本发明利用了以下发现，包含细胞和生物相容性基质的可植入材料，当 向血管通路结构局部地提供时，可以促进结构的形成和/或增强结构的熟化， 以及延长结构的熟化的、功能性状态。根据本发明，所述可植入材料位于处 在或邻近于或接近于血管通路结构的血管的外表面上。本发明可以有效地促 进新建的血管通路结构的整合和/或增强其熟化；提高和维持现有的功能性结 构的功能寿命；以及，可以有助于抢救失效的或失效中的结构。
在一个方面，本发明是处理患者中血管通路结构的方法，包括步骤：在 所述血管通路结构处、邻近或附近放置包含细胞和生物相容性基质的可植入 材料，其中所述可植入材料有效提高所述结构的功能。根据如下所述的某些 实施方式，所述血管通路结构用于透渗析。
根据各种实施方式，所述血管通路结构是动静脉的天然瘘、动静脉的移 植物、外周移植物、静脉导管或内驻的端口。在一个实施方式中，所述动静 脉移植物包含修复性桥。在其他实施方式中，所述导管是内驻的双管腔导管， 处理所述内驻的双管腔导管提高了临床稳定性来足以允许血液透析。
在一个实施方式中，处理所述血管通路结构提高了流过所述结构和流向 所述结构下游的正常的或近正常的血流。例如，正常的或近正常的血流是处 在足以防止血液透析期间的再循环的速度的血流。根据其他的实施方式，处 理所述血管通路结构提高了正常的或近正常的血管直径，并降低了血液透析 的流动再循环。
对动静脉的天然瘘来说，处理所述动静脉的天然瘘增强了临床熟化足以 允许血液透析，降低了动静脉的天然瘘的熟化中的延迟，改进重复插管。对 于动静脉移植物来说，处理所述动静脉移植物提高了临床稳定性足以恢复正 常的或近正常的循环。在各种实施方式中，所述可植入材料降低了具有通路 结构的患者中校正的发生。
在一个实施方式中，增强熟化的特征在于重复地将导管插入所述瘘用于 透渗析的能力。根据另一个实施方式，增强熟化的特征在于在透渗析期间获 得充足血流的能力。优选的，充足的血流包含约350mL/分钟的速度。根据 各种实施方式，生物相容性材料在动静脉瘘上的应用在使用治疗试剂、物理 扩张或展伸之后或同时进行。动静脉瘘是桡头的、头臂的或臂贵要的 (brachiobasilic)。
在一个优选的实施方式中，本发明是在人体中防止动静脉瘘熟化失败的 方法，包括步骤：将包含生物相容性基质和血管内皮细胞的可植入材料放置 在位于、邻近或接近所述瘘的位置，从而防止瘘熟化失败。在一个实施方式 中，熟化失败的特征在于不能重复地将导管插入所述瘘用于透渗析，或在透 渗析期间不能获得充足的血流，其中所述充足的血流包括约350mL/分钟的 速度。在其他实施方式中，成熟失败的特征在于在建成之后至少2个月、至 少3个月、或至少4个月不能向动静脉瘘中插入导管。
在另一个实施方式中，本发明是维持动静脉移植物的血流速度足以允许 透渗析的方法，包括提供包含细胞和生物相容性基质的可植入材料的步骤， 其中以有效维持移植物的血流速度足以允许透渗析的数量，在所述动静脉移 植物的静脉流出区域的修复性桥处、其邻近或附近，将所述可植入材料放置 在所述动静脉移植物的外表面上。在一个实施方式中，所述动静脉移植物的 静脉流出区域处的血流速度基本上相似于所述流出区域上游的血流速度。
在另一个实施方式中，本发明是维持外周旁路移植物的正常血流足以维 持外周循环的方法，包括提供包含细胞和生物相容性基质的可植入材料的步 骤，其中以有效维持所述旁路移植物的血流速度足以允许维持外周循环的数 量，在修复性桥处、其邻近或附近，将所述可植入材料放置在所述旁路移植 物的外表面上。在一个实施方式中，流入血液速度和流出血液速度是基本上 相似的。
在另一个实施方式中，本发明是维持动静脉移植物的血压足以允许透渗 析的方法，包括提供包含细胞和生物相容性基质的可植入材料的步骤，其中 以有效维持血压足以允许透渗析的数量，在所述动静脉移植物的静脉流出区 域的修复性桥处、其邻近或附近，将所述可植入材料放置在所述动静脉移植 物的外表面上。在一个实施方式中，所述动静脉移植物的静脉流出区域处的 血压基本上相似于所述流出区域上游的血压。所述修复性桥选自：隐静脉； 牛异种移植物；脐静脉；涤纶；PTFE；ePTFE，聚氨基甲酸酯；牛肠系膜静 脉；和低温保存的股静脉同种异体移植物。根据优选的实施方式，所述修复 性桥是ePTFE。
在另一个实施方式中，本发明是促进动静脉移植物或外周旁路移植物的 修复性桥的组织整合的方法，包括提供包含细胞和生物相容性基质的可植入 材料的步骤，其中以有效促进所述桥的组织整合的数量，在修复性桥处、其 邻近或附近，将所述可植入材料放置在所述动静脉移植物或所述外周旁路移 植物的外表面上。在某些实施方式中，所述可植入材料促进所述修复性桥的 内管腔表面之内或附近的平滑肌细胞增殖或迁移，或促进所述修复性桥的内 管腔表面之内或附近的内皮细胞增殖或迁移。在某些其他实施方式中，所述 可植入材料促进所述移植物处、其邻近或附近的平滑肌细胞和/或内皮细胞增 殖。
在另一个实施方式中，本发明是预防或降低动静脉瘘或动静脉移植物发 生开裂的方法，包括提供包含细胞和生物相容性基质的可植入材料的步骤， 其中以有效预防或降低开裂发生率的数量，在所述动静脉移植物的静脉流出 区域的修复性桥处、其邻近或附近，将所述可植入材料放置在所述瘘或动静 脉移植物的外表面上。
根据其他实施方式，所述提供步骤在天然动静脉瘘失效之后或在天然或 隐静脉血管外周旁路失效之后作为介入性治疗来进行。
在另一个方面，本发明是适合于处理血管通路结构的包含细胞和生物相 容性基质的可植入材料。所述细胞是内皮细胞或具有内皮样表型的细胞。所 述生物相容性基质是柔性平面形式或可流动组合物。在特别优选的实施方式 中，所述细胞是血管内皮细胞。所述柔性平面形式被配置用于在血管通路结 构处、其邻近或附近植入。在某些实施方式中，这种形式限定了槽隙。根据 可流动组合物的一个实施方式，所述可流动组合物是保持形状的组合物。
在其他实施方式中，本发明是包含细胞和生物相容性基质的可植入材 料，适用于通过防止动静脉瘘熟化失败来增强动静脉瘘熟化的方法。所述细 胞是内皮细胞或具有内皮样表型的细胞，所述生物相容性基质是柔性平面形 式或可流动组合物。在一个实施方式中，所述柔性平面形式被配置用于在天 然瘘处、其邻近或附近植入。在某些实施方式中，这种形式被配置，从而它 限定了槽隙或一系列槽隙。对于所述可流动组合物，它是保持形状的组合物。
在另一个实施方式中，本发明是包含细胞和生物相容性基质的可植入材 料，其中所述可植入材料被放置在修复性桥处、其邻近或附近的血管的外表 面。所述修复性桥位于或接近动静脉移植物的静脉流出区域，或位于或接近 流出口。
在另一个方面，本发明是用于保存包含生物相容性基质和移接的细胞的 可植入材料的转移介质组合物。所述转移介质组合物包含一定量的VEGF， 当细胞在低于所述细胞的标准细胞培养温度的温度下保存在所述转移介质 组合物中时，VEGF的量足以维持细胞存活力或抑制性表型、以及使细胞维 持存活延长的时间。
在另一个方面，本发明是在低于细胞的标准细胞培养温度的温度下长期 保存包含生物相容性基质和移接的细胞的可植入材料的方法。所述方法包括 将所述可植入材料浸浴在转移介质组合物中的步骤，所述转移介质组合物包 含在保存期间足以维持细胞活力或抑制性表型的量的VEGF。当在低于所述 细胞的标准细胞培养温度的温度下在所述转移介质组合物中保存时，所述细 胞长时间保持存活。
根据一个实施方式，所述转移介质组合物含有一定量的VEGF，VEGF 的量足以在低于所述细胞的标准细胞培养温度的温度下维持细胞活力或抑 制性表型，并且高于在所述细胞的标准细胞培养温度下所需的VEGF数量。 根据一个实施方式，所述VEGF数量是约4ng/mL。
根据其他实施方式，所述可植入材料在低于37℃的温度下或在环境温度 下在所述转移介质组合物中保存约1周、约2周、或约3周的长时间。所述 细胞是保存时是近融合的(near-confluent)、融合的(confluent)或融合后的 (post-confluent)并且至少80％存活的内皮细胞或内皮样细胞。
在另一个方面，本发明是用于低温保存包含生物相容性基质和移接的细 胞的可植入材料的低温保存介质组合物。所述低温保存介质组合物包含低温 保存剂、多糖和血清。当保存在至少约-4℃时，细胞活力或抑制性表型以 及基质完整性被保持长时间。
在一个实施方式中，所述低温保存介质组合物中血清的数量超过用于细 胞的常规培养的血清数量，例如，20％血清或50％血清。在一个实施方式中， 所述血清是胎儿牛血清。在一个实施方式中，所述低温保存介质组合物中的 多糖超过用于细胞的常规培养的多糖数量，例如，至少约4％多糖或至少约 4.5％多糖。在一个实施方式中，所述多糖是葡聚糖。在另一个实施方式中， 所述低温保存介质组合物进一步包含约10％DMSO。
根据一个实施方式，所述低温保存介质组合物用于在至少约-80℃、至 少约-140℃或至少约-160℃下保存。根据各种实施方式，所述长时间是约 1个月、约6个月或约1年。在一个实施方式中，细胞活力是至少约80％。
在另一个方面，本发明是低温保存的可植入材料，包含用细胞移接的生 物相容性基质和足以在低温保存时维持细胞活力或抑制性表型以及基质完 整性的体积的低温保存介质组合物，其中所述低温保存介质组合物包含低温 保存剂、多糖和血清。
在另一个方面，本发明是制备包含生物相容性基质和移接的细胞的可植 入材料的方法。所述方法包括步骤：提供包含细胞的工作细胞库、提供水化 的生物相容性基质材料、用来自所述工作细胞库的细胞播种所述水化的生物 相容性基质材料、将所述细胞播种的生物相容性基质材料放置在孵育器中直 到所述细胞近融合、融合或融合后，以及评定所述细胞播种的生物相容性基 质材料的细胞计数、细胞活力和细胞功能。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括步骤：将所述细胞播种的生物 相容性基质材料放置在适合于低温保存的小瓶中，向近融合的、融合的、或 融合后的细胞播种的生物相容性基质材料中引入一定体积的低温保存介质 组合物，所述低温保存介质组合物包含低温保存剂、多糖和血清，在所述材 料被低温保存时，所述体积的组合物足以保持细胞活力或抑制性表型以及基 质完整性，将所述含有细胞播种的生物相容性基质材料和低温保存介质组合 物的小瓶放置在冷冻容器中，向所述冷冻容器中引入控制冷冻速度的试剂、 将含有所述试剂的所述冷冻容器放置在至少-4℃的冷冻器中，从所述至少 约-4℃冷冻器中移出所述冷冻容器，将所述冷冻容器放置在至少约-80℃ 的冷冻器中。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括步骤：从至少-80℃冷冻器 中移出所述冷冻容器，以及将所述冷冻容器置于至少-160℃的冷冻器中。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括步骤：从所述冷冻器中移出 所述小瓶，将所述小瓶放置在环境温度空气中约15分钟，随后将所述小瓶 放置在环境温度水浴中约15分钟，从所述小瓶中移出所述可植入材料，在 清洗介质组合物中清洗所述可植入材料约5分钟，以及将所述可植入材料放 置在细胞培养介质中约48小时。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括步骤：从所述冷冻器中移出 所述小瓶，将所述小瓶放置在环境温度空气中约15分钟，随后将所述小瓶 放置在环境温度水浴中约15分钟，从所述小瓶中移出所述可植入材料，以 及在清洗溶液组合物中清洗所述可植入材料约30分钟。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括步骤：将所述细胞播种的生 物相容性基质材料放置在适合于保存的小瓶中，向近融合、融合或融合后的 细胞播种的生物相容性基质材料中引入一定体积的转移介质组合物，所述转 移介质组合物包含一定量的VEGF，足以在所述材料保存在所述组合物中时 维持细胞活力或抑制性表型。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括步骤：制备细胞播种的生物 相容性基质材料，用于根据公开的方法低温保存或用于根据公开的方法保 存，制备小瓶，用于转移，和转运所述外盒到临床位置用于向患者施用。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括步骤：将含有细胞播种的生 物相容性基质材料的小瓶放置到内盒中，将所述内盒放置到隔离的外盒中， 以及提供产品文件。
在所述方法的一个实施方式中，所述细胞播种的生物相容性基质材料是 临床试验材料，所述患者是临床试验中的参与者。在所述方法的另一个实施 方式中，所述可植入材料以工业规模制备。在另一个方面，本发明是实施任 何在此公开的方法的机器人系统。
在另一个方面，本发明是制造包含细胞和生物相容性基质的可植入材料 的方法，所述方法包括步骤：使用适合的试剂和条件使细胞与生物相容性基 质接触，其中所述细胞的数量足以增殖(populate)所述基质并生长到融合、 近融合或融合后的群体，以及进一步的，其中所述基质用与细胞类型无关的、 未经兼容性测试的、未匹配的细胞增殖。在另一个方面，本发明是提供根据 这种方法制造的可植入材料的方法。在进一步的方面，本发明是根据这种方 法制造的包含细胞和生物相容性基质的可植入材料。
附图说明
在附图中，相同的附图标记一般在不同的视图中指代相同的部分。并且， 所述附图没有按比例或成比例绘制，而重点一般是说明本发明的原理。
图1是根据本发明的示例性实施方式，用于向管形解剖结构的外表面施 用的可植入材料的柔性平面形式的示意性立体图。
图2A是根据本发明的示例性实施方式，用于向管形解剖结构的外表面 施用的可植入材料的轮廓化柔性平面形式的示意性立体图。
图2B、图2C、图2D、图2E、图2F和图2G是根据本发明的各种示例 性实施方式包含槽隙的可植入材料的轮廓化柔性平面形式的示意立体图。
图3A和图3B是根据本发明的示例性实施方式的代表性细胞生长曲线。
图4A、图4B和图4C说明了根据本发明的示例性实施方式从顶部透视 的、施用具有多个柔性平面形式的可植入材料到血管接合点的外表面的一系 列步骤。
图5是根据本发明的示例性实施方式，向血管接合点的外表面施用的轮 廓化形式的可植入材料的俯视图。
图6是根据本发明的示例性实施方式，向管形解剖结构施用的柔性平面 形式可植入材料的俯视图。
图7是根据本发明的示例性实施方式，制备、保存和转移用于向接受者 施用的可植入材料的方法的流程图。

如在此解释的，本发明基于这样的发现，基于细胞的治疗可以用于处理 血管通路结构。以下呈现的教导提供了制造和使用本发明的材料和方法的足 够指导，进一步为鉴定适合的指标和受试者提供了足够的指导，用于测试、 测量和监视本发明的材料和方法的性能。
因而，已经开发了基于细胞的治疗，用于临床上管理血管通路并发症和 /或失效。本发明的示范性的实施方式包含适用于在此描述的处理范例的生物 相容性基质和细胞。特别地，在一个优选的实施方式中，所述可植入材料包 含生物相容性基质和内皮细胞或内皮样细胞。在一个实施方式中，所述可植 入材料具有柔性平面形式，并且包含内皮细胞或内皮样细胞，优选人大动脉 内皮细胞，以及生物相容性基质Gelfoam明胶海绵(Pfizer，New York，NY， 以下称“Gelfoam基质”)。根据另一个优选的实施方式，所述可植入材料具有 可流动形式，并且包含内皮细胞或内皮样细胞，优选人大动脉内皮细胞，以 及生物相容性基质Gelfoam明胶颗粒或粉末(Pfizer，New York，NY，以下称 “Gelfoam颗粒”)。
本发明的可植入材料包含在生物相容性基质之上、之中和/或之内移接的 细胞。移接是指经由细胞与细胞和/或细胞与基质相互作用可靠地连接，从而 细胞经得起在此公开的准备性操作的苛刻条件。如在此其他地方说明的，可 植入材料的操作性实施方式包括具有优选表型的近融合、融合或融合后的细 胞群体。要理解的是，可植入材料的实施方式可能在准备性操作期间脱落细 胞，和/或某些细胞不是与其他细胞一样可靠地连接的。全部需要的是，可植 入材料包含满足在此阐述的功能或表型指标的细胞。
本发明的可植入材料是基于组织工程原理开发的，代表了解决上述临床 需求的新方法。本发明的可植入材料是独特的，原因在于在所述生物相容性 基质之上、之中和/或之内移接的活细胞能够在生理学反馈控制之下以生理学 比例供给血管通路结构和相关的基于脉管系统多细胞的产物。如在此其他地 方描述的，适合与可植入材料使用的细胞是内皮细胞或内皮样细胞。通过这 些细胞的多化合物本地递送以及生理学上动态的给药提供了对过程的更有 效调节，所述过程负责维持功能性血管通路结构和减少血管通路并发症和/ 或失效。重要地，由于被放置在血管的非腔体表面，例如，在外膜或接触血 管的外表面处，本发明的可植入材料的例如内皮细胞被保护免于受到血管管 腔内的侵蚀性血流的影响。本发明的可植入材料，当缠绕在、沉积在或以其 他方式与这种外部目标位点即接合点和/或其周围接触时，用来重建稳态。也 就是说，本发明的可植入材料可以提供一种环境，其模拟了支持性的生理， 并有助于血管通路结构形成、熟化、整合和/或稳定。
对于本发明来说，接触是指直接或间接地与在此其他地方定义的腔外或 非腔表面相互作用。对于某些优选的实施方式来说，实际的物理接触不是有 效性所需的。在其他实施方式中，实际的物理接触是优选的。实践本发明所 需的全部是，以有效治疗受损或患病位置的数量、可植入材料在受损或患病 位置处、邻近或附近发生腔外或非腔沉积。对于某些疾病或损伤来说，患病 或损伤位置可以临床地显现在内管腔表面上。对于其他疾病或损伤来说，患 病或损伤位置可以临床地显现在腔外或非腔表面上。在某些疾病或损伤中， 患病或损伤的位置可以临床地显现在内管腔表面以及腔外或非腔表面上。本 发明对于治疗任何上述临床表现是有效的。
