重组人糖基化尿激酶原的制备方法
专利汇可以提供重组人糖基化尿激酶原的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 是利用 生物 工程 的方法,通过基因工程技 术构建了一种有双重放大功能的表达载体,并获得一株高效表 达的CHO工程细胞。经微载体和低血清培基高 密度 灌流培养 和纯化,制备一种 治疗 冠状动脉 梗塞,脑血栓,中央 视网膜 动静脉 血栓和其他血栓病的药物一重组人糖基化尿激酶原。，下面是重组人糖基化尿激酶原的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种重组人糖基化尿激酶原的制备方法，其组成包括：(1) 人尿激酶原全长cDNA基因的构建和克隆，(2)构建中间载体 1(pSV2-pro-UK)，构建中间载体2(pMTSV-dhfr)和新型高效表达载 体(pMTSV-du)，(3)转染和筛选高效表达CHO工程细胞，(4)高密 度培养和放大培养CHO工程细胞技术，(5)低血清培基成份配比以 及(6)工程细胞分泌产物的纯化技术，其特征在于利用基因重组技 术，将各种载体(pUC19，pMM-UK，pSV2-dhfr，pXMT，pSV2-pro-UK) 上的有用元件，进行重组，构建一个适合于在中国地鼠卵母细胞 (CHO)中高效表达其外源基因的新型载体(pMTSV-du)，通过转染 筛选获得高效表达的CHO工程细胞株CL-11G，并用微载体 (Biosilon，SH-2，Cytopore)灌流培养技术高密度培养和放大培养 CL-11G工程细胞及其产物的纯化。
2.如权利要求1所述的一种重组人糖基化尿激酶原的制备方 法，其特征在于：
(1)人尿激酶原全长cDNA基因的克隆，是采用肉豆寇酯(PMA) 诱导Detroit 562细胞，使细胞中尿激酶mRNA的含量提高8倍以 上，用酸性硫氰胍—酚—氯仿法提取细胞总RNA，oligo(dT)-纤维 素柱层析法分离poly(A+)RNA，通过反转录和dG·dC接尾重组技 术构建成Detroit 562细胞的cDNA文库，通过筛选而获得含有编 码尿激酶基因片段的阳性克隆株，采用人工合成寡核苷酸片段和 DNA重组技术，构建尿激酶原全长cDNA基因并克隆至pUC19 质粒DNA，获得一个pMM-UK重组质粒，经全序列测定证明， cDNA基因全长为1565bp，含有60bp(20aa)信号肽序列，1233bp 编码序列(1-411aa)和272bp 3’非编码序列，该基因5’端含有Hind III和EcoR1单一酶切位点，3’端含有SalI，XbaI，SmaI，KpnI和 SacI 5个单一酶切位点，便于尿激酶原的克隆和表达，
(2)中间载体1(pSV2-pro-UK)的构建，是将pSV2-dhfr载体用Bgl II酶切后用Klenow F酶末端补平，再用Hind III酶切，分离回收 载体大片段；从pMM-UK质粒DNA中，用Hind III和Sma I双酶 切，分离pro-UK cDNA；再将载体大片段与pro-UK cDNA连接形 成可表达pro-UK的重组质粒pSV2-pro-UK，
(3)中间载体2(pMTSV-dhfr)的构建，是将pSV2-dhfr表达质粒用 Bgl II酶切，并用Klenow F酶将末端补平，再通过T4 DNA连接 酶将质粒重新环化，并消除质粒中的Bgl II酶切位点，然后将该质 粒经BamH 1和pVU II双酶切及Klenow F酶将末端补平，通过电 泳回收1.9Kb DNA片段(内含SV40增强子和二氢叶酸还原酶基 因)，将此片段插入经EcoR1酶切，Klenow F酶末端补平的pXMT 载体中，从而获得了长度为8.25Kb的中间载体pMTSV-dhfr，
(4)新型高效表达载体(pMTSV-du)的构建，将pSV2-pro-UK重 组质粒经Sal1酶切，Klenow F酶末端补平，再通过T4 DNA连 接酶将质粒重新环化并消除了质粒中的Sal1酶切位点，然后将该 质粒经pVU1和EcoR V双酶切及Klenow F酶将末端补平，通过 电泳回收3.8Kb片段(含全长尿激酶原cDNA)，并将该片段插入经 Bgl II酶切，Klenow F酶末端补平的pMTSV-dhfr中间载体，从而 获得一个长度为12 Kb，能高效表达尿激酶原的载体pMTSV-du，
