生物传感器微阵列构成和方法
阅读：990发布：2020-05-14
专利汇可以提供生物传感器微阵列构成和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 描述了基本不含污染物的包含检测多肽 单层 的 生物 传感器 微阵列。还提供了通过包含捕获部分和相关传感器的阵列捕获多肽来生成这类 生物传感器 微阵列的方法。，下面是生物传感器微阵列构成和方法专利的具体信息内容。
1.一种生物传感器微阵列，其包含：
(i)固体支持物基材表面，其包含多个可密封的纳米孔；
(ii)多个检测肽，其通过多个捕获部分中至少一个结合所述固体支持物基材表面，并由密封的纳米孔中的分离的体外翻译反应的阵列提供；以及
(iii)多个传感器；其中
所述多个传感器中的各传感器直接接触或靠近所述多个捕获部分中的一捕获部分，且所述生物传感器微阵列基本不含体外翻译污染物。
2.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，所述检测肽包括激酶、蛋白酶、磷酸酶、氧化酶、还原酶、聚合酶、水解酶、裂解酶、转移酶、异构酶、连接酶、氧化还原酶、葡糖苷酶、糖苷水解酶、麦芽糖糊精酶、脱氢酶、烯醇酶、分泌酶、合成酶、内切核酸酶、外切核酸酶、脂肪酶、加氧酶、纤维素酶、环化酶、酯酶或其组合。
3.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，所述检测肽可逆地结合所述捕获部分。
4.如权利要求3所述的生物传感器微阵列，所述检测肽还包含可切割接头，所述接头的切割从所述捕获部分中释放所述检测肽。
5.如权利要求4所述的生物传感器微阵列，所述可切割接头是蛋白酶可切割接头，光可切割接头，或化学反应性可切割交联物。
6.如权利要求3所述的生物传感器微阵列，所述捕获部分包含非共价亲和部分。
7.如权利要求6所述的生物传感器微阵列，所述非共价亲和部分包含脱硫生物素且所述检测肽包含亲和素的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，所述捕获部分包括抗体、化学接头、亲和试剂或卤代烷烃脱卤酶标签多肽的配体(HaloTag配体)。
9.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，所述捕获部分是抗体。
10.如权利要求9所述的生物传感器微阵列，所述检测肽包含表位标签且所述抗体特异性结合所述表位标签。
11.如权利要求10所述的生物传感器微阵列，所述表位标签是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、卤代烷烃脱卤酶、MYC标签、FLAG标签、血凝素(HA)标签、6X-His标签或荧光蛋白。
12.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，所述多个捕获部分与多个珠或纳米颗粒相连。
13.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，至少一种所述检测肽包含翻译后修饰。
14.如权利要求13所述的生物传感器微阵列，所述翻译后修饰包括：酰化、乙酰化、去乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、酰胺化、糖基化、氧化、糖化、磷酸化、生物素化、泛素化、SUMO化、类泛素化、硫酸化、PEG化、瓜氨酸化、去磷酸化、去酰胺化，或消除化。
15.如权利要求13所述的生物传感器微阵列，所述多个检测肽包含具有相同氨基酸序列的至少两种多肽或肽，且所述至少两种多肽或肽之一不包含翻译后修饰。
16.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，所述多个检测肽包含人多肽、病毒多肽、真菌多肽、细菌多肽、非人动物多肽、植物多肽或其组合。
17.如权利要求16所述的生物传感器微阵列，所述检测肽包含人多肽。
18.如权利要求17所述的生物传感器微阵列，所述检测肽包含至少100种各自独立的人蛋白质序列。
19.如权利要求17所述的生物传感器微阵列，所述检测肽是癌症相关多肽。
20.如权利要求16所述的生物传感器微阵列，所述检测肽是病毒多肽、真菌多肽、细菌多肽、非人动物多肽、植物多肽或其组合。
21.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，所述基材表面是金、银、锗、铝或金属膜夹心结构。
22.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，所述多个传感器包括场效应传感器、压电传感器、声波传感器、等离子体传感器、SPR传感器、拉曼传感器、SERS传感器、悬臂传感器、量热传感器、电势传感器、电流传感器、电导传感器、离子通道传感器、离子敏感型传感器或基于阻抗光谱的传感器。
23.如权利要求22所述的生物传感器微阵列，所述场效应传感器包括半导体纳米线传感器、金属纳米线、碳纳米管、纳米线、基于石墨烯的装置、纳米带传感器、聚合物传感器、电阻式传感器、电容式传感器、电感式传感器、巨磁电阻传感器或其组合。
24.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，所述多个传感器包括等离子体传感器、量热传感器、电势传感器、电流传感器、电导传感器、离子通道传感器、离子敏感型传感器或基于阻抗光谱的传感器。
25.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，所述多个检测肽包含至少100种不同蛋白质的氨基酸序列。
26.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，所述多个传感器中的一些传感器直接接触或靠近所述多个捕获部分中的各捕获部分。
27.如权利要求26所述的生物传感器微阵列，所述一些传感器包括具有不同形状、不同尺寸、不同厚度、不同表面结构、不同表面化学或不同电特性的传感器。
28.如权利要求26所述的生物传感器微阵列，所述一些传感器中的至少一个是参比传感器。
29.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，所述多个传感器包含纳米结构、纳米模式、微米结构、微米模式、中间结构、中间模式、纳米多孔或微米多孔的传感器表面。
30.一种生物传感器微阵列试验，其包括：
(i)使权利要求1所述的生物传感器微阵列接触包含一种或多种分析物的样品，所述分析物中至少一种与多个检测肽中的至少一种结合的检测肽的特异性结合生成可检测信号；
以及
(ii)检测并测定所述至少一种分析物与所述至少一种检测肽结合相关的信号水平。
31.如权利要求30所述的生物传感器微阵列试验，其中，在所述样品中检测至少10种不同分析物。
32.如权利要求30所述的生物传感器微阵列试验，其中，至少一种所述分析物是蛋白质、酶、抗体、非肽药物候选物、代谢物或核酸。
33.如权利要求30所述的生物传感器微阵列试验，所述分析物包含一种或多种待检测抗体。
34.如权利要求30所述的生物传感器微阵列试验，所述样品是来自人对象的生物样品。
35.如权利要求34所述的生物传感器微阵列试验，还包括：基于一种或多种抗体是否存在或其水平来显示人对象中是否存在身体病症。
36.如权利要求30所述的生物传感器微阵列试验，所述一种或多种分析物包含分子量为100道尔顿至900道尔顿的药物候选化合物。
37.如权利要求30所述的生物传感器微阵列试验，其中，一种或多种所述检测肽可逆地结合所述捕获部分。
38.如权利要求37所述的生物传感器微阵列试验，还包括在检测步骤前从所述捕获部分中释放所述一种或多种可逆结合的肽。
39.一种生物传感器微阵列，其包含：
(i)固体支持物基材表面，其包含多个可密封的纳米孔；
