二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用
专利汇可以提供二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种二氢 杨梅素 在拮抗奶 牛 乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，包括 奶牛 乳腺上皮细胞对数生长期细胞的培养、奶牛乳腺上皮细胞热应激处理、热应激处理后细胞存活率检测以及二氢杨梅素对奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤的调控验证。本发明致 力 于阐明二氢杨梅素对高温诱导奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤的拮抗作用和机制，有助于深入了解高温环境对正常奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤和二氢杨梅素拮抗细胞凋亡的作用机理及内在联系。，下面是二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用专利的具体信息内容。
1.一种二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，其特征在于，包括奶牛乳腺上皮细胞对数生长期细胞的培养、奶牛乳腺上皮细胞热应激处理、热应激处理后细胞存活率检测以及二氢杨梅素对奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤的调控验证，具体包括以下步骤：
A奶牛乳腺上皮细胞对数生长期细胞的培养
①取液氮冻存的奶牛乳腺上皮细胞系1 mL，37℃水浴复苏后常规培养，以细胞培养基DMEM/F12加10%体积分数的胎牛血清作为完全培养基，于37℃、5%的CO2培养箱中培养，每隔
2～3天更换培养基或传代培养，取对数生长期细胞用于后续试验；
B奶牛乳腺上皮细胞热应激处理
①用0.25%的胰蛋白酶消化收集上述步骤A中对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，细胞计数板计数后，制备成1×104个/mL的细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔接种200μL，接种两板，同时置于37℃、5%的CO2培养箱中培养24 h；
②培养结束后将每板随机各分为5个试验组，每组5个重复，向各个试验组中分别加入含0μΜ、5μΜ、10μΜ、25μΜ及50μΜ的二氢杨梅素完全培养基200 μL继续于37℃、5%的CO2培养箱中预处理12 h；
③将上述步骤②中处理后的两板细胞，随机分为两组，其中1板转入42℃、5%的CO2培养箱中高温培养2 h，引起热应激反应；另一板继续于37℃、5%的CO2培养箱中正常培养2 h；
C热应激处理后细胞存活率检测
①向上述步骤B中热应激处理结束后的两个培养板中每孔加入10 μL CCK-8溶液，并于
37℃、5%的CO2培养箱孵育1 h，全波长酶标仪测定各孔在激发波长为490 nm处的吸光度OD值，分别计算每组细胞存活率，
细胞存活率=试验组OD值/对照组OD值×100%
其中，选取37℃、5%的CO2培养箱中培养且二氢杨梅素物质的量浓度为0 μΜ的组别为对照组，对照组的细胞存活率定义为100%；
D二氢杨梅素对奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤的调控验证
①根据上述步骤C的细胞存活率检测结果，选择二氢杨梅素物质的量浓度25μΜ为作用浓度，用0.25%的胰蛋白酶消化收集上述步骤A中对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，细胞计数板计数后，制备成1×105个/mL的细胞悬液，并接种于6孔细胞培养板中，每孔2 mL，接种两板，同时置于37℃、5%的CO2培养箱中培养24 h后，建立以下4组试验：
a、对照组，将细胞板放置于37℃条件下正常培养2 h；
b、二氢杨梅素模型组，向细胞板中添加25μΜ的二氢杨梅素，并放置于37℃条件下正常培养2 h；
c、热应激模型组，将细胞板放置于42℃高温条件下培养2 h；
d、热应激挽救组，向细胞板中添加25μΜ二氢杨梅素，并放置于42℃高温条件下培养2 h；
②采用流式细胞术检测上述4个试验组中乳腺上皮细胞凋亡百分数；
③采用荧光定量PCR即RT-qPCR检测HSP70、Bax和Bcl-2 mRNA表达量；
④采用蛋白免疫印迹法即Western blot检测HSP70和Bax的蛋白表达丰度。
2.根据权利要求1所述的二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，其特征在于，所述全波长酶标仪型号为Bio-Tek(Eon)。
3.根据权利要求1所述的二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，其特征在于，所述流式细胞术检测包括以下步骤：
a、用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化收集上述步骤D中4个试验组细胞，转移至离心管中，300g离心5min，弃上清液；
