一株呕吐毒素降解菌及其应用
阅读：1发布：2022-05-24
专利汇可以提供一株呕吐毒素降解菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一株呕吐毒素降解菌及其应用。该降解菌是选自广东省阳江市的 水 稻种植农田DON污染的 土壤 ，经过含DON的富集培养基培养，再以DON为唯一 碳 源的无机盐培养基驯化培养、压 力 筛选、分离、纯化获得。名称为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601，于2017年06月02日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省 微 生物 研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：60194。该菌在好 氧 条件下以DON作为唯一碳源和 能源 进行生长繁殖，同时将其快速降解，降解DON的 稳定性 良好，在优化培养基中传代5～8代，DON降解率均能达到50％以上。，下面是一株呕吐毒素降解菌及其应用专利的具体信息内容。
1.一株呕吐毒素降解菌，其特征在于：名称为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）WD601，于2017年06月02日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：60194。
2.一种呕吐毒素降解试剂，其特征在于：含有权利要求1所述的呕吐毒素降解菌。
3.权利要求1所述的呕吐毒素降解菌在降解呕吐毒素方面的非疾病治疗目的的应用。
4.权利要求2所述的呕吐毒素降解试剂在降解呕吐毒素方面的非疾病治疗目的的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
将权利要求1所述的呕吐毒素降解菌以10%接种量接种至含40～60 μg/mL呕吐毒素的无机盐培养基中，37 ℃下培养72～168 h。
一株呕吐毒素降解菌及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)，又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇，主要是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生的B类单端孢霉烯毒素，对谷物污染非常严重。已知DON在人类和动物中引起一系列疾病，如呕吐、拒食、腹泻、食管穿孔以及营养吸收不良等症状，其中猪对呕吐毒素最为敏感；同时，DON能使增长迅速、处于分裂状态的细胞凋亡，高浓度DON不仅能抑制动物免疫细胞增殖，还易造成妊娠期动物流产或对胚胎有致畸作用。
[0003] DON在谷物真菌毒素中检出率最高，不同地区制定了相应标准，如FDA规定食品中DON的安全标准是1mg/kg，我国在GB2715-2005和GB2761-2011中规定小麦等制品DON的允许限量不超过1mg/kg。目前，此类真菌毒素污染已对我国食品安全和农产品出口构成实际、严重负面影响，如何有效脱毒成为了亟待解决的重大社会问题。
[0004] 目前，国内外谷物和饲料霉变脱毒方法主要有物理吸附法、化学脱毒法以及生物脱毒法等。物理吸附法对DON吸附可逆且效率差，还易吸附微量营养元素，造成谷类和饲料中营养物质流失；化学脱毒易残留一些潜在有毒物质，对谷物和饲料造成二次污染，因此DON传统脱毒方法在实际应用中具有一定局限性；生物脱毒法是通过微生物释放的酶作用于DON，并将其转化为更低毒性的代谢产物，由于微生物降解具有成本低、效率高、营养物质损失少，无二次污染和生态恢复性良好等优点而受到广大关注。
[0005] 早期报道的DON降解菌大部分来源于动物肠道内容物，以肠道和牛瘤胃中分离出来的厌氧菌种居多。厌氧菌群虽然可以作用于DON并具有较好的降解效果，但是菌种分离纯化极其困难，且严谨与苛刻的反应条件并不适合大规模的DON生物脱毒；且所报道的几株兼性厌氧菌大部分为混合菌群，并没有将分解DON的微生物菌种进行纯种分离和鉴定。因此，亟需一种能高效降解DON的好养或兼性厌氧纯种菌，从而带动谷物和饲料中DON生物降解技术的进一步发展和应用。
发明内容
[0006] 为了克服现有DON微生物降解中的缺点与不足，本发明的目的在于提供一株呕吐毒素降解菌。该菌是从受DON污染的土壤中筛选分离的、在好氧条件下能以DON为唯一碳源在无机盐培养基中生长、并可高效降解DON的呕吐毒素降解菌。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述呕吐毒素降解菌的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009] 本发明提供一株呕吐毒素降解菌，菌种命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601，是选自广东省阳江市的水稻种植农田DON污染的土壤，经过含DON的富集培养基培养，再以DON为唯一碳源的无机盐培养基驯化培养、压力筛选、分离、纯化获得。