(ii)通过多个捕获部分中的至少一个结合所述固体支持物基材表面的多个反应性肽，所述结合的反应性肽中至少一个具有在目标配体存在的情况下进行相互作用或反应以生成报告剂的能力，并且其中，所述多个反应性肽已通过密封的纳米孔中的分离的体外翻译反应的阵列提供；以及
(iii)在所述报告剂存在的情况下生成可检测信号的多个传感器；其中
所述多个传感器中的各传感器直接接触或靠近所述多个捕获部分中的一捕获部分，且所述生物传感器微阵列基本不含体外翻译污染物。
40.如权利要求39所述的生物传感器微阵列，所述多个传感器位于固体支持物基材表面上，传感器所在的固体支持物基材表面不是连接有所述多个捕获部分的固体支持物基材。
41.如权利要求39所述的生物传感器微阵列，所述报告剂是非荧光的。
42.如权利要求39所述的生物传感器微阵列，所述报告剂是反应性或氧化还原物质，其生成可检测的电荷传输。
43.如权利要求39所述的生物传感器微阵列，所述报告剂是报告肽。
44.如权利要求43所述的生物传感器微阵列，所述报告肽是被所述多个反应性肽中一种或多种反应性肽翻译后修饰的肽。
45.如权利要求39所述的生物传感器微阵列，所述生物传感器微阵列还包含与所述报告剂特异性结合的多个捕获部分。
46.如权利要求39所述的生物传感器微阵列，所述多个传感器还包含对所述报告剂的存在敏感的包被层。
47.如权利要求46所述的生物传感器微阵列，所述包被层包含有机单层、生物分子单层、无机单层、多层膜、金属膜、介电膜或半导体膜。
48.一种生物传感器微阵列试验，其包含：
(i)使权利要求39所述的生物传感器微阵列接触包含一种或多种目标配体的测试样品，使得所述一种或多种目标配体与反应性肽之一的相互作用或反应生成报告剂；以及(ii)检测并测定所述报告剂的信号水平。
49.一种生成生物传感器微阵列的方法，所述方法包括：
(i)提供与固体支持物基材表面相连的多个捕获部分，其中，多个传感器直接接触或靠近所述多个捕获部分；
(ii)在密封的纳米孔中提供由分离的体外翻译反应的阵列所提供的多个检测肽，该分离的体外翻译反应包含编码所述检测肽的RNA；
(iii)使所述体外翻译反应的阵列与所述多个捕获部分接触，此时所述检测肽特异性结合捕获部分的阵列；以及
(iv)清洗接触的捕获部分以除去非特异性结合所述捕获部分的体外翻译污染物，从而获得基本不含体外翻译污染物的生物传感器微阵列。
50.如权利要求49所述的方法，所述体外翻译反应的阵列包括至少100个体外翻译反应，各体外翻译反应包含的翻译的检测肽的氨基酸序列与其他翻译的检测肽不同。
51.通过权利要求49所述的方法生成的生物传感器微阵列。
52.如权利要求1所述的生物传感器微阵列，其中，所述多个检测肽包含至少100至100,
000种不同的检测肽。
53.如权利要求39所述的生物传感器微阵列，其中，所述多个反应性肽包含至少100至
100,000种不同的反应性肽。
生物传感器微阵列构成和方法
[0001] 交叉参考
[0003] 发明背景
[0004] 蛋白质微阵列领域的当前状态促使以高密度形式从DNA微阵列中原位生产高质量功能性蛋白质。目前的方法/技术包括，例如，核酸可编程蛋白质阵列(NAPPA)、蛋白质原位阵列(PISA)、原位嘌呤霉素捕获、从DNA阵列到蛋白质阵列(DAPA)、纳米孔蛋白质阵列、分析性微阵列(也称为捕获阵列)、功能性蛋白质阵列(也称为目标蛋白质阵列)、反相蛋白质微阵列(RPPA)等。在无细胞的方法中，将编码cDNA、基因或质粒的微阵列打印在玻璃基材上并与体外转录和翻译(IVTT)混合物孵育，以在使用时表达新鲜蛋白质。也可通过打印先前表达的纯化蛋白质来生产蛋白质阵列，但这些蛋白质通常在表达、分离、纯化和打印的费力过程中丢失3D构象依赖性的功能。原位生成的蛋白质阵列通过首次促进对于蛋白质和蛋白质功能的高通量研究而彻底改变了蛋白质组学领域。也发现其可广泛地用于生物标志物发现研究，发现亲和结合剂，抗体谱和临床验证研究。不幸的是，目前的生产蛋白质阵列的方法都无法符合对于生成基于蛋白质的生物传感器的挑战和质量要求。
发明内容
[0005] 本发明描述了生物传感器微阵列，用于制备这类生物传感器微阵列的方法，以及其使用方法。
[0006] 在一个方面中，本发明描述了一种生物传感器微阵列，其包含：(i)固体支持物基材表面；(ii)与固体支持物基材表面连接的多个捕获部分；(iii)由这些捕获部分特异性结合的多个检测多肽或检测肽；以及(iv)多个传感器；这些多个传感器中的每一个传感器都直接接触或靠近多个捕获部分中的一捕获部分，且该生物传感器微阵列基本不含体外翻译污染物。
[0007] 在一些实施方式中，这些检测多肽包括激酶、蛋白酶、磷酸酶、氧化酶、还原酶、聚合酶、水解酶、裂解酶、转移酶、异构酶、连接酶、氧化还原酶、葡糖苷酶、糖苷水解酶、麦芽糖糊精酶、脱氢酶、烯醇酶、分泌酶、合成酶、内切核酸酶、外切核酸酶、脂肪酶、加氧酶、纤维素酶、环化酶、酯酶或其组合。
[0008] 在一些实施方式中，这些检测多肽或检测肽可逆地结合捕获部分。在一些实施方式中，当检测多肽或检测肽可逆地结合捕获部分时，这些检测多肽或检测肽还包含可切割接头，该接头的切割从捕获部分中释放检测多肽或检测肽。在一些实施方式中，该可切割接头是蛋白酶可切割的接头(例如烟草黄边病毒(TEV)蛋白酶切割位点；肠激酶切割位点，凝血酶切割位点，或HRV3C蛋白酶切割位点)，光可切割的接头，或化学反应性可切割交联物。在一些实施方式中，当检测多肽或检测肽可逆地结合时，这些捕获部分包含非共价亲和部分。在一些实施方式中，这些检测多肽包含亲和素的氨基酸序列，且这些非共价亲和部分包含脱硫生物素。
[0009] 在一些实施方式中，该生物传感器微阵列中的捕获部分包含抗体、生物素或卤代烷烃脱卤酶标签多肽的配体。在一些实施方式中，这些捕获部分是抗体。
[0010] 在一些实施方式中，多个捕获部分与多个珠或纳米颗粒相连。
[0011] 在一些实施方式中，这些检测多肽或检测肽包含至少一种基材以进行酶促翻译后修饰(例如酰化、乙酰化、去乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、酰胺化、糖基化、氧化、糖化、磷酸化、生物素化、泛素化、SUMO化、类泛素化、硫酸化、PEG化、瓜氨酸化、去磷酸化、去酰胺化或消除化(eliminylation))。
[0012] 在一些实施方式中，多个检测多肽或检测肽包含具有相同氨基酸序列的至少两种多肽或肽，且该至少两种多肽或肽之一包含不具有翻译后修饰的相同氨基酸序列。
[0013] 在一些实施方式中，当捕获部分是抗体时，这些检测多肽或检测肽包含表位标签且这些抗体特异性结合该表位标签。在一些实施方式中，该表位标签是谷胱甘肽-S转移酶(GST)、卤代烷烃脱卤酶、MYC标签、FLAG标签、血凝素(HA)标签、6X-His标签或荧光蛋白。
[0014] 在一些实施方式中，多个检测多肽或检测肽包含人多肽、病毒多肽、细菌多肽、真菌多肽、非人动物多肽、植物多肽或其组合。在一些实施方式中，这些检测多肽或检测肽包含人多肽。在一些实施方式中，这些检测多肽或检测肽包含至少100条各自独立的人蛋白序列(例如1000、5000、10000或20000条人蛋白序列)。在一些实施方式中，这些人检测多肽或肽是癌相关多肽或肽。在一些实施方式中，这些检测多肽是病毒多肽、细菌多肽、真菌多肽或其组合。
[0016] 在一些实施方式中，多个传感器包括场效应传感器、压电传感器、声波传感器、谐振器或悬臂传感器。在一些实施方式中，这些场效应传感器包括半导体纳米线传感器、金属纳米线、碳纳米管、纳米线、基于石墨烯的装置、纳米带传感器、聚合物传感器、电阻式传感器、电容式传感器、电感式传感器、巨磁电阻传感器或其组合。
[0018] 在一些实施方式中，多个检测多肽包含至少100种不同蛋白质的氨基酸序列。
[0019] 在一些实施方式中，多个传感器中的一些传感器直接接触或靠近多个捕获部分中的各捕获部分。在一些实施方式中，所述一些传感器包括具有不同形状、不同尺寸、不同厚度、不同表面结构、不同表面化学或不同电特性的传感器。在一些实施方式中，所述一些传感器中至少一种是参比传感器。