b、弃上清液后每组加入1mL 4℃预冷的PBS洗涤，相同条件离心弃上清后，每组加100 μL的1×Binding Buffer重悬细胞；
c、转入流式管，依次加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，轻轻混匀，避光、室温反应10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀，1 h内用流式细胞仪检测。
4.根据权利要求3所述的二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，其特征在于，所述流式细胞仪型号为BD FACSCalibur。
5.根据权利要求1所述的二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR方法包括以下步骤：
a、弃上述步骤D中4个试验组六孔板的培养基，PBS洗涤3次细胞，采用Trizol法提取总RNA，Nanodrop超微量分光光度计测定RNA浓度和OD 260/280比值，其中比值为1.8～2.1为RNA纯度良好，DEPC水调整总RNA浓度为500 ng/μL，根据Takara的反转录试剂盒将纯度良好的总RNA反转录成cDNA，总体系20 μL，其中：RNA（500 ng/μL）4 μL，5 × PrimeScript RT Master Mix 4 μL，RNase Free dH2O 12 μL，冰上操作，混匀后，置于PCR仪上完成反应，反应程序为：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃，反应结束后将所得cDNA产物于-20ºC低温保存备用；
b、根据奶牛相应基因CDS区序列，采用Primer 5.0设计特异性引物，序列如下：
RT-qPCR反应体系：总体积20 μL，其中：模板cDNA（500ng/ μL）2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH20 7.2 μL，2 × ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL；
RT-qPCR反应程序：预变性95℃ 30 s；循环反应95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环；溶解曲线95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s；
该反应以β-Act in为内参，通过计算2-∆∆Ct得出相应目的基因的相对表达量。
6.根据权利要求1所述的二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，其特征在于，所述Western blot检测包括以下步骤：
a、弃上述步骤D中4个试验组六孔板培养基，4℃预冷的PBS洗三次，吸水纸吸干残液，置于冰上；每孔加入100 μL含1% PMSF的蛋白裂解液，细胞刮刀刮下细胞，冰上裂解30 min；收集细胞裂解液于1.5 mL的离心管中，4 ℃，12 000 r离心15 min，弃沉淀；通过BCA检测法检测蛋白浓度；
b、将上述蛋白样品进行Western blot检测；
c、检测结果采用Image J软件处理系统分析目标条带的灰度值。
二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用
技术领域
背景技术
发明内容
①取液氮冻存的奶牛乳腺上皮细胞系1 mL，37℃水浴复苏后常规培养，以细胞培养基DMEM/F12加10%体积分数的胎牛血清作为完全培养基，于37℃、5%的CO2培养箱中培养，每隔
2～3天更换培养基或传代培养，取对数生长期细胞用于后续试验；
B奶牛乳腺上皮细胞热应激处理
①用0.25%的胰蛋白酶消化收集上述步骤A中对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，细胞计数
4
板计数后，制备成1×10个/mL的细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔接种200μL，接种两板，同时置于37℃、5%的CO2培养箱中培养24 h；
②培养结束后将每板随机各分为5个试验组，每组5个重复，向各个试验组中分别加入含0μΜ、5μΜ、10μΜ、25μΜ及50μΜ的二氢杨梅素完全培养基200 μL，继续于37℃、5%的CO2培养箱中预处理12 h；
③将上述步骤②中处理后的两板细胞，随机分为两组，其中1板转入42℃、5%的CO2培养箱中高温培养2 h，引起热应激反应；另一板继续于37℃、5%的CO2培养箱中正常培养2 h；
C热应激处理后细胞存活率检测
①向上述步骤B中热应激处理结束后的两个培养板中每孔加入10 μL CCK-8溶液，并于
37℃、5%的CO2培养箱孵育1 h，全波长酶标仪测定各孔在激发波长为490 nm处的吸光度OD值，分别计算每组细胞存活率，
细胞存活率=试验组OD值/对照组OD值×100%
其中，选取37℃、5%的CO2培养箱中培养且二氢杨梅素物质的量浓度为0 μΜ的组别为对照组，对照组的细胞存活率定义为100%；