3.如权利要求1所述一种重组人糖基化尿激酶原的制备方 法，其特征在于转染和筛选高效表达的CHO工程细胞是将20- 40μg高效表达载体(pMTSV-du)质粒DNA通过磷酸钙共沉淀法转 染CHO-dhfr-细胞，先用HAT选择培养基筛选，10天后换成含 1-3×10-8M MTX选择培基进行dhfr和MTX双重筛选，并对33株 表达有尿激酶原活性的阳性转化细胞多次亚克隆和MTX加压扩 增基因，再经锌离子诱导筛选出高效表达，活性达到500-800 IU/106细胞/天的尿激酶原工程细胞株CL-11G，
4.如权利要求1所述一种重组人糖基化尿激酶原的制备方 法，其特征在于CHO工程细胞的高密度培养是用固体聚乙烯微载 体(Biosilon，SH-2)和多孔纤维素微载体(Cytopore)在一个由改进的 灌流培养控制装置(中国专利ZL 91208893.1)的反应器内进行灌流 培养，灌流量逐渐增加，使细胞密度达1-2×107/ml，尿激酶原的产 量随细胞密度的增加而增加，
5.如权利要求1所述一种人重组糖基化尿激酶原的制备方 法，其特征在于利用该CHO工程细胞在培养中能在微载体之间自 动转移的特点，用以放大生产规模，即直接将小反应器内已长有 细胞的微载体，转入加有3倍，5倍或7倍量的培养基和新鲜微 载体的大反应器内，继续灌流培养，
6.如权利要求1所述一种人重组糖基化尿激酶原的制备方 法，其特征在于低血清培基的研制是通过对培养过程中培基成份 的氨基酸分析，以及通过正交试验确定以DMEM/F12(1∶1)培基为 基础，佐以天门冬氨酸，胱氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，丝氨酸，谷 氨酰胺，蛋白胨，叶酸，抑肽酶(aprotinin)，Hepes以及葡萄糖等， 同时将原来培基中的小牛血清用量从5％减至1％和0.5％，
7.如权利要求1所述一种重组人糖基化尿激酶原的制备方 法，其特征在于：
(1)尿激酶原产品采用四步纯化方法，如：
第一步：CM-径向离子交换色谱，色谱柱的构成是用聚乙 烯与纤维素共聚膜共价结合羧甲基绕在多孔轴管上，并固定在有 机玻璃柱内，柱层析时的pH值为5.7，柱床体积700ml时流速为 25-30ml，
第二步：微孔高硅玻璃珠色谱，用微孔高硅玻璃珠装填层析 柱，层析后收集其蛋白吸收峰流出液，
第三步：凝胶色谱，收集其第二蛋白峰组份，
第四步：对氨基苯甲脒亲和色谱，层析其第三步的收集液， 并继续收集穿过蛋白的流出液。
(2)或采用一步法，即抗体亲和层析法，将尿激酶原先与苯 甲脒在室温保温0.5小时，再上单抗与Sepherose 4B偶联的层析 柱，然后收集活性峰。
本发明是利用生物工程技术，对以下六种载体如pUC19， pMM-UK，pSV2-dhfr，pSV2-pro-UK，pXMT，pMTSV-dhfr上的有用 元件，经过重组，构建一个适合在中国地鼠卵母细胞(CHO)中高效 表达外源基因的新型载体(pMTSV-du)，然后将转染筛选获得的 CHO工程细胞株CL-11G用微载体(Biosilon，SH-2，Cytopore)灌流 培养技术和低血清培基进行高密度培养，并对产品进行四步或一 步纯化，制备一种治疗冠状动脉梗塞，脑血栓，中央视网膜动静 脉血栓及其他血栓病的药物—重组人尿激酶原(prourokinase，简称 pro-UK)，此属于生物工程技术。
尿激酶原是尿激酶的前体，是一种糖蛋白，由411个氨基酸 组成，其本身无活性，经纤维蛋白溶解酶和激肽酶的激活，使其 Lys158-Ile159之间的肽链打开形成尿激酶，才能发挥其溶血拴的效 能。
自Bernit1973年发现pro-UK以来，已有人相继从人的血液， 尿液和各种重组宿主细胞培养液中获得，如用大肠杆菌培养液中 获得的有Holmes，W.E.1985以及安内.布兰法兹等(中国专利，CN 1042181A，1990-05-16)，用酵母表达成功的如Melnick，L.M.等 (1990)用中国地鼠卵母细胞(CHO)表达成功的有Nells，L.等(1987)； Avgerinos，G.C.等(1990)。
本发明包括：1.人尿激酶原全长cDNA基因的克隆，2.构建 在CHO细胞高效表达的转移载体和工程细胞株，3.对CHO工程 细胞的大量培养，获得大量尿激酶原原料，并加以纯化，其目的 在于利用生物工程技术制备一种适于临床应用的糖基化尿激酶原 产品。