[0020] 在一些实施方式中，多个传感器包含纳米结构、纳米模式、微米结构、微米模式、中间结构、中间模式、纳米多孔或微米多孔的传感器表面。
[0021] 在一个相关的方面中，本发明描述了一种生物传感器微阵列试验，其包括以下步骤：(i)使上述生物传感器微阵列与包含一种或多种分析物的样品接触，至少一种分析物与生物传感器微阵列的多个检测多肽或检测肽中至少一种结合的检测多肽或检测肽的特异性结合或相互作用或反应生成可检测信号；以及(ii)检测和测定至少一种分析物与至少一种检测多肽或肽结合或相互作用或反应相关的信号水平。
[0022] 在该方法的一些实施方式中，在样品中检测至少十种不同分析物。在一些实施方式中，至少一种待检测分析物是蛋白质、酶、抗体、非肽药物候选物、代谢物或核酸。在一些实施方式中，这些分析物包含一种或多种待检测抗体。在一些实施方式中，该样品是来自人对象的生物样品。在一些实施方式中，当样品是来自人对象的包含抗体的生物样品时，该方法还包括基于一种或多种抗体的存在或水平显示是否存在身体病症。
[0023] 在其他实施方式中，一种或多种分析物包含分子量为约100道尔顿至约900道尔顿的药物候选化合物。
[0024] 在该方法的其他实施方式中，一种或多种检测多肽或检测肽可逆地结合捕获部分。在一些实施方式中，当一种或多种检测多肽或检测肽可逆地结合捕获部分时，该方法还包括在使生物传感器微阵列接触样品前释放这些可逆结合的检测多肽或肽。
[0025] 在另一个方面中，本发明描述了一种生物传感器微阵列，其包含：(i)固体支持物基材表面；(ii)与固体支持物基材表面连接的多个捕获部分；(iii)由这些捕获部分结合的多个反应性多肽，各结合的反应性多肽都具有在目标配体存在的情况下相互作用或反应以生成报告剂的活性；以及(iv)在目标配体或报告剂存在的情况下生成可检测信号的多个传感器；这些多个传感器中的每一个传感器都直接接触或靠近多个捕获部分中的一捕获部分，且该生物传感器微阵列基本不含体外翻译污染物。
[0026] 在一些实施方式中，多个传感器位于除连接有多个捕获部分的固体支持物基材以外的固体支持物基材表面上。
[0027] 在一些实施方式中，通过反应性多肽生成的报告剂是非荧光的。在其他实施方式中，该配体或报告剂是反应性或氧化还原物质，其生成可检测的电荷传输。在一些实施方式中，该报告剂是报告多肽。在一些实施方式中，该报告多肽是被多个反应性多肽中一种或多种反应性多肽翻译后修饰的多肽。
[0028] 在其他实施方式中，该生物传感器微阵列还包含特异性结合报告剂的多个捕获部分。
[0029] 在其他实施方式中，多个传感器还包含对报告剂的存在敏感的包被层(coated layer)。在一些实施方式中，该涂层包含有机单层、生物分子单层、无机单层、多层膜、金属膜、介电膜或半导体膜。
[0030] 在其他实施方式中，该配体或报告剂与传感器表面上沉积的另一种化学或生物单层或多层或膜或有机或无机或介电或金属或绝缘体或拓扑绝缘体或半导体膜反应，导致传感器中的响应。
[0031] 在一个相关的方面中，本发明描述了一种生物传感器微阵列试验，其包括：(i)将上述生物传感器微阵列与包含一种或多种目标配体的测试样品接触，使得一种或多种目标配体与一种或多种反应性多肽的反应生成报告剂；以及(ii)检测和测定报告剂的信号水平。
[0032] 在另一个方面中，本发明提供了一种生成生物传感器微阵列的方法，其包括：(i)提供多个捕获部分，其与固体支持物基材表面相连，其中多个传感器直接接触或靠近多个捕获部分；(ii)提供经排列的体外翻译反应，其包含编码多种检测多肽的RNA、核糖体和从RNA翻译得到的多种检测多肽；(iii)使经排列的体外翻译反应与多个捕获部分接触，使得多种检测多肽特异性结合捕获部分的阵列；以及(iv)清洗接触的捕获部分以除去非特异性结合捕获部分的体外翻译污染物，从而获得基本不含体外翻译污染物的生物传感器微阵列。
[0033] 在上述方法的一些实施方式中，多个体外翻译反应包括至少100(例如500、1000、5000或10000)个体外翻译反应，其中各体外翻译反应包含的多肽的氨基酸序列与其他翻译的检测多肽不同。
[0034] 在一些实施方式中，经排列的体外翻译反应排列于微米孔或纳米孔中。
[0036] 图1是多种类型的生物传感器及其检测形式的示意图。
[0037] 图2(上图)是使用捕获抗体包被的传感器阵列芯片对表达的蛋白质进行分离捕获的示意图。使抗体包被的传感器阵列接触通过体外翻译反应生成的多种蛋白质，导致翻译的目标蛋白结合其相应抗体以生成捕获/分离的蛋白质的单层阵列。(下图)阵列中纯化的p53单层点的荧光显微图。
[0038] 图3是表面捕获蛋白质生物传感器的示意图。各蛋白质表达于密封的纳米孔中并捕获试剂(如抗体)包被的传感器表面(例如以阵列形式)上被捕获以生成纯蛋白质的阵列，所述纯蛋白质通过捕获试剂(如抗体)直接结合于传感器表面。在该非限制性实施方式中，这些传感器是纳米线场效应晶体管(FET)/离子敏感型场效应晶体管(ISFET)元件。
[0039] 图4玻璃上纯蛋白质单层的分离捕获。通过在捕获部分包被的载玻片上捕获来形成POLB、Abl、MAPK1蛋白点。将具有GST标签的POLB、Abl、MAPK1融合蛋白的cDNA(质粒)打印至硅纳米孔基材的孔中，孔间距为375微米。在其他孔中，将融合蛋白的cDNA连同各组中打印化合物的其他组分打印。抗GST抗体包被的载玻片用作捕获表面/基材。使用体外转录和翻译(IVTT)细胞提取物填充含有cDNA的硅纳米孔并使用抗GST包被的捕获玻璃基材盖在纳米孔基材的顶部，并孵育以进行蛋白质表达。在抗GST包被的玻璃捕获表面上捕获表达为具有GST标签的融合蛋白形式的蛋白质，将其移出并彻底清洗以在载玻片上生成纯/清洁的蛋白质阵列，并清洗掉细胞提取物的其他组分。该图显示载玻片中纯POLB、Abl、MAPK1蛋白阵列的荧光图像，不具有可检测的蛋白质交叉污染或扩散。
[0040] 图5FET传感器阵列装置原型。上图：多个阵列设计中，在绝缘体晶片基材上的硅上产生的场效应晶体管(FET)传感器的光学图像。在该小图中：在Su-8中制备具有纳米孔的10x 10FET传感器阵列，其在各阵列位置中均包括第二参考传感器。下图：FET纳米线传感器的SEM图像。
[0041] 图6FET生物传感器检测磷酸激酶活性。该图通过检测H+显示对Src激酶自磷酸化的全耗尽指数耦合(FDEC)响应。在添加10mM ATP后产生了200mV阈值电压响应。添加纯水或ADP不产生响应。
[0042] 图7FET生物传感器检测星形孢菌素对Src激酶的抑制。显示在2μM星形孢菌素存在或不存在的情况下，使用基于FET的生物传感器微阵列实时检测Src激酶自身磷酸化。
[0043] 图8接近式捕获蛋白质生物传感器的示意图。使通过分离的蛋白质捕获获得的蛋白质阵列接触含有纳米线传感器和酶底物的纳米孔。在蛋白质存在的情况下，传感器(如FET/ISFET传感器)检测是否存在蛋白质反应(如转换的底物)或蛋白质-蛋白质相互作用。
[0044] 图9是接近式蛋白质传感的非限制性实施方式的示意图，其中蛋白质在珠上被捕获并接触紧密靠近纳米线传感器的反应底物。
[0045] 图10是蛋白质组生物传感器芯片的非限制性实施方式的示意图，其中整个组或亚组的人蛋白结合在传感器阵列(如纳米线传感器阵列)的表面，各蛋白质直接结合或紧密靠近单独可寻址的传感器装置。
[0046] 图11是基于纳米线传感器的生物传感器微阵列的非限制性实施方式的示意图。分离的蛋白质捕获被用于在纳米线传感器表面上捕获肿瘤基因的表达产物。随后，可分析生物样品(如血清或全血)中是否存在特异性抗体及其含量，所述分析是基于这些抗体与纳米线传感器表面上结合的其目标蛋白抗原的特异性相互作用。该信号模式从而生成与特定肿瘤/癌症类型的诊断或预后相关的抗体谱特征(antibody profiling signature)。
[0047] 图12显示“多重”生物传感器平台的非限制性实施方式的示意图，其中传感器阵列用与多种身体病症相关联的蛋白质(例如，炎性疾病、肺癌肿瘤蛋白、乳腺癌肿瘤基因、白血病相关蛋白质、感染物蛋白质等)被覆。测试患者生物样品是否存在针对不同排列的蛋白质的抗体能够产生免疫应答谱，以协助快速疾病诊断和预后。
