技术领域
[0001] 本
发明涉及一种制备抵抗α-葡萄糖苷酶水解的交联右旋糖苷凝胶的方法，属于材料领域。
背景技术
[0002] 右旋糖苷是一类以α-糖苷键为链接，以葡萄糖为
基础功能
单体的聚合多糖，由于其不具备
抗原性且能够结构稳定，并能够耐受高温高压灭菌，可作为
血浆扩张剂。右旋糖苷水凝胶具有较好的保水特性，且
稳定性较高，在整形美容行业的注射填充领域具有较大的应用潜
力。右旋糖苷被证明有效增强
机体的免疫系统，抵抗
微生物引起的
疾病，在
肿瘤、感染病和
治疗创伤等方面的应用深受瞩目。此外，右旋糖苷尚有清除游离基、抗
辐射、溶解胆固醇，
预防高脂血症作用及抵抗滤过性病毒、
真菌、细菌等引起的感染。故广泛用于医药、食品、
化妆品等行业。
[0003] 在人体内，α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase,EC 3.2.1.20)为一种能水解α-葡萄糖苷键的酶，可以特异性水解右旋糖苷分子中的α-1,6/1,3/1,4葡萄糖苷键，从而降解右旋糖苷分子。目前，其注射液已被用于α-葡萄糖苷酶缺乏症患者的治疗。
[0004] 由于右旋糖苷具有结构稳定，无抗原性等特点，可开发温和高效的交联方法，制备交联右旋糖苷凝胶，用于整形美容行业的填充注射。此外，由于人体自身表达α-葡萄糖苷酶，能够对填充的交联右旋糖苷凝胶进行水解并逐渐使其失去塑性效果。因此，为了提高交联右旋糖苷凝胶在机体内的整体维持时间以及塑形效果，有必要考虑利用特异性的方法来抑制人体α-葡萄糖苷酶的酶解效率。目前，提高透多糖水凝胶的维持时间，仅用提高化学交联度的模式，但是化学交联剂含量的提高，可能导致后续的不良反应。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种制备抵抗α-葡萄糖苷酶水解的交联右旋糖苷凝胶的方法，以解决上述问题。
[0006] 本发明采用了如下技术方案：
[0007] 一种制备抵抗α-葡萄糖苷酶水解的交联右旋糖苷凝胶的方法，以低分子量右旋糖苷(10000-20000Da)为起始骨架，用含有环
氧基团的活化剂对其进行活化，使其带有多个环氧基团，获得一种生物中间体，即活化的低分子量右旋糖苷；所述含有环氧基的活化剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)或环氧氯丙烷中的一种；利用活化的低分子量右旋糖苷作为生物交联中间体与高分子量右旋糖苷(700000-1000000Da)混合并进行交联反应形成水凝胶，并均质形成均一的凝胶颗粒；利用N-乙酰-D-
氨基葡萄糖，D-氨基葡萄糖，以及
纤维二糖等功能单体，抑制α-葡萄糖苷酶的催化活性，延长交联右旋糖苷凝胶的稳定时间。
[0008] 该方法主要有以下步骤：
[0009] 1)以低分子量右旋糖苷(10000-20000Da)为起始骨架，用含有环氧基团的活化剂对其进行活化，使其带有多个环氧基团，获得一种生物中间体，即活化的低分子量右旋糖苷；所述含有环氧基的活化剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)或环氧氯丙烷中的一种；
[0010] 2)利用活化的低分子量右旋糖苷作为生物交联中间体与高分子量右旋糖苷(700000-1000000Da)混合并进行交联反应形成水凝胶，并均质形成均一的凝胶颗粒；
[0011] 3)利用N-乙酰-D-氨基葡萄糖，D-氨基葡萄糖，以及纤维二糖等功能单体，抑制α-葡萄糖苷酶的催化活性，延长交联右旋糖苷凝胶的稳定时间。较佳的，步骤1)中，低分子量右旋糖苷功能单体与环氧基活化剂的摩尔比为1:4-1:10，活化反应时间为2-5小时，活化反应
温度为30-50℃，活化反应中以0.1-0.4M的NaOH作为催化剂。
[0012] 较佳的，步骤1)中，低分子量右旋糖苷的浓度为20-30wv％，环氧化的低分子量右旋糖苷生物交联中间体中包含的环氧基与高分子量右旋糖苷功能单体的摩尔比为1:30-1:50，交联反应时间为2-5小时，交联反应温度为30-50℃，交联反应中以0.1-0.4M的NaOH作为催化剂。
[0013] 教佳的，步骤2)中，高分子量右旋糖苷的浓度为30wv％。
[0014] 教佳的，步骤1)中，得到环氧化的低分子量右旋糖苷生物交联中间体后，利用4-8次冷
乙醇沉淀洗涤步骤，进行纯化并去除残留的含有环氧基的活化剂。
[0015] 教佳的，步骤2)中，最终的凝胶颗粒产品利用生理盐水进行4-8次清洗。
[0016] 教佳的，步骤3)中，N-乙酰-D-氨基葡萄糖，D-氨基葡萄糖，以及纤维二糖等功能单体对α-葡萄糖苷酶的催化活性最优抑制浓度为0.2-0.6mmol/L。