D二氢杨梅素对奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤的调控验证
①根据上述步骤C的细胞存活率检测结果，选择二氢杨梅素物质的量浓度25μΜ为作用浓度，用0.25%的胰蛋白酶消化收集上述步骤A中对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，细胞计数
5
板计数后，制备成1×10 个/mL的细胞悬液，并接种于6孔细胞培养板中，每孔2 mL，接种两板，同时置于37℃、5%的CO2培养箱中培养24 h后，建立以下4组试验：
a、对照组，将细胞板放置于37℃条件下正常培养2 h；
b、二氢杨梅素模型组，向细胞板中添加25μΜ的二氢杨梅素，并放置于37℃条件下正常培养2 h；
c、热应激模型组，将细胞板放置于42℃高温条件下培养2 h；
d、热应激挽救组，向细胞板中添加25μΜ二氢杨梅素，并放置于42℃高温条件下培养2 h；
②采用流式细胞术检测上述4个试验组中乳腺上皮细胞凋亡百分数；
③采用荧光定量PCR即RT-qPCR检测应激和凋亡相关基因HSP70、Bax和Bcl-2 mRNA表达量；
④采用蛋白免疫印迹法即Western blot检测应激和凋亡相关蛋白HSP70和Bax的蛋白表达丰度。
b、弃上清液后每组加入1mL预冷的PBS洗涤，相同条件离心弃上清后，每组加100 μL的1×Binding Buffer重悬细胞；
c、转入流式管，依次加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，轻轻混匀，避光、室温反应10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀，1 h内用流式细胞仪BD FACSCalibur检测。
b、根据奶牛相应基因CDS区序列，采用Primer 5.0设计特异性引物，序列如下：
RT-qPCR反应体系：总体积20 μL，其中：模板cDNA（500ng/ μL）2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH20 7.2 μL，2 × ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL；
RT-qPCR反应程序：预变性95℃ 30 s；循环反应95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环；溶解曲线95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s；
该反应以β-Act in为内参，通过计算2-∆∆Ct得出相应目的基因的相对表达量。
b、将上述蛋白样品进行Western blot检测；
c、检测结果采用Image J软件处理系统分析目标条带的灰度值。
2、本发明可为深入研究奶牛热应激的调节机理、营养调控和药效学研究提供试验模型基础和数据参考；
3、本发明以奶牛乳腺上皮细胞为试验材料比通过活体组织取样获得试验材料简单、安全、经济，在体外培养条件下研究应激对乳腺上皮细胞的影响，从而能够直接观察细胞发生的一系列应激反应，并进一步对药物的作用作出客观评价，解决在活体情况下难以研究的许多问题。
附图说明
具体实施方式
①取液氮冻存的奶牛乳腺上皮细胞系1 mL，37℃水浴复苏后常规培养，以细胞培养基DMEM/F12加10%体积分数的胎牛血清作为完全培养基，于37℃、5%的CO2培养箱中培养，每隔
2～3天更换培养基或传代培养，取对数生长期细胞用于后续试验；
B奶牛乳腺上皮细胞热应激处理
①用0.25%的胰蛋白酶消化收集上述步骤A中对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，细胞计数
4
板计数后，制备成1×10个/mL的细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔接种200 μL，接种两板，同时置于37℃、5%的CO2培养箱中培养24 h；
②培养结束后将每板随机各分为5个试验组，每组5个重复，向各个试验组中分别加入含0μΜ、5μΜ、10μΜ、25μΜ及50μΜ的二氢杨梅素完全培养基200 μL继续于37℃、5%的CO2培养箱中预处理12 h；
③将上述步骤②中处理后的两板细胞，随机分为两组，其中1板转入42℃、5%的CO2培养箱中高温培养2 h，引起热应激反应；另一板继续于37℃、5%的CO2培养箱中正常培养2 h；
C热应激处理后细胞存活率检测
①向上述步骤B中热应激处理结束后的两个培养板中每孔加入10 μL CCK-8溶液，并于
37℃、5%的CO2培养箱孵育1 h，全波长酶标仪测定各孔在激发波长为490 nm处的吸光度OD值，分别计算每组细胞存活率，
细胞存活率=试验组OD值/对照组OD值×100%
其中，选取37℃、5%的CO2培养箱中培养且二氢杨梅素物质的量浓度为0 μΜ的组别为对照组，对照组的细胞存活率定义为100%，检测结果如下图所示：
表1热应急处理后细胞存活率检测结果表
所述全波长酶标仪型号为Bio-Tek(Eon)。
a、对照组（37℃），将细胞板放置于37℃条件下正常培养2 h；
b、二氢杨梅素模型组（37℃+DMY），向细胞板中添加25μΜ的二氢杨梅素，并放置于37℃条件下正常培养2 h；
c、热应激模型组（42℃），将细胞板放置于42℃高温条件下培养2 h；