例如，内皮细胞可以释放各种各样的试剂，其组合起来可以抑制或缓解 与血管通路结构建成之后的急性并发症相关的有害生理学事件。如在此例示 的，概括了正常的生理和给药的组合物和使用方法对于增强血管通路结构形 成、熟化、整合和/或位点，以及促进这种血管通路结构的长期开放是有用的。 一般地，处理包括在血管通路结构位置处、其邻近或附近，例如，在操作中 涉及的动脉和静脉管腔外侧的血管周围间隙中放置本发明的可植入材料，。 当缠绕、环绕、沉积或以其他方式接触损伤的、外伤的或患病血管时，所述 可植入材料的细胞可以为血管系统提供生长调节化合物，例如，对血管内的 底层平滑肌细胞提供。预期的是，当位于腔外位置时，所述可植入材料的细 胞提供了多种调节化合物的连续供应，所述化合物可以渗透血管组织并到达 管腔，而所述细胞被保护免于受到血管中血流的有害机械作用。如在此描述 的，一个优选的腔外位置是血管的外表面。
使用本发明的优选实施方式处理可以促进正常的或近正常的痊愈和正 常的生理。相反地，在缺少本发明的优选实施方式的处理时，正常的生理痊 愈被损害，例如，天然内皮细胞和平滑肌细胞可能在血管通路结构建成之后 以过度地或不受控制的速度异常生长，引起有害的临床结果，包括血管通路 结构失效。因而，如在此预期的，使用本发明的可植入材料处理将改善接合 位置处天然组织的痊愈以维持血管通路结构开放。
对于本发明来说，血管通路结构可以形成为各种构型。血管通路结构可 以包括天然发生的或手术创建的动静脉瘘、动静脉移植物、外周旁路移植物、 内驻静脉导管、内驻血管端口、或其他被创建以改善患者中的血管通路的血 管接合结构。另外，血管通路结构的各种实施方式形成为各种构型，包括面 对面、端对面、端对端和面对端接合点。血管通路结构也可以放置在各种解 剖学位置中。
本发明的可植入材料可以以各种构型放置在要处理的血管通路结构处。 根据某些实施方式，本发明的可植入材料可以置于接合接点以及置于远离接 合点的近端静脉段。在其他实施方式中，本发明的可植入材料可以置于动脉 段、近端静脉段、远端静脉段，和/或桥接血管通路结构。在另一个实施方式 中，所述可植入材料也可以置于接合接点处的移植材料上或移植材料的一部 分上。血管可以完全或部分地接触，例如，本发明的可植入材料可以周向地 或以弧形构型应用于血管。血管和/或血管通路结构仅需要与足够改善、形成、 熟化、整合和/或稳定血管通路结构的数量的可植入材料接触。
动静脉瘘。根据某些实施方式，为血管通路创建的动静脉瘘(“AV瘘”) 可以用本发明的可植入材料处理。AV瘘可以置于患者体内的各种位置，包 括，例如，放置在颈部、腕、上臂或小臂。临床的AV瘘结构包括桡头的(在 桡动脉和头静脉之间)、Brescia-Cimino(在腕内桡动脉和头静脉的面对面接 合)、头臂的(在肱动脉和头静脉之间)、臂-肘前的(肱动脉和肘前静脉之 间)、臂贵要的(移位的贵要静脉)、尺头的(ulnarcephalic)(尺动脉和头静 脉之间)和隐静脉回路(隐静脉和股动脉的右侧)瘘。
AV瘘手术的并发症一般在三个阶段出现。这些阶段是通常以血栓形成 为特征的人为急性阶段、临床标志是瘘不能熟化的中间阶段，和最后的，例 如可能由于渐进性静脉狭窄造成的已经建成的功能性瘘的更慢性的失效。
AV瘘熟化的特征包括，例如重复地将导管插入所述瘘用于进行透渗析 的能力。AV瘘熟化的另一特征是获得对血液透析有用的充足透渗析血流的 能力。充足的血流至少是使用透渗析机器足够支持透渗析的流速，从而不出 现再循环。对本发明来说，充足的透渗析血流是在瘘的建成之后不超过24 周，优选超过20周，更优选16周、最优选十二周的时间点至少约350mL/ 分钟的血流。AV瘘不能熟化的机理当前理解为包括，例如，瘘血管的早期 血栓形成、在结合位点处或附近的狭窄、附属静脉的存在，包括侧突或静脉 侧枝、不足够的静脉大小，包括不足够的静脉内径，和由于渐进性狭窄造成 的晚期瘘失效。通过转移血流和通过不允许与瘘相连的静脉变为足够大小以 允许插管，附属的静脉可以阻止瘘的发育。当前认为，附属静脉可以响应于 例如瘘中狭窄的存在而发育。AV瘘熟化的机理是多模式的，一般需要对多 种临床征候的评定。单独的缺少狭窄一般是成熟的AV瘘的不充分指标。
此外，认为足够用于透渗析目的的AV瘘需要瘘的熟化以及足以支持透 渗析的血流，所述瘘的熟化就是在瘘的静脉段发生的、容许瘘被重复地插入 导管的那些变化。即使在存在很少血流时，AV瘘可以保持开放，但是开发 的AV瘘可能临床上足以进行透渗析。对于本发明来说，用于透渗析的临床 上充足的血流是约150-500mL/分钟、优选约300-500mL/分钟、最优选 约350-400mL/分钟；适合的血压是约50-180mmHg，优选约50-120 mmHg。
对于本发明来说，相信的是，使用本发明的可植入材料处理提供了有益 的自我平衡性环境，从而无论在瘘建成时或更晚的阶段被放置在瘘邻近或附 近时，在AV瘘熟化中常见的并发症，例如血栓形成、狭窄、凝结和/或附属 静脉的生长被减少。这种类型的有益环境允许AV瘘继续熟化和/或保持在成 熟阶段。例如，AV瘘静脉增厚并能够引导高流动、高压血液时，功能上地 实现熟化。用在此提供的可植入材料处理AV瘘增强了瘘的熟化和/或防止瘘 不能熟化。对于本发明来说理解的是，AV瘘熟化的增强包括在瘘功能中的 任何改善，包括它的形成、达到功能状态所需的时间以及维持瘘处于成熟形 态形式。
手术后即时的血栓形成可能阻止开放的AV瘘的形成并引起瘘的早期失 效。如在此解释的，在手术时使用本发明的可植入材料处理可以防止AV瘘 由于手术后血栓形成即时失效。例如，所述可植入材料释放降低血栓形成的 抗血栓性介体，可以在整个瘘形成或熟化阶段维持瘘的开放。
在手术时在AV瘘位置处或附近放置可植入材料也可以通过以下措施来 增强熟化：在接合点处或附近降低狭窄、容许瘘变为足够大小以提供充足的 血流来支持透渗析、促进静脉和动脉的扩张、降低寄生性附属静脉的形成、 维持天然的附属静脉来增强瘘的熟化、以及改善静脉的大小。
另外，AV瘘比AV瘘移植物需要更长的时间段来达到熟化。在瘘熟化 期间，一般使用透皮导管或内驻导管来进行血液透析，导致感染风险提高和 损害中央静脉的开放性。在瘘建成时在AV瘘位点防止可植入材料可以降低 瘘熟化所需的时间，从而降低相关的感染风险和损害中央静脉的开放性。在 内驻导管的位置处放置可植入材料可以降低与内驻导管相关的血栓形成、内 膜增生和再狭窄的风险，从而降低相关的感染风险和损害中央静脉的开放 性。
最后，在此描述的可植入材料的使用可以降低成熟AV瘘的晚期失效。 由于晚期的渐进性狭窄，成熟的瘘可能经历减少的血流和增加的静脉狭窄。 瘘狭窄或闭塞到足以使血流降低到低于透渗析所需水平的程度，可能需要介 入性血管成形术或瘘的展伸来恢复足够的血流水平。这种介入性治疗增大了 静脉狭窄和闭塞的风险，进一步阻止了成熟瘘的形成。此外，展伸可能引起 在展伸的血管远端和近端的一部分中被处理的血管形成闭塞性血栓形成或 再狭窄，通常称为边缘效应。
可植入材料的应用可以产生主动的改变(血管扩张与同时抑制静脉新内 膜增生的组合)，从而防止晚期的渐进性狭窄，增大成熟瘘的血流，降低对 复原性血管成形术或阻塞瘘的展伸的需求，防止展伸相关的边缘效应，以及 延长成熟瘘的使用期和可用性。
本发明的可植入材料可以在许多不同阶段的任何时候向瘘提供。例如， 在手术时的处理可以防止AV瘘不能成熟和/或可以增强瘘的熟化。可植入材 料通常也可以在开始手术之后提供来促进愈合，以及在形成了成熟AV瘘之 后提供来维持它处于临床上稳定的状态。另外，所述可植入材料也可以援救 随后将失效的成熟的AV瘘，和/或可以延长成熟瘘的使用期。这些情况是 AV瘘熟化增强的非限制性实例。因而，预期的是，可植入材料不仅可以在 创建AV瘘的手术开始时使用，还可以在随后的时间点使用(例如，用于维 持成熟AV瘘或援救成熟的瘘以免失效)。随后的施用可以手术地或非侵入 性地实现。
动静脉移植物。根据其他的实施方式，为血管通路创建的动静脉移植物 (“AV移植物”)可以用本发明的可植入材料处理。AV移植物可以是前臂直 移植物、前臂回路移植物或上臂移植物的形式。动脉流入位置包括，但不限 于，颈总动脉、腕处的桡动脉、肘窝处的肱动脉、臂的低位部分的肱动脉、 腋下的肱动脉、腋动脉和股动脉。静脉流出位置包括，但不限于，中部的肘 前静脉、近端头静脉、远端头静脉、手肘水平的贵要静脉、上臂水平的贵要 静脉、腋静脉、颈静脉和股静脉。其他适合于AV移植物形成的动脉和静脉 位置包括胸壁(腋动脉到锁骨下静脉)、低位末端(股动脉/静脉、隐静脉、 或胫骨(前)动脉、主动脉到大静脉、腋动脉到股静脉或股动脉到腋静脉。
对于本发明来说，涉及适合于透渗析的修复性桥的功能性AV移植物能 够引导高流动、高压的血液通过该修复性桥。在这种AV移植物中，所述移 植物的静脉流出区域处的血流速度基本上相似于所述移植物流出区域上游 的血流速度。适合于透渗析的血流速度是约150-500mL/分钟、优选约300 -500mL/分钟、最优选约350-400mL/分钟；适合的血压是约50-180 mmHg，优选约50-120mmHg。
由于移植物相关的内膜增生，随后是在静脉-移植物接合点处或在近端 静脉段处移植物相关的血栓形成，造成AV移植物通常失效。由于天然血管 和修复性桥材料之间不良的组织整合和桥材料与血管的最后开裂，AV移植 物也是容易失效的。
对于本发明来说，使用本发明的可植入材料处理提供了有益的自我平衡 性环境，从而无论在移植物创建时或更晚的阶段，与AV移植物整合和熟化 相关的并发症，例如血栓形成、狭窄、凝结和/或开裂被减小。这种类型的有 益环境容许与AV移植物相关的血管完全地与修复性桥材料整合。例如，AV 移植物整合并能够引导高流动、高压血液时，功能上地实现熟化。如在此展 现的，使用可植入材料处理AV移植物增强了移植物的整合和熟化。对于本 发明来说，理解的是，AV移植物整合和/或熟化的增强包括在移植物的功能 方面的任何改善，包括它的形成、达到功能状态所需的时间、以及移植物保 持其功能形式。
手术后即时的与移植物相关的血栓形成能够阻止组织整合和开放AV移 植物的最后形成，并可以引起移植物的早期失效。如在此解释的，在手术时 的处理可以防止AV移植物由于手术后血栓形成而即时失效。例如，所述可 植入材料释放降低血栓形成的抗血栓性介体，并在整个移植物整合和熟化阶 段维持开放的移植物。
在手术时，在AV移植物接合点处、邻近或附近；在移植物的静脉流出 区域处、邻近或附近；和/或在移植物处、邻近或附近放置可植入材料也可以 通过在移植物接合点处或附近减少即时血栓形成和渐进性狭窄来增强整合 和熟化。这种治疗效果容许移植物有足够的时间来变得与修复性桥材料充分 整合、最小化血管血栓形成和闭塞、并维持足够的血管内径来支持足够透渗 析的血流。
可植入材料的施用也可以最小化成熟AV移植物的晚期失效。由于晚期 的渐进性狭窄，成熟的移植物能够经历减小的血流和增大的静脉狭窄。可植 入材料的应用可以产生主动的改变(血管扩张与同时抑制静脉新内膜增生的 组合)，从而防止晚期的渐进性狭窄，增大成熟移植物的血流，以及延长成 熟移植物的使用期和可用性。
如在此展现的，使用本发明的可植入材料处理AV移植物接合点促进了 适合于透渗析的功能性AV移植物的形成。进一步理解的是，对于本发明来 说，功能性AV移植物的形成包括移植物的临床功能的任何改善、或移植物 接合点的形成过程或修复性桥的整合过程、和/或移植物接合点保持成熟形 式，包括开裂发生率的降低。
如临床医师公认的，AV移植物的足够性需要移植物支持和维持足够的 血流。对于用于血液透析的AV移植物来说，充足的血流至少是足够支持使 用透渗析机器进行透渗析的流速，从而不出现再循环。临床上失效的AV移 植物是不能支持足够支持透渗析的血流的移植物。预期的是，通过促进能够 支持透渗析的充足血流的功能性移植物的形成，本发明的优选的实施方式将 延迟AV移植物失效的发作或降低AV移植物失效。
外周旁路移植物。根据其他的实施方式，被创建来绕过失效的外周血管 的外周移植物可以使用本发明的可植入材料处理。外周旁路移植物可以置于 各种解剖学位置，包括末端，例如低于或高于膝盖的腿的区域。外周旁路移 植物可以用于绕过阻塞的外周血管，包括在外周动脉或静脉中的堵塞。外周 旁路移植物可以用于修复和/或维持通向末端的正常血流，例如，足以维持正 常或近正常外周循环的血流速度。根据某些实施方式，外周旁路移植物在高 于堵塞区域或低于堵塞区域处形成。在某些实施方式中，本发明可以用于改 善具有包含天然材料的桥的外周旁路的功能、整合、熟化和/或稳定；在某些 其它实施方式中，所述移植物具有修复性桥。
对于外周旁路移植物来说，可植入材料可以置于移植物一端或两端的血 管的外表面上和/或移植物材料的外表面上。在某些实施方式中，所述可植入 材料可以在一端或两端接触外周旁路移植物接点。在某些其他实施方式中， 所述植入物可以置于外周旁路移植物上游的血管外部。
在手术时在外周旁路移植物的流入或流出区域处或附近放置可植入材 料的优选实施方式也可以增强功能性移植物的形成、促进整合和/或防止开 裂。对于本发明来说，功能性外周旁路移植物能够在正常压力下引导正常的 血流。膝盖以下的旁路移植物的正常流速是约50-150mL/分钟、优选约80 -100mL/分钟；膝盖以上的旁路移植物的正常流速是约50-150mL/分钟， 优选约80-100mL分钟；脚移植物的正常流速是约25-30mL/分钟。适合 的血压是约50-180mmHg，优选约50-120mmHg。
对于如在此描述的经处理的外周旁路移植物来说，流出速率基本上相似 于流入速率。本发明恢复了通向低位肢端的充足血流，并减少了与通向低位 肢端的血流不足相关的症状。本发明的优选实施方式通过促进形成具有足够 维持外周循环的血流的功能性外周旁路移植物延迟了外周旁路移植物失效 的发作或降低了外周旁路移植物失效。
对于本发明来说，任何修复性桥材料适合于创建血管通路结构，只要它 支持在AV移植物的情况下血液透析所需的血流速度和压力，并且支持在外 周旁路移植物的情况下外周循环所需的血流速度和压力。一般地，修复性桥 优选地是柔性的，与细胞整合相容的，并且具有合适的大小来支持所需的血 流速度。一个优选的实施方式利用了PTFE、或ePTFE、聚四氟乙烯桥；另 一个实施方式利用Dacron(E.I.duPont de Nemours and Co.)。修复性桥也 可以由修饰的PTFE材料、聚氨基甲酸酯、碳包被的PTFE和复合移植物形 成。PTFE移植物可以制作成各种物理构型，包括锥形、延伸的、棱纹状的、 平滑的，可以含有多种水平的PTFE。修复性移植物也可以包括末梢修饰， 包括静脉贴片、轴环、和插入在动脉和瘘之间的套管。其他实施方式包括天 然材料，例如隐静脉移植物、脐静脉移植物、股静脉同种异体移植物和生物 学异种移植，包括牛颈动脉和牛肠系膜静脉移植物。包含上述任一种的复合 移植物也是此处预期的。熟练医师将认可适合的等价物。
另外地和重要地，对于AV移植物或外周旁路移植物来说，正常或近正 常的痊愈速度促使内皮细胞在修复性桥的腔表面增殖，从而促进移植物和相 连血管系统的整合。为了促进整合，可植入材料的细胞提供的治疗因子扩散 到管壁。对于合成的移植物材料来说，合成材料的孔隙也可以影响治疗因子 到达在合成移植物的腔表面上增殖的细胞的能力。
PTFE移植物。在某些优选的实施方式中，15-25cm长度的6-mm 内径PTFE管被用于形成移植物(Atrium Advanta VS Standard Wall PTFE graft， 0.6mm，Atrium Medical Corp，Hudson，NH)。特别优选的移植物材料PTFE是 柔性的聚合物，其已经显示了用于外科操作时是非血栓性的。预期的是，替 代的聚合物材料，例如Dacron具有与PTFE类似的性质，也可以用作移 植物材料。
移植物可以被切割成期望的长度来便于在特定患者中精确放置。移植物 可以是前臂回路移植物或直移植物。移植物的末端可以被切割成角、具有凸 缘，或具有其他的构型，足以提高移植物末端的表面积用于缝合或足以改善 移植物在特定患者中的适应即可。移植物的末端也可以粗糙化或以其他方式 修饰来促进细胞粘附。另外，移植物材料可以包被有明胶、白蛋白或另一种 治疗试剂。
最后，为失效中或失效的AV移植物或外周旁路移植物提供可植入材料 可以引起原始移植物的复原，从而恢复移植物的功能。在相关的环境中，失 效的天然AV瘘可以用与本发明的可植入材料组合的AV移植物替换，作为 介入性治疗。
血管通路导管。根据某些实施方式，为血管通路创建的内驻静脉导管可 以用本发明的可植入材料处理。导管可以置于患者体内的各种位置，包括， 例如，放置在颈部、胸部和腹股沟。对于血液透析来说，当瘘在熟化时或移 植物在手术后整合时，双管腔导管可以被植入作为临时血管通路。
由于与导管相关的内膜增生，随后是在静脉-导管的通路接合点处或在 近端静脉段处与导管相关的血栓形成，造成血管通路导管通常过早地失效。
对于本发明来说，使用本发明的可植入材料处理提供了有益的自我平衡 性环境，从而无论在导管放置时或更晚的阶段与血管通路导管功能相关的并 发症，例如血栓形成、狭窄和/或凝结被减少。对于本发明来说，理解的是， 血管通路导管功能的增强包括导管功能方面的任何改善，或导管维持功能形 式方面的任何改善。
血管通路端口。根据某些实施方式，为血管通路创建的内驻端口可以用 本发明的可植入材料处理。端口可以置于患者体内的各种位置，包括，例如， 放置在臂、胸部和腹股沟中的静脉或动脉位置。
由于与端口相关的内膜增生，随后是在静脉-端口接合点处或在近端静 脉节处与端口相关的血栓形成，导致血管通路端口一般过早地失效。
对于本发明来说，使用本发明的可植入材料处理提供了有益的自我平衡 性环境，从而无论在端口放置时或更晚的阶段与血管通路端口功能相关的并 发症，例如血栓形成、狭窄和/或凝结在端口处被减少。对于本发明来说，理 解的是，血管通路端口功能的增强包括端口功能方面的任何改善，或端口维 持功能形式方面的任何改善。
一般问题。在本发明的某些实施方式中，在所述可植入材料的施用之前、 同时或之后施用其他治疗试剂。例如，可以施用防止或减少血凝块形成、血 小板凝聚或其他类似堵塞的试剂。示范性的试剂包括，例如，硫酸乙酰肝素 和TGF-β。取决于植入物需要的临床指标，其他细胞因子或生长因子也可以 掺入到可植入材料中，包括VEGF，来促进内皮细胞重生，以及包括b-FGF 来促进移植物整合。其他治疗试剂种类包括，但不限于，抗增殖试剂和抗肿 瘤试剂。实例包括雷帕霉素、紫杉醇(paclitaxel)和E2F诱物(Decoy)试 剂。任何上述试剂可以局部地或全身地施用；如果局部地施用，某些试剂可 以被包被在可植入材料内或由所述细胞提供。