本发明的技术要点是：
1.通过对Detroit 562细胞的诱导和提取细胞总RNA，经反 转录和dG·dC接尾构建了cDNA文库，再通过筛选和人工合成寡 核苷酸等DNA重组技术，构建了尿激酶原全长cDNA基因并克隆 至pUC19质粒DNA，获得pMM-UK重组质粒。
2.将几种表达载体如pUC19，pMM-UK，pSV2-dhfr，pSV2- proUK，pXMT，pMTSV-dhfr，等载体上的有用元件，经多次基因操 作和重组，构建了一个适合在CHO细胞中高效表达外源基因的新 型载体(pMTSV-du)。
3.采用微载体(Biosilon，SH-2，Cytopore)灌流培养技术和低血 清培基高密度培养CL-11G工程细胞，获得大量含高活性尿激酶原 的原料。
4.采用四步法，即CM阳离子亲和层析-MPG吸附层析- Sephacryl S-200凝胶过滤—对氨基苯甲脒色谱，或采用一步法， 即用抗体亲和层析法纯化产品。
实施例：
1.人尿激酶原全长cDNA基因的构建和克隆：采用肉豆寇酯 (PMA)诱导Detroit 562细胞，使细胞内尿激酶mRNA含量提高8 倍以上，用酸性硫氰胍—酚—氯仿法提取细胞总RNA，oligo(dT)- 纤维素柱层析法分离poly(A+)RNA，通过反转录和dG·dC接尾重组 技术构建了Detroit 562细胞的cDNA文库，通过筛选获得了含有 编码尿激酶基因片段的阳性克隆株。再采用人工合成寡核苷酸片 段和DNA重组技术，构建了人尿激酶原全长cDNA基因并克隆至 pUC19质粒DNA，获得了pMM-UK重组质粒。全序列测定结果 表明，cDNA基因全长为1565bp，含有60bp(20aa)信号肽序列， 1233bp编码序列(1-411aa)和272bp 3’非编码序列。该基因5’端含 有Hind III和EcoR1单一酶切位点，3’端含有Sal I，Xba I，Sma I， Kpn I和Sac I 5个单一酶切位点，便于尿激原基因的克隆和表达。
2.中间载体1 pSV2-pro-UK的构建：将pSV2-dhfr载体用Bgl II酶切后用Klenow F酶补平，再用Hind III酶切，分离回收载体 大片段；从pMM-UK质粒DNA中，用Hind III和Sma I双酶切， 分离pro-UK cDNA；将载体大片段与pro-UK cDNA连接形成可表 达pro-UK的重组质粒pSV2-pro-UK。
3.中间载体2 pMTSV-dhfr的构建：将pSV2-dhfr表达质粒用 Bgl II酶切，并用Klenow F酶将末端补平，再通过T4DNA连接酶 将质粒重新环化并消除了质粒中的Bgl II酶切位点。然后将该质粒 经BamH 1和pVU II双酶切及Klenow F酶将末端补平，通过电泳 回收1.9Kb DNA片段(内含SV40增强子和二氢叶酸还原酶基 因)。将此片段插入经EcoR1酶切，Klenow F酶末端补平的pXMT 载体中，从而获得了长度为8.25Kb的中间载体pMTSV-dhfr.
4.新型高效表达载体pMTSV-du的构建：将pSV2-pro-UK重 组质粒经Sal I酶切，Klenow F酶末端补平，再通过T4 DNA连接 酶将质粒重新环化并消除了质粒中的Sal I酶切位点。然后将该质 粒经pVU I和EcoR V双酶切及Klenow F酶将末端补平，通过电 泳回收3.8Kb片段含全长尿激酶原cDNA)，并将该片段插入经Bgl II酶切，Klenow F酶末端补平的pMTSV-dhfr中间载体，从而获 得长度为12Kb，可高效表达尿激酶原的载体pMTSV-du.该载体的 特点是：
A.将表达尿激酶原和二氢叶酸还原酶基因的两个转录单位置 于同一载体，分别受金属硫蛋白(MT)和SV40早期启动子控制， 使之具有用氨甲喋呤(MTX)使基因扩增和用金属Zn++诱导的双重 放大功能，这有利于尿激酶原的高表达。
B.将SV40增强子置于两个启动子之间，为两个启动子公用。 由于SV40增强子的增强作用广谱性强，有利于尿激酶原基因在多 种细胞中获得高效表达。
C.在载体的非必需区，有一Sal I单一酶切位点，可方便地进 行重组载体的线性化，有利于通过电击介导法获得多考贝尿激酶 原基因，并整合在细胞染色体上使稳定表达。
D.使表达尿激酶原和二氢叶酸还原酶的两个转录单位转录方 向相反，这可减少dhfr基因转录时对尿激酶原基因转录的影响， 有利于尿激酶原的高表达。