[0010] 所述的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2017年06月02日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC No：60194。
[0011] 所述的WD601的16S rDNA与阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae的同源性为99％。该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
[0012] 本发明还提供了含有所述的呕吐毒素降解菌的呕吐毒素降解试剂。
[0013] 本发明还提供了所述的呕吐毒素降解菌在降解呕吐毒素方面的应用。
[0014] 本发明还提供了所述的呕吐毒素降解试剂在降解呕吐毒素方面的应用。
[0015] 进一步的，所述的呕吐毒素降解菌在降解呕吐毒素方面的应用，包括如下步骤：
[0016] 将阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601以10％接种量接种至含40～60μg/mL DON的的无机盐培养基中，37℃下培养72～168h。
[0017] 所述的无机盐培养基为：0.5g/L(NH4)2SO4，0.2g/L MgSO4·7H2O，0.05g/L CaCl2，2.44g/L Na2HPO4，及1.52g/L KH2PO4，调节pH至7.0，121℃下灭菌15～20min。
[0018] 以无机盐培养基作为阴性对照，以含有40、60μg/mL DON的无机盐培养基作为阳性对照。
[0019] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0020] (1)本发明中分离纯化得到对DON降解性能好的微生物菌种阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601菌株，在好氧条件下以DON作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，同时将其快速降解，降解率达50％以上。本发明的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601菌株能在无机盐培养基中生长，筛选分离纯化技术简单。
[0021] (2)本发明的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601菌株降解DON的稳定性良好，在优化培养基中传代5～8代，DON降解率均能达到50％以上。在基础无机盐培养基中，DON初始浓度为40mg/L、60mg/L时，37℃培养7d后DON降解率分别为21.47％和40.40％。附图说明
[0022] 图1是本发明提供的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601菌株菌落形态图；其中，a：平板上菌落形态；b：显微镜下菌体形态；c：扫描电镜下菌体形态(20,000×)。
[0023] 图2是本发明提供的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601的16S rDNA片段PCR扩增结果。
[0024] 图3是本发明提供的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601的系统进化树。
[0025] 图4是本发明提供用HPLC检测DON标准品所得的标准曲线图。
[0026] 图5是本发明提供的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601的HPLC检测反应前后DON含量；其中，a：以不含DON的无机盐培养基的阴性对照；b：DON初始浓度为60μg/mL的阳性对照；c：当DON初始浓度为60μg/mL时，反应3d后降解率；d：当DON初始浓度为60μg/mL时，反应7d后降解率。
具体实施方式
[0027] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0028] 实施例1、Enterobacter cloacae WD601的筛选、分离及纯化