[0017] 发明的有益效果
[0018] 本发明的提供了一种制备抵抗α-葡萄糖苷酶水解的交联右旋糖苷凝胶的方法，并提供了一组利用N-乙酰-D-氨基葡萄糖，D-氨基葡萄糖，以及纤维二糖等功能单体降低α-葡萄糖苷酶活性，有效增强交联右旋糖苷水凝胶维持时间与塑性效果的方法。利用该方法，在体外交联右旋糖苷酶解的实验中，α-葡萄糖苷酶的催化效率被降低50％以上。具有较大的应用潜力，体现出较大的经济效益。
附图说明
[0019] 图1是N-乙酰-D-氨基葡萄糖与人源α-葡萄糖苷酶催化中心氨基酸残基的相互作用；
[0020] 图2是D-氨基葡萄糖与人源α-葡萄糖苷酶催化中心氨基酸残基的相互作用；
[0021] 图3是纤维二糖糖与人源α-葡萄糖苷酶催化中心氨基酸残基的相互作用；
[0022] 图4是不同浓度N-乙酰-D-氨基葡萄糖抑制人源性重组α-葡萄糖苷酶对交联右旋糖苷的水解能力；
[0023] 图5是不同浓度D-氨基葡萄糖抑制人源性重组α-葡萄糖苷酶对交联右旋糖苷的水解能力；
[0024] 图6是不同浓度纤维二糖抑制人源性重组α-葡萄糖苷酶对交联右旋糖苷的水解能力。
具体实施方式
[0026] 活化浓度为20％(w/v)的低分子量右旋糖苷成为生物交联中间体：
[0027] 取20％(w/v)低分子量右旋糖苷(10000-20000Da)溶液于15mL的离心管中，按照低分子量右旋糖苷功能单体与含有环氧基的活化剂的摩尔比为1:1,1:2,1:4,1:6；1:8；1:10，分别加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)、环氧氯丙烷等作为活化剂进行活化反应。反应体系中含有0.3M NaOH作为催化剂，30℃反应4小时，获得一种温和有效的生物交联中间体，即环氧活化的低分子量右旋糖苷。利用75％的乙醇沉淀并洗涤3次后冻干为粉末。利用纯水将其溶解后，利用
硫代硫酸钠滴定法对生物交联中间体上所含有的环氧基
密度进行测定。
[0028] 当低分子量右旋糖苷的葡萄糖功能单体与活化剂的摩尔比达到1:6-1:10时，生物交联中间体中所含有的环氧基密度达到30～40μmol/g，对大分子量右旋糖苷交联的作用最佳。
[0029] 实验结果见表1。
[0030] 表1右旋糖苷功能单体与活化剂摩尔比对20％(w/v)的低分子量右旋糖苷生物交联中间体所含环氧基密度的影响
[0031]
[0032]
[0033] 实施例二：
[0034] 活化不同浓度的低分子量右旋糖苷成为生物交联中间体：
[0035] 分别取浓度为5％，10％，15％，20％，25％，30％(w/v)的低分子量右旋糖苷(10000-20000Da)溶液于15mL的离心管中，按照低分子量右旋糖苷功能单体与活化剂的摩尔比为1：4分别加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)、环氧氯丙烷等作为活化剂进行活化反应。反应体系中含有0.3M NaOH作为催化剂，30℃反应4小时，得到含有环氧基的生物交联中间体。利用75％的乙醇沉淀活并洗涤3次后冻干为粉末。在纯水中溶解后，利用硫代硫酸钠滴定法对生物交联中间体上所含有的环氧基密度进行测定。当低分子量右旋糖苷浓度为20％-30％时，生物交联中间体中所含有的环氧基密度达到30～40μmol/g，对大分子量右旋糖苷交联的作用最佳。实验结果见表1。
[0036] 表2低分子量右旋糖苷功能单体与含有环氧基的活化剂的摩尔比为1:4时，不同的低分子量右旋浓度对生物交联中间体中所含有的环氧基密度的影响
[0037]
[0038]
[0039] 实施例3生物交联中间体中含有的环氧基与高分子量右旋糖苷功能单体的摩尔比对交联后凝胶中右旋含量的影响：
[0040] 取30％(w/v)高分子量右旋糖苷(700000～1000000Da)溶液于15mL的离心管中，按照生物交联中间体中含有的环氧基与高分子量右旋糖苷功能单体的摩尔比为1：10,1:20,1：30，1:40,1：15，1:60,1:80及1:100的比例，分别加入以1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)、环氧氯丙烷作为活化剂得到的生物交联中间体。反应体系中含有0.2M NaOH作为催化剂，30℃反应4小时。制备成凝胶颗粒。将颗粒完全
真空冷冻干燥，计算每g凝胶中右旋糖苷的含量。当生物交联中间体中含有的环氧基与高分子量右旋糖苷功能单体的摩尔比为1:30-1:50时，交联反应最佳，凝胶颗粒的右旋糖苷含量为20～25mg/g。实验结果见表3。
