tctcacccac tt                                   22 <210>314 <211>30 <212>DNA <213>Mycobacterium gallisepticum <400>314 agaataatct tcccttccag caatggagta                           30 <210>315 <211>21 <212>DNA <213>Propionibacterium freudenreichii <400>315 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<213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Synechocystis细菌属衍推出 <400>323 gatgagtact ctcatggtgt t                                   21 <210>324 <211>16 <212>DNA <213>Borrelia burgdorferi <400>324 agatgagata tccttt                                         16 <210>325 <211>14 <212>DNA <213>Chlamydia trachomatis <400>325 agataaggta tccc                                           14 <210>326 <211>32 <212>DNA <213>Pseudomonas stutzeri <400>326 agctccctga agggccgtcg aagactacga cg                          32 <210>327 <211>32 <212>DNA <213>Thiobacillus ferrooxidans <400>327 agccccctga agggacgtgg aagactacca cg                          32 <210>328 <211>22 <212>DNA <213>Agrobacterium vitis <400>328 agagccgtgg aagacgacca cg                                     22 <210>329 <211>22 <212>DNA <213>Adalia bipunctata <400>329 agagccgtgg aagaccacca cg                                     22 <210>330 <211>30 <212>DNA <213>Amycolatopsis orientalis <400>330 aggggttaag gctcccagta gacgactggg                             30 <210>331 <211>22 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Brucella，Bradyrhizobium细菌属衍推出 <400>331 agagccgtgg aagaccacca cg                                   22 <210>332 <211>30 <212>DNA <213>Pseudomonas paucimobilis <400>332 aggaagtaag atccctgaaa gatgatcagg                           30 <210>333 <211>22 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Rhodobacter，Rickettsia细菌属衍推出 <400>333 agggccgtgg aagaccacca cg                                   22 <210>334 <211>26 <212>DNA <213>Sphingomonas paucimobilis <400>334 agctccttga agggtcgttc gagacc                               26 <210>335 <211>22 <212>DNA <213>Zymomonas mobilis <400>335 agagccgtcg aagactacga cg                                    22 <210>336 <211>26 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Alcaligenes细菌属衍推出 <400>336 tgtcctctaa agagccgttc gagact                                 26 <210>337 <211>25 <212>DNA <213>Pseudomonas cepacia <400>337 tgtgtgagag gcccccagcc agacc                                  25 <210>338 <211>26 <212>DNA <213>Ralstonia pickettii <400>338 agttccctga agggccgtcg aagact                                 26 <210>339 <211>14 <212>DNA <213>Campylobacter jejuni <400>339 agaagactac tagt                                              14 <210>340 <211>25 <212>DNA <213>Helicobacter pylori <400>340 tgaagctcgc acaaagacta tgtgc                                 25 <210>341 <211>28 <212>DNA <213>Actinoplanes utahensis <400>341 agtgggtaag gctcccagct agactact                              28 <210>342 <211>31 <212>DNA <213>Bacillus halodurans <400>342 aatccagtaa gaccccttag agatgatgag g                          31 <210>343 <211>30 <212>DNA <213>Bacillus subtilis <400>343 aggaagtaag atccctgaaa gatgatcagg                            30 <210>344 <211>32 <212>DNA <213>Clostridium tyrobutyricum <400>344 agctggtaag gccccttgaa gaacacaagg tg                         32 <210>345 <211>30 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Frankia细菌属衍推出 <400>345 cctggtaagg cccccgacta gatgatcggg                            30 <210>346 <211>30 <212>DNA <213>Microbispora bispora <400>346 accgggtaag gctcccagta gatgactggg                            30 <210>347 <211>31 <212>DNA <213>Mycobacterium leprae <400>347 ggtgggataa ggccccccgc agaacacggg a                          31 <210>348 <211>31 <212>DNA <213>Mycobacterium smegmatis <400>348 ggagggataa ggccccccgc agaccacggg a                          31 <210>349 <211>31 <212>DNA <213>Mycobacterium tuberculosis <400>349 ggtgggataa ggccccccgc agaacacggg t                          31 <210>350 <211>30 <212>DNA <213>Propionibacterium freudenreichii <400>350 aatgtggtaa ggcccccggt agaccaccgg                            30 <210>351 <211>31 <212>DNA <213>Rhodococcus erythropolis <400>351 gagggggtaa ggcccccggc agaccaccgg g                          31 <210>352 <211>29 <212>DNA <213>Staphylococcus aureus <400>352 ggttataaga tccctcaaag atgatgagg                             29 <210>353 <211>31 <212>DNA <213>Streptococcus faecalis <400>353 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cagtaatggg tgtagggaac tggtgctaac cggccgaaaa c                 41 <210>384 <211>86 <212>DNA <213>Mycobacterium gallisepticum <400>384 agaatcgttg tagactacga cgttgatagg ctaaaggtgt aagtgccgcg aggtatttag 60 ctgattagta ctaataattc gaggac                                86 <210>385 <211>27 <212>DNA <213>Propionibacterium freudenreichii <400>385 gctgaccgat actaagtggc cgagggc                               27 <210>386 <211>41 <212>DNA <213>Rhodococcus erythropolis <400>386 cagtaatgca tgcaggtgac tggtactaat aggccgagga c                41 <210>387 <211>41 <212>DNA <213>Rhodococcus fascians <400>387 cagcaatgta tgcaggtgac tggtactaat aggccgagga c                41 <210>388 <211>27 <212>DNA <213>Staphylococcus aureus <400>388 gctgacgaat actaatcgat cgagggc                                27 <210>389 <211>27 <212>DNA <213>Streptococcus faecalis <400>389 gcggaccaat actaatcggt cgaggac                                27 <210>390 <211>51 <212>DNA <213>Streptomyces ambifaciens <400>390 ccgcaaggtg tggaggtgac cggtactaat aggccgaggg cttgtcctca t     51 <210>391 <211>51 <212>DNA <213>Streptomyces galbus <400>391 cggtaacgtg tggaggtgac cggtactaat aggccgaggg cttgtcctca g     51 <210>392 <211>51 <212>DNA <213>Streptomyces griseus <400>392 cggtaacggg tggagctgac tggtactaat aggccgaggg cttgtcctca g     51 <210>393 <211>51 <212>DNA <213>Streptomyces lividans <400>393 ccgtgaggtg tggaggtgac cggtactaat aggccgaggg cttgtcctca g     51 <210>394 <211>51 <212>DNA <213>Streptomyces mashuensis <400>394 cggtaacggt tggagctgac tggtactaat aggccgaggg cttgtccata g     51 <210>395 <211>28 <212>DNA <213>Flavobacterium resinovorum <400>395 gctaaccagt actaattgcc cgtaaggc                               28 <210>396 <211>28 <212>DNA <213>Sphingobacterium multivorans <400>396 gccaagtggt actaatagcc cgaagctt                               28 <210>397 <211>27 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Synechococcus细菌属衍推出 <400>397 gctgaggcgt actaatagac cgagggc                                27 <210>398 <211>27 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Synechocystis细菌属的种衍推山 <400>398 gtcgaggagt actaatagac cgagggc                                27 <210>399 <211>27 <212>DNA <213>Borrelia burgdorferi <400>399 gctgactaat actaattacc cgtatct                                27 <210>400 <211>28 <212>DNA <213>Chlamyia trachomatis <400>400 gctaaccaat actaataagt ccaaagac                               28 <210>401 <211>36 <212>DNA <213>Salmonella typhi <400>401 cttaacctta caacgccgaa gatgttttgg cggatg                      36 <210>402 <211>35 <212>DNA <213>Buchnera aphidocola <400>402 cttaacctta caacaccaga ggtgtttttt ataaa                       35 <210>403 <211>35 <212>DNA <213>Pseudomonas stutzeri <400>403 cttgaccata taacacccaa acaatttgat gtttg                       35 <210>404 <211>35 <212>DNA <213>Thiobacillus ferrooxidans <400>404 cttgaccata tatcaccaag cattaaagag cttcc                       35 <210>405 <211>35 <212>DNA <213>Sphingomonas paucimobilis <400>405 cttgtcccta taaccttggt agtccaaggt cgagt                       35 <210>406 <211>35 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Alcaligenes细菌属的种衍推出 <400>406 cttgactata caacacccaa gcagttgtat ataaa                       35 <210>407 <211>23 <212>DNA <213>Pseudomonas cepacia <400>407 aggactaacg actcgtgaag ctg                                    23 <210>408 <211>29 <212>DNA <213>Ralstonia pickettii <400>408 cttgaccata taacacccaa gcaatttga                              29 <210>409 <211>35 <212>DNA <213>campylobacter jejuni <400>409 cttatcttta ataaagcatc acttccttgt taagg                       35 <210>410 <211>35 <212>DNA <213>Helicobacter pylori <400>410 cttgtttttt gctttttgat aagataacgg caata                       35 <210>411 <211>33 <212>DNA <213>Actinoplanes utahensis <400>411 cggtaacgtg ttgagttgac cggtactaat agg                         33 <210>412 <211>35 <212>DNA <213>Bacillus halodurans <400>412 ttatccaaaa acaaatcaaa agcaacgtct cgaac                       35 <210>413 <211>21 <212>DNA <213>Bacillus subtilis <400>413 ttaaccacat tttgaatgat g                                      21 <210>414 <211>32 <212>DNA <213>Clostridium tyrobutyricum <400>414 ttgaccaaat ttatcttact gtgcaatttt ca                          32 <210>415 <211>56 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Frankia细菌属的种衍推出 <400>415 cggtgacgca tggagctgac cggtactaat aggccgaggg cttgtcttcg aaggtg    56 <210>416 <211>56 <212>DNA <213>Microbispora bispora <400>416 cggtaacgtg tggagccgac cggtactaat aagccgagag gcttgacttc acatgc    56 <210>417 <211>56 <212>DNA <213>Mycobacterium leprae <400>417 cagtaatgag tgtagggaac tggcactaac tggccgaaag cttacaaaac acacac    56 <210>418 <211>56 <212>DNA <213>Mycobacterium smegmatis <400>418 tagtaatagg tgcagggaac tggcactaac cggccgaaaa cttacaacac cccata    56 <210>419 <211>56 <212>DNA <213>Mycobacterium tuberculosis <400>419 cagtaatggg tgtagggaac tggtgctaac cggccgaaaa cttacaacac cctccc    56 <210>420 <211>39 <212>DNA <213>Mycobacterium gallisepticum <400>420 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<213>Flavobacterium resinovorum <400>428 cttgatccta taaccagtgt gttttgcctg gtgggtgatc gcg                  43 <210>429 <211>28 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Synechococcus细菌属的种衍推出 <400>429 ttgacctcta acactttgat atcggcac                              28 <210>430 <211>28 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Synechocystis细菌属的种衍推出 <400>430 ttgaccttta ttcttcattt ttctttct                                 28 <210>431 <211>34 <212>DNA <213>Chlamyia trachomatis <400>431 cttggtcttt ttatgattgg aagagccgaa aggc                          34 <210>432 <211>51 <212>DNA <213>Salmonella typhi <400>432 cttaacctta caacaccgaa ggtgttttgg aggataaaag aaacagaatt t       51 <210>433 <211>117 <212>DNA <213>Buchnera aphidocola <400>433 cttaacctta caacaccaga ggtgtttttt ataaaaaata aaaaatcttg ttttactgaa 60 tttattgttg tattaatata tatatattat aatagcacta aaaaatgcct ggtaaaa   117 <210>434 <211>233 <212>DNA <213>Pseudomonas stutzeri <400>434 cttgaccata taacacccaa acaatttgat gtttgcgtgt cagacggttg aagtcgacaa 60 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<213>Bacillus halodurans <400>450 cttaaccaca ttttgaatga tgtcacacct gttatctagt tttgagagaa cacctctcta 