[0029] (1)菌株的富集
[0030] 将土壤样品过40目筛后，分别取1g用3mL生理盐水混匀。取100μL悬浮液，加至5mL含有10μg/mL DON的富集培养基中，设定三种不同的温度：25℃，30℃，37℃，并在180r/min下培养72h。
[0031] 所述含有DON的富集培养基为：称取10g蛋白胨，1g NaCl，1g葡萄糖，溶解于1000mL无菌蒸馏水中，调节pH至7.0，121℃下灭菌15min。
[0032] (2)涂布法筛选菌株
[0033] 分别吸取100μL培养3d的富集液，3,000r/min离心5min后弃上清，用100μL含20μg/mL的DON无机盐液体培养基悬浮沉淀，涂布于平板上，分别于25℃，30℃，37℃下培养24h。
[0034] 所述的无机盐培养基为：称取0.5g(NH4)2SO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.05g CaCl2，2.44g Na2HPO4，及1.52g KH2PO4，溶解于1000mL无菌蒸馏水中，调节pH至7.0，121℃下灭菌
15min。
15min。
[0035] (3)平板划线筛选菌株
[0036] 待培养基灭菌后，将DON标准溶液过0.22μm微孔滤膜后加入培养基中，使DON终浓度为20μg/mL。挑取单菌落接种于无机盐培养基中，分别在25℃，30℃，37℃培养箱培养24h。再次挑选单菌落，划线于无机盐培养基上培养24h，如此反复划线以纯化菌株。
[0037] 挑选培养18～24h的新鲜单菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察菌种生理形态。将单菌落接种至无机盐培养基中过夜培养，5,000r/min离心5min后弃上清，用适量的蒸馏水悬浮菌体，5,000r/min离心5min，重复上述操作一次，弃上清后用2mL无菌蒸馏水悬浮菌体，冷冻干燥得到菌粉，用扫描电镜进行观察。
[0038] 在无机盐培养基上，菌株生长只能利用DON作为唯一的碳源，以此为基础，可以将能降解DON的菌株从平板上分离出来。将菌种富集液在含有20μg/mL的DON无机盐固体培养基上培养24h后，在37℃的培养基中的菌落生长最快，挑选单菌落进行划线纯化。通过反复的划线纯化从广东阳江水稻土壤中筛选出了一株白色菌株，在基础无机盐培养基上菌株的生长情况如图1a所示，菌落呈圆形，直径在1mm左右，边缘整齐，表面湿润有光泽，呈灰白色。通过革兰氏染色在显微镜下进行观察，菌体形态如图1b所示，该菌株为革兰氏阴性菌，形态呈短杆状。将离心后的菌体冷冻干燥后，用SEM对干燥的菌粉进行观察，在20,000×的倍数下，菌体呈长短不等排列不规律的短杆状，两端钝圆，大小在0.5×1～3μm(图1c)。该菌株能够以DON作为唯一的碳源进行生长，说明可能具有降解DON的能力。将该菌株命名为WD601，并接种至含DON的液体培养基中培养并测定其降解能力。
[0039] 实施例2、分离菌株的鉴定
[0040] (1)菌落形态鉴定
[0041] 挑选培养18～24h的WD601的新鲜单菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察菌种生理形态。将单菌落接种至无机盐培养基中过夜培养，5,000r/min离心5min后弃上清，用适量的蒸馏水悬浮菌体，5,000r/min离心5min，重复上述操作一次，弃上清后用2mL无菌蒸馏水悬浮菌体，冷冻干燥得到菌粉，用扫描电镜进行观察。
[0042] 本发明提供的WD601的形态特征如下：菌株在LB平板上37℃培养24h后，如图1a所示菌落呈圆形，直径在1mm左右，边缘整齐，表面湿润有光泽，呈灰白色。通过革兰氏染色在显微镜下进行观察，菌体形态如图1b所示，该菌株为革兰氏阴性菌，形态呈短杆状。将离心后的菌体冷冻干燥后，用SEM对干燥的菌粉进行观察，在20,000×的倍数下，菌体呈长短不等排列不规律的短杆状，两端钝圆，大小在0.5×1～3μm(图1c)。
[0043] (2)生化特性分析
[0044] 参照《细菌系统鉴定手册》常见菌株鉴定方法对白色菌株进行生理生化鉴定。
[0045] 葡萄糖及其他糖醇类的氧化发酵：将培养了18～24h WD601新鲜单菌落穿刺接种于休和利夫森二氏培养基中，用灭菌的凡士林石蜡油封盖，约0.5～1cm厚，以隔绝空气，同时设计不做封油的实验组验证菌株的氧化发酵类型。室温培养1，2，3，7，14d后，观察颜色变化。分别用乳糖、麦芽糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、木糖和蔗糖代替葡萄糖，检测菌株的糖醇类利用情况。