另外，介导积极的组织重塑的试剂也可以与在此描述的可植入材料实施 方式组合施用。例如，某些试剂可以促进在血管损伤的部位，包括外科位置 处正常的或正常样的管腔再生或腔组织重塑。再一次，这些试剂可以包含在 所述可植入材料内或由所述细胞提供。
如临床医师所公认的，足够血液透析的血管通路需要血管通路结构成熟 和具有充足的血流。如在此其他地方说明的，熟化涉及在静脉中发生的解剖 变化，其允许透渗析期间重复的插管。允许重复性插管的某些改变涉及血管 大小和/或血管壁增厚和/或管腔直径。并且，如在此解释的，某一些上述变 化允许足够支持透渗析的血流速度。此外，如在此其他地方说明的，临床上 失效的血管通路结构是不能重复地将导管插入用于透渗析的结构，和不能支 持足以支持透渗析的血流的结构。这些临床失效可以直接与如上所述的解剖 参数中的功能障碍直接相关。
因而，本发明还提供了实现血管通路相关的临床终点的方法，包括提高 插管频率、改善血管通路结构血流、提高血管壁厚度、维持管腔直径、和/ 或上述的组合，其中所述方法包括以有效实现一种或多种上述终点的数量在 所述血管通路结构处、邻近或附近放置所述可植入材料的步骤。
此外，本发明还提供了鉴定成功地熟化的血管通路结构的方法，其中所 述方法包括监视以下临床参数的任一项的步骤：重复的插管；足够在透渗析 期间防止再循环的血流；血管壁增厚；足以在透渗析期间允许血液流动的管 腔直径，其中所述成功地熟化的血管通路结构展现至少一种上述参数。
本发明的可植入材料可以应用于需要介入性治疗以维持稳态的任何管 形解剖结构。管形的解剖结构包括血管系统、生殖系统、生殖泌尿系统、胃 肠系统、肺系统、呼吸系统以及脑和脊髓的室系统的结构。如在此预期的， 管形解剖结构是具有内部腔表面和腔外表面的那些结构。对于本发明来说， 腔外表面可以是但不限于管形结构的外表面。在某些结构中，所述内部腔表 面是内皮细胞层；在某些其他结构中，内部腔表面是非内皮细胞层。
细胞来源。如在此描述的，本发明的可植入材料包括细胞。细胞可以是 同种异体的、异种的或自体的。在某些实施方式中，活细胞的来源可以来自 适合的供体。在某些其他实施方式中，细胞的来源可以来自尸体或来自细胞 库。
在一个当前优选的实施方式中，所述细胞是内皮细胞。在特别优选的实 施方式中，这种内皮细胞从血管组织获得，优选但不限于动脉组织。如以下 例示的，适合使用的一种血管内皮细胞是主动脉内皮细胞。适合使用的另一 种血管内皮细胞是脐带静脉内皮细胞。以及，适合使用的另一种血管内皮细 胞是冠状动脉内皮细胞。适合本发明使用的其他种类的血管内皮细胞包括肺 动脉内皮细胞和髂动脉内皮细胞。
在另一种当前的优选实施方式中，适合的内皮细胞可以从非血管组织获 得。非血管组织可以来自此处的其他地方描述的任何管形解剖结构，或可以 来自任何非血管组织或器官。
在又一个实施方式中，内皮细胞可以来自内皮祖细胞或干细胞；在又一 个实施方式中，内皮细胞可以一般地来自祖细胞或干细胞。在其他优选的实 施方式中，细胞可以是来自血管、非血管组织或器官的同种异体的、异种的 或自体的非内皮细胞。本发明还预期遗传改变的、修饰的或工程化的任何上 述细胞。
在进一步的实施方式中，两种或多种细胞被共培养来制备当前的组合 物。例如，第一细胞可以导入到生物相容的可植入材料中并培养直到融合。 第一细胞类型可以包括，例如，平滑肌细胞、成纤维细胞、干细胞、内皮祖 细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的组合、任何其他期望的细胞类型或适合于 创建有助于内皮细胞生长的环境的期望细胞类型的组合。一旦第一细胞类型 达到融合，第二细胞类型被播种到生物相容性基质之中、之上或之内的第一 融合细胞类型的顶部，并培养直到第一细胞类型和第二细胞类型达到融合。 第二细胞类型可以包括，例如，内皮细胞或任何其他期望的细胞类型或细胞 类型的组合。预期的是，第一和第二细胞类型可以逐步地、或作为单一混合 物来引入。还预期的是，可以改变细胞密度来改变平滑肌细胞与内皮细胞的 比例。
为了防止平滑肌细胞或其他倾向于过度增殖的细胞类型的过度增殖，可 以修改培养过程。例如，在第一细胞类型融合之后，可以在引入第二细胞类 型之前用适合于第二细胞类型的附着因子包被培养物。示范性的附着因子包 括用明胶包被培养物来改善内皮细胞的附着。根据另一个实施方式，肝素可 以在培养第二细胞类型期间添加到培养基中来降低第一细胞类型的增殖并 优化期望的第一细胞类型与第二细胞类型的比例。例如，在平滑肌细胞的初 步生长之后，可以施用肝素来控制平滑肌细胞生长以实现更大的内皮细胞与 平滑肌细胞的比例。
在优选的实施方式中，通过首先用平滑肌细胞种植生物相容性可植入材 料创建共培养物，来创建血管结构。一旦平滑肌细胞达到融合，将内皮细胞 播种到可植入材料上培养的平滑肌细胞表面顶部来创建模拟的血管。这种实 施方式可以根据在此描述的方法应用到，例如，AV移植物或外周旁路移植 物，来促进修复性移植物材料的整合。
所有需要的是，当前组合物的细胞展现一种或多种优选的表型或功能性 质。如在此较早描述的，本发明基于以下发现：当与优选的基质(在此其他 地方描述)相连时具有可易于鉴定的表型的细胞可以促进、修复和/或以其他 方式调节与血管通路结构例如动静脉瘘或动静脉移植物的处理相关的血管 内皮细胞生理机能和/或腔稳态。
对于本发明来说，本发明的细胞的一种这样优选的、可易于鉴定的典型 表型是抑制或以其他方式干扰血管平滑肌细胞增殖的能力，如以下描述的体 外分析所测定的。这在此称为抑制性表型。
由当前组合物的细胞展现的另一种可容易鉴定的表型是，它们是抗血栓 性的或能够抑制血小板粘附和聚集。抗血栓活性可以使用如下所述的体外硫 酸乙酰肝素分析和/或体外血小板凝聚分析来测定。
在本发明的典型操作性实施方式中，细胞不必展现超过一种上述表型。 在某些实施方式中，细胞可以展现超过一种上述表型。
虽然上述表型各自代表了功能性的内皮细胞，例如但不限于血管内皮细 胞，但是展现了这种表型的非内皮细胞对于本发明来说被考虑为内皮样的， 并因而适用于本发明。内皮样的细胞在此也称为内皮细胞的功能类似物；或 内皮细胞的功能模拟物。因而，仅仅举例来说，适用于在此公开的材料和方 法的细胞还包括产生内皮样细胞的干细胞或祖细胞；非内皮细胞来源的但功 能上表现像使用在此列出的参数的内皮细胞的细胞；任何来源的、被工程化 或以其他方式被修饰以具有使用在此列出的参数的内皮样功能的细胞。
一般地，当以融合、近融合或融合后群体存在并与例如在此其他地方描 述的优选的生物相容性基质相连时，本发明的细胞展现一种或多种上述表 型。本领域普通技术人员理解的是，细胞的融合、近融合或融合后群体可以 通过各种技术容易地鉴定，最常见和广泛接受的技术是直接显微镜检查。其 他的技术包括使用标准细胞计数技术评估单位表面积的细胞数量，所述标准 细胞计数技术例如但不限于血球计数器或库尔特计数器。
另外，对于本发明来说，内皮样细胞包括但不限于功能上和表型上模仿 或模拟融合的、近融合的或融合后内皮细胞的细胞，如通过在此所列的参数 所测量的。
因而，使用以下阐述的详细说明和指导，本领域普通技术的医师将理解 如何生产、使用、测试和鉴定在此公开的可植入材料的操作性实施方式。也 就是说，在此提供的教导公开了制备和使用本发明的可植入材料所必需的所 有内容。进一步的，在此提供的教导公开了鉴定、制备和使用含有操作上等 效的细胞的组合物所必需的所有内容。实际上，所有需要的是含等效细胞的 组合物对于根据在此公开的方法处理血管通路结构是有效的。熟练医师将理 解的是，当前组合物的等效实施方式可以仅使用常规实验和在此提供的教导 来鉴定。
在某些优选的实施方式中，本发明的可植入材料中使用的内皮细胞从人 类尸体供体的主动脉分离。每一批细胞来自单个或多个供体，广泛地测试内 皮细胞纯度，生物学功能，以及细菌、真菌、已知的人类病原体和其他外来 试剂的存在。使用公知的技术低温保存细胞并入库，用于稍后在培养中扩增， 从而随后配制在生物相容性可植入材料中。
细胞制备。如上所述，适合的细胞可以从各种组织类型和细胞类型获得。 在某些优选的实施方式中，可植入材料中使用的人类主动脉内皮细胞分离自 尸体供体的主动脉。在其他实施方式中，猪的主动脉内皮细胞(Cell Applications，San Diego，CA)通过用于分离人类主动脉内皮细胞的相似操作 分离自正常的猪主动脉。每一批细胞来自单个或多个供体，广泛地测试内皮 细胞活力，纯度，生物学功能，以及支原体、细菌、真菌、酵母、已知的人 类病原体和其他外来试剂的存在。使用公知的技术进一步扩增、表征和低温 保存细胞，形成处于第三到第六次传代的工作细胞库，用于稍后在培养中扩 增，从而随后配制到生物相容性可植入材料中。
在通过在每个烧瓶中添加约15ml内皮细胞生长培养基预处理的T-75烧 瓶中制备人或猪主动脉内皮细胞。人类主动脉内皮细胞在内皮生长培养基 (EGM-2，Cambrex Biosciences，East Rutherford，NJ)中制备。EGM-2由补 充有含2％FBS的EGM-2单等分量(singlequot)的内皮细胞基础培养基 (EBM-2，Cambrex Biosciences)构成。猪细胞在补充有5％FBS和50μg/ml 庆大霉素的EBM-2中制备。将烧瓶置于维持在约37℃和5％CO2/95％空气、 90％湿度的孵化器中至少30分钟。从-160℃到-140℃冷冻器中移出一个 或两个细胞的小瓶，在约37℃解冻。每个解冻细胞的小瓶以大约3×103个细 胞每cm3的密度、优选不低于1.0×103和不超过7.0×103的密度播种到两个 T-75烧瓶中；将含有上述细胞的烧瓶放回孵化器中。在约8-24小时之后， 除去消耗了的培养基，用新鲜培养基替换。每两到三天更换培养基，此后， 直到细胞达到约85-100％的融合，但优选不低于60％和不超过100％。当 所述可植入材料预计用于临床应用时，在人类主动脉内皮细胞的解冻后培养 中和本发明的可植入材料的制备中仅使用无抗生素的培养基。
然后除去内皮细胞生长培养基，用10ml HEPES缓冲盐水(HEPES)冲 洗单细胞层。除去HEPES，添加2ml胰蛋白酶来从T-75烧瓶表面剥离细胞。 一旦发生分离，添加3ml胰蛋白酶中和溶液(TNS)来终止酶反应。添加另 外5ml HEPES，使用血球计对细胞计数。离心细胞悬浮液，对于人类细胞， 使用无抗生素的EGM-2调节到密度大约1.75×106个细胞/ml，或对于猪细胞， 使用补充有5％FBS和50μg/ml庆大霉素的EBM-2调节到密度大约 1.50×106个细胞/ml。
生物相容性基质。根据本发明，所述可植入材料包含生物相容性基质。 所述基质对于细胞生长和附着到基质之上或之内是容许的。所述基质是柔性 的和贴附的(conformable)。所述基质可以是固体、半固体或可流动的多孔 组合物。对于本发明来说，可流动组合物是指可以利用注射或注射型递送装 置，例如但不限于，针、注射器或导管施用的组合物。采用挤压、喷出或排 出的其他递送装置在此也是预期的。多孔基质是优选的。优选的可流动组合 物是保持形状的。所述基质也可以是具有柔性平面形式。所述基质也可以是 凝胶、泡沫、悬浮液、颗粒、微载体、微囊或纤维结构的形式。当前优选的 基质具有颗粒形式。
所述基质，例如当植入到血管的外表面上时，在其生物侵蚀之前可以存 留在植入位置至少约56-84天，优选约至少7天，更优选约至少14天，最 优选约至少28天。
一种优选的基质是Gelfoam(Pfizer，New York，NY)，一种可被吸收的 明胶海绵(以下称“Gelfoam基质”)。Gelfoam基质是从特别处理的、纯化的 猪皮明胶溶液制备的多孔的和柔性的外科海绵。
根据另一个实施方式，所述生物相容性基质材料可以是经修饰的基质材 料。当细胞与基质相连时，可以选择对基质材料的修饰，来优化和/或控制细 胞的功能，包括如上所述的细胞的表型(例如，抑制性表型)。根据一个实 施方式，对基质材料的修饰包括用附着因子或增强细胞抑制平滑肌细胞增殖 能力的粘附肽来包被所述基质，以降低炎症、提高硫酸乙酰肝素产量、提高 前列环素产量，和/或提高TGF-β1产量。示范性的附着因子包括，例如，纤 连蛋白、血纤蛋白凝胶、和利用标准的水成碳二亚胺化学作用(aqueous carbodiimide)共价连接的细胞粘附配体(包括例如RGD)。其他细胞粘附配 体包括具有细胞粘附识别序列的肽，所述细胞粘附识别序列包括但不限于： RGDY、REDVY、GRGDF、GPDSGR、GRGDY和REDV。
根据另一个实施方式，所述基质是Gelfoam以外的基质。其他示范性的 基质材料包括，例如，血纤蛋白凝胶、藻酸盐、聚苯乙烯磺酸钠微载体、胶 原包被的葡聚糖微载体、PLA/PGA和pHEMA/MMA共聚物(每种共聚物的 聚合比例从1-100％)。根据优选的实施方式，这些其他的基质被修饰以包 括附着因子或粘附肽，如以上叙述和描述的。示范性的附着因子包括，例如， 明胶、胶原、纤连蛋白、血纤蛋白凝胶、和利用标准的水成碳二亚胺化学作 用共价连接的细胞粘附配体(包括RGD)。其他细胞粘附配体包括具有细胞 粘附识别序列的肽，所述细胞粘附识别序列包括但不限于：RGDY、REDVY、 GRGDF、GPDSGR、GRGDY和REDV。
根据另一个实施方式，所述生物相容性基质材料被物理地修饰来改善对 基质的细胞附着。根据一个实施方式，所述基质被交联来增强它的机械性能， 和改善它的细胞附着和生长性质。根据优选的实施方式，首先使用硫酸钙交 联藻酸盐基质，随后是使用氯化钙和常规方案实施第二交联步骤。
根据又一个实施方式，改变所述生物相容性基质的孔径大小。优选的基 质孔径大小是约25μm到约100μm；优选约25μm到50μm；更优选约50μm 到75μm；进一步优选约75μm到100μm。其他优选的孔径大小包括低于约 25μm和高于约100μm的孔径大小。根据一个实施方式，所述孔径大小使用 盐浸出技术来改变。氯化钠被混合到基质材料和溶剂的溶液中，将溶液注入 模具中，容许溶剂蒸发。然后将基质/盐块浸入水中，盐浸出并留下多孔结构。 选择溶剂使得基质溶于溶液中而盐不溶。一种示范性的溶液包括PLA和二 氯甲烷。
根据可选择的实施方式，将二氧化碳气泡引入到非固态形式的基质中， 然后用合适的表面活性剂稳定。随后利用真空除去气泡，留下多孔结构。
根据另一个实施方式，采用冻干技术来控制基质的孔径大小，利用冰微 粒的冷冻速度来形成不同大小的孔径。例如，约0.1-2％猪或牛明胶的明胶 溶液可以注入到模具或平皿中，并在各种不同温度预先冷冻，然后冻干一段 时间。然后可以利用，优选的，紫外光(254nm)或通过添加戊二醛(甲醛) 来交联材料。预冷冻温度(例如，-20℃、-80℃或-180℃)、冻干温度(在 约-50℃冻干)和明胶浓度(0.1％到2.0％；孔径大小一般与溶液中明胶的 浓度成反比)的变化都可能影响产生的基质材料的孔径大小，并且可以被修 改来产生优选的材料。熟练技术人员将理解，适合的孔径大小是促进和维持 具有在此其他地方描述的表型的最佳的细胞群体的孔径大小。
柔性平面形式。如在此教导的，平面形式的生物相容性基质可以配置成 各种形状和大小，优选适合于植入在瘘、移植物、外周移植物或其他血管通 路结构和其周围之处、邻近或附近的形状和大小，所述形状和大小能够贴附 通路结构和其相连血管的轮廓化表面。根据优选的实施方式，调整单片基质 的大小并配置单片基质，以应用于要处理的特定血管通路结构。
根据一个实施方式，所述生物相容性基质被配置为柔性平面形式。为向 管状结构例如但不限于血管施用，或为向血管通路结构例如但不限于血管接 合点施用而配置的示范性的实施方式在图1中说明。长度、宽度、厚度和表 面积的特征没有按比例或以成比例方式在图1中描绘；图1是非限制性的示 例性实施方式。
参考图1，柔性平面形式20由一片合适的生物相容性基质形成。所有需 要的是，柔性平面形式20是柔性的、贴附的和/或适合于管状结构例如血管 的轮廓化的外表面。柔性平面形式20可以接触血管的外表面，可以包裹外 表面，或可以卷绕外表面。
根据图2A中说明的一个示范性实施方式，轮廓化的柔性平面形式20′ 可以被配置以含有可分界的区域，例如体30，连接到桥50，连接到片40。 片40是可通过桥50从体30分离的，而这几个区域形成连续的整体。根据 一个示范性实施方式，这几个区域的内部边缘被设置来限定轮廓化的柔性平 面形式20′中的内部槽隙60。根据优选的实施方式，限定内部槽隙60的这几 个区域进一步限定了位于轮廓化的柔性平面形式20′内部的第一端点62，位 于轮廓化的柔性平面形式20′的外部边缘上的第二端点64，以及宽度66。在 这个特定的示范性实施方式中，第一端点62处在片40和桥50之间的边界 上；第二端点64处在片40和体30之间的边界上。
在某些实施方式中，预期的是由以上描述的片40、体30和桥50限定槽 隙60的宽度66，优选是约0.01到约0.04，更优选约0.05到约0.08，最优选 约0.06英寸。优选的，柔性平面形式20′的槽隙60的宽度66具有足够的尺 寸，以阻止移接的细胞形成跨越槽隙60的宽度66的不间断的融合层或细胞 桥。然而预期的是，限定槽隙60和槽隙宽度66的实施方式可以如在此描述 的使用，即使仅仅通过切割或以其他方式阻断这种细胞层或细胞桥而使细胞 跨越宽度66。
本发明进一步预期图1的柔性平面形式20′可以适合于在即将使用之前 限定槽隙60，仅通过指导熟练医师使用解剖刀或其他刀具来部分地切割所述 平面形式，从而限定槽隙。