发明内容
[0049] 引言
[0050] 迄今为止，虽然以能够使用先前表达并纯化的纯蛋白质单层包被有限的传感器阵列，但其无法应用于具有数以万计蛋白质的大传感器阵列而不损失蛋白质功能。目前的基于蛋白质的生物传感器使用有限组的预定蛋白质(或其他生物分子)包被的小传感器装置阵列来检测预确定的感兴趣生物标志物，从而诊断疾病。如同目前对于PSA测试应用的争议所示例的那样，在许多病例中，基于单个生物标志物(或甚至一小组生物标志物)的过表达或低表达的疾病诊断可导致非最佳决定。不同于检测单个蛋白质(或其抗体)的调控，更优的方法是快速获取许多组织特异性蛋白质或抗体的表达水平。通过使用本文所述生物传感器微阵列和方法来进行的诊断身体病症的疾病特征方法涉及检测多种结合或相互作用或反应的物质，最小化失误(如过度诊断或诊断不足)。因此，生物传感器领域的最大挑战之一是生产大的传感器阵列(100个传感器至最多10,000,000个传感器单元或更多)，各传感器被能够与感兴趣的分析物(例如其他蛋白质、酶、抗体、代谢物、核酸或小分子药物)相互作用的检测多肽单层包被。
[0051] 在本方法中，打印了用于表达产物的捕获剂和核酸(如质粒DNA和/或mRNA)连同核糖体和体外翻译所需的其他组分。因此，从DNA原位生产的生物分子、表达产物(即翻译的多肽或肽)被捕获于打印的材料之上或周围。当这类阵列暴露于测试介质以用作生物传感器时，目标物质可与打印的物质中存在的第二材料非特异性相互作用(即非特异性结合或相互作用或反应)，所述第二材料实际上是来自体外翻译反应的“污染物”，例如核糖体、氨基酸、tRNA、mRNA、DNA、有机分子等。或者，这些体外翻译污染物可与测试溶液(分析物)中存在的非目标分子和材料(非特异性)结合或相互作用。这些不需要的第二相互作用添加噪音，通过降低检测目标生物分子物质过程中的信噪比降低了检测的特异性。对于生物传感器，理想情况是在信号转换元件的表面上(或附近)仅存在感兴趣的纯检测多肽(纯生物分子)以及仅需要的组分(如反应物化学品、生物分子或催化剂或酶)。
[0052] 生物传感器或信号转换器检测感兴趣的目标物质的能力取决于传感事件产生的信号幅度(或信号变化)。并且通常在生物传感器中，信号转换的效率或幅度与结合/相互作用事件与敏感型转换元件的‘物理/电子接近度’成正比。当结合或相互作用事件在最靠近传感元件处发生时，信号转换元件的电子或电化学或磁性或光学或热学性质的变化达到最大。目前，形成于打印的(分散的)材料外壳(crust)顶部的蛋白质阵列从结合/相互作用事件“筛选”信号敏感型元件，将检测的敏感性实际降低最多一个数量级或更多，使其在大多数配置中较难用作传感器(使用光学标签的除外)。因此，在将目前的蛋白质生产方法用于生物传感器应用时，不仅噪音较高，而且信号本身较低。理想情况下，对于生物传感器而言，需要蛋白质(或其他感兴趣的生物分子)的单层或少量多层或膜，所述蛋白质(或其他感兴趣的生物分子)直接连接于本文所述传感器元件(或者多层，在单层不可能时)的表面(或靠近传感器元件)。
[0053] 构成
[0054] 生物传感器微阵列
[0055] 生物传感器是将信号转换(传感)元件与薄膜或化学或生物组分(生物分子)组合的装置，其用于通过特异性结合、相互作用或生物化学反应来检测、定量测试介质中是否存在感兴趣的特定化学或生物分子物质。生物传感器微阵列是传感器的阵列，其包含各传感器单元(或多个传感器单元)上独特的化学或生物分子，以组合地检测测试介质中是否存在单个或多个感兴趣的生物分子。该信号转换元件可包含光学活性标签(如染料)、量子点、磁性颗粒、纳米颗粒或放射性标签。生物传感器还可包括传感器装置，其监测转换(传感)元件的电性质(如电阻、电容、电导或质量)、电化学或等离子体或磁性或光学或热学(或其组合)的性质，从而检测感兴趣的目标化学或生物分子。示例包括场效应晶体管(FET)纳米线传感器、离子敏感型FET(ISFET)、SPR传感器、等离子体传感器、石英晶体微天平等。应用于生物传感器应用时，目前的蛋白质微阵列技术囿于许多限制，如下文所述，例如导致高假阳性的低特异性、假阴性和低敏感型、低信噪比等，其在本发明所述生物传感器微阵列中可避免或减低。
[0056] 在一些实施方式中，通过本发明所述方法生成的生物传感器微阵列包含：(i)固体支持物基材表面；(ii)与固体支持物基材表面连接的多个捕获部分；(iii)由这些捕获部分特异性结合的多个检测多肽或检测肽；以及(iv)多个传感器；这些多个传感器中的每一个传感器都直接接触或靠近多个捕获部分中的一捕获部分，且该生物传感器微阵列基本不含体外翻译污染物(即除翻译的检测多肽以外的体外翻译试剂)。在这类实施方式中，这些传感器检测结合于捕获部分的目标分析物检测多肽的结合或相互作用。
[0057] 在其他实施方式中，该生物传感器微阵列包含：(i)固体支持物基材表面；(ii)与固体支持物基材表面连接的多个捕获部分；(iii)由这些捕获部分结合的多个反应性多肽，各结合的反应性多肽(例如激酶、磷酸酶、蛋白酶、酶或酶底物)都具有在目标配体存在的情况下相互作用或反应以生成报告剂的活性；以及(iv)在报告剂存在的情况下生成可检测信号的多个传感器；这些多个传感器中的每一个传感器都直接接触或靠近多个捕获部分中的一捕获部分，且该生物传感器微阵列基本不含体外翻译污染物。在这类实施方式中，通过在目标配体与反应性多肽相互作用后生成报告剂来间接生成信号。在一些情况下，该报告剂可以是多肽(即“报告多肽”)。在一些实施方式中，在反应性多肽与目标配体(如激酶或蛋白酶)相互作用后，可由此衍生该报告多肽。在一些实施方式中，当生物传感器微阵列配置为检测报告剂时，多个传感器位于固体支持物基材表面上(多个捕获部分连接的固体支持物基材除外)，如图8所示。在一些实施方式中，报告剂的生成需要使目标配体和反应性多肽接触促进目标配体与反应性多肽(如ATP或其他代谢物)之间反应或相互作用的其他试剂。
[0058] 合适的固体支持物基材表面包括但不限于：金、银、锗、铝的膜或金属膜夹心结构。
[0059] 合适类型的检测多肽包括但不限于酶，例如激酶、蛋白酶、磷酸酶、氧化酶、还原酶、聚合酶、水解酶、裂解酶、转移酶、异构酶、连接酶、氧化还原酶、葡糖苷酶、糖苷水解酶、麦芽糖糊精酶、脱氢酶、烯醇酶、分泌酶、合成酶、内切核酸酶、外切核酸酶、脂肪酶、加氧酶、纤维素酶、环化酶和酯酶。
[0060] 在一些实施方式中，该生物传感器微阵列中的这些检测多肽可逆地结合捕获部分。例如，在检测多肽可逆结合的实施方式中，这类检测多肽可包含可切割接头，其允许在接头切割后释放待释放的可逆结合的检测多肽。可切割接头的示例包括但不限于：蛋白酶可切割接头、光可切割接头和化学反应性可切割交联剂。合适的蛋白酶可切割接头包括但不限于：肠激酶切割位点，凝血酶切割位点，HRV3C蛋白酶切割位点，和烟草黄边病毒(TEV)蛋白酶切割位点的蛋白酶识别位点。光可切割接头可包括光可切割生物素(例如可购自马萨诸塞州沃特敦镇的安本基公司(Ambergen))；3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸(ANP；Ariyasu等2012,Langmuir,28(36):13118-13126)；以及光可切割组氨酸肽(Gropeanu等2013,Small.,9(6):838-884)。化学反应性可切割交联剂包括但不限于巯基可切割交联剂(如二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯))。
[0061] 在一些实施方式中，生物传感器微阵列中的至少一些捕获部分是非共价亲和部分，其允许捕获部分与检测多肽的非共价结合。例如，在一些情况下，检测多肽是在N或C末端处包含亲和素的氨基酸序列(如GenBank登录号CAC34569.1)的融合多肽且非共价亲和部分是脱硫生物素，其虽然对亲和素标签具有高亲和力，但在过量生物素存在的情况下是可逆的，所述过量生物素可竞争性破坏结合有底物的脱硫生物素(即捕获部分)与携带亲和素的检测多肽的结合。