[0046] 所述的休和利夫森二氏培养基为：称取2g蛋白胨，5g NaCl，10g葡萄糖，0.2g K2HPO4，溶解于1000mL无菌蒸馏水中，添加1％的溴百里酚蓝指示剂3mL，115℃下灭菌20min。糖醇类发酵实验时，葡萄糖以被测1％的糖醇代替。
[0047] 甲基红及V.P测定：接种WD601单菌落于培养液中，适温培养2～6d，在培养基中加入一滴甲基红试剂，变红为阳性；取培养液和40％的NaOH等量混合，加入少许肌酸，10min内出现红色则为V.P实验阳性。
[0048] 所述的甲基红和V.P培养基为：称取5g蛋白胨，5g葡萄糖，5g K2HPO4，溶解于1000mL无菌蒸馏水中，115℃下灭菌20min。
[0050] 所述的淀粉培养基为：在肉汁胨中加入0.2％的可溶性淀粉，121℃下灭菌20min。
[0051] 氧化酶及接触酶：取培养了18～24h的新鲜单菌落，涂抹在被1％盐酸二甲基对苯二胺水溶液润湿的滤纸上，10s内观察颜色变化；取新鲜单菌落涂抹在已滴有10％H2O2的玻片上，观察有无气泡产生。
[0053] 所述的L-色氨酸脱氢酶及脲酶检测培养基为：称取3g L-色氨酸，5g NaCl，1g K2HPO4，1g KH2PO4，加入10mL 95％的乙醇，溶于1000mL蒸馏水中，121℃下灭菌20min。另将尿素溶于100mL水中，过滤灭菌，待培养基灭菌后加入到培养基中。
[0055] 所述的硫化氢检测培养基为：称取7.5g牛肉膏，10g蛋白胨，5g NaCl，120g明胶，溶于1000mL无菌蒸馏水中，121℃下灭菌20min。待培养基灭菌后加入5mL 10％的FeCl2(过滤灭菌)。
[0056] 菌株的生理生化结果见表1，糖醇类发酵实验是鉴定细菌最主要和最基本的实验，特别是对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要，实验表明，WD601为发酵型菌株，可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、果糖、木糖和蔗糖等，不能利用阿拉伯糖。M.R实验主要是为了检验菌种利用葡萄糖产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物的能力，实验结果为阴性，表明WD601菌株可能为一株产气型菌株。V.P实验为阳性，表明菌株将葡萄糖分解为丙酮酸，进而脱羧生成乙酰甲基乙醇，最后与NaOH反应生成红色化合物。WD601菌株还能水解淀粉并且作用于半固体的明胶生成液体氨基酸，可产生接触酶和脲酶，不产生氧化酶和L-色氨酸脱氢酶。实验结果基本符肠杆菌的生化特征，初步确定WD601菌株属于肠杆菌科。
[0057] 表1 WD601的生理生化特性
[0058]项目 结果 项目 结果
氧化-发酵(O/F) 发酵型 淀粉水解 +
葡萄糖 + V.P实验 +
乳糖 + M.R实验 -
麦芽糖 + 明胶水解 +
甘露醇 + 硫化氢 -
阿拉伯糖 - 氧化酶 -
果糖 + 接触酶 +
木糖 + 脲酶 +
蔗糖 + L-色氨酸脱氢酶 _
氧化-发酵(O/F) 发酵型 淀粉水解 +
葡萄糖 + V.P实验 +
乳糖 + M.R实验 -
麦芽糖 + 明胶水解 +
甘露醇 + 硫化氢 -
阿拉伯糖 - 氧化酶 -
果糖 + 接触酶 +
木糖 + 脲酶 +
蔗糖 + L-色氨酸脱氢酶 _
[0059] 注：“+”表示结果为阳性。“-”表示结果为阴性。
[0060] (3)16S rDNA基因序列测定
[0061] 采用基因组抽提试剂盒提取菌株培养液的全基因组，设计上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和下游引物1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′，进行PCR扩增反应，反应体系为：2.5μL的基因组DNA，2.5μL的10×Buffer(with Mg2+)，1μL的dNTPs(10mol/L)，0.2μL的酶(5U/μL)，上下游引物(10mol/L)各0.5μL，添加无菌蒸馏水至25μL。PCR反应条件如下：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环后于72℃继续延伸10min，扩增产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。将扩增产物用PCR纯化试剂盒进行纯化，并送至美吉生物有限公司进行测序。将测序结果提交到GenBank中进行BLAST比对，选取同源性较高的菌株采用MEGA软件进行进化树分析。
[0062] 以上数据重复测定三次取平均值，测试结果用x±s表示，利用Origin 85对实验数据进行统计分析和处理，采用GenBank和MEGA 7.0对序列同源性进行分析。