部分地，在此公开的发明基于以下发现，轮廓化的或贴附的柔性平面形 式容许可植入材料最佳地应用到管状结构而不损害植入物或移接其上的细 胞的完整性。一种优选的实施方式优化了与手术处理的血管的解剖结构的接 触和相符，并控制可植入材料叠盖的程度。可植入材料在外膜间隙内的过度 叠盖可以在处理的血管上引起压力点，潜在地限制血流通过血管或产生其他 可能延迟和/或抑制稳态和正常痊愈的破坏。熟练医师将认识到植入时的过度 叠盖，并将认识到重新放置或改变例如修整可植入材料的需要。另外，在其 他实施方式中，可植入材料的叠盖能够引起散布在可植入材料内的治疗试剂 的过量给药。如在此其他地方描述的，化学物质或其他外源提供的治疗试剂 可以任选地添加到植入物中。在某些其他实施方式中，这种试剂可以添加到 生物相容性基质并在不存在细胞的情况下施用；在这种方式下使用的生物相 容性基质任选的限定槽隙。
相比之下，不充分接触目标管状结构的可植入材料能够引起对该移接的 细胞所提供的临床益处的不充分暴露，或添加到所述可植入材料中的治疗试 剂的不足给药。熟练的医师将认识到在植入时次最优接触对于重新放置和/ 或其他可植入材料的需要。
可流动组合物。在此处预期的某些实施方式中，本发明的可植入材料是 包含颗粒状生物相容性基质的可流动组合物。用于能够通过进入血管内部长 度来管腔内(血管内)施用、或通过透皮局部施用的可注射型递送装置的、 任何非固体可流动组合物是此处预期的。可流动组合物优选的是保持形状的 组合物。因而，在此处预期的、在可流动型颗粒状基质之中、之上或之内包 含细胞的可植入材料，可以被配制用于任何可注射递送装置，所述递送装置 内径范围从约22规格(gauge)到约26规格，并能够递送约50mg包含颗 粒材料、在约1到约3ml中含有约1百万个细胞的可流动组合物。
根据当前优选的实施方式，可流动组合物包含生物相容的颗粒状基质， 例如Gelfoam颗粒、Gelfoam粉末或粉碎的Gelfoam(Pfizer Inc.，New York， NY)(以下称“Gelfoam颗粒”)，其为来自猪皮明胶的产品。根据另一种实施 方式，所述颗粒状基质是Cytodex-3(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ) 微载体，包含与交联葡聚糖的基质联结的变性胶原。
根据可选择的实施方式，所述生物相容性可植入颗粒状基质是经修饰的 生物相容性基质。修饰包括以上对于可植入基质材料描述的那些。
适合按这种方式使用的可流动组合物的实例在同一天提交的共同待决 申请PCT/US_______(代理人编号No.ELV-008PC)中公开，其完整内 容通过引用并入本文；以及在同一天提交的共同待决申请 PCT/US______(代理人编号No.ELV-009PC)中公开，其完整内容通过 引用并入本文。
生物相容性基质的细胞播种。适合的生物相容性基质的预先切割的片段 或适合的生物相容性可流动基质的等分量，通过添加没有抗生素的EGM-2 在大约37℃和5％CO2/95％空气中重新水化12到24小时。然后从它们的重 新水化容器中移出可植入材料，放置到各个组织培养平皿中。生物相容性基 质以大约1.5-2.0×105个细胞(1.25-1.66×105个细胞/cm3基质)的优选的 密度播种，放置到维持在大约37℃和5％CO2/95％空气、90％湿度的孵化器 中3-4小时以促进细胞附着。播种的基质然后放置到各个容器(American Master Tech，Lodi，CA)管中，各自装有带0.2μm过滤器的帽子和EGM-2， 在大约37℃和5％CO2/95％空气下孵育。每两到三天更换培养基，此后，直 到细胞达到融合。在一个优选的实施方式中的细胞优选是第6次传代，但是 可以使用更少或更多次传代的细胞。根据本发明的其他实施方式的其可植入 材料制备方案在提交的共同待决申请PCT/US______(代理人编号No.ELV -009PC)中公开，其完整内容通过引用并入本文。
细胞生长曲线和融合。在或大约在第3或4、6或7、9或10、和12或 13天移出可植入材料的样品，计数细胞并评定活力，构建生长曲线和评估以 评估生长特点，和确定是否达到融合、近融合或融合后。在图3A和图3B 中呈现了来自包含猪主动脉内皮细胞植入物的可植入材料的两个制品的代 表性生长曲线。在这些实例中，所述可植入材料具有柔性平面形式。一般地， 普通技术人员将理解早期、中期和晚期时间点的可接受细胞生长的特征，例 如在早期时间点观察到细胞数量增加(当参考图3A时，约2-6天之间)， 随后是近融合阶段(参考图3A时，在约6-8天之间)，随后是一旦细胞达 到融合时细胞数量的平台期(参考图3A时，在约8-10天之间)，和当细胞 是融合后时细胞数量的维持(参考图3A时，在约10-14天之间)。对于本 发明来说，处于平台期至少72小时的细胞群体是优选的。
通过使用0.8mg/ml胶原酶在胰蛋白酶-EDTA溶液中形成的溶液完全消 化可植入材料的等分量，实现细胞计数。在测量消化的可植入材料的体积之 后，用0.4％锥虫蓝稀释已知体积的细胞悬液(细胞∶锥虫蓝为4∶1)，通过 锥虫蓝排阻评定活力。使用血球计数器计数活细胞、非存活细胞和总细胞。 通过将活细胞数目相对于培养天数作图来构建生长曲线。在达到融合之后将 细胞装运和移植。
对于本发明来说，融合被定义为当可植入材料是柔性平面形式 (1.0×4.0×0.3cm)时存在至少约4×105个细胞/cm3，当是柔性组合物时优选 每等分量(50-70mg)约7×105到1×106个总细胞。对这两者，细胞活力至 少约90％，但优选不低于80％。如果到第12或13天细胞不融合，更换培 养基，继续孵育一天。继续这个过程直到达到融合或直到播种后14天。在 第14天，如果细胞没有融合，全部丢弃。如果在进行过程中检查之后确定 细胞是融合的，进行最后的培养基更换。这种最后的培养基更换使用没有酚 红和没有抗生素的EGM-2进行。在培养基更换之后立刻地给试管装上无菌 栓塞密封帽用于装运。
功能评估。对于在此描述的发明来说，在植入之前进一步测试可植入材 料的功能。例如，在培养期间收集条件培养基来确定培养的内皮细胞产生的 硫酸乙酰肝素、转化生长因子-β1(TGF-β1)、碱性成纤维细胞生长因子 (b-FGF)和氧化氮的水平。在某些优选的实施方式中，当总细胞是至少约 2、优选至少约4×105个细胞/cm3的柔性平面形式；活细胞的百分比是至少 约80-90％、优选≥90％、最优选至少约90％；条件培养基中硫酸乙酰肝 素是至少约0.5-1.0、优选至少约1.0微克/106个细胞/天时，所述可植入材 料可以用于在此描述的目的。在条件培养基中TGF-β1是至少约200-300、 优选至少约300皮克/ml/天；条件培养基中的b-FGF是少于约200皮克/ml、 优选不超过约400皮克/ml。
硫酸乙酰肝素水平可以使用常规的二甲基亚甲基蓝色-软骨素酶ABC消 化分光光度分析来测定。总硫酸化糖胺聚糖(GAG)水平使用二甲基亚甲基 蓝(DMB)染料结合分析来测定，其中未知样品与使用在集中培养基中稀释 的已知数量的纯化硫酸软骨素产生的标准曲线比较。在添加DMB显色试剂 之前将其他的条件培养基样品与软骨素酶ABC混合来消化软骨素和硫酸皮 肤素。在与GAG标准物混合的DMB染料的最大波长吸光度下，一般约515 -525nm下，测定所有的吸光度。通过从条件培养基样品中的总硫酸化糖胺 聚糖浓度中减去软骨素和硫酸皮肤素的浓度，计算每106个细胞每天的硫酸 乙酰肝素浓度。软骨素酶ABC活性通过消化纯化的硫酸软骨素样品来确认。 如果低于100％的纯化的硫酸软骨素被消化，适当地校正条件培养基样品。 硫酸乙酰肝素水平也可以使用采用单克隆抗体的ELISA分析来测定。
TGF-β1和b-FGF水平可以使用采用单克隆或多克隆抗体、优选多克隆 抗体的ELISA分析来测定。对照集中培养基也可以使用ELISA分析来测定， 根据对照培养基中存在的TGF-β1和b-FGF水平适当地校正样品。
氧化氮(NO)水平可以使用标准的格里斯反应分析来测定。氧化氮的 短暂和挥发性特性使他不适合大多数检测方法。然而，氧化氮的两种稳定的 分解产物，硝酸盐(NO3)和亚硝酸盐(NO2)可以使用常规光度方法来检 测。在存在硝酸盐还原酶的情况下，格里斯反应分析酶学地转化硝酸盐成为 亚硝酸盐。作为有色的偶氮染料产物以色谱方式检测亚硝酸盐，在约540nm 的范围内吸收可见光。系统中存在的氧化氮的水平通过以下方法测定：转化 所有的硝酸盐为亚硝酸盐、测定未知样品中亚硝酸盐的总浓度、然后比较产 生的亚硝酸盐的浓度与使用转变成亚硝酸盐的已知数量的硝酸盐产生的标 准曲线。
使用如上所述的定量硫酸乙酰肝素、TGF-β1、NO和/或b-FGF分析，以 及如下的对平滑肌细胞生长和血栓形成抑制作用的定量体外分析，来评定较 早描述的优选的抑制性表型。对于本发明来说，当一种或多种这些可选择的 体外分析确定了可植入材料展现优选的抑制性表型时，可植入材料准备好用 于植入。
为了评估对体外的平滑肌细胞生长的抑制作用，测定与培养的内皮细胞 相关的抑制作用大小。猪或人类主动脉平滑肌细胞稀疏地播种到24孔组织 培养平板中的平滑肌细胞生长培养基(SmGM-2，Cambrex BioScience)中。 容许细胞附着24小时。然后使用含有0.2％FBS的平滑肌细胞基础培养基 (SmBM)替换该培养基达48-72小时来延滞细胞生长。从融合后内皮细 胞培养物制备条件培养基，用2×SMC生长培养基1∶1稀释，并添加到培养 物中。对平滑肌细胞生长的抑制作用的阳性对照被包括在每个分析中。在三 到四天之后，使用库尔特计数器计数每个样品中的细胞数量。通过比较即将 添加条件培养基之前每反应孔的平滑肌细胞数目和暴露于条件培养基之后 三到四天的数目，以及对照培养基的数目(有和没有添加生长因子的标准生 长培养基)，测定条件培养基对平滑肌细胞增殖的影响。与条件培养基样品 相关的抑制作用的大小同与阳性对照相关的抑制作用的大小相比较。根据优 选的实施方式，如果条件培养基抑制了肝素对照物所能抑制的量约20％，所 述可植入材料被认为是抑制性的。
为了评估体外的血栓形成抑制作用，测定与培养的内皮细胞相关的硫酸 乙酰肝素水平。硫酸乙酰肝素具有抗增殖和抗血栓性质。使用以上详细描述 的常规的二甲基亚甲基蓝-软骨素酶ABC分光光度法分析或ELISA分析，计 算出每106个细胞的硫酸乙酰肝素的浓度。当条件培养基中的硫酸乙酰肝素 是至少约0.5-1.0、优选至少约1.0微克/106个细胞/天时，所述可植入材料 可以用于在此描述的目的。
评估血栓形成抑制作用的另一种方法涉及测定与富血小板血浆相关的 体外血小板凝聚抑制作用的大小。通过在室温下向猪血液样品添加柠檬酸钠 来获得猪血浆。柠檬酸化的血浆以柔和的速度离心，来将血红细胞和白细胞 提取到团粒(pellet)中，留下血小板悬浮在血浆中。从融合后内皮细胞培养 物制备条件培养基，并添加到富血小板血浆的等分量中。向血浆添加血小板 聚集剂(激动剂)作为对照。血小板激动剂通常包括花生四烯酸 (arachidonate)、ADP、胶原、肾上腺素和瑞斯托菌素(ristocetin)(可从 Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO获得)。其他的血浆等分量不添加血小板激 动剂或条件培养基，来评定基线的自发血小板凝聚。用于抑制血小板凝聚的 阳性对照也被包括在每个分析中。示范性的阳性对照包括阿斯匹林、肝素、 阿昔单抗(abciximab)(ReoProEli Lilly，Indianapolis，IN)、替罗非班 (tirofiban)(AggrastatMerck & Co.，Inc.，Whitehouse Station，NJ)或依替 巴肽(eptifibatide)(IntegrilinMillennium Pharmaceuticals，Inc.，Cambridge， MA)。然后使用聚集计测量所有测试条件的产生的血小板聚集。聚集计通过 监视光密度来测量血小板聚集。血小板聚集时，更多的光线可以通过样本。 聚集计以“血小板聚集单位”报告结果，这是血小板聚集速度的函数。作为在 添加激动剂之后6分钟的最大聚集来评定聚集。通过比较添加条件培养基之 前的基线血小板聚集以及富血小板血浆暴露于条件培养基之后的血小板聚 集，以及比较阳性对照，来测定条件培养基对血小板聚集的影响。结果表示 为占基线的百分比。与条件培养基样品相关的抑制作用的大小同与阳性对照 相关的抑制作用的大小相比较。根据优选的实施方式，如果条件培养基抑制 了阳性对照所能抑制的约20％，所述可植入材料被认为是抑制性的。
当准备植入时，具有柔性平面形式的可植入材料供应至最终产物容器 中，各自优选含有1×4×0.3cm(1.2cm3)的无菌片，所述无菌片具有优选大 约5-8×105、优选至少约4×105个细胞/cm3，和至少约90％的活细胞，例如， 来自单一尸体供体来源的人类主动脉内皮细胞，每立方厘米，在大约45-60 ml、优选约50ml内皮生长培养基中(例如，不包含酚红和抗生素的内皮生 长培养基(EGM-2)。当使用猪主动脉内皮细胞时，生长培养基也是不包含 酚红的EBM-2，但补充有5％FBS和50μg/ml庆大霉素。
在其他优选的实施方式中，包含可流动颗粒形式的可植入材料在最终产 物容器中提供，包括，例如，装备有过滤帽子的密封的组织培养容器或预先 装载的注射器，各自优选含有约50-60mg颗粒材料，使用约7×105到约 1×106个总内皮细胞移接，这些细胞存在于每等分量约45-60ml、优选约 50ml内皮生长培养基中。
可植入材料的货架寿命。包含融合、近融合或融合后细胞群体的可植入 材料可以在室温下以稳定和存活条件维持至少两周。优选的，这种可植入材 料被保持在约45-60ml、更优选50ml有或没有额外的FBS的转移培养基 中。转移培养基包含没有酚红的EGM-2培养基。FBS可以添加到转移培养 基的体积中，直至约10％FBS，或约12％FBS的总浓度。然而，由于FBS 必需在植入之前从可植入材料中除去，优选的是限制转移培养基中使用的 FBS的数量来降低植入前所需的清洗时长。
可植入材料的低温保存。包含融合的细胞群体的融合可植入材料可以被 低温保存，用于保存和/或转运到临床，而在最后解冻时不降低它的临床效力 或完整性。优选的，所述可植入材料低温保存在15ml冷冻管(Nalgene Nalge Nunc Int′l，Rochester，NY)中、存在于含有约5％到20％DMSO、约2 -8％葡聚糖和约50-75％FBS的约5ml CryoStor CS-10溶液(BioLife Solutions，Oswego，NY)中。将冷冻管置于冷异丙醇(或控制冷冻速度的任 何这样的试剂中)水浴中，转移到约-80℃冷冻器约4小时，随后转移到液 氮中(约-150到-165℃)。
可植入材料的低温保存的等分量然后在室温下慢慢解冻约15分钟，随 后在室温水浴中继续解冻大约15分钟。然后在约15ml洗涤培养基中洗涤 材料约3次。洗涤培养基包含没有酚红、有50μg/ml庆大霉素的EBM。前 两次清洗操作在室温下进行约5分钟。最终的清洗操作在37℃在5％CO2中 进行约30分钟。
在解冻和清洗操作之后，容许低温保存的材料在约10ml再生溶液中静 息约48小时。对于猪内皮细胞，再生溶液是补充有5％FBS和50μg/ml庆 大霉素、在37℃在5％CO2中的EBM-2。对于人内皮细胞，再生溶液是没有 抗生素的EGM-2。进一步的解冻后调节可以在使用和包装用于保存或转运 之前另外进行至少24小时。
在即将植入之前，倾倒培养基，在约250-500ml无菌盐水(USP)中 清洗可植入材料。如有必要，最终产品中的培养基含有少量的FBS来在转运 到临床位置期间维持细胞活力。FBS已经根据Title 9CFR：Animal and Animal Products广泛地测试了细菌、真菌和其他病毒剂的存在。仅在植入之 前采取清洗操作，其降低转运的FBS的数量，优选降低到单位植入物0-60 ng之间。
每个人患者的总细胞载荷优选是大约1.6-2.6×104个细胞每kg体重， 但是不低于约2×103以及不超过约2×106个细胞每kg体重。
如在此预期的，本发明的可植入材料包含细胞，优选血管内皮细胞，其 优选是约90％存活的、密度优选约4×105个细胞/cm3柔性平面形式，当融 合时，产生含有至少约0.5-1.0、优选至少约1.0微克/106个细胞/天的硫酸 乙酰肝素，至少约200-300、优选至少约300皮克/ml/天的TGF-β1，和低于 至少约210皮克/ml、优选不超过约400皮克/ml的b-FGF的条件培养基。
柔性平面形式的可植入材料的递送
一般问题。可植入材料可以以各种形式施用给血管通路结构。根据一个 优选的实施方式，所述可植入材料是按形状和大小切割的柔性平面形式，使 其适合于植入到瘘、移植物、外周移植物或其他血管通路结构和其周围附近， 并且其可以贴附在通路结构和它相连的血管的轮廓化表面。
根据优选的实施方式，为向要处理的血管通路结构应用来调整单片可植 入材料的大小。根据另一个实施方式，超过一片的柔性平面形式的可植入材 料，例如二、三、四、五、六、七、八或更多片基质材料，可以用于单个血 管通路位置。另外，沿着血管通路结构长度的超过一个位置可以用一片或多 片可植入材料处理。例如，对于动静脉移植物来说，每个近端静脉接合点、 远端静脉接合点和远端静脉节可以用一片或多片所述可植入基质材料处理。
根据一个非限制性实施方式，所述可植入材料被配置以贴附血管的外表 面。在图1中说明了示范性的非限制性平面形式。参考图1，示范性的柔性 平面形式20具有长度12、宽度14和高度16。根据一个优选的实施方式， 柔性平面形式20的长度12是约2cm到约6cm，柔性平面形式20的宽度 14是约0.5cm到约2cm，柔性平面形式20的高度16是约0.1cm到约0.5cm。
根据另一个实施方式，柔性平面形式20可以配置为解剖学上轮廓化的 形式，其贴附血管或血管通路结构的外表面。在图2A中描绘了被配置用于 向血管通路结构施用的示范性的解剖学轮廓化的柔性平面形式20′，并在以 下更详细地讨论。