[0062] 包含可逆结合的检测多肽、检测肽或反应性多肽的生物传感器微阵列在一些应用中是特别有用的，如本发明所述，此时结合的多肽被释放(例如通过蛋白酶切割、光解或生物素的竞争性结合)至阵列上生成的各微米孔或纳米孔中的溶液中，之后测试样品中是否存在感兴趣的分析物。
[0063] 合适的捕获部分包括但不限于：抗体、化学接头、亲和试剂、生物素、亲和素，或本文所述卤代烷烃脱卤酶标签多肽的配体(“Halotag配体”)。在一些实施方式中，多个检测多肽包括融合多肽，其中多个融合多肽包含与多个检测多肽共有的多种氨基酸序列和N末端或C末端表位标签氨基酸序列。在一些实施方式中，这些捕获部分包含抗体。在一些实施方式中，这些检测多肽或检测肽包含表位标签且这些抗体特异性结合这些表位标签。在一些实施方式中，该表位标签是谷胱甘肽-S转移酶(GST)、卤代烷烃脱卤酶、MYC标签、FLAG标签、血凝素(HA)标签、6X-His标签或荧光蛋白(如EGFP)。这些表位标签和这类表位标签的特异性抗体或亲和试剂(例如螯合的镍)是本领域已知的并可从多个来源购得。
[0064] 在其他实施方式中，当捕获部分是抗体时，这些抗体特异性针对多种检测多肽中的多种检测多肽氨基酸序列而非常见的表位标签。
[0065] 在一些实施方式中，该表位标签(位于融合检测多肽的N或C末端)包含卤代烷烃脱卤酶的氨基酸序列
[0066] SEQ ID NO:1( 氨基酸序列)
[0067] MAEIGTGFPFDPHYVEVLGERMHYVDVGPRDGTPVLFLHGNPTSSYVWRNIIPHVAPTHRCIAPDLIGMGKSDKPDLGYFFDDHVRFMDAFIEALGLEEVVLVIHDWGSALGFHWAKRNPERVKGIAFMEFIRPIPTWDEWPEFARETFQAFRTTDVGRKLIIDQNVFIEGTLPMGVVRPLTEVEMDHYREPFLNPVDREPLWRFPNELPIAGEPANIVALVEEYMDWLHQSPVPKLLFWGTPGVLIPPAEAARLAKSLPNCKAVDIGPGLNLLQEDNPDLIGSEIARWLSTLEISG[0068] 当检测多肽是包含 表位标签的融合多肽时，多个捕获部分包含具有下文所示式I的结构的HaloTag配体：
[0069] (式I)
[0070]
[0071] 通常，捕获部分在固体支持物基材表面上组装为单层，其已进行衍生化以与捕获部分相连。衍生化多种类型的基材表面以允许生物分子的连接的方法是本领域已知的。参见例如Samanta等(2011),Chem Soc Rev.,40(5):2567-2592。随后通过捕获来自本发明所述经排列的体外翻译反应的检测多肽来形成阵列图案。在其他实施方式中，这些捕获部分本身可与作为阵列的基材表面相连，例如通过使用针点样装置在网格图案中点样，或使用液体喷墨打印机分散，或使用化学接头的蒸汽涂覆。
[0072] 在其他实施方式中，多个捕获部分连接于多个珠或纳米颗粒，其中不同的纳米颗粒组单独地与不同的检测多肽相连，而非限制于二维表面阵列。参见例如图9。
[0073] 本发明所述生物传感器微阵列的一个优势是可呈现多种多样的检测多肽。在一些实施方式种，多个检测多肽包括至少100种至约100,000种不同蛋白质的氨基酸序列，例如200种蛋白质、300种蛋白质、400种蛋白质、500种蛋白质、1,000种蛋白质、2,000种蛋白质、
3,000种蛋白质、5,0000种蛋白质、7,000种蛋白质、8,000种蛋白质、20,000、30,000、40,
000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或至少100种至约100,000种不同蛋白质之间另一数量的蛋白质。在其他实施方式中，多个检测多肽包括至少3种蛋白质至约50种不同蛋白质的氨基酸序列，例如5种蛋白质、8种蛋白质、10种蛋白质、15种蛋白质、20种蛋白质、30种蛋白质、40种蛋白质或至少3种蛋白质至约50种蛋白质之间另一数量的蛋白质。在一些实施方式中，该生物传感器微阵列中至少一种检测多肽或检测肽包括用于翻译后修饰的至少一种底物，其在酶或酶和辅助因子(例如生物样品(如血液或尿液样品)中发现的酶)存在的情况下经历酶促翻译后修饰反应，其可通过传感器检测。在一些实施方式中，这些翻译后修饰包括：酰化、乙酰化、去乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、酰胺化、糖基化、氧化、糖化、磷酸化、生物素化、泛素化、SUMO化、类泛素化、硫酸化、PEG化、瓜氨酸化、去磷酸化、去酰胺化、消除化(eliminylation)。
3,000种蛋白质、5,0000种蛋白质、7,000种蛋白质、8,000种蛋白质、20,000、30,000、40,
000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或至少100种至约100,000种不同蛋白质之间另一数量的蛋白质。在其他实施方式中，多个检测多肽包括至少3种蛋白质至约50种不同蛋白质的氨基酸序列，例如5种蛋白质、8种蛋白质、10种蛋白质、15种蛋白质、20种蛋白质、30种蛋白质、40种蛋白质或至少3种蛋白质至约50种蛋白质之间另一数量的蛋白质。在一些实施方式中，该生物传感器微阵列中至少一种检测多肽或检测肽包括用于翻译后修饰的至少一种底物，其在酶或酶和辅助因子(例如生物样品(如血液或尿液样品)中发现的酶)存在的情况下经历酶促翻译后修饰反应，其可通过传感器检测。在一些实施方式中，这些翻译后修饰包括：酰化、乙酰化、去乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、酰胺化、糖基化、氧化、糖化、磷酸化、生物素化、泛素化、SUMO化、类泛素化、硫酸化、PEG化、瓜氨酸化、去磷酸化、去酰胺化、消除化(eliminylation)。
[0074] 在一些实施方式中，多个检测多肽或检测肽包含具有相同氨基酸序列的至少两种多肽或肽，且该至少两种多肽或肽之一不包含翻译后修饰。这是有用的，例如用于检测依赖于某一结合伙伴的特定翻译后修饰的蛋白质-蛋白质相互作用。
[0075] 生物传感器微阵列中多种检测多肽或检测肽的氨基酸序列对应于来自多个来源的氨基酸序列。在一些实施方式中，多个检测多肽或检测肽包含人多肽、病毒多肽、细菌多肽、真菌多肽、动物多肽、植物多肽或其组合。在一些实施方式中，这些检测多肽包含人多肽，例如与身体病症相关的人多肽，所述身体病症包括但不限于癌症、肺动脉高血压、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病、CNS病、黄斑变性、特发性肺纤维化、系统性硬化病和类风湿性疾病。在一些实施方式中，这些检测多肽或肽是癌症相关多肽(例如p53、肿瘤抗原或癌细胞系抗原)。
[0076] 在一些实施方式中，当检测多肽是人多肽时，这些检测多肽包含至少1％至约100％的人蛋白质组序列，例如2％、5％、10％、12％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、
75％、80％、90％或至少1％至约100％的人蛋白质组序列之间另一百分比的人蛋白质组序列。在一些实施方式中，多个检测多肽包含至少10至500条各自独立的人蛋白质序列，例如
50、100、200、300、400或至少10至500之间另一数目的人蛋白质序列。在其他实施方式中，这些检测多肽包含至少500至约50,000条各自独立的人蛋白质序列或其变体(其序列与天然产生的人蛋白质序列至少约90％(例如95％、97％、99％)相同)，例如至少1,000、2,000、5,
000、10,000、20,000、30,000、40,000条人蛋白质序列或至少1,000至约50,000之间另一数目的人蛋白质序列。参见例如图10。