[0063] 采用细菌DNA抽提试剂盒对新鲜WD601培养液中的细菌DNA进行提取，以菌株的基因组DNA作为模板，按照上述中的PCR体系进行PCR扩增，通过1％琼脂糖凝胶电泳发现产物在约1500bp处出现一条特异性条带，如图2所示。将纯化后的PCR产物进行测序，输出峰图，将序列结果提交至GenBank进行BLAST比对，发现该菌株与肠杆菌科(Enterobacteriaceae)具有较高的同源性，选取其中16株序列同源性在98％以上的菌株，通过MEGA7.0.25软件构建进化树，进化树结果见图3，结果显示WD601菌株与肠杆菌属(Enterobacter)和西地西菌属(Cedeceadavisae)处于同一主分支，但从遗传距离分析与肠杆菌属的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)亲缘关系更近，因此，将菌株WD601鉴定为肠杆菌，这与WD601的生理生化实验结果相符合。
[0064] 本发明最终鉴定菌株到属，结果表明，该株细菌经鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601，与阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae的同源性为99％。本发明中，将得到的菌株命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601。
[0065] (4)菌种保藏
[0066] 将菌种培养物制成30％甘油管，放置在-80℃冰箱内保藏，待用。上述菌株已于2017年6月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，该中心位于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，菌种保藏号为GDMCC No：60194。
[0067] 实施例3、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601降解DON的应用[0068] (1)HPLC测DON降解率
[0069] 取1mL培养液过0.22mL微孔滤膜后，用带有紫外检测器的HPLC检测降解后培养基中DON含量。高效液相色谱检测DON的条件为：采用Agilent ZORBAX SB-C18的色谱柱(4.6×150mm，5μm)，流动相采用甲醇/水为20/80(V/V)。测试时的柱温为35℃，流量为0.9mL/min，检测器的波长为218nm。采用下列公式计算DON降解率：
[0070]
[0071] (2)DON标准曲线的绘制：取DON储备液(1mg/mL)分别稀释至4，10，20，50，100μL/mL的工作液，进样20μL，重复测定三次取平均值。根据浓度与峰面积关系绘制DON标准曲线。
[0072] 分别配置浓度为4，10，20，50和100μg/mL的DON工作液，测得DON浓度与峰面积关系2
标准曲线，如图4所示，相关系数R＝0.9999。
标准曲线，如图4所示，相关系数R＝0.9999。
[0073] (3)DON降解反应
[0074] 取阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601，接种于2mL含40μg/mLDON的液体培养基中分别培养3d和7d，扩大DON浓度(60μg/mL)重复实验。以无机盐培养基作为阴性对照，以含有40μg/mL和60μg/mL DON的无机盐培养基作为阳性对照。
[0075] 采用HPLC检测WD601的DON降解能力，结果见表2，接种WD601单菌落至终浓度分别为40和60μg/mL的DON反应3d和7d后，DON浓度均出现不同程度的下降，表明WD601具有明显降解DON的能力。HPLC结果如表2所示，以不含DON的无机盐培养基作为阴性对照(图5a)，DON的出峰时间约为16.20min(图5b)，当DON初始浓度为60μg/mL时，反应3d后降解率为7.1％(图5c)，7d后高达40.40％(图5d)。
[0076] 表2 HPLC测不同反应条件下菌株DON降解
[0077]
[0078] (4)将阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)WD601优化扩大培养后制成液态或固态的含有该菌株的呕吐毒素降解试剂，该试剂同样具备降解效果。该降解试剂采用与步骤(3)相同的方法进行DON降解实验，降解效率达到50％以上。
[0079] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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