如在此的其他地方说明的，图2A的轮廓化的柔性平面形式20′可以配置 为各种几何形式。例如，根据一个实施方式，轮廓化的柔性平面形式20′含 有限定内部槽隙60的几个区域。根据其他实施方式，轮廓化的柔性平面形 式20′的边缘和/或内部槽隙60的边缘是有角度的或曲线的。根据另一个实施 方式，轮廓化的柔性平面形式20′的高度16′跨越长度12′和/或宽度14′地变化。 另外，取决于轮廓化的柔性平面形式20′的构型和预期目的，可以有一个、 或超过一个的片40、桥50和/或槽隙60。对于槽隙的特征，可以在轮廓化的 柔性平面形式20′之中、之上或之内的任何地方限定槽隙。槽隙可以被限定 为宽度均一或宽度有变化。槽隙可以被限定为线性、非线性或曲线的。
参考图2B、图2C、图2D和图2E，其描绘了含有至少一个槽隙60的 本发明的轮廓化柔性平面形式20′的多种实施方式，在某些实施方式中所述 轮廓化的柔性平面形式20′可以限定一个或超过一个的槽隙，并可以根据在 此公开的方法来使用。在轮廓化的柔性平面形式20′之上或之内限定的槽隙 60可以沿着所述轮廓化的柔性平面形式20′的任何边缘排列，或可以穿透到 轮廓化的形式20′的内部。现在参考图2E，在所述轮廓化的柔性平面形式20′ 之中或之内的槽隙60的宽度66或总体形状可以被限定为宽度均一或宽度有 变化，可以限定为线性、非线性或曲线的。
对于图2F和图2G，轮廓化的柔性平面形式20′可以限定分别具有不同 宽度66和66′的槽隙60或60′。
如所描绘的，图2G的槽隙60′和宽度66′代表一种实施方式，其中医师 在植入之时，切割在此其他地方提出的柔性平面形式20′，从而将它转变成 图2G中描绘的轮廓化的柔性平面形式20′。
根据一个实施方式，端对面血管接合点连接，例如动静脉瘘，可以使用 本发明的可植入材料处理。在图4A、图4B和图4C中说明了将柔性平面形 式的可植入材料递送到端对面血管接合点的示范性方法的步骤。
参考图4A，通过将第一片可植入材料22的一个末端34或第二末端36 移至接合段110下部，直到第一片可植入材料22的中段32处在接点112处， 在此血管100、110会合，向血管通路结构提供第一片可植入材料22。末端 34、36然后在接点112卷绕缝合线114，保持可植入材料中心在缝合线114 上。根据一个实施方式，第一片可植入基质材料22的末端34、36可以相互 叠盖仅仅足以固定第一片可植入基质材料22就位即可。根据另一个实施方 式，第一片可植入基质材料22的末端34、36不相互叠盖。第一片可植入基 质材料22或任何其他片可植入基质材料的末端34、36，不必相互会合、相 互叠盖、或卷绕任一血管100、110的整个圆周。根据一个优选的实施方式， 第一片可植入材料22的末端34、36卷绕接合接点112尽可能远而不拉伸或 撕扯。所有需要的是，实现血管的充分覆盖。熟练技术人员将理解何时恰当 地实现可植入材料的施用。
参考图4B，根据另一个实施方式，任选的应用第二片可植入材料24， 第二片可植入材料24的中段42中心在接合接点112处、邻近或附近。第二 片可植入材料24的末端44、45卷绕血管100。如在图4A中对于第一片可 植入材料22所描述的，第二片可植入基质材料24的末端44、46可以但不 需要接触、叠盖、或卷绕任一血管100、110的整个圆周。
参考图4C，根据又一个实施方式，第三片可植入材料26任选的置于处 理的血管100的近端血管段116处、接合接点112的远端。根据一个实施方 式，第三片可植入材料26沿着血管100的长度纵向地放置，第三片可植入 材料26的第一末端54在接合接点112处、其邻近或附近，第三片可植入材 料26的第二末端56远离接合接点112。如在图4A中对于第一片可植入材 料22所描述的，第三片可植入基质材料26的末端54、56可以但不需要接 触、叠盖、或卷绕血管100的整个圆周。
根据可选择的实施方式，限定槽隙60的单片轮廓化柔性平面形式20′， 例如图2A中说明的示范性轮廓化的形式，被提供给血管通路结构，例如端 对面接合点。在图5中说明了在端对面接合点处、邻近或附近植入限定槽隙 60的轮廓化的柔性平面形式20′的可植入材料。当可植入材料以缠绕方式使 用时，预期的是单片的可植入基质材料足够处理接合点和邻近的脉管系统。 调整每个轮廓化的柔性平面形式20’的大小和形状，用于应用到特定血管通 路结构，并因而，被预先形成以提供足够的覆盖和充足水平的内皮细胞因子 和/或治疗试剂，来为该特定的血管通路结构和附近的脉管系统创建自我平衡 的环境。
参考图5，根据一个实施方式，通过从片40分离体30，向接合点提供 限定槽隙的单个轮廓化的柔性平面形式20′。体30沿着主要血管100的表面 放置。桥50置于主要血管100的表面上，以及二级血管110的分支的下方。 然后将片40围绕分支的血管110，将片40沿着分支的血管110的上表面放 置。
根据图5，单片的轮廓化的柔性平面形式20′含有两个参照点70、80(还 参见图2A)。当施用到端对面接合点的位置时，如图5中说明的，对准两个 参照点70、80。第一参照点70位于片40上，第二参照点80位于桥50上(还 参见图2A)。在轮廓化的柔性平面形式20′的一个实施方式中，在植入之前， 参照点70、80分开约二分之一英寸、优选小于约1英寸、更优选约1英寸、 最优选不超过1.5英寸的距离。当轮廓化的柔性平面形式20′被施用到接合点 的位置时，槽隙特征所允许的轮廓化的柔性平面形式20′围绕分支的血管110 的旋转使得参照点70、80对准。
根据一个实施方式(再次参考图4A、图4B和图4C)，例如，当处理动 静脉移植物时，第一片可植入材料22和第二片可植入材料24分别被应用到 近端静脉接合点和远端静脉接合点。另外，第三片可植入材料26可以位于 远端静脉、远端静脉接合点的下游。
根据图6中例示的又一个可选择的示范性实施方式，柔性平面形式20 中的单片可植入材料20应用到管状结构例如血管100上。预期的是，可植 入材料可以应用于管状结构，例如不含有血管通路结构的血管。例如，血管 通路结构下游的静脉部分可能经历加重的炎症、血栓形成、再狭窄或闭塞， 其由血管通路结构的形成或被处理的静脉部分上游的血管通路结构处的粘 针(needle stick)引起。在这种情况下，本发明的可植入材料可以处理、管 理和/或改善这些状况，这些状况在距离血管通路结构一定距离处出现。
可流动组合物中可植入材料的递送
一般问题。本发明的可植入材料当处于可流动组合物形式时包含颗粒状 生物相容性基质和细胞，优选内皮细胞，更优选血管内皮细胞，所述细胞是 约90％存活的，优选密度约0.8×104个细胞/mg，更优选约1.5×104个细胞 /mg，最优选约2×104个细胞/ml，所述细胞可以产生条件培养基，所述培养 基含有至少0.5-1.0、优选至少约1.0微克/106个细胞/天的硫酸乙酰肝素， 至少约200-300、优选至少约300皮克/ml/天的TGF-β1，以及低于约200皮 克/ml和优选不超过约400皮克/ml的b-FGF；以及，所述细胞显示早前描述 的抑制性表型。
对于本发明来说，一般地，可流动颗粒材料的施用被定位到血管通路结 构处、其邻近或附近的位置。可植入材料的沉积位置是腔外。如在此预期的， 局部的、腔外的沉积可以如下实现。
在特别优选的实施方式中，所述可流动组合物首先使用适合的针、导管 或其他适合的透皮注射型递送装置透皮地施用，进入血管周围间隙然后沉积 在腔外位置。做为选择，所述可流动组合物使用针、导管或其他适合的递送 装置透皮地递送，连同鉴定步骤来便于向期望的腔外位置的递送。鉴定步骤 可以在透皮肤递送之前或同时发生。所述鉴定步骤可以使用血管内超声、其 他的常规超声、荧光检查和/或内窥镜检查方法来实现，略举数例。任选地进 行所述鉴定步骤，而不是实践本发明的方法必要的。
所述可流动组合物也可以腔内地，即，血管内地施用。例如，所述组合 物可以通过能插入到血管内的任何设备来递送。在这种情况下，这样的管腔 内递送装置具备横贯或穿透设备，其穿透血管的腔壁来到达血管的非腔表 面。然后所述可流动组合物在血管通路结构位置处、邻近或附近沉积在血管 的非腔表面上。
在此预期的是，非腔的、也称为腔外的表面可以包括血管的外部表面或 血管周表面，或可以处在血管的外膜、血管中层或内膜之内。对于本发明来 说，非腔的或腔外的表面是除了管腔内表面之外的任何表面。
在此预期的穿透设备可以允许，例如，单个递送点或以期望的几何构型 排列的多个递送点来实现可流动组合物向血管的非腔表面的递送，而不破坏 血管通路结构。可以排列多个递送点，例如，环形、牛眼形、或线列排列， 略举数例。所述穿透设备也可以是展伸穿孔器的形式，例如但不限于，包括 多个递送点的气球支架(balloon stent)。
根据本发明的优选实施方式，所述穿透设备在所述血管通路结构位置的 近端或远端经由血管的内腔表面插入。在某些临床受试者中，穿透设备在血 管通路结构位置处的插入可能破坏血管通路结构和/或引起动静脉移植物或 外周移植物的开裂。因而，在这些受试者中，应当小心地在离血管通路结构 一定距离的位置插入所述穿透设备，优选由临床医师取决于手头的特定环境 确定该距离。
优选的，可流动组合物沉积在血管的血管周表面上，在要处理的血管通 路结构的位置，或在血管通路结构位置的邻近或附近。所述组合物可以沉积 在相对于血管通路结构的各种位置，例如，在近端接合点处、在远端接合点 处、邻近于任一接合点、例如，接合点的上游，对着接合点的外部血管表面。 根据优选的实施方式，邻近的位置位于血管通路结构位置的约2mm到20 mm之内。在另一个优选的实施方式中，位置在约21mm到40mm之内； 在又一个优选的实施方式中，位置在约41mm到约60mm之内。在另一个 优选的实施方式中，位置在约61mm到100mm之内。做为选择，邻近的位 置是任何其他的、临床医师确定的邻近位置，在此沉积的组合物能够展现对 于血管通路结构附近的血管的期望效果。
在另一个实施方式中，所述可流动组合物直接递送到血管通路结构处、 邻近或附近的手术暴露的腔外位置。在这种情况下，通过对该位置的直接观 察来引导和指导递送。还是在这种情况下，通过同时使用如上所述的鉴定步 骤，可以帮助递送。再一次地，鉴定步骤是任选的。
腔外施用。对于本发明来说，可流动组合物的施用被定位到邻近于、附 近于、或需要处理的位置之处的位置。如在此预期的，局部的、腔外的沉积 可以如下实现。
使用针、导管或其他适合的递送装置透皮地递送可流动组合物。做为选 择，与导引方法的使用同时地透皮递送所述可流动组合物，来便于向需要处 理的位置的递送。在进入血管周围间隙时，临床医师将所述可流动组合物沉 积在需要处理的位置之处、邻近或附近的腔外位置。透皮递送最佳地可以通 过常规超声、荧光检查、内窥镜检查方法来导引和指导，略举数例。
在另一个实施方式中，所述可流动组合物局部地递送到需要处理的位置 之处、邻近或附近的手术暴露的腔外位置。在这种情况下，通过直接观察需 要处理的位置来导引和指导递送；同样在这种情况下，通过同时使用如上所 述的其他导引方法，可以帮助递送。
适合按这种方式使用的可流动组合物的实例在同一天提交的共同待决 申请PCT/US______(代理人编号No ELV-008PC)中公开，其完整内 容通过引用并入本文；以及在同一天提交的共同待决申请 PCT/US______(代理人编号No ELV-009PC)中公开，其完整内容通过 引用并入本文。
接合密封剂。在某些其他实施方式中，本发明的可流动组合物另外可以 特别地充当接合密封剂，或一般地充当外科密封剂。在这种双重目的实施方 式中，当与结构的外表面接触、或应用到外表面上的弧中、或绕圆周地应用 时，所述组合物对于密封两个或多个管状结构的接点、或密封管状结构中的 空隙也是有用的。这种密封剂可以消除缝合的需求，所述缝合可能进一步损 伤血管组织，例如，引起腔内皮的伤害。这种密封剂可以在接合点附近提供 额外的稳定性，从而加强任何缝合修复。所有需要的是，这种双重目的组合 物的密封剂型性质不影响或损害细胞的期望表型的一致性表达和所述组合 物的基于细胞的功能。
对于某些密封剂实施方式来说，所述可流动组合物包含生物相容性基 质，所述生物相容性基质本身包含具有密封剂性质的成分，例如但不限于血 纤蛋白网络，同时还具有支持内皮细胞或内皮样细胞群体的必需性质。并且， 生物相容性基质本身可以具有密封剂性质，以及支持细胞群体所需的那些性 质。对于其他实施方式来说，密封剂功能可以由细胞至少部分地贡献。例如， 预期的是，与该组合物相连的细胞可以产生能修饰基质的物质，从而所述基 质获得密封剂性质，同时还展现/维持它们的必需细胞功能。某些细胞可以天 然地产生这种物质，而其他细胞可以被工程化来产生。
制备、保存和转运可植入材料的方法
获得和制备细胞的方法。所述可植入材料包含同种异体的、异种的或自 体的内皮细胞或内皮样细胞。所述内皮细胞从患者、尸体或细胞库获得。所 述内皮细胞来源于血管组织，更优选来源于主动脉组织、最优选冠状动脉组 织、肺动脉组织或髂动脉组织。做为选择，内皮细胞或内皮样细胞来源于非 血管组织或器官、内皮祖细胞或其他祖细胞，或来自干细胞。根据其他实施 方式，所述细胞被遗传地改变、修饰或工程化。
广泛地测试来自供体的每一批细胞的内皮细胞纯度，生物学功能，以及 支原体、细菌、真菌、酵母、已知的人类病原体和其他外来试剂的存在。根 据优选的实施方式，细胞从O型血的供体获得。所述细胞使用公知的技术进 一步扩增至第2代或第4代、表征、并低温保存在-140℃，来形成主细胞 库，用于稍后制备工作细胞库、在培养基中扩增以及随后在可植入材料中制 剂。
选择的主细胞库然后在含有约15mL内皮细胞生长培养基的T-75烧瓶 中扩增形成工作细胞库。将烧瓶置于维持在大约37℃和5％CO2/95％空气、 90％湿度的孵化器中至少30分钟。从-160℃-140℃冷冻器中移出一个或 两个小瓶，在大约37℃解冻。每瓶解冻的细胞以约3×103个细胞每cm3，但 优选不低于1.0×103以及不超过7.0×103的密度播种到两个T-75烧瓶中。含 有细胞的烧瓶放回孵化器中。在约8-24小时之后，除去消耗了的培养基， 用新鲜培养基替换。每两到三天更换培养基，此后，直到细胞达到约85-100 ％的融合，但不低于60％和不超过100％。当所述可植入材料预计用于临床 应用时，在细胞的解冻后培养中和本发明的可植入材料制备中仅使用无抗生 素的培养基。
然后除去内皮细胞生长培养基，用10mL HEPES缓冲盐水(HEPES) 冲洗单细胞层。除去HEPES，添加2mL胰蛋白酶(约0.25mg/mL)来从T-75 烧瓶表面剥离细胞。一旦发生分离，添加3mL胰蛋白酶中和溶液(TNS) 来终止酶反应。添加另外5mL HEPES，使用血球计对细胞计数。对细胞悬 液离心并使用没有抗生素的EGM-2调节到约1.75×106个细胞/mL的密度。
如果细胞将被冷冻形成工作细胞库，使用额外的10％FBS(最终12％ FBS)和10％二甲亚砜(DMSO)补充培养基。将一毫升体积的产生的细胞 悬浮液分散到冷冻管中，并置于-80℃的冷冻器中4-24小时。冷冻的细胞， 即，工作细胞库，然后转移到设置在-140℃的冷冻器用于保存直到使用。 在第5代时冷冻工作细胞库。
制备可植入材料的方法。生物相容性基质的预切片或可流动基质的等分 量通过添加没有抗生素的EGM-2在大约37℃和5％CO2/95％空气中12到48 小时来再水化。然后从它的再水化容器中移出基质材料，放置到单独的组织 培养平皿中。用来自工作细胞库的细胞以大约1.5-2.0×105个细胞(1.25- 1.66×105个细胞/cm3基质)的优选的密度播种基质材料，放入维持在大约 37℃和5％CO2/95％空气、90％湿度的孵化器中3-4小时以促进细胞附着。 根据一个实施方式，播种的基质然后放入具有带0.2μm过滤器的帽子且装有 EGM-2的、单独的可密封容器或试管，在大约37℃和5％CO2/95％空气中孵 育。每两到三天更换培养基，此后，直到细胞达到融合。根据可选择的实施 方式，播种的基质放入具备栓塞密封盖的单独的可密封容器或试管中，并用 10％CO2吹洗。根据这种方法，每次更换培养基时用10％CO2吹洗容器。
测定细胞融合和功能的方法。在或大约在第3或4、6或7、9或10、以 及12或13天时移出可植入材料的样品。对细胞计数并评定活力，构建生长 曲线并进行评估，以评定生长特征和确定是否已经达到融合、近融合或融合 后。通过使用HEPES/CaCl2溶液中的0.5mg/mL胶原酶的溶液完全消化可 植入材料的等分量，实现细胞计数。在测量消化的可植入材料的体积之后， 用0.4％锥虫蓝稀释已知体积的细胞悬液(细胞∶锥虫蓝为4∶1)，通过锥虫 蓝排阻评定活力。使用血球计计数活细胞、非存活细胞和总细胞。通过将活 细胞数目相对于培养天数作图来构建生长曲线。优选的，包含细胞的可植入 材料在细胞达到融合之后植入，但可以使用融合后或近融合的细胞。如果到 第12或13天细胞不融合，更换培养基，继续孵育额外一天。继续这个过程 直到达到融合或直到播种后14天。在第14天，如果细胞还没有融合，该批 次一般地但不是必需地被丢弃。如果在进行过程中检查之后确定细胞是融合 的，进行最后的培养基更换。这种最后的培养基更换使用没有酚红和没有抗 生素的EGM-2进行。在更换培养基之后立刻地给试管紧密地装上无菌栓塞 密封帽用于装运。
在植入之前进一步测试可植入材料的功能标志。例如，在培养期间收集 条件培养基来确定培养的内皮细胞产生的硫酸乙酰肝素、转化生长因子-β1 (TGF-β1)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和氧化氮(NO)的水平， 以及细胞体外抑制平滑肌细胞生长和血栓形成的能力。根据早先描述的分析 和参数评估条件培养基。当前优选的分析是硫酸乙酰肝素分析，其可以单独 使用来确认功能。做为选择，它可以与用于移接的细胞产生的TGF-β1、b-FGF 和NO的一种或多种分析组合使用，和/或组合在此其他地方描述的体外抑制 平滑肌细胞分析。
低温保存可植入材料的组合物和方法。包含移接到生物相容性基质中的 近融合、融合或融合后细胞群体的可植入材料，可以被低温保存用于延长保 存数月到数年，或无限期保存。除了降低生产时间和成本之外，低温保存提 供了可用的、完全测试的、活的和确认功能的可植入材料，用于在任何时候 临床使用，而没有任何生产和运输相关的延迟。