75％、80％、90％或至少1％至约100％的人蛋白质组序列之间另一百分比的人蛋白质组序列。在一些实施方式中，多个检测多肽包含至少10至500条各自独立的人蛋白质序列，例如
50、100、200、300、400或至少10至500之间另一数目的人蛋白质序列。在其他实施方式中，这些检测多肽包含至少500至约50,000条各自独立的人蛋白质序列或其变体(其序列与天然产生的人蛋白质序列至少约90％(例如95％、97％、99％)相同)，例如至少1,000、2,000、5,
000、10,000、20,000、30,000、40,000条人蛋白质序列或至少1,000至约50,000之间另一数目的人蛋白质序列。参见例如图10。
[0077] 在一些实施方式中，该生物传感器微阵列中的检测多肽是病毒多肽、细菌多肽、真菌多肽或其组合。这类阵列是有用的，例如用于检测是否存在针对病毒病原体(如HIV)或细菌病原体(如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))的抗体。
[0078] 本发明所述生物传感器微阵列中可使用多种类型的传感器。在一些实施方式中，多个传感器包括场效应传感器、压电传感器、声波传感器、等离子体传感器、拉曼传感器、谐振器或悬臂传感器。在一些实施方式中，这些场效应传感器包括半导体纳米线传感器、金属纳米线、碳纳米管、纳米线、基于石墨烯的装置、纳米带传感器、聚合物传感器、电阻式传感器、电容式传感器、电感式传感器、巨磁电阻传感器或其组合。
[0079] 在其他实施方式中，该生物传感器微阵列中的多个传感器包括量热传感器、电势传感器、电流传感器、电导传感器、离子通道传感器、离子敏感型传感器、基于阻抗光谱的传感器或表面等离极化激元传感器。
[0080] 在一些实施方式中，多个传感器包括表面增强拉曼光谱(SERS)传感器。在其他实施方式中，多个传感器包括基于STM、AFM、SPM的传感器。
[0081] 在一些实施方式中，多个传感器中的传感器包含等离子体活性表面(例如金或银膜，或金属膜夹心结构)，其是连续的或离散的微米、纳米尺寸形状，支持于介电膜或玻璃或其他表面上。
[0082] 在一些实施方式中，生物传感器微阵列可配置为使得多个传感器直接接触或靠近各捕获部分，即传感器与捕获部分的比例可以大于1:1，例如，其可以是2:1至约100:1，例如3:1、5:1、10:1、20:1、50:1、75:1或2:1至约100:1之间另一比例。在一些实施方式中，与一捕获部分相关的多个传感器包括具有不同形状、不同尺寸、不同厚度、不同表面结构、不同表面化学或不同电特性的传感器。在一些实施方式中，与一捕获部分相关的传感器之一用作参比传感器，即在报告剂的反应性或灵敏性或者相对于其他传感器分析物的存在的方面不同的传感器。
[0083] 在一些实施方式中，多个传感器包括具有纳米结构、纳米模式、微米结构、微米模式、中间结构、中间模式、纳米多孔或微米多孔表面的传感器。
[0084] 在多个实施方式中，各传感器与其相应检测多肽之间的距离范围是至少1nm至约1mm，例如10nm、100nm、1000nm、10,000nm、100,000nm或500,000nm或至少1nm至约1mm之间另一距离，这取决于具体的检测方式。例如，当分析物是待检测的目标配体时(所述检测是间接通过本发明所述可扩散报告剂的生成进行的)，检测多肽与传感器的位置之间的距离可更长。
[0085] 上述生物传感器微阵列可通过检测多肽与感兴趣的分析物之间的直接相互作用检测是否存在分析物(例如多肽、小分子量药物或碳水化合物)。或者，可通过检测多肽与目标配体直接相互作用所生成的副产物或“报告剂”来检测分析物。
[0086] 在一些实施方式中，当生物传感器微阵列对报告剂敏感时，该报告剂是非荧光的。在一些实施方式中，该报告剂是反应性或氧化还原或带电荷或极化或磁性物质，其生成可检测的电荷传输。在一些实施方式中，该报告剂是报告多肽。在一些实施方式中，该报告剂是被多个反应性多肽中一种或多种反应性多肽翻译后修饰的多肽。在一些实施方式中，反应性多肽用作目标配体(如蛋白激酶)的底物(如蛋白激酶底物)，并在与目标配体本身反应后成为报告多肽。
[0087] 在一些实施方式中，当生物传感器微阵列配置为检测报告剂时，其还包含特异性结合该报告剂的捕获部分，该报告剂是例如翻译后修饰的蛋白质或肽或样品中目标配体与生物传感器微阵列中存在的反应性多肽相互作用所生成的蛋白水解片段。在其他实施方式中，生物传感器微阵列包含多个传感器，这些多个传感器也包含对是否存在报告剂(如磷酸基团部分或其他离子)敏感的包被层。参见例如图13(下图)。例如，可使用磷酸亲和试剂(含有Ga(III)、Fe(III)、Zn(II)和Al(III)金属离子的膜)包被传感器，使得磷酸化的产物蛋白质通过该磷酸亲和试剂(金属离子)与传感器结合以生成可检测信号。在一些实施方式中，该包被层包含有机单层、双分子单层、无机单层、多层膜、介电膜或半导体膜。
[0088] 在一些实施方式中，该生物传感器微阵列包含绝缘表面(如金或锗或铝表面)以使用电化学氧化还原、其他电子输送过程来间接检测和定量分析物-检测多肽。
[0089] 在一些实施方式中，多个传感器包括压电传感器或声波传感器(SAW)，谐振器，悬臂传感器或电化学膜包被的压电传感器，如石英(QCM)，硅悬臂传感器(其频率不同，例如共振频率变化)，其用于检测与目标物质的相互作用。
[0090] 在一些实施方式中，当该生物传感器微阵列以纳米颗粒或珠的形式提供时，多个传感器包括量子点或磁性颗粒。
[0091] 方法
[0092] 生物传感器微阵列的生成
[0093] 本发明所述任何生物传感器微阵列都可通过包括以下步骤的方法生成：(i)提供多个捕获部分，其与固体支持物基材表面相连，其中多个传感器直接接触或考考多个捕获部分；(ii)提供经排列的体外翻译反应，其包含编码多种检测多肽(或反应性多肽)的RNA、核糖体和从RNA翻译得到的多种检测多肽；(iii)使经排列的体外翻译反应与多个捕获部分接触，使得多种检测多肽特异性结合捕获部分的阵列；以及(iv)清洗接触的捕获部分以除去非特异性结合捕获部分的体外翻译污染物，从而获得基本不含体外翻译污染物的生物传感器微阵列。
[0094] 在一些实施方式中，这些排列的体外翻译反应包括至少100个体外翻译反应，其中，各体外翻译反应包含的多肽的氨基酸序列与其他翻译的检测多肽不同。在一些实施方式中，这些排列的体外翻译反应包括至少100至100,000个体外翻译反应(IVT)，例如200个IVT、300个IVT、400个IVT、500个IVT、1,000个IVT、2,000个IVT、3,000个IVT、5,0000个IVT、7,000个IVT、8,000个IVT、20,000个IVT、30,000个IVT、40,000个IVT、50,000个IVT、60,000个IVT、70,000个IVT、80,000个IVT、90,000个IVT，或至少100个IVT至约100,000个IVT之间另一数量的IVT。在其他实施方式中，这些排列的IVT包括至少3个IVT至约50个IVT，例如5个IVT、8个IVT、10个IVT、15个IVT、20个IVT、30个IVT、40个IVT，或至少3个IVT至约50个IVT之间另一数量的IVT。
[0095] 通常，用于生成本发明所述生物传感器微阵列的捕获部分是以单层形式提供的。换言之，这些捕获部分(共价或非共价)结合于固体支持物基材表面。随后通常使捕获部分包被的载玻片覆盖接触分离的体外翻译反应的阵列(例如在微米孔或纳米孔中)以特异性捕获体外翻译的蛋白质(即检测多肽)以形成不含来自体外翻译翻译的污染物(例如核糖体和核酸)的纯化的检测多肽的单层。参见图2-4。可通过本领域已知的多种方法中的任一种生成阵列形式的检测多肽，包括但不限于：核酸可编程蛋白质阵列(NAPPA)、分离的捕获或覆盖捕获、蛋白质原位阵列(PISA)和从DNA阵列到蛋白质阵列(DAPA)，特别是以纳米孔阵列形式提供时。较高密度的微阵列降低了点样的蛋白质的空间分离。使用传统平面载玻片的实验显示，当微阵列上各点之间中心至中心分隔距离小于400nm时，出现反应物扩散的问题。虽然在750nm的间距时观察到最小扩散，但当点间隔降低至375nm时出现显著扩散。