d、热应激挽救组（42℃+DMY），向细胞板中添加25μΜ二氢杨梅素，并放置于42℃高温条件下培养2 h；
②采用流式细胞术检测上述4个试验组中乳腺上皮细胞凋亡百分数
所述流式细胞术检测包括以下步骤：
a、用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化收集上述步骤D中4个试验组细胞，转移至离心管中，300 g离心5 min，弃上清液；
b、弃上清液后每组加入1 mL预冷的PBS洗涤，相同条件离心弃上清后，每组加100 μL的
1×Binding Buffer重悬细胞；
c、转入流式管，依次加5 uL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，轻轻混匀，避光、室温反应10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀，1 h内用流式细胞仪BD FACSCalibur检测。
0.01）。
a、弃上述步骤D中4个试验组六孔板的培养基，PBS洗涤3次细胞，采用Trizol法提取总RNA，Nanodrop超微量分光光度计测定RNA浓度和OD 260/280比值，其中比值为1.8～2.1为RNA纯度良好，DEPC水调整总RNA浓度为500 ng/μL，根据Takara的反转录试剂盒将纯度良好的总RNA反转录成cDNA，总体系20 μL，其中：RNA（500 ng/μL）4 μL，5 × PrimeScript RT Master Mix 4 μL，RNase Free dH2O 12 μL，冰上操作，混匀后，置于PCR仪上完成反应，反应程序为：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃，反应结束后将所得cDNA产物于-20ºC低温保存备用；总共20 μL体系，冰上操作，混匀后，置于PCR仪上完成反应。
RT-qPCR反应体系：总体积20 μL，其中：模板cDNA（500ng/ μL）2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH20 7.2 μL，2 × ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL；
RT-qPCR反应程序：预变性95℃ 30 s；循环反应95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环；溶解曲线95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s；
-∆∆Ct
该反应以β-Act in为内参，通过计算2 得出相应目的基因的相对表达量。
a、弃上述步骤D中4个试验组六孔板培养基，4℃预冷的PBS洗三次，吸水纸吸干残液，置于冰上；每孔加入100 μL含1% PMSF的蛋白裂解液，细胞刮刀刮下细胞，冰上裂解30 min；收集细胞裂解液于1.5 mL的离心管中，4 ℃，12 000 r离心15 min，弃沉淀；通过BCA检测法检测蛋白浓度；
b、将上述蛋白样品进行Western blot检测；
c、检测结果采用Image J软件处理系统分析目标条带的灰度值。
（2）制备BCA工作液，按照50:1的比例混合试剂A与试剂B；
（3）加样，混匀上述蛋白样品，在96孔酶标板中，每个样品10 μL，BCA工作液90 μL；
（4）混匀，避免产生气泡，37ºC孵育30 min；
（5）用酶标仪测量其在562 nm处的吸光值；
（6）根据标准曲线，计算蛋白浓度，并调整至3 μg/μL。
（2）上样和电泳：加足够的电泳液后空跑15 min，以除去胶上可能存在的杂质，空跑后将样品加入电泳孔中，电泳，浓缩胶电压60V 30 min，分离胶用120V 60 min，电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳；
（3）转膜：准备6张7 × 9 cm的滤纸和一张大小适中的PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇激活15 s左右，在加有转移液的盘子中放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻棒，滤纸和经过活化的PVDF膜，将夹子打开使黑的一面保持水平，在垫子上垫海绵、三层滤纸，小心剥下分离胶盖于滤纸上，将膜盖于胶上，在膜上盖三张滤纸并除去气泡，最后盖上另一个海绵垫，合并三明治夹，插入转膜槽中，打开电源，90V 60min恒压转膜；
（4）封闭：将转好的膜置于室温脱色摇床上，加入5%的脱脂牛奶(TBST配制)，封闭1 h；
（5）一抗：将HSP70、Bax和β-act in一抗浓储液用5%的脱脂牛奶按1:2000稀释后，4ºC孵育膜过夜；
（6）二抗：用TBST在室温脱色摇床上将膜洗涤三次，每次5 min，将羊抗兔二抗用TBST按
1：5 000稀释，室温下孵育60 min后，TBST洗三次，每次5 min；
（7）曝光：ECL A和ECL B两种试剂在离心管中等体积混合，将PVDF膜的蛋白面朝上与此混合液充分接触，1 min后，去尽残液，包好，放入曝光仪中曝光。
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