当细胞是近融合、融合或融合后的时，可植入材料可以被低温保存。根 据各种实施方式，所述可植入材料在细胞播种到生物相容性基质中之后低温 保存10到14天、更优选在播种之后保存10到12天、最优选播种之后保存 12天。一般地，在播种后10天或约10天内皮细胞是融合前或融合的，在播 种后12天或约12天内皮细胞是融合后2-3天的。
在低温保存之前和任选低温保存之后，评估可植入材料的细胞数量、活 力和功能指标。示范性的细胞功能分析包括评估硫酸乙酰肝素(HS)、转化 生长因子(TGF)-β1、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和氧化氮(NO) 的水平，以及抑制培养的平滑肌细胞(SMC)生长的能力。此外，在向患者 施用可植入材料之前，厂家和/或医师可以使用如上详细描述的锥虫蓝分析评 定细胞活力。根据优选的实施方式，如果总细胞计数等于或大于400,000个 细胞/cm3、80％到90％或更多的细胞是存活的、硫酸乙酰肝素以0.23μg/mL/ 天或更高的量存在，TGF-β1以300pg/mL/天或更高的量存在，则所述可植入 材料是可接受的。根据其他的实施方式，如果b-FGF的水平是300pg/mL/ 天或更低，则所述可植入材料是可接受的。
根据一个实施方式，所述可植入材料被低温保存在低温保存介质组合物 中，所述低温保存介质组合物包含补充有多糖和血清的低温保存剂。根据优 选的实施方式，所述可植入材料被低温保存在低温保存介质组合物中，所述 低温保存介质组合物包含约5mL的CryoStorTM CS-10溶液(BioLife Solutions， Oswego，NY)，所述溶液含有约10％DMSO并补充有约4.5％葡聚糖和约 50％FBS。根据其他的实施方式，FBS的浓度大于细胞培养中使用的FBS 的量，所述浓度是约20％到80％，更优选约40％到60％，最优选约50％。 根据其他的实施方式，DMSO的浓度是约5％到20％DMSO，更优选约7 ％到15％，最优选约10％DMSO。根据其他的实施方式，葡聚糖的浓度是 约2％到8％，更优选约4％到6％，最优选约4.5％。根据一个实施方式， 葡聚糖具有约10,000到500,000、更优选约20,000到200,000、最优选约70,000 的分子量。根据优选的实施方式，所述低温保存介质组合物具有约6.8到8.0、 更优选约7.2到7.6、最优选约7.4的pH值。
根据低温保存的一种方法，所述可植入材料从它的细胞培养物小瓶中转 移到15mL冷冻瓶(NalgeneNalge Nunc Int′l，Rochester，NY)中，所述冷 冻瓶中添加了约5mL的低温保存介质组合物。根据其他的实施方式，所述 冷冻瓶具有约6到10mL的体积，更优选具有约10到15mL的体积，和最 优选具有约15ml的体积。根据一个实施方式，所述冷冻瓶中低温保存介质 与空气的体积比是约1∶1到1∶2、更优选约1∶1到2∶3、最优选约1∶1。
根据低温保存的一种方法，所述装有可植入材料和低温保存介质组合物 的冷冻瓶被置于冷冻容器(Mr.FrostyTM，Nalge Nunc Int′l，Rochester，NY)中。 向所述冷冻容器中添加异丙醇来填充约二分之一的冷冻容器体积。根据一个 实施方式，所述冷冻容器然后转移到-20℃冷冻器中。根据另一个实施方式， 所述冷冻容器然后转移到-80℃冷冻器中。根据进一步的实施方式，在-80 ℃冷冻器中保持约16小时之后，冷冻容器被转移到液氮气相中(大约-140 ℃到-160℃)。根据各种实施方式，所述冷冻容器被保持在约-4℃到-160 ℃、更优选约-20℃、约-80℃或-160℃，最优选约-140℃到-160℃。 根据各种实施方式，所述可植入材料可以保持在低温保存状态2个月、4个 月、6个月、8个月、10个月、12个月和更久。
如果所述可植入材料不被慢慢地解冻，所述生物相容性材料倾向于分裂 成几片，降低基质完整性、细胞融合性和活力。通过慢慢地解冻所述可植入 材料，改善了材料的完整性。根据慢慢解冻可植入材料的优选的方法，含有 所述冷冻的可植入材料和冷冻保存介质的冷冻瓶从冷冻器(约-4℃到-80 ℃)或液氮气相(大约-40℃到-160℃)中取出，在室温下解冻约15分钟， 随后在室温水浴中另外解冻15分钟。然后从所述冷冻瓶中移出可植入材料， 洗涤来除去剩余的低温保存介质。
根据一个实施方式，在实验室中解冻所述可植入材料用于体外评定。依 据这种实施方式，所述可植入材料在15mL洗涤培养基(EBM-PRF和50 μg/ml庆大霉素)中在室温下洗涤两次达5分钟，随后在约15mL洗涤培养 基中在37℃和5％CO2中最后洗涤30分钟。在洗涤过程之后，可植入材料 置于37℃和5％CO2的10mL EGM-2中达约48小时的恢复时间。在临床使 用之前，或用于随后可植入材料为了转运的包装，任选地可以调整可植入材 料另外24小时。
根据另一个实施方式，在临床中解冻所述可植入材料用于患者植入。依 据这种实施方式，所述可植入材料从冷冻瓶中移出，并在约500mL洗涤培 养基中洗涤两次。根据各种实施方式，在室温下，所述洗涤培养基包含USP 级别盐水、乳酸化的林格氏溶液和EBM-PRF。所述可植入材料保持在第一 洗涤培养基溶液中约1到40分钟，更优选约2到25分钟，保持在第二洗涤 培养基溶液中约1到20分钟，更优选约1到10分钟。从所述第二洗涤培养 基中移出可植入材料并植入患者中。
延长可植入材料的货架寿命的组合物和方法。包含包埋入生物相容性基 质的近融合、融合或融合后的内皮细胞群体的可植入材料的实施方式可以在 室温下以存活、货架稳定的条件维持用于保存和/或转运约21到28天。根据 其他的实施方式，所述可植入材料可以在室温维持至少约1周、至少约2周、 至少约3周或至少约4周。
根据各种实施方式，在将细胞播种到生物相容性材料中之后10到14天， 可以制备可植入材料用于在室温下保存。根据当前优选的实施方式，在播种 后12天制备所述可植入材料用于在室温下保存。根据另一个当前优选的实 施方式，在播种后10天制备所述可植入材料用于在室温下保存。
在保存在转移培养基中之前或任选的之后，可以评估所述所述可植入材 料的细胞数量、和活力与功能指标。示范性的细胞功能分析包括评估硫酸乙 酰肝素(HS)、转化生长因子(TGF)-β1、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF) 和氧化氮(NO)的水平，以及抑制培养的平滑肌细胞(SMC)生长的能力。 此外，在向患者施用可植入材料之前，厂家和/或医师可以使用如上详细描述 的锥虫蓝分析评定细胞活力。根据优选的实施方式，如果总细胞计数等于或 大于400,000个细胞/cm3、80％到90％或更多的细胞是存活的、硫酸乙酰肝 素以0.23μg/mL/天或更高的量存在，TGF-β1以300pg/mL/天或更高的量存 在，则所述可植入材料是可接受的。根据其他的实施方式，如果b-FGF的水 平是300pg/mL/天或更低，则所述可植入材料是可接受的。
所述可植入材料在室温下保持在包含补充的EGM-2的转移介质组合物 中。当用于细胞培养目的时，标准的、未补充的EGM-2含有约2％FBS、约 0.2mg/mL氢化可的松、约2ng/mL VEGF、约4ng/mL hFGF、约5ng/mL R3-IGF-1、约75mg/mL抗坏血酸、约10ng/mL hEGF和约1ng/mL肝素。 根据其他的实施方式，所述未补充的EGM-2进一步含有抗生素，包括但不 限于约30μg/ml庆大霉素或约15ng/ml两性霉素-B。
根据优选的实施方式，所述可植入材料在室温下保存在转移介质组合物 中，所述转移介质组合物包含没有酚红的约50mL EGM-2(Cambrex BioScience，East Rutherford，NJ)、补充有额外的约2ng/mL VEGF、使转移培 养基中VEGF的总浓度到约4ng/mL。根据其他的实施方式，正常的EGM-2 补充以约0.1到4ng/mL VEGF、更优选约1到3ng/mL VEGF，以及最优选 约2ng/mL VEGF。根据优选的实施方式，在细胞暴露之前转移培养基pH值 是约7.4到8.0。随着对细胞的暴露的提高，转移培养基的pH值降低，在细 胞暴露之后产生约6.8到7.4的转移培养基pH值。
根据另一个实施方式，所述可植入材料在室温下保存在转移介质组合物 中，所述转移介质组合物包含没有酚红的约50mL EGM-2(Cambrex BioScience，East Rutherford，NJ)、补充有额外的约8％FBS、使转移培养基 中FBS的总浓度到约10％。根据其他的实施方式，正常的EGM-2补充以约 1到50％FBS、更优选约2到20％FBS、和最优选约8％FBS。
转移培养基的体积是在低于约37℃的温度下，例如在室温下维持可植入 材料的活力多至约21到28天的重要条件。转移培养基的体积应当足以提供 最佳浓度或稀释度的细胞废物产物，而同时提供最佳浓度的细胞分泌的有益 产物。一般地，维持可植入材料的转移培养基的最佳体积随着温度降到低于 37℃而提高，37℃是细胞的标准细胞培养温度。根据优选的实施方式，所述 可植入材料在室温下保存在约50mL的转移培养基中。根据其他的实施方 式，所述可植入材料保存在约28到150mL转移培养基、更优选约50到100 mL转移培养基、和最优选约50mL转移培养基中。根据一个实施方式，转 运小瓶含有约4.2-17×105个细胞/cm3基质材料。根据另一个实施方式，所 述转运小瓶含有约0.1-0.4×105个细胞/mL转移培养基。
根据货架寿命保存的一种方法，可植入材料保持在它的细胞培养小瓶中 用于保存和/或转运。根据优选的实施方式，所述细胞培养小瓶是50mL细 胞培养小瓶(Evergreen Scientific，Los Angeles，CA；Becton，Dickenson and Company，Franklin Lakes，NJ)。根据保存的另一种方法，所述可植入材料在 30mL细胞培养小瓶中培养，然后在保存和/或转运之前从它的细胞培养小瓶 中转移到50mL转运小瓶中以容纳更大体积的转移培养基。根据保存的进一 步的方法，所述可植入材料从它的细胞培养小瓶中转移到150mL转运小瓶 (NalgeneNalge Nunc Int′l，Rochester，NY)中。根据各种实施方式，所述 转运小瓶具有约53到58mL的体积，更优选约54到56mL的体积，和最优 选约57ml的体积。根据优选的实施方式，所述转运小瓶含有至少约5到6mL 的5％CO2/95％空气，或空气体积与培养基和可植入材料的体积的比例约为 1∶8到1∶12，更优选约1∶10。在室温下保存之前，从小瓶移除过滤器帽， 用栓塞密封帽(Evergreen Scientific，Los Angeles，CA)密封小瓶，并盖紧帽 子。
用于可植入材料的地面和航空运输的包装。根据以下方法之一包装可植 入材料的转运小瓶，其被包装用于环境温度下保存和设计用于经由地面载体 或航空载体运输。根据一种方法，在两个可重新密封的塑料袋的每一个中装 入三个转运小瓶，并密封袋子。两个袋子(六个小瓶)然后包装到内盒中。 根据另一种方法，将每个小瓶置于单独的可重新封装的塑料袋中，将袋子密 封。然后将四个小瓶包装到塑料圆筒中。所描述的包装结构的每一种是被设 计以提供多个边界层以保护产物免于热量影响、转运损坏和维持清洁的无菌 的环境。内盒或塑料圆筒然后包装到保温的外部装运盒中。所述外部装运盒 利用泡沫填充物和凝胶填充物来维持期望的热环境(优选约15-25℃)并保 护对抗转运损坏。包括在每个产品中的是合适的文件。装有可植入材料的小 瓶以及所述内盒或塑料圆筒和所述外部装运盒也被适当地标记。
根据以下方法之一包装可植入材料的冷冻瓶，用于在-20℃、-80℃、 或-140℃到-160℃下保存和设计用于经由地面载体或航空载体运输。根据 一种方法，将每个冷冻瓶置于单独的可重新封装的塑料袋中，将袋子密封。 所述冷冻瓶然后包装到含有干冰的保温的内盒，例如StyrofoamTM(Dow Chemical Co.，Midland，MI)内盒中。冷冻瓶被埋入或浸入干冰中。所述内盒 利用干冰(优选约-80℃)来维持期望的热环境(优选约-80℃到-160℃)， 和保护所述冷冻瓶对抗转运损坏。StyrofoamTM内盒然后包装到保温的外部装 运盒中。根据一个实施方式，在到达临床时，冷冻瓶被置于-20℃或-80℃ 冷冻器中持续延长的保存时间。根据另一个实施方式，在到达临床时，所述 冷冻瓶经历清洗和解冻操作，如上所述，用于即时的患者植入。
根据各种实施方式，在使用之前，所述可植入材料可以通过低温保存在 低温保存介质中维持约一个月到一年，之前和/或之后是在约室温下在转移培 养基中保存约至少三周，同时维持了所述可植入材料的活力和功能。
在即将植入之前，所述可植入材料可以从转运、低温保存或条件培养基 中移出，在约250-500mL无菌盐水(USP)中洗涤两次或三次来除去剩余 的培养基成分，包括FBS。在植入之前，可植入材料的样品等分量可以由厂 家和/或由医师检测活力，例如使用以上详细描述的锥虫蓝分析进行检测。
在由申请人或申请人的代理人收到对可植入材料的需求时，将启动以下 例示的一系列事件：低温保存的植入物将如上所述在干冰中准备转运，植入 物将如上所述在室温下准备转运，或将通过用细胞播种生物相容性基质来制 备植入物并允许体外生长直到它展现如上所述的一种或多种功能表型。用于 播种的细胞可以从以上解释的细胞库获得，或可以直接从植入物的预定接受 者获得。不考虑可植入材料中存在的细胞来源或类型，不需要首先测试细胞 与预定接受者的相容性。也就是说，使用本发明的可植入材料处理在生产或 植入之前不需要相对于预定的接受者来细胞分型、细胞匹配或细胞相容性测 试。当根据在此列出的教导制备时，使用可植入材料的治疗是与细胞类型无 关的、细胞相容性自由的、匹配自由的治疗方式。本发明的这种特征与常规 的基于细胞、组织或器官的治疗形成鲜明的对照，其通常需要预先测试来确 定在预定接受者和要植入的细胞、组织或器官之间存在匹配；在缺乏匹配的 情况下，将不进行治疗。本发明避免了预先测试以确定匹配存在的需要，从 而为临床医师提供了可容易获得的、不间断的可植入材料供应，用于在此描 述的任一种损伤或疾病的治疗。
实施例
实施例1：人AV瘘研究
这个实施例提供了测试和使用可植入材料的优选的实施方式的实验方 案，所述可植入材料包含血管内皮细胞来增强瘘的熟化和/或防止瘘熟化失 败。使用标准的手术操作，在期望的解剖位置创建动静脉瘘。然后将柔性平 面形式的可植入材料放置在手术创建的瘘邻近的血管周围间隙中；以下列出 了一个示范性操作的细节。如较早描述的，可以改变可植入材料的放置和构 型以适合临床环境。在这项研究中，在至少图1或2A中描绘了优选的示范 性柔性平面形式。
以下列出的实验和方案提供了足够的指导：
1.评估在3个月时熟化失败的动静脉瘘
对于这项研究，熟化失败被定义为在瘘建成后约12周内不能允许瘘的 重复性插管用于透渗析，和不能获得35-500mL/分钟的范围内足够的透渗 析血流，优选至少350mL/分钟的血流。采用标准的临床实践。
2.在第5天、2周、1、3和6个月和随后的时间点，通过彩色流动多普 勒超声来评估通路流速和解剖结构(区域狭窄％)。
如彩色流动多普勒超声所测量的，在基线测量(手术后第5天)和手术 后6个月之间绝对通路流量降低。与基线(手术后第5天的值)相比时，在 6个月时多普勒超声确定狭窄量。采用标准的临床实践。
3.评估与使用同种异体的细胞产品相关的HLA抗体反应。
在第5天、2周、1、3和6个月时供体HLA抗体的存在的定量免疫学 评估结果与手术前水平相比。采用标准的临床实践。
特别地，该研究包括10位经历动静脉瘘手术的尿毒症患者。经历AV 瘘手术的这些患者将接受(手术后立即)两个(2)1×4×0.3cm(1.2cm3) 柔性平面形式实施方式的应用；一个(i)置于接合接点，另一个纵向地置于 远离接合点的近端静脉段上。其他5位患者将被编入，但不接受植入物。这 5名患者将用于与标准护理比较。
在第5天、2周和在1、3和6个月时将进行临床跟踪。使用彩色流动多 普勒超声的通路流量测定将在手术后第5天进行，来确定基线水平，随后在 手术后2周、1个月、3个月和6个月进行。对展现了低于约350mL/分钟的 绝对流量、或在早先测量中展现了超过25％的流量降低、或展现大于50％ 区域狭窄(如多普勒超声所测量的)的患者进行血管造影。对于血管造影所 测定的大于50％的狭窄病变，允许补救性临床介入，例如血管成形术。对具 有12周内未能熟化的瘘的患者将进行诊断成像。允许标准的补救性临床介 入，包括血管成形术和手术来打结侧枝或修正瘘，以帮助未能在12周内熟 化的瘘实现功能性熟化。每位患者的研究参与持续时间将是6个月。
从而，总共15名患者将加入这个试验。十名患者将各自接受2个植入 物，接受标准护理的5名患者用于比较。经历用于血液透析通路的AV瘘放 置的患者也将被编入。
根据以下研究设计，用本发明的可植入材料处理的十名处理的患者将各 自接受标准的AV瘘放置、药物治疗、处理和植入物。这些患者的前5名将 接受柔性平面形式的两个移植物，一个处在结合点位置，另一个纵向地置于 远离接合点的近端静脉段上。在处理了这个第一组中的最后一名患者之后， 在下一组的处理之前存在一个月的观察期。在从前5名患者获得满意的1个 月数据之后，将处理后5名患者。
五名患者将被编入临床试验，将接受标准的AV瘘放置、药物治疗、处 理，但没有可植入材料。这些患者将用于与标准护理比较，将接受与植入物 处理的患者类似的成像和免疫学跟踪。
常规的AV瘘手术操作将根据标准操作技术进行。在瘘完成之时，但在 植入之前，进行对流出静脉直径的测量。
无齿镊子被用于从清洗碗中轻轻地取出平面形式的可植入材料。在通路 手术完成并在进行了所有基线测量的情况下确定流经瘘的流量之后，应用可 植入材料。在放置可植入材料之前，控制所有的出血，使要处理的区域尽可 能干燥。在植入物放置之后将不再冲洗该区域。一个或两个植入物将用于处 理接合位置。另一个植入物用于处理远离接合点的近端静脉段。在某些实施 方式中，通过将植入物的一端移至接合段下部，直到植入物的中部处在血管 的汇合点上，来处理端对面血管连接。然后将两端卷绕缝合线，保持植入物 中心在缝合线上。通过从接合位置开始将可植入材料纵向地沿静脉的长度放 置，处理近端静脉段(远离静脉-动脉接合点)。可植入材料不需要完全地卷 绕静脉的圆周。