[0096] 在一些实施方式中，体外翻译排列在可密封的纳米孔中，各纳米孔的直径约250微米且深度为75微米，各孔之间中心至中心的距离为至少400nm至约1000nm。在一些实施方式中，这些体外翻译阵列以硅晶片上制造的纳米孔阵列形式提供。
[0097] 参见例如Takulapalli等(2012),J.Proteome Res.,(8),第4382–4391页。将捕获部分(例如多肽，如抗体，或亲和素)连接至金属基材表面(如金)的方法是本领域已知的，参见例如Moth-Poulsen等(2010)，Bioconjug Chem,21(6):1056-1061；Yang等(2005),Langmuir,21(5):1858-1865。
[0098] 在一些实施方式中，体外翻译反应以微米孔阵列的形式提供，一个微米孔的尺寸范围可以是直径约300nm至直径约1000nm。
[0099] 生物传感器微阵列试验
[0100] 在多个实施方式中，本文所述生物传感器微阵列用于多种应用以检测样品中是否存在一种或多种分析物。在多个实施方式中，一种生物传感器微阵列试验，其包括：(i)使本文所述生物传感器微阵列接触包含一种或多种待检测分析物的测试样品，其中，至少一种分析物与生物传感器微阵列中检测多肽或检测肽的特异性结合或相互作用或反应生成可检测信号；以及(ii)检测和测定至少一种分析物与至少一种检测多肽或肽结合或相互作用或反应相关的信号水平。
[0101] 在其他实施方式中，其中使用反应性多肽配置生物传感器微阵列以生成并检测报告剂，该方法包括以下步骤：(i)使生物传感器微阵列接触包含一种或多种配体的测试样品，其中，一种或多种目标配体与一种反应性多肽的相互作用或反应生成报告剂；以及(ii)检测和测定该报告剂的信号水平。
[0102] 在一些实施方式中，该信号通过场效应生成并经由基于场效应晶体管(FET)的传感器转换。参见例如图5。
[0103] 合适的测试样品包括但不限于：生物样品(例如全血、血清、血液部分、痰液、尿液、活检样品和粗裂解物)；纯化的化合物(例如小分子药物候选化合物)；小分子化合物文库；细胞培养物蛋白质提取物或用过的培养基上清；细菌培养物；以及植物提取物。
[0104] 在一些实施方式中，在待测定样品中检测至少1-500种分析物，例如至少1、2、4、5、7、10、15、20、30、50、75、100、150、200、300、400、450或其他数目的待测定分析物。在一些实施方式中，在样品中检测至少十种不同分析物。在一些实施方式中，在样品中检测至少5000种不同分析物。在一些实施方式中，在样品中检测至少100,000种不同分析物。在一些实施方式中，在样品中检测至少十种不同分析物。
[0105] 在一些实施方式中，至少一种分析物是蛋白质、抗体、非肽药物、代谢物或核酸。在一些实施方式中，一种或多种待检测分析物包含分子量为约100道尔顿至约900道尔顿的药物候选化合物。例如，在通过表型筛选鉴定药物候选物时，鉴定的药物候选物的作用模式和/或靶标是未知的。因此，这些生物传感器微阵列和微阵列试验对于鉴定药物候选物的靶标而言非常有用，具体方法为检测药物候选物与传感器微阵列中检测多肽的相互作用，或者检测这类相互作用生成的副产物(即报告剂)。
[0106] 在一些实施方式中，待检测分析物是与身体病症(例如癌症、感染性疾病或自身免疫疾病)相关的多种抗体。实际上，在生物样品中存在多种抗体提供了疾病相关诊断“特征”。参见例如图11-12。
[0107] 在一些实施方式中，该生物传感器微阵列用于定量测试样品中一种或多种分析物与相应检测多肽之间相互作用的动力学速率。在其他实施方式中，该生物传感器微阵列使用评估蛋白质-蛋白质相互作用或对蛋白质活性的抑制。例如，当检测多肽是蛋白激酶底物或具有自身磷酸化活性的激酶时，可在已知或推定的特定磷酸激酶活性抑制剂存在或不存在的情况下检测磷酸激酶活性(参见例如图6-7)。这还可用于分析蛋白激酶抑制剂的特异性，其中多种不同的蛋白激酶是检测多肽，可在推定的激酶抑制剂存在或不存在的情况下定量其相对活性以测定测试的激酶抑制剂化合物的特异性。此外，当激酶磷酸化的提高与特定疾病状态相关时，可通过使本发明所述生物传感器微阵列接触相关生物样品并检测一种或多种检测多肽的磷酸化来评估特定生物样品的激酶活性。蛋白激酶是多种身体病症的重要靶标，例如癌症、肺动脉高血压、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病、CNS病、黄斑变性、特发性肺纤维化、系统性硬化病、类风湿性疾病等，允许发现激酶抑制剂药物并将激酶功能性筛选应用为疾病诊断学。
[0108] 在一些实施方式中，待使用的生物传感器微阵列包含检测多肽或反应性多肽，其可逆地结合本发明所述捕获部分。在一些实施方式中，当检测多肽或反应性多肽可逆结合时，该试验方法还包括在检测步骤前释放可逆结合的多肽的步骤。当报告剂的生成由溶液中的反应性多肽(而非固定的多肽，其可导致位阻现象)与目标配体的相互作用促进或需要这类相互作用。当该报告剂是反应性多肽本身的翻译后修饰形式时，这也是有用的。例如，样品中感兴趣的分析物(“目标配体”)可以是蛋白激酶，此时底物是与捕获部分结合的“反应性多肽”。反应性多肽底物的释放随后允许通过使用对磷酸化多肽(即“报告剂”)具有特异亲和性的捕获部分捕获磷酸化。
[0110] 实施例1使用分离的蛋白质捕获传感器阵列进行免疫筛选或抗体谱分析(预测性)[0111] 应用本发明公开的蛋白质生物传感器的示例性方法是用于疾病诊断和预后的免疫(自身免疫)特征筛选或抗体谱分析。除抗体谱分析外，“疾病组学”和“癌症组学”生物传感器可用于亲和谱分析和相互作用谱分析(参见例如图12)。
[0112] 例如，可使用NAPPA-IPC方法表达乳腺癌患者(单一患者或多个患者)中来自肿瘤细胞系的基因(全部基因或特定基因亚组)并可在装置表面上(或者在第二表面上)直接捕获所得肿瘤蛋白/抗原。此时，可以以阵列形式在直接在传感器装置中(或靠近传感器装置处)生产数百至数千种乳腺癌特异性阵列蛋白质。这可以使用乳腺癌基因文库以相对简单的方式在单个原位表达步骤中完成。通常，这可用作女性中乳腺癌阵列检测/筛选的极佳诊断装置。如果存在导致肿瘤的癌症(即使在非常小/最初的阶段)，身体免疫系统生成特异性针对这些癌蛋白/生物标志物/生物分子/细胞的抗体，且进一步生成的抗体相比癌蛋白/细胞/其他生物标志物数量增大。因此，上述所述使用表达自乳腺癌基因的蛋白质/抗原包被的传感器装置可用于检测来自患者的相关体液或活检样品/血液/组织试样中特异性针对乳腺癌细胞的抗体。如果观察到通过底部传感器检测的抗体特征(表示抗体对传感器上乳腺癌蛋白的结合模式)类似于来自乳腺癌肿瘤的抗体，则表明测试患者具有乳腺癌肿瘤的可能性很高。该方法中可以使用来自测试患者的任何典型的临床测试样品，例如血液、血清、活检样品、体液、唾液、组织样品、细胞裂解物、呼吸提取物(在溶液中捕获的呼出气体)等。通过鉴定和定量抗体特征，还可检测肿瘤的尺寸和疾病的阶段，因为与早期阶段癌症相比，较多数量的抗体存在于较晚期阶段的癌症。可使用癌蛋白包被的生物传感器在一个下午进行完整的乳腺癌诊断测试，其中传感器阵列上包被的癌蛋白的文库的患者抗体特征可用于诊断女性身体中是否存在乳腺癌肿瘤。
[0113] 许多目前的诊断测试使用蛋白质生物标志物的检测，其通常数量非常少。然而，针对癌蛋白/生物分子/抗原的抗体(自身免疫)应答在组织/细胞/体液中被大幅扩大，其中对癌蛋白/生物分子/细胞特异性的抗体可以超过癌蛋白/生物分子/细胞本身数个数量级的含量存在，有助于具有较高灵敏性的较容易的检测。因此，使用简单的筛选，可获得抗体特征以诊断乳腺癌。