5.转染和筛选高效表达的CHO工程细胞：将20-40μg pMTSV-du质粒DNA通过磷酸钙共沉淀法转染CHO-dhfr-细胞， 先用HAT选择培基筛选，10天后换成含1-3×10-8M MTX的选择 培基进行dhfr和MTX双重筛选，并对33株表达有尿激酶原活性 的阳性转化细胞经多次亚克隆和MTX加压扩增基因，锌离子诱 导，最终筛选到三株能高效表达尿激酶原的细胞株，其中一株 CL-11G表达的活性可达500-800 IU/106细胞/天。该株细胞经长 期液氮保存和一百多次转代培养，表达水平基本不变。表达产物 经抗原性和Western印迹分析，其分子量为52Kd，较大肠杆菌表 达的分子量(47Kd)大，表明它确与天然的相似，是糖基化了的尿 激酶原。
6.CHO工程细胞的高密度培养：采用固体的聚苯乙烯微载体 如Biosilon，SH-2，和多孔纤维素微载体如Cytopore，在我们改进 了的灌流培养控制系统(已获中国国家专利，专利号：ZL 91208893.1，1994-08-24)控制下，用搅拌式生物反应器(如Celligen) 培养，灌流量自0.5个工作体积/天逐渐增加至2个工作体积/天， 细胞密度可达1-2×107/ml，尿激酶原产量可高达8096 IU/ml。培 养时间可长达53天。
7.放大生产规模：是利用该细胞能在微载体之间自动转移的特 点，直接将已长有细胞的微载体从小反应器转入加有3倍，5倍 或7倍量培基和新微载体的大反应器内。
8.研制和采用低血清培基：通过对培养过程中培基成份的氨 基酸分析，以及通过正交试验，确定以DMEM/F12(1∶1)为基础培 基的低血清培基，佐以天冬氨酸，胱氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，丝 氨酸，谷氨酰胺，蛋白胨，叶酸以及抑肽酶(aprotinin)，Hepes， 葡萄糖等。血清量从原来的5％减少到1％和0.5％。
9.四步法纯化尿激酶原：
第一步，CM-径向离子交换法：该色谱柱是由聚乙烯与纤维 素共聚膜共价结合羧甲基绕在多孔轴管上并固定在有机玻璃柱内 构成。先用0.15mol/L，pH5.7的磷酸缓冲液平衡。尿激酶原原液经 3000×g，4℃离心后用6mol/L HCl调pH至5.7后上柱，流速为 12-15ml/分(柱床体积250ml)或25-30ml/分(柱床体积700ml)。当洗 液中蛋白吸收峰值低于0.005以下时改用0.025mol/L，pH6.8的醋 酸缓冲液(含0.75mol/L硫酸铵)，0.005％Tween-80)洗脱，收集活性 蛋白峰流出液。
第二步，MPG吸附色谱法：它是由微孔高硅玻璃珠组成的色 谱柱。将第一步的收集液直接上柱，用0.5mol/LTris-HCl，pH9.5的 缓冲液洗去杂蛋白，再用0.02mol/L，pH8.0的磷酸缓冲液(含 0.1mol/L NaCl)洗至吸收峰值低于0.005以下后，分别用含1mol/L 和2mol/L硫酸铵的0.5mol/L，pH9.25的Tris-HCl缓冲液线性梯度 洗脱并收集蛋白吸收峰流出液。
第三步，凝胶色谱Sephacryl S-200 HR高效凝胶色谱先用 0.092mol/L，pH5.3 (含0.1mol/L NaCl)醋酸缓冲液平衡，然后将第二步的收集液上柱， 继续用该缓冲液洗柱并收集第二蛋白峰组分。
第四步，对氨基苯甲脒亲和色谱：先用0.092mol/L，pH5.3(含 0.2mol/L NaCl)的醋酸缓冲液平衡，然后将第三步收集液上柱，继 续用该缓冲液洗柱并收集穿过蛋白流出液。
10.一步抗体亲和层析法纯化：用制备的单克隆抗体和 Sepherose 4B偶联并装成层析柱。将收集的尿激酶原原液先与 0.002M苯甲醚在室温保温0.5h，然后上柱。用0.1M，pH2.2的Gly- HCl缓冲液洗脱，收集活性峰。
11.纯化产品的理化性能测定：纯化后的产品的活性可被抗尿 激酶的抗体中和，但不能被DFP抑制。分子量为52Kd，等电点为 8.9，N-末端氨基酸序列为SNELHQVPSNCDCLN，这些结果表 明，它与天然的糖基化的尿激酶原完全一致。
附图说明：
图1.pMTSV-du高效表达载体的构建。
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