在AV瘘手术之后的医院恢复过程期间，使用标准的护理操作跟踪患者。 紧密地监视生命体征。记录伴随的药物治疗。告知患者在第5天、2周以及 在1、3和6个月时的跟踪访问需求。
将在手术后5天(基线)、2周和此后1、3和6个月时记录通路流量。 狭窄的程度还将通过多普勒超声在第5天测定来建立基线水平，再次在2周、 1、3和6个月测定用于比较目的。在手术后5天、2周、1、3和6个月获得 5cc全血样本来提供血清，用于测定抗HLA抗体水平。
使用彩色流动多普勒超声在手术后第5天(±24小时)测定通路流量来 建立基线测量值，并在手术后2周(±2天)、1个月(±4天)、3和6个月(±7 天)测定。对展现了低于约350mL/分钟的绝对流量、或在他们早先测量中 展现了超过25％的流量降低、或展现大于50％区域狭窄(如多普勒超声所 测量的)的患者进行血管造影。对于血管造影所测定的大于50％狭窄的狭窄 病变，允许补救性临床介入，例如血管成形术。对具有12周内未能熟化的 瘘的患者将进行诊断成像。允许标准的补救性临床介入，包括血管成形术和 手术来打结侧枝或修正瘘，以帮助未能在12周内熟化的瘘实现功能性熟化。 这种介入可以继之以可植入材料的植入，来增强修正的瘘的熟化和/或维持修 正的瘘的功能和援救正在失效或已失效的瘘。
AV瘘研究的预期结果。预期的是，如上所述用本发明的可植入材料处 理的患者将展示瘘熟化增强和/或防止瘘熟化失败的一种或多种标志。特别 地，处理的患者将分别显示，例如，改善的血流量、直至足够透渗析的流量 (例如，35-500mL/分钟范围内的血流，优选至少350mL/分钟)和/或重 复地套管插入所述瘘用于透渗析的改善的能力。瘘熟化的另一种标志是脉壁 厚度；成功地熟化的或熟化中的瘘展现出脉壁增厚。这将根据标准的临床实 践使用血管内超声(IVUS)来测量。简要地，IVUS将用于测量脉壁厚度并 描绘内膜和中层之间的厚度。处理的瘘或对照瘘将被插入导管，超声探针置 于目标静脉和动脉内部。功能性瘘的又一个标志是充足的管腔直径。预期的 是，本发明的可植入材料将允许维持充足的管腔直径，从而允许血液以适合 于有效透渗析的速度不受阻碍地流动，即，略大于透渗析机器的泵速度的血 流量；或至少足以防止透渗析期间的再循环的血液速度。从瘘建成后第5天 开始和此后的手术后至少3个月，使用瘘的血管造影来连续监视管腔直径。 利用标准的多普勒超声方案，将手术后管腔的狭窄与血流速度相关联。预期 的是，所述可植入材料将防止或延迟变窄，所述变窄阻挡血流使其低于在此 描述的适合透渗析的速度。表征了失效瘘的这种管腔变窄，可以由于狭窄和 内膜的相关增厚而引起，或可以通过血管的皱缩和/或收缩而没有任何相关的 增厚而引起。对于实际的增厚来说，血管成形术介入是当前标准的临床手段； 对于皱缩和/或收缩来说，例如由于消极组织重塑的皱缩和/或收缩，扩张术 是当前标准的临床介入。预期的是，植入物处理的瘘将不需要血管成形术或 扩张术。
作为整体，处理的患者预计在至少一种这些前述的熟化标志方面与对照 相比至少显示了增加的差异。
实施例2：AV移植物动物研究
这个实施例提供了实验方案，用于测试和使用本发明的优选的实施方式 来促进动物测试受试者中功能性AV移植物的形成。使用标准的手术操作， 在颈动脉和颈静脉之间创建AV移植物。然后将可植入材料放置在每个手术 创建的AV移植物接合点邻近的血管周围间隙中；以下列出了一个示范性操 作的细节。如较早描述的，可植入材料的放置和构型可以改变。在这项研究 中，所述可植入材料具有如图4A、图4B和图4C描绘的柔性平面形式。
特别地，该研究包括经历了AV移植物手术的26名猪测试受试者。常 规的AV移植手术操作将根据标准操作技术进行。在移植手术完成以及移植 物通畅之后，可植入材料被应用到AV移植物接合点和周围，如以下描述的。
对于经历了AV移植手术的每个测试受试者，将一个六毫米内径的PTFE 移植物置于测试受试者的左侧颈总动脉和右侧外颈静脉之间。使用运动6-0 聚丙烯缝合线，在移植物的每个末端创建倾斜的端对面接合点。在了之后， 所有测试受试者接受内部起作用的肝素和每天施用阿斯匹林。
十位测试受试者在手术当天接受包含主动脉内皮细胞的可植入材料。五 个这样的植入物被应用给每个测试受试者。两个接合位置的每一个都用两个 植入物卷绕。在这种环境下，将可植入材料的一端移至接合段下部，直到植 入物的中部处在血管和移植物的汇合点上。然后将植入物两端卷绕缝合线， 保持植入物中心在缝合线上。末端最低限度地叠盖来固定材料就位。对于每 个测试受试者，另外一个植入物场区那个接合点处开始沿着近端静脉段的长 度纵向地放置。植入物不完全地卷绕静脉的圆周。
用可植入材料缠绕接合点位置，例如，如图4A和图4B中说明的。另 外，通过从接合位置开始将可植入材料纵向地沿静脉的长度放置，例如，如 图4C中说明的，来处理近端静脉段(静脉-动脉接合点的远端)。
十名测试受试者接受没有细胞的对照植入物，在手术当天将对照植入物 卷绕接合点位置并置于移植物的近端静脉段上，例如，如图4A、图4B和图 4C中描绘的。其他6名测试受试者不接受任何一种类型的植入物。这6名 测试受试者将用于与标准照料比较。根据体重的总细胞载荷是大约2.0×105 个细胞每kg。预期的是，这种细胞载荷是如下所述将用于人类临床研究的估 计的细胞载荷的大约至少6-10倍。
手术操作。产生15cm的中线纵向颈部切口，分离左侧颈总动脉，之后 是右侧外颈静脉。从周围组织剥离8cm静脉段，从静脉伸出的所有分支用3 -0丝缝线连接。夹住左侧颈动脉，进行7mm直径的环向动脉切开术。使 用连续的6-0聚丙烯缝合线，在动脉和6mm内径PTFE移植物之间产生倾 斜的端对面接合点。一旦形成，除去动脉夹具，用肝素-盐水溶液冲洗移植 物。记录动脉进入移植物的流量。移植物然后穿过胸锁乳突肌肉之下并进入 右侧外颈静脉附近。
直接在外颈静脉上进行7mm直径环向静脉切开术。然后使用连续的6 -0聚丙烯缝合线在PTFE移植物和右侧外颈静脉之间以倾斜的端对面接合 完成动静脉移植物，(移植物的长度在15-25cm之间，在放置之时记录)。 除去所有夹具，确认移植物通畅。远离PTFE接合点的左侧颈动脉用3-0 丝缝线双重地结扎。
在完成接合之后，定位PTFE动静脉移植物以防止扭结。PTFE动静脉 移植物使用23-规格(gauge)蝴蝶针在颈动脉-移植物接合点远端透皮地插 管。为了确认放置，将血液吸出到具有10cc注射器的系统中。然后用10cc 盐水冲洗系统。然后在研究动物的颈部上放置C-臂荧光镜，从而可以显现静 脉-移植物接合点和静脉流出道。在连续的荧光检查之下，注射10-15cc的 含碘造影剂(iodinated contrast)(Renograffin，全强度)。记录并保存电影血 管造影片，用于与预先处死而得到的血管造影片比较。
在血管造影完成之后，将接合点位置包在湿润的4″×4″纱布棉拭中。维 持接合点位置的压力持续大约5分钟的时间，之后除去纱布棉拭，检查接合 位置。如渗血所证明的，如果还没有实现止血，再次缠绕该位置另外的5分 钟。如果从该位置的出血是严重的，在外科医生的判断下放置其他缝合线。 一旦实现止血，用无菌盐水填充颈部伤口，使用6mm跨音速流量探测器在 远端静脉流出道处进行流量探测分析。如有必要，除去盐水，使接合点尽可 能干燥，用包含主动脉内皮细胞的可植入材料或对照植入物来处理。一些位 置不用任一种植入物处理，直到已经控制了所有的出血，确认移植物通畅， 使该区域尽可能干燥。完成时，按层闭合伤口，容许动物从麻醉中恢复。
在手术前作为100U/kg的弹丸注射加上35U/kg/hr的连续输注来施用肝 素，维持直到手术结束。根据需要施用另外的弹丸剂量(100U/kg)，以维持 ACT≥200秒。
移植物开通性。在手术之后立即地、手术后3-7天以及此后每周一次 地，使用彩色流动多普勒超声和跨音速流量探测器(Transonic Systems，Inc.， Ithaca，NY)通过通路流量测定来确认AV移植物开通性。严密监视移植物的 血流量。
病理过程。动物试验受试者使用戊巴比妥钠(65mg/kg，IV)麻醉。暴 露PTFE移植物，进行PTFE移植物和静脉接合点的数字摄影。PTFE动静脉 移植物然后使用23-规格蝴蝶针在颈动脉-移植物接合点远端透皮地插管。为 了确认放置，将血液吸出到10cc注射器的系统中。然后用10cc盐水冲洗系 统。然后在研究动物的颈部上放置C-臂荧光镜，从而可以显现静脉-移植物 接合点和静脉流出道。在连续的荧光检查之下，注射10-15cc的含碘造影 剂(Renograffin，全强度)。在PTFE移植物的0°和90°角处记录电影血管造 影片。通过将尸检血管造影片的盲读数与放置后的血管造影片成对比较，测 定移植物开通率和静脉流出道的狭窄程度。取决于血管造影片中观察的狭窄 程度，在0-5的尺度上分级血管造影片。分级方案采用以下的：0＝0％狭 窄，1＝20％狭窄，2＝40％狭窄，3＝60％狭窄，4＝80％狭窄和5＝100％ 狭窄。预料的是，在检查血管造影片时，与对照物相比，用本发明的可植入 材料处理的移植物将展现降低的狭窄百分比。
组织学。一半的动物测试受试者(5例细胞移接的植入物受试者；5例 对照植入物受试者；3例没有植入物的受试者)在手术后3天被执行安乐死。 其余的动物测试受试者(5例细胞移接的植入物受试者；5例对照植入物受 试者；3例没有植入物的受试者)在手术后一个月被执行安乐死。
在所有测试受试者上进行有限的尸检，被定义为施用位置的宏观检查， 包括所有接合点和近端静脉位置、和周围组织，包括导液淋巴结。对于在手 术后一个月被执行安乐死的所有测试受试者，收集来自主要器官，包括脑、 肺、肾脏、肝脏、心脏和脾脏的组织，并保存。仅当从身体外表面的宏观检 查或从施用位置和周围组织的显微镜检查产生异常发现时，器官才被分析。 没有出现异常的发现，这保证了对被编入这项研究中的任何动物中主要器官 进行进一步检查。
所有的AV移植物接合位置和周围组织，包括每个接合的静脉和动脉的 5cm段，被修整、固定在10％福尔马林(或等效物)中，并包埋在乙二醇 甲基丙烯酸酯(或等效物)中。使用C-形不锈钢刀(或等效物)切下的大约 3μm厚切片，从至少三个区域制备切片：静脉移植物接合点、移植物-动脉 接合点和静脉流出道。横断静脉移植物接合点地制作三个切片。穿过静脉流 出道制作五个切片(因而覆盖1.5cm的流出静脉)。以1mm的间隔穿过移 植物-动脉接合点制作三个切片。这些切片固定在明胶包被的(或等效物) 玻璃载片上，用苏木素和曙红或Verhoeffs弹性蛋白着色剂来染色。
急性地(3天的受试者)和长期地(1个月的受试者)测定血管周炎症 和管腔炎症。急性炎症标志是粒细胞、主要是嗜中性粒细胞，而慢性炎症标 志是巨噬细胞和淋巴细胞。另外，切片也可以用于以下特异性标记物染色： 抗CD45来鉴定白细胞，抗CD3来鉴定T细胞，CD79a来鉴定B细胞，以 及MAC387来鉴定单核细胞/巨噬细胞。
检查并记录染色的载玻片上平滑肌细胞和内皮细胞的存在，以及动脉或 静脉接合点与人工移植物材料之间的整合指标。分离的组织的所有切片，包 括每个静脉移植物接合点、移植物-动脉接合点、静脉流出道的移植物材料、 内膜/伪内膜、近管腔的血管中层的内部部分、近外膜的血管中层的外部部分 以及外膜，将被评估和计分。每一个组织区室，例如内膜、血管中层和外膜 的大小，将按微米来计量。将评估每个切片的每种以下标志的存在和/或程度。 将评估炎症的标志，包括但不限于，嗜中性细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、嗜 曙红细胞、巨细胞和浆细胞的存在和程度。将评估移植物切片是否存在成纤 维细胞、新血管形成、钙化、出血、充血、血纤蛋白、移植物纤维化和移植 物浸润(graft infiltration)。另外将评估组织切片的退化标志，包括但不限于 退化、弹性蛋白损失和/或组织部分的缺失、平滑肌肌纤维的空泡化和/或组 织的钙化。还将评估组织切片的内皮细胞增殖、内膜下细胞增殖，包括但不 限于新血管形成以及平滑肌肌纤维、成纤维细胞和纤维化的存在。还将评估 每个测量的组织切片的组织坏死和外来物质的存在。为每个变量按0到4的 标度分配分值(0＝没有显著的变化；1＝最小的；2＝轻微的；3＝中度的；4＝ 严重的)。
仅仅来自1个月动物试验受试者的动静脉移植物接合位置的其他切片将 被固定在玻璃载片并染色(Verhoeff’s弹性蛋白)用于形态学分析。对每个 切片使用具有图象显微镜的计算机化的数字面积法和定制的软件来进行腔、 中层、内膜和总血管体积的测量。将对每个切片测定内膜增生的程度。定量 内膜增生的一种方法是通过总血管壁面积来标准化内膜面积[(内膜，mm2) /(内膜+血管中层，mm2)]，或通过测定残余管腔来标准化内膜面积[(管 腔，mm2)/管腔+内膜，mm2)]。
AV移植物动物受试者的结果。如上所述用本发明的可植入材料处理的 受试者显示了临床上功能性AV移植物形成的一种或多种标志。根据在此公 开的材料和方法处理的AV移植物支持了足以允许透渗析的血流速度。有效 的透渗析需要略大于透渗析机器的泵速度的血流量，或至少足够防止透渗析 期间的再循环的血液速度。并且，处理的受试者分别显示了降低的开裂发生 率，所述开裂被定义为接合的静脉或动脉从PTFE移植物分离，以及显示了 改善的修复性桥整合，所述整合被定义为平滑肌细胞或内皮细胞进入修复性 桥的管腔或在其内的增殖和/或迁移。静脉流出位置处AV移植物的血液流量 与进入移植物位置的血液流量是可比较的。如在此使用的，可比较的意思是 对于临床目的基本上是相似的。例如，期望的血流速度是约150-500mL/ 分钟，优选约300-500mL/分钟，更优选约350-400mL/分钟。
另外，平滑肌细胞和/或内皮细胞进入修复性桥或在之内的迁移将作为整 合的标志来测量。预期的是，本发明的可植入材料将促进平滑肌细胞增殖和 内皮细胞增殖，以及两者向桥内的迁移。可以获得整个PTFE移植物上的三 个五微米切片并对SMC肌动蛋白染色，进行评估来鉴定SMC和因子VIII (von Willebrands因子)和/或PECAM-1，以鉴定内皮细胞。内皮细胞将使 用显微镜检查/形态测定法和定制软件来测定。
功能性A/V移植物的又一个标志是充足的管腔直径。通过降低血管狭 窄，本发明的植入物将允许维持充足的管腔直径，从而允许血液以适合于有 效透渗析的速度不受阻碍地流动，即，有效的透渗析需要略大于透渗析机器 的泵速度的血流量，或至少足以防止透渗析期间的再循环的血流速度。在动 静脉移植物建成当天和即将30天处死之前，使用对动静脉移植物接合点的 血管造影来监视管腔直径和狭窄百分比。利用标准的多普勒超声方案，将手 术后管腔的变窄与血流速度相关联。
与对照植入物相比，本发明的可植入材料降低了处理的接合点的狭窄的 存在和程度。对于研究中的每个测试受试者通过血管造影确定的狭窄百分比 在以下表1中显示。平均起来，可植入材料降低了狭窄百分之九十五，从对 照动物的46％降低到接受包含细胞的移植物的动物的2.5％([46- 2.5]/46×100)。结果将组织学地确认。这些研究说明了，本发明阻止或延迟 了变窄，从提高了A/V移植物接合点的功能，所述变窄阻挡血流使其低于适 合于透渗析的速度。
表1AV移植物研究的总结

实施例3：人AV移植物临床研究
这个实施例提供了实验方案，用于测试和使用本发明来促进人临床测试 受试者中形成功能性AV移植物。使用标准的手术操作，在期望的解剖位置 创建AV移植物接合点，在动脉和静脉接合点之间放置ePTFE修复性桥。然 后将可植入材料放置在每个手术创建的AV移植物接合点邻近的血管周围间 隙中；以下列出了一个示范性操作的细节。如较早描述的，可植入材料的放 置和构型可以由熟练医师按照常规方式改变。
具体地，该研究包括经历了AV移植手术的人测试受试者。常规的AV 移植手术操作将根据标准操作技术进行。在移植手术完成以及确认移植物通 畅之后，本发明的可植入材料将被应用到AV移植物接合点和周围，如以下 描述的。
人临床受试者将在手术当天接受可植入材料的一个或多个部分。两到三 个这种部分将应用于每个测试受试者。可植入材料的一个部分卷绕每个接合 点位置。然后将一端移至接合段下部，直到缠绕物的中部处在血管和移植物 的汇合点上。然后将植入物两端卷绕缝合线，保持植入物中心在缝合线上。 末端可以叠盖来固定材料就位。对于每个测试受试者，可植入材料的其他单 个部分将置于动静脉移植物的近端静脉段，从接合点处开始沿着静脉的长度 纵向地放置。可植入材料不需要完全地卷绕静脉的圆周。
接合点位置将用优选的植入物处理，例如，如在图4A、图4B和图4C 中，或在图5中说明的。另外，在某些患者中，通过从接合位置开始将优选 的植入物纵向地沿静脉的长度放置，处理近端静脉段(远离静脉-动脉接合 点)。预期的是，基于体重的总细胞载荷将是大约2.0×104个细胞每kg到大 约6.0×104个细胞每kg。
在第5天、2周和在1、3和6个月时将进行临床跟踪。将在手术后第5 天需要使用彩色流动多普勒超声进行通路流量测定，来确定基线水平，随后 在手术后2周、1个月、3个月和6个月测定流量。对展现了低于约350mL/ 分钟的绝对流量、或在早先测量中展现了超过25％的流量降低、或展现大于 50％区域狭窄(如多普勒超声所测量的)的测试受试者进行血管造影。对于 血管造影所测定的大于50％的狭窄病变，允许补救性临床介入，例如血管成 形术。
在基线处，在3个月时，进行移植物以及动脉和静脉接合位置的血管造 影对比。对每个区域计算管腔直径，测量峰值收缩速度。