[0114] 此外，使用这类蛋白质传感器平台，能够检测肿瘤是由良性还是恶性癌症导致的，其类型和子类型(在ER+、PR+、HER2+乳腺癌之间区分)，其耐药性，发展的阶段等。这是因为体内的自身抗体/免疫应答是对体内的疾病或癌症类型和亚类型具有特异性的。例如，与恶性肿瘤相比，良性肿瘤预期具有不同的抗体应答。因此，当使用乳腺癌肿瘤蛋白传感器文库进行测试时(其包含来自恶性和良性肿瘤良性的蛋白质)，由传感器检测的抗体特征或免疫应答在两种情况之间不同。
[0115] 癌症组蛋白质传感器阵列芯片
[0116] 通过使用具有大阵列尺寸的传感器阵列并使用表达自一些或全部肿瘤、癌、肉瘤、白细胞、淋巴瘤的基因的独特的多组蛋白质修饰部分阵列(传感器亚组)，可生产能够检测和诊断测试患者中任何这类癌症的癌症组蛋白质传感器芯片。
[0117] 疾病组蛋白质传感器阵列芯片
[0118] 使用本发明所述方法，可使用特异性针对一些或全部已知疾病的多组蛋白质生产蛋白质传感器芯片。这可用于测试患者中任何和所有已知疾病和病症的检测、诊断和预后。
[0119] 感染的检测
[0120] 类似地方法可用于生产使用蛋白质/抗原修饰的传感器阵列芯片，所述蛋白质/抗原表达自任何或所有致病病原体(如病毒、细菌、真菌、原生动物、蠕虫、朊病毒、其他单细胞或多细胞致病剂)的基因。由于感染细菌/疾病的患者的免疫系统生成针对细菌细胞/蛋白质/脂质等的抗体，对感染剂特异性应答生成的抗体特征谱的分析可用作检测患者中感染的理想诊断方法。从病原体中表达蛋白质/抗原生成的蛋白质生物传感器可因此用于检测测试患者的抗原应答以检测和诊断特定疾病的感染、害病、发展。这类传感器可用于诊所以诊断感染，也可用于生物防御以检测病原体、生物剂、化学剂、感染等。除人以外，本发明所述这些方法和特定应用也可用于检测和诊断其他动物、其他物种、野生动物、宠物、狗、猫、奶牛等的疾病、感染和病症。
[0121] 实施例2抗体谱分析传感器的应用(预测性)
[0122] 使用磁性纳米颗粒或包被有抗人二抗(通常用作二抗，在任何宿主中制备)的珠处理从测试患者中获取的感兴趣的血液或血清或体液或细胞提取物或组织提取物或活检样品或混合上述两种物质，持续简短时间。这导致待捕获的测试流体中存在的所有抗体都结合在磁性颗粒上，其随后可在多个清洗步骤中从测试流体中分离出来。或者，可使用抗体捕获剂(如化学接头、即混型涂料(mix&go coating)、生物偶联物等)包被磁珠。随后可将磁性颗粒上捕获的抗体与磁性颗粒化学或酶促分离/切开/解离，并可使用蛋白质传感器阵列芯片检测所得纯抗体溶液——从而检测疾病特异性的抗体，辅助疾病诊断和预后。或者，可使用蛋白质传感器阵列芯片直接测定具有捕获的抗体的磁性颗粒，且来自传感器阵列的多重信号可用于检测和诊断疾病和其他人类病症。
[0123] 实施例3蛋白质-蛋白质相互作用谱分析(预测性)
[0124] 蛋白质组传感器阵列(如上文所述)可用于蛋白质相互作用谱分析，测量传感器结合的蛋白质与患者样品(如血液或血清或体液或细胞提取物或组织提取物或活检样品)中蛋白质的相互作用。通过表达所有天然产生的人蛋白质(包括翻译后修饰的蛋白质)或其亚组来生成蛋白质组生物传感器芯片。类似于上文所述抗体谱分析，疾病组/癌症组生物传感器还可用于通过传感和测量患者样品中蛋白质与传感器结合的疾病蛋白的相互作用来进行蛋白质-蛋白质相互作用谱分析。
[0125] 蛋白质-蛋白质相互作用在自然中是非常特异性和选择性的，且因此相互作用特征对于疾病、癌症而言是独特的。DNA相互作用在自然中较大程度上是线性的，而蛋白质相互作用是多维的。设想蛋白质以多个位置和多个平衡具有多种作用，这取决于特定情况/时间于特定位置处存在的蛋白质的浓度。原则上，这是因为蛋白质的功能性取决于其折叠的三维结构，并且蛋白质的相互作用是平衡过程。因此，从复杂蛋白质相互作用提取信息所面临的挑战具有五个要素：(a)(高通量)提取的信息的大小(b)3维功能(化学和物理上的蛋白质异质性)(c)信息的内容或性质(我们是否能够获得动力学/动态信息？)(d)提取的信息的保真度(假阳性和假阴性？)(e)信息读出的时间(或速度)(例如，实时感测)。除了解析产生关于重要方面(例如各节点程度(k)、程度-程度相关性、聚类、微观性质)的信息的蛋白质相互作用网络(拓扑学)，采用蛋白质生物传感器的终极目的是除解读相互作用拓扑学以外的蛋白质相互作用动力学和动态。由蛋白质生物传感器微阵列提取的蛋白质相互作用特性和相互作用拓扑学可用于获取对于人体中发生的全部即时事件的快照，其中将相互作用和相互作用速率与感染或癌症或疾病或炎症或其它人类病症等的起始/存在/不存在/发展直接关联。
[0126] 实施例4亲和谱分析(预测性)
[0127] 蛋白质通过与其他蛋白质、DNA/寡核苷酸、代谢物、小分子、抗体、肽、离子、信号分子和药物分子相互作用而实现其功能。DNA-蛋白质相互作用在多种过程中出现，例如经由盐桥的静电相互作用、经由氢键的偶极相互作用、亲水/疏水相互作用和经由碱基叠加的分散力。这些不同的关联为这些相互作用赋予序列特异和蛋白表位组特异的选择性。理解蛋白质-DNA相互作用以获得与特定蛋白质形成选择性复合物的核酸序列的知识对于理解许多细胞调控过程(如转录因子-DNA结合等)而言是至关重要的。参见例如Boon等(2002),Nat Biotechnol,20(3):282-286以及Link等(2013),Nat Biotechnol(2013),31:357-361。
[0128] 实施例5酶活性和翻译后修饰(PTM)的检测(预测性)
[0129] 公开的蛋白质生物传感器可用于检测酶活性。一种示例性应用是将至少一种感兴趣的酶添加至传感器结合的生物芯片并通过传感器响应检测针对存在的那组蛋白质的特异性酶活性。另一种示例性应用是其中结合于阵列传感器位置的蛋白质是酶，其中在传感器位置上生产并捕获酶蛋白。这些酶生物传感器可用于检测针对测试蛋白质、DNA或测试介质中的其他生物分子的特异性活性。在这两种情况下，这些蛋白质/酶直接结合传感器表面(其检测反应所生成的蛋白质/酶变化)，或者这些蛋白质/酶与目标分子反应并通过传感器检测反应产物。一种示例性生物传感器基于检测酶催化反应生成的电子或质子。在另一个实施例中，通过生物传感器检测酶催化反应的产物。
[0130] 此外，本申请所述蛋白质生物传感器可用于检测传感器阵列结合的蛋白质的翻译后修饰。可以检测的示例性PTM是(但不限于)：酰化、乙酰化、去乙酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、酰胺化、糖基化、氧化、糖化、磷酸化、生物素化、泛素化、SUMO化、类泛素化、硫酸化、PEG化、瓜氨酸化、去磷酸化、去酰胺化、消除化(eliminylation)。
[0131] 实施例6高通量药物发现(预测性)
[0132] 小分子或配体相互作用筛选
[0133] 鉴定与蛋白质相互作用的小分子、发现针对任何给定蛋白质的配体分子的能力对于理解蛋白质功能、活性调控和药物分子的开发而言至关重要。使用诸如混合裂分合成的策略和相应标签技术的发展，目前能够制备合成和天然产物样小分子化合物的大集合。使用上文所述蛋白质生物传感器(蛋白质组生物传感器、疾病组生物传感器等)，能够以非常高通量的方式检测感兴趣的蛋白质的小分子配体。通过监测传感器应答，使用小分子测定与传感器装置结合的蛋白质以测试特异性相互作用。传感器应答也允许检测小分子/配体相互作用的速率。
[0134] 公开的蛋白质生物传感器可用于毒性研究，交叉反应性研究，其中使用传感器结合的蛋白质阵列测定测试药物分子或探针分子(如抗体或小分子或大分子)以通过传感器应答检测反应性。参见例如Macbeath等(1999),J Am Chem Soc,121:7967-7968，其讨论了生成小分子文库和使用感兴趣的蛋白质筛选以检测特异性结合或相互作用的方法。我们公开了相反的情况，其中蛋白质结合于大阵列中的传感器并通过测量传感器应答来检测小分子结合。也参见Wang等(2005),Proc Natl Acad Sci USA,102(9):3208-3212，其描述了使用纳米线传感器检测小分子蛋白质相互作用。
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