60 aaggcggaag gtaaggaaac tccgctaagg gctctcacat cctgtgagaa acgcccagta 120 cc                                                                122 <210>451 <211>209 <212>DNA <213>Clostridium tyrobutyricum <400>451 cttgaccaaa tttatcttac tgtgcaattt tcagagaata attattctct tatctccatt 60 agaaatataa tgtttctatt ttattataga gaataaagta agtaaattga taataaccat 120 tagtacaagg aagatatgag cgaagagcgg aatttactta ggtaaatgag cactggagtg 180 aataattctg acggtgtaat gagaagtta                                   209 <210>452 <211>100 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Frankia细菌属的种衍推出 <400>452 cggtgacgca tggagctgac cggtactaat aggccgaggg cttgtcttcg aaggtgctac 60 gcgtccactg tgcggttctc gggtgtacgg ccggttcggc                       100 <210>453 <211>85 <212>DNA <213>Microbispora bispora <400>453 cggtaacgtg tggagccgac cggtactaat aagccgagag gcttgacttc acatgcacgc 60 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<213>Staphylococcus aureus <400>461 cttaaccaaa ataaatgttt tgcgaagcaa aatcactttt acttactatc tagttttgaa 60 tgta                                                              64 <210>462 <211>87 <212>DNA <213>Streptococcus faecalis <400>462 cttaaccaaa gaatggataa gtaaaagcaa cttggttatt ttgattcaaa cttcaatcca 60 gttttgagtg aatnaagatt cnctcaa                                     87 <210>463 <211>123 <212>DNA <213>Streptomyces ambifaciens <400>463 ccgcaaggtg tggaggtgac cggtactaat aggccgaggg cttgtcctca tttgctcgcg 60 tccactgtgt tggttctgaa accacgaaca accccatgtg ccacacatgg tgcggttgtc 120 agt                                                               123 <210>464 <211>134 <212>DNA <213>Streptomyces galbus <400>464 cggtaacgtg tggaggtgac cggtactaat aggccgaggg cttgtcctca gttgctcgcg 60 tccactgtgt tggttctgaa accacgaaca gccccatgct ctggcatggt gcggcattgt 120 tcgacagttt cata                                                   134 <210>465 <211>143 <212>DNA <213>Streptomyces griseus <400>465 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<213>Sphingobacterium multivorans <400>469 ctttctcaag cagataacac tgttgtcttc ctctttaatt tttagaaacg aaaagaataa 60 caaaaaagaa acgaagctct ttcaatagat atgtcagttg gcctgacgat gatatattat 120 cataag                                                            126 <210>470 <211>63 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Synechococcus细菌属的种衍推出 <400>470 cttgacctct aacactttga tatcggcact ctcctctatg cagccttcaa ggctctaatc 60 tcc                                                               63 <210>471 <211>67 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Synechocystis细菌属的种衍推出 <400>471 cttgaccttt attcttcatt tttctttctc ttttcttgtg cagtcttctg ggtttcttct 60 cagcaaa                                                           67 <210>472 <211>17 <212>DNA <213>Borrelia burgdorferi <400>472 ctttggccat atttttg                                               17 <210>473 <211>111 <212>DNA <213>Chlamydia trachomatis <400>473 cttggtcttt ttatgattgg aagagccgaa aggcaaagac aataagaaaa agagtagaga 60 gtgcaagtac gtagaagaca agcttttaag cgtctattag tatacgtgag a         111 <210>474 <211>148 <212>DNA <213>Azotobacter vinelandii <400>474 aaacaatctg ttgccagccc cagcggggcg gcacggagag ggcgcagccg acaggccgaa 60 gatttggctg gaccgcacgc tgccggaaac aggctaccgc tatcacctac ccgattggct 120 gtcgtgtcat cgacacggcg gcaaccga                                    148 <210>475 <211>229 <212>DNA <213>Cowduria ruminantium <400>475 ggtgtgtaag tatggtaaca tatgtagcta accagtacta atagcccgat tgatttactt 60 aatttgtaat tatatgtagt attaaaactg cagcttgtct ttttgcttat tttgttttat 120 agtttaattg ggttggtggt