人AV移植物临床研究的预期结果。预期的是，如上所述用本发明的可 植入材料处理的受试者将显示临床上功能性AV移植物形成的一种或多种标 志。特别地，治疗的受试者将分别显示，例如，改善的血流，高达至少足够 透渗析的流量(例如，35-500mL/分钟范围内的血流，和优选至少350mL/ 分钟)，降低的开裂发生率，所述开裂被定义为接合静脉或动脉从PTFE移 植物的分离，降低的移植物周围血清集中(serous perigraft collection)以及 假动脉瘤的发生率，和/或改善的修复性桥整合，所述整合被定义为平滑肌细 胞或内皮细胞进入修复性桥的管腔或在其内的增殖和/或迁移。静脉流出位置 处AV移植物的血液流量与进入移植物位置的血液流量是可比较的。可比较 的意思是对于临床目的基本上是相似的。例如，期望的血流速度是约150- 500mL/分钟，优选约300-500mL/分钟，更优选约350-400mL/分钟。
另外，进入修复性桥或在其内的平滑肌细胞和/或内皮细胞迁移将作为整 合的标志通过血管内超声来测量。预期的是，当如在此描述的使用时，本发 明的可植入材料将促进平滑肌细胞增殖和/或内皮细胞增殖，以及两者向桥内 的迁移。
功能性AV移植物的又一个标志是充足的管腔直径。预期的是，本发明 的植入物将允许维持充足的管腔直径，从而允许血液以适合于有效透渗析的 速度不受阻碍地流动，即，有效的透渗析需要略大于透渗析机器的泵速度的 血流量，或至少足以防止透渗析期间的再循环的血流速度。在基线处(动静 脉移植物建成后大约5天)和此后的手术后至少3个月，使用对动静脉移植 物接合点的血管造影监视管腔直径。利用标准的多普勒超声方案，将手术后 管腔的狭窄与血流速度相关联。预期的是，当如在此描述的使用时，本发明 将防止或延迟变窄，所述变窄阻挡血流，使其低于在此描述的适合透渗析的 速度。
对于AV移植物来说，预期的是，本发明的可植入材料将防止或降低开 裂的发生率。
作为整体，处理的受试者预计在至少一种这些前述的功能标志方面与对 照相比至少显示了增加的差异。
实施例4：外周移植物研究
这个实施例提供了实验方案，用于测试和使用本发明的优选的实施方式 来促进测试受试者中形成功能性外周移植物。使用标准的手术操作，在期望 的解剖位置创建外周移植物接合点，在接合点之间放置ePTFE修复性桥。然 后将可植入材料放置在每个手术创建的外周移植物接合点邻近的血管周围 间隙中；以下列出了一个示范性操作的细节。如较早描述的，可植入材料的 放置和结构可以改变。
具体地，该研究包括经历了外周移植手术的测试受试者。常规的外周移 植物手术操作将根据标准操作技术进行。在移植手术完成以及确认移植物通 畅之后，可植入材料将被应用到外周移植物接合点和周围，如以下描述的。
测试受试者将在手术当天接受一个或多个优选的可植入材料。两到三个 这种植入物将应用于每个测试受试者。一个这种植入物卷绕每个接合点位 置。然后将可植入材料的一端移至接合段下部，直到缠绕物的中部处在血管 和移植物的汇合点上。然后将植入物两端卷绕缝合线，保持植入物中心在缝 合线上。末端可以相互叠盖来固定材料就位。对于每个测试受试者，其他的 单个植入物可以置于外周移植物的近端静脉段，从接合点处开始沿着静脉的 长度纵向地放置。植入物不需要完全地卷绕静脉的圆周。
接合点位置将用可植入材料缠绕，例如，如在图4A、图4B和图4C中， 或在图5中说明的。另外，通过从接合位置开始将可植入材料纵向地沿血管 的长度放置，处理近端血管段(远离接合点)。基于体重的总细胞载荷将是 大约2.0×104个细胞每kg到大约6.0×104个细胞每kg。
在第5天、2周和在1、3和6个月时将进行临床跟踪。将在手术后第5 天需要使用彩色流动多普勒超声进行血流量测量，来确定基线水平，随后在 手术后2周、1个月、3个月和6个月进行血流量测量。对展现了低于约350 mL/分钟的绝对流量、或在早先测量中展现了超过25％的流量降低、或展现 大于50％区域狭窄(如多普勒超声所测量的)的测试受试者进行血管造影。 对于血管造影所测定的大于50％的狭窄病变，允许补救性临床介入，例如血 管成形术。
将进行移植物以及接合位置的血管造影对比。对每个区域计算管腔直 径，测量峰值收缩速度。
外周移植物受试者的预期结果。预期的是，如上所述用本发明的可植入 材料处理的受试者将显示临床上功能性外周移植物形成的一种或多种标志。 根据在此公开的材料和方法处理的外周移植物将支持足以恢复或维持临床 上可接受的血液循环的血流量。并且，处理的受试者将分别显示，例如，降 低的开裂发生率，所述开裂被定义为接合的静脉从PTFE移植物分离，和/ 或显示改善的修复性桥整合，所述整合被定义为平滑肌细胞或内皮细胞进入 修复性桥的管腔或在其内的增殖和/或迁移。流出位置处外周移植物的血液流 量与进入移植物位置的血液流量是可比较的。如在此使用的，可比较的意思 是对于临床目的基本上是相似的。例如，期望的血流速度是约150-500mL/ 分钟，优选约300-500mL/分钟，更优选约350-400mL/分钟。
另外，进入修复性桥或在其内的平滑肌细胞和/或内皮细胞迁移将作为整 合的标志来测量。预期的是，本发明的可植入材料将促进平滑肌细胞增殖和 /或内皮细胞增殖，以及两者向桥内的迁移。
功能性外周移植物的又一个标志是充足的管腔直径。预期的是，本发明 的植入物将允许维持足够的管腔直径，从而允许血液以足够维持外周循环的 速度不受阻碍地流动。在基线处，在移植物建成后至少3个月，使用外周移 植物的血管造影监视管腔直径。利用标准的多普勒超声方案，将手术后管腔 的狭窄与血流速度相关联。预期的是，本发明的可植入材料将防止或延迟变 窄，所述变窄阻挡血流，使其低于在此描述的适合于外周循环的速度。
对于外周旁路移植物来说，预期的是，使用本发明的可植入材料处理将 产生允许临床上可接受的循环的血流速度、或近似正常的速度。移植物的流 入和留出将是可比较的。可比较的意思是对于临床目的基本上是相似的。例 如，期望的血流速度是约150-500mL/分钟，优选约300-500mL/分钟， 更优选约350-400mL/分钟。另外，预期的是，所述处理将促进平滑肌细胞 和/或内皮细胞的增殖和迁移进入修复性移植物或天然移植物。
对于外周旁路移植物来说，预期的是，本发明的可植入材料将防止或降 低开裂的发生率。
作为整体，处理的受试者预计在至少一种这些前述的功能标志方面与对 照相比至少显示了增加的差异。
本发明可以以其他特定的形式体现而不背离其精神和基本特征。当前的 实施方式因而被认为是说明性的而非限制性的，本发明的范围由权利要求书 而不是由上述说明书来表明，因而本发明包括处在权利要求书的含义和等效 范围内的所有改变。
相关的申请数据
这个非临时专利申请于2006年6月5日提交，根据35 U.S.C.Section 119 (e)要求2005年6月21日提交的临时专利申请U.S.S.N.60/692,708的权益； 并根据35 U.S.C.Sections 120、363和/或365要求2005年12月6日提交的 共同待决国际申请PCT/US05/43967的优先权；其要求了2004年12月8日 提交的临时专利申请U.S.S.N.60/634,155；2005年3月21日提交的临时专 利申请U.S.S.N.60/663,859；和2005年5月19日提交的临时专利申请U.S.S.N. 60/682,054的优先权；每一个上述申请的完整内容通过引用并入本文。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1. 一种用于保存包含生物相容性基质和移接的细胞的可植入材料的转 移介质组合物，所述转移介质组合物包含足以维持细胞活力或抑制性表型的 量的VEGF，其中当在低于细胞的标准细胞培养温度的温度下保存在所述转 移介质组合物中时，所述细胞长时间保持存活。
2. 权利要求1的转移介质组合物，其中足以在低于细胞的标准细胞培养 温度的温度下维持细胞活力或抑制性表型的VEGF的数量大于在细胞的标 准细胞培养温度下所需的VEGF的数量。
3. 权利要求1的转移介质组合物，其中所述可植入材料在低于约37℃的 温度下保存在所述转移介质组合物中。
4. 权利要求1的转移介质组合物，其中所述可植入材料在环境温度下保 存在所述转移介质组合物中。
5. 权利要求1的转移介质组合物，其中所述细胞活力是至少约80％。
6. 权利要求1的转移介质组合物，其中所述细胞在保存之时是近融合的、 融合的或融合后的。
7. 权利要求1的转移介质组合物，其中所述长时间是约1周。
8. 权利要求1的转移介质组合物，其中所述长时间是约2周。
9. 权利要求1的转移介质组合物，其中所述长时间是约3周。
10. 权利要求1的转移介质组合物，其中所述细胞是内皮细胞或内皮 样细胞。
11. 权利要求1的转移介质组合物，其中所述VEGF的数量是约 4ng/mL。
12. 一种用于低温保存包含生物相容性基质和移接的细胞的可植入材 料的低温保存介质组合物，所述低温保存介质组合物包含低温保存剂、多糖 和血清，其中当保存在至少约-4℃时，细胞活力或抑制性表型以及基质完 整性被长时间保持。
13. 权利要求12的低温保存介质组合物，其中所述低温保存介质组合 物中血清的数量超过用于常规培养所述细胞的血清数量。
14. 权利要求12的低温保存介质组合物，包含至少约20％的血清。
15. 权利要求12的低温保存介质组合物，包含至少约50％的血清。
16. 权利要求12的低温保存介质组合物，其中所述血清是胎儿牛血清。
17. 权利要求12的低温保存介质组合物，其中所述低温保存介质组合 物中多糖的数量超过用于常规培养所述细胞的多糖数量。
18. 权利要求12的低温保存介质组合物，包含至少约2-8％的多糖。
19. 权利要求12的低温保存介质组合物，包含至少约4.5％的多糖。
20. 权利要求12的低温保存介质组合物，其中所述多糖是葡聚糖。
21. 权利要求12的低温保存介质组合物，进一步包括约10％的 DMSO。
22. 权利要求12的低温保存介质组合物，其中所述保存是在至少约-20 ℃进行。
23. 权利要求12的低温保存介质组合物，其中所述保存是在至少约-80 ℃进行。
24. 权利要求12的低温保存介质组合物，其中所述保存是在至少约 -140℃进行。
25. 权利要求12的低温保存介质组合物，其中所述长时间是约1个月。
26. 权利要求12的低温保存介质组合物，其中所述长时间是约6个月。
27. 权利要求12的低温保存介质组合物，其中所述长时间是约1年。
28. 权利要求12的低温保存介质组合物，其中细胞活力是至少约80 ％。
29. 一种低温保存的可植入材料，包含用细胞移接的生物相容性基质 和具有足以在低温保存时维持细胞活力或抑制性表型以及基质完整性的体 积的低温保存介质组合物，其中所述低温保存介质组合物包含低温保存剂、 多糖和血清。
30. 一种在低于细胞的标准细胞培养温度的温度下长时间保存包含生 物相容性基质和移接的细胞的可植入材料的方法，所述方法包括步骤：
将所述可植入材料浸浴在转移介质组合物中，所述转移介质组合物包含 在保存期间足以维持细胞活力或抑制性表型的量的VEGF，
其中当在低于所述细胞的标准细胞培养温度的温度下在所述转移介质 组合物中保存时，所述细胞长时间保持存活或维持抑制性表型。
31. 权利要求30的方法，其中足以在低于细胞的标准细胞培养温度的 温度下维持细胞活力或抑制性表型的VEGF的数量大于在细胞的标准细胞 培养温度下所需的VEGF的数量。
32. 权利要求30的方法，其中转移介质组合物的体积与可植入材料的 体积的比例是约50∶1。
33. 权利要求30的方法，其中转移介质组合物的体积是约50mL。
34. 权利要求30的方法，其中所述转移介质组合物的pH值是约7.4。
35. 权利要求30的方法，其中所述可植入材料在低于约37℃的温度下 保存在所述转移介质组合物中。
36. 权利要求30的方法，其中所述可植入材料在环境温度下保存在所 述转移介质组合物中。
37. 权利要求30的方法，其中细胞活力是至少约80％。
38. 权利要求30的方法，其中所述细胞在保存之时是近融合的、融合 的或融合后的。
39. 权利要求30的方法，其中所述长时间是约1周。
40. 权利要求30的方法，其中所述长时间是约2周。
41. 权利要求30的方法，其中所述长时间是约3周。
42. 权利要求30的方法，其中所述细胞是内皮细胞或内皮样细胞。
43. 权利要求30的方法，其中所述VEGF的数量是约4ng/mL。
44. 一种在约-4℃的温度下长时间低温保存包含生物相容性基质和 移接的细胞的可植入材料的方法，所述方法包括步骤：
将所述可植入材料浸浴在包含低温保存剂、多糖和血清的低温保存介质 组合物中，
其中当在约-4℃的温度下保存在所述低温保存介质组合物中时，细胞 长时间保持存活或维持抑制性表型并且基质保持完整。
45. 权利要求44的低温保存方法，其中所述低温保存介质组合物中血 清的数量超过用于常规培养所述细胞的血清数量。
46. 权利要求44的低温保存方法，其中所述低温保存介质组合物包含 至少约20％的血清。
47. 权利要求44的低温保存方法，其中所述低温保存介质组合物包含 至少约50％的血清。
48. 权利要求44的低温保存方法，其中所述血清是胎儿牛血清。
49. 权利要求44的低温保存方法，其中所述低温保存介质组合物中的 多糖的数量超过用于常规培养所述细胞的多糖数量。
50. 权利要求44的低温保存方法，其中所述低温保存介质组合物包含 至少约2-8％的多糖。
51. 权利要求44的低温保存方法，其中所述低温保存介质组合物包含 至少约4.5％的多糖。
52. 权利要求44的低温保存方法，其中所述多糖是葡聚糖。
53. 权利要求44的低温保存方法，其中所述低温保存介质组合物进一 步包含约10％的DMSO。
54. 权利要求44的低温保存方法，其中低温保存介质组合物的体积与 可植入材料的体积的比例是约5∶1。
55. 权利要求44的低温保存方法，其中所述低温保存介质组合物的体 积是约5mL。
56. 权利要求44的低温保存方法，其中所述保存是在至少约-80℃进 行。
57. 权利要求44的低温保存方法，其中所述保存是在至少约-140℃ 进行。
58. 权利要求44的低温保存方法，其中所述保存是在至少约-160℃ 进行。
59. 权利要求44的低温保存方法，其中所述长时间是约1个月。
60. 权利要求44的低温保存方法，其中所述长时间是约6个月。
61. 权利要求44的低温保存方法，其中所述长时间是约1年。
62. 权利要求44的低温保存方法，其中细胞活力是至少约80％。
63. 一种制备包含生物相容性基质和移接的细胞的可植入材料的方 法，所述方法包括步骤：
制备工作细胞库；
提供水化的生物相容性基质材料；
使用来自所述工作细胞库的细胞播种所述水化的生物相容性基质材料；
将所述细胞播种的生物相容性基质材料放置到孵化器中来促进细胞附 着；
将所述细胞播种的生物相容性基质材料放置到孵化器中直到细胞是近 融合、融合或融合后的；和
评定所述细胞播种的生物相容性基质材料的细胞计数、细胞活力和/或细 胞功能。
64. 权利要求63的方法，进一步包括步骤：
将所述细胞播种的生物相容性基质材料放置在适合于低温保存的小瓶 中；和
向所述近融合、融合或融合后的细胞播种的生物相容性基质材料引入一 定体积的低温保存介质组合物，所述低温保存介质组合物包含低温保存剂、 多糖和血清，所述体积的低温保存介质组合物足以在所述材料被低温保存时 维持细胞活力或抑制性表型以及基质完整性。
65. 权利要求64的方法，进一步包括步骤：
将装有细胞播种的生物相容性基质材料和低温保存介质组合物的小瓶 放置在冷冻容器中；
向所述冷冻容器中引入控制冷冻速度的试剂；
将装有所述试剂的冷冻容器放置在至少约-4℃的冷冻器中；
从所述至少约-4℃的冷冻器取出所述冷冻容器；和
将所述冷冻容器放置在至少约-80℃的冷冻器中。
66. 权利要求65的方法，进一步包括步骤：
从所述至少约-80℃的冷冻器中取出所述冷冻容器；以及将所述小瓶放 置到至少约-160℃的冷冻器中。
67. 权利要求66的方法，进一步包括步骤：
从所述冷冻器取出所述小瓶；
将所述小瓶放置在环境温度空气中约15分钟，随后将所述小瓶放置在 环境温度水浴中约15分钟；
将所述可植入材料从所述小瓶中取出；
在清洗介质组合物中清洗所述可植入材料约5分钟；和
将所述可植入材料放置到细胞培养介质中约48小时。
68. 权利要求66的方法，进一步包括步骤：
从所述冷冻器取出所述小瓶；
将所述小瓶放置在环境温度空气中约15分钟，随后将所述小瓶放置在 环境温度水浴中约15分钟；
将所述可植入材料从所述小瓶中取出；和
在清洗溶液组合物中清洗所述可植入材料约30分钟。
69. 权利要求63的方法，进一步包括步骤：
将所述细胞播种的生物相容性基质材料放置在适合于保存的小瓶中；和
向所述近融合、融合或融合后的细胞播种的生物相容性基质材料引入一 定体积的转移介质组合物，所述转移介质组合物包含一定量的VEGF，足以 在所述材料保存在所述组合物中时维持细胞活力或抑制性表型。
70. 权利要求63的方法，进一步包括步骤：
制备所述细胞播种的生物相容性基质材料用于根据权利要求64的方法 低温保存，或用于根据权利要求69的方法保存；
制备所述用于转运的小瓶；
将所述小瓶转移到临床位置用于向患者施用。
71. 权利要求70的方法，进一步包括步骤：
将装有细胞播种的生物相容性基质材料的小瓶放置到内盒中；
将所述内盒放置到保温的外盒中；和，
提供产品文件。
72. 权利要求70的方法，其中所述细胞播种的生物相容性基质材料是 临床试验材料，以及其中所述患者是临床试验中的参与者。
73. 权利要求63的方法，其中所述可植入材料以工业规模制备。
74. 一种实施权利要求63-71的任何一项或多项的方法的机器人系 统。
75. 一种生产包含细胞和生物相容性基质的可植入材料的方法，所述 方法包括步骤：
使用适合的试剂和条件用所述细胞接触所述生物相容性基质；其中所述 细胞具有足够增殖所述基质的数量，并生长成为融合、近融合或融合后群体， 以及进一步地，其中所述基质用与细胞类型无关的、未经兼容性测试的、未 匹配的细胞增殖。
76. 一种处理方法，所述方法包括步骤：
提供根据权利要求75的方法生产的可植入材料。
77. 一种根据权利要求75的方法产生的、包含细胞和生物相容性基质 的可植入材料。