[0041] 表3生物交联中间体中含有的环氧基与高分子量右旋糖苷功能单体的摩尔比对30％高分子量右旋糖苷交联后凝胶中右旋糖苷含量的影响
[0042]
[0043]
[0044] 实施例4高分子量右旋糖苷浓度对交联后凝胶中右旋糖苷含量的影响：
[0045] 分别取浓度为10％，20％，30％，40％，50％，60％(w/v)的高分子量右旋糖苷(700000～1000000Da)溶液于15mL的离心管中，按照生物交联中间体中含有的环氧基与高分子量右旋糖苷功能单体的摩尔比为1:40比例分别加入以1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)、环氧氯丙烷作为活化剂得到的生物交联中间体。反应体系中含有0.2M NaOH作为催化剂，30℃反应4小时。制备成凝胶颗粒，将颗粒完全真空冷冻干燥，计算每g凝胶中右旋糖苷的含量。当高分子量右旋糖苷浓度达到20％-40％时，交联反应较佳；当高分子量右旋糖苷浓度达到30％时，交联反应最佳，凝胶颗粒的右旋糖苷含量为～20mg/g。实验结果见表4。
[0046] 表4高分子量右旋糖苷的功能单体与生物交联中间体中环氧基的摩尔比为1:40时，高分子量右旋糖苷浓度对交联后凝胶中右旋糖苷含量的影响
[0047]
[0048] 实施例5
[0049] 用于抑制α-葡萄糖苷酶活性的功能单体分别为N-乙酰-D-氨基葡萄糖，D-氨基葡萄糖，以及纤维二糖，分子式如下：
[0050]
[0051] 利用Discovery Studio 4.0
软件将所述功能单体与人源α-葡萄糖苷酶进行模拟对接。人源α-葡萄糖苷酶已通过结晶-
X射线晶体衍射解析基本结构，PDB ID:5NN3。如图1至图3所示，这组分子能够与人源α-葡萄糖苷酶催化中心形成稳定的相互作用，具有降低其催化效率的潜力。实施例6-8中将通过具体的实验来证这些化合物对右旋糖苷酶活性的影响。
[0052] 实施例6
[0053] 利用N-乙酰-D-氨基葡萄糖抑制人源性重组α-葡萄糖苷酶活性
[0054] 反应体系的建立：
[0055] 0.5g交联右旋糖苷水凝胶(BDDE活化交联)，右旋糖苷含量为22.2mg/g，加入2mL PBS缓冲液，pH 6.5-7.5，其中含有人源性重组α-葡萄糖苷酶100U/mL；添加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖，在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后取上清测定游离右旋糖苷含量。计算各种浓度N-乙酰-D-氨基葡萄糖添加后在不同时间点交联右旋糖苷凝胶的酶解效率结果如图4所示。
[0056] 实施例7
[0057] 利用D-氨基葡萄糖抑制人源性重组α-葡萄糖苷酶活性
[0058] 反应体系的建立：
[0059] 0.5g交联右旋糖苷水凝胶(BDDE活化交联)，右旋糖苷含量为22.2mg/g，加入2mL PBS缓冲液，pH 6.5-7.5，其中含有人源性重组α-葡萄糖苷酶100U/mL；添加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L D-氨基葡萄糖，在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后取上清测定游离右旋糖苷含量。计算各种浓度D-氨基葡萄糖添加后在不同时间点交联右旋糖苷凝胶的酶解效率结果如图5所示。
[0060] 实施例8
[0061] 利用纤维二糖抑制人源性重组α-葡萄糖苷酶活性
[0062] 反应体系的建立：
[0063] 0.5g交联右旋糖苷水凝胶(BDDE活化交联)，右旋糖苷含量为22.2mg/g，加入2mL PBS缓冲液，pH 6.5-7.5，其中含有人源性重组α-葡萄糖苷酶100U/mL；添加0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L纤维二糖，在37℃水浴72小时，每隔24小时取样，12000rpm离心10分钟后取上清测定游离右旋糖苷含量。计算各种浓度纤维二糖添加后在不同时间点交联右旋糖苷凝胶的酶解效率结果如图6所示。
[0064] 结果显示，N-乙酰-D-氨基葡萄糖，D-氨基葡萄糖，以及纤维二糖等功能单体均能在一定程度上抑制人源性α-葡萄糖苷酶对交联右旋糖苷水凝胶的降解能力。对比未添加配体的空白反应体系，添加后在72小时内均能降低空白反应体系中约一半的酶解效率。如图4-图6可知，功能单体的最佳添加浓度为0.2-0.6mM。