aatagcagaa gtgatacacc cagctacatt tcgaacctgg 180 aagttaagcc ttctagcgct tatggtactt tgtcttaagg cacgggaga             229 <210>476 <211>110 <212>DNA <213>Mycobacterium intracellulare <400>476 taagcttgat tcacacactc gcaaccacag tccatttcgc gcgttctgcc gctgaagcta 60 gaacaccgca ccccccacca aacaaattta aatagagtta cggcggccac           110 <210>477 <211>107 <212>DNA <213>Mycobacterium lufu <400>477 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<213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Brucella细菌属的种衍推出 <400>492 atgtttgtgt tcttcgccga cctggtggtt atggcggagc ggccgcaccc ga       52 <210>493 <211>40 <212>DNA <213>Bradyrhizobium japonicum <400>493 ttcgccggcc tggtggtttt agcgaagagc ctcaacccga                     40 <210>494 <211>36 <212>DNA <213>Pseudomonas paucimobilis <400>494 tcttcagcgc cgatggtagt cggggttccc cctaat                         36 <210>495 <211>40 <212>DNA <213>Rhodobacter sphaeroides <400>495 ttctccggtc tggtggccat agcacgagca aaacacccga                   40 <210>496 <211>53 <212>DNA <213>Rickettsia prowazekii <400>496 ccttgcttaa gaataatata atagcattaa cagcatatta taatacaacc tat       53 <210>497 <211>51 <212>DNA <213>Rickettsia bellii <400>497 aaatttcttt aagtcctgca acaacactaa cagcaaacca atacaaatct a        51 <210>498 <211>53 <212>DNA <213>Rickettsia rickettsii <400>498 gaattttttt gagtcgtgca acaacattaa cagtagacta taatacaaat cta      53 <210>499 <211>47 <212>DNA <213>Sphingomonas paucimobilis <400>499 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ccatagagtc acacccttcc tggtgtctat ggcggtatgg aaccactctg acc       53 <210>522 <211>60 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Synechocystis细菌属的种衍推出 <400>522 agcaaaaccc aaaaatcttt cttggtgtct ttagcgtcat ggaaccactc cgatcccatc 60 <210>523 <211>53 <212>DNA <213>Borrelia burgdorferi <400>523 ttttgtcttc cttgtaaaaa ccctggtggt taaagaaaag aggaaacacc tgt        53 <210>524 <211>51 <212>DNA <213>Chlamydia trachomatis <400>524 gagaaacgat gccaggatta gcttggtgat aatagagaga gggaaacacc t          51 <210>525 <211>138 <212>DNA <213>Sphingomonas paucimobilis <400>525 ctataacctt ggtagtccaa ggtcgagtac aactgctcga tacaagctac aacccaacaa 60 tacttcttcc agattcatgg ccacgctgaa caaagcgtag ggtgggcggc tgtnccgccc 120 acgcgtaact caagcgta                                               138 <210>526 <211>107 <212>DNA <213>Zymomonas mobilis <400>526 ttttgagaac tccactgtca atgtcagcat tgctgacctg ataatgtttt ctcttagctc 60 ttttgaatat cttcgatttt caattaactt cacgcacagg tgtcata              107 <210>527 <211>167 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人造序列描述：由Alcaligenes细菌属的种衍推出 <400>527 atacaacacc caagcagttg tatataaagc atcaatcgat tcattaatat gcaaagcaac 60 ttgatttagt tatacgctta gctaaaatga acaaaatata gtaagactca atcagcccat 120 ctgtaaagat ttggaaaacg catcggcaac caataagacc aatgcaa               167 <210>528 <211>225 <212>DNA <213>Borrelia burgdorferi <400>528 ctgcgagttc gcgggagagt aagttattgc cagggttttt tatttttttt tagtttttat 60 gttatttaaa tggcttattc aaacaacata aaaaagaaaa tagatattga catggattaa 120 acaaaagata tatattattc tatgttgcat aaacaaattg gcaaagtaga gatggaagat 180 aaaaatatgg tcaaagtaat aagagtctat ggtgaatgcc tagga                 225 <210>529 <211>681 <212>DNA <213>Xanthomonas campestris <400>529 tggagcaaga cgtcattcgt cctagtcggg cgtcctcaca aattacctgc attcagagat 60 tcataccggc acaggtcggt atgcgaagtc ccttttgggg ccttagctca gctgggagag 120 cacctgcttt gcaagcaggg ggtcgtcggt tcgatcccga caggctccac catattgagt 180 gaaaagactt cgggtctgta gctcaggtgg ttagagcgca cccctgataa gggtgaggtc 240 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