用于脂质体纳米颗粒的修饰的药物
阅读：347发布：2024-01-16
专利汇可以提供用于脂质体纳米颗粒的修饰的药物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了适合于加载到脂质体纳米颗粒载体中的药物衍 生物 。在一些优选方面，该衍生物包括用弱 碱 部分衍生化的 水 溶性差的药物，该弱碱部分促进药物通过LN跨膜pH或离子梯度主动加载到LN的含水内部。弱碱部分可以任选包括便于药物主动加载到脂质体膜的内部 单层 中的亲脂性区域。有利地，相对于相应的游离药物，药物衍生物的LN制剂显示出改善的 溶解度 、降低的毒性、增强的效果和/或其它益处。，下面是用于脂质体纳米颗粒的修饰的药物专利的具体信息内容。
1.式I的药物衍生物∶
其中
D是药物；
n是1、2或3；和
Z是式II的脂质体增溶单元∶
其中
[L]是连接基，选自∶氧基羰基、羰基氧基、氧基羰基亚氨基、亚氨基羰基氧基、和烷基甲硅烷基，
[S]是间隔基，选自∶
C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，每个任选被一个或多个选自下列的取代基取代∶
2
卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
Y是杂原子，选自∶N、O、S和Si，和
2
R选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；
2
C1-C10杂烷基，任选被-YR 取代一或多次，其中
Y是选自N、O、S和Si的杂原子，和
2
R选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和
[N]是通式III的增溶域∶
其中
R和R'独立地选自∶H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和可质子化的含氮杂环体系；或R和R'与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
2.权利要求1的药物衍生物，其中[N]选自式IVa或IVb的基团∶
其中∶
A选自:羰基、亚甲基和NR-C＝O，其中R是H或C1-C5烷基；
1 2
R和R 独立地选自:直链或支链C1-C30烷基、C2-C30烯基和C2-C30炔基；和
3 4
R和R 独立地选自:H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；或
3 4
R和R 与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
3.权利要求1的药物衍生物的脂质体纳米颗粒制剂。
4.权利要求3的脂质体纳米颗粒制剂，其通过将药物衍生物主动加载到具有含水内部的脂质体纳米颗粒中而形成。
5.权利要求4的脂质体纳米颗粒制剂，其中药物衍生物存在于脂质体纳米颗粒的含水内部中。
6.权利要求4的脂质体纳米颗粒制剂，其中[N]为式IVa或IVb的基团∶
其中∶
A选自:羰基、亚甲基和NR-C＝O，其中R是H或C1-C5烷基；
1 2
R和R 独立地选自:直链或支链C1-C30烷基、C2-C30烯基和C2-C30炔基；和
3 4
R和R 独立地选自:H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；或
3 4
R和R 与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
7.药物组合物，其包含权利要求3的脂质体纳米颗粒制剂和可药用赋形剂。
8.将药物修饰以促进药物加载到LN中的方法，该方法包括∶
使式II的脂质体增溶单元(Z)与药物缀合
其中
[L]是连接基，选自∶氧基羰基、羰基氧基、氧基羰基亚氨基、亚氨基羰基氧基、和烷基甲硅烷基。
[S]是间隔基，选自∶
C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，每个任选被一个或多个选自下列的取代基取代∶
2
卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
Y是杂原子，选自∶N、O、S和Si，和
2
R选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；
2
C1-C10杂烷基，任选被-YR 取代一或多次，其中
Y是选自N、O、S和Si的杂原子，和
2
R选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和
[N]是通式III的增溶域∶
其中
R和R'独立地选自∶H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和可质子化的含氮杂环体系；或R和R'与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
9.将药物加载到脂质体纳米颗粒中的方法，包括∶
使式II的脂质体增溶单元(Z)与药物缀合，形成药物衍生物；和
将药物衍生物主动加载到具有含水内部的脂质体纳米颗粒中，
其中
式II是∶
[L]是连接基，选自∶氧基羰基、羰基氧基、氧基羰基亚氨基、亚氨基羰基氧基、和烷基甲硅烷基。
[S]是间隔基，选自∶
C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，每个任选被一个或多个选自下列的取代基取代∶
2
卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
Y是杂原子，选自∶N、O、S和Si，和
2
R选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；
2
C1-C10杂烷基，任选被-YR 取代一或多次，其中
Y是选自N、O、S和Si的杂原子，和
2
R选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和
[N]是通式III的增溶域∶
其中
R和R'独立地选自∶H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和可质子化的含氮杂环体系；或R和R'与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
10.权利要求9的方法，其中[N]是式IVa或IVb的基团∶
其中∶
A选自:羰基、亚甲基和NR-C＝O，其中R是H或C1-C5烷基；
R1和R2独立地选自:直链或支链C1-C30烷基、C2-C30烯基和C2-C30炔基；和R3和R4独立地选自:H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；或
R3和R4与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
用于脂质体纳米颗粒的修饰的药物
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求美国临时申请61/055,929(2008年5月23日申请)的权益，本文引入其全部内容作为参考。发明领域
[0004] 本发明一般地涉及将抵抗或不能包封在脂质体中的药物进行化学修饰、从而形成可以有效地加载到具有跨膜pH或离子梯度的脂质体纳米颗粒(LN)中的衍生物的方法。在一些优选方面，该衍生物是一旦从LN中释放出来就可以容易地转变为游离药物的前体药物。本发明还涉及按照本发明方法制备的药物衍生物，包含这种衍生物的LN制剂和药物组合物，以及其制备和使用方法。
背景技术
[0005] 许多现有药物的发现策略是以发现可溶于水和可生物利用的‘可药用’化合物为判断标准的。因而，新发现的溶解度差和生物利用率受到限制的化合物尽管具有有希望的治疗性能，但常常很少推进到先导(lead)状态。
[0006] 已经开发了多种药物制剂和递送方法，以便努力克服非可药用化合物的限制性。脂质体纳米颗粒(LN)是用于全身(静脉内)给予药物的领先的药物递送系统，并且目前在市场上和临床试验中有许多脂质体药物。LN通常具有低毒性，并且可以进行设计，以便提供大量有利的药物性能，例如，改善血清半衰期、生物利用率、渗透性等等。LN制剂在与化学治疗剂相关方面特别成功，当这种化学治疗剂以其常规(游离)形式用药时，由于它们的水溶性低、血浆半衰期短和正常和疾病组织等中不加选择的积聚，其效果受到限制。
[0007] 长循环LN典型地具有大约100nm或更小的直径，并且保持在血液循环中，用于延长时间周期。长循环LN的延长的存在时间可以使它们聚集在感染位点、炎症位点、肿瘤生长位点及其它疾病相关的药物靶点上或其附近。由于这些区域中的脉管系统的局部结构(称为“有漏隙的”脉管系统)，使这种积聚更方便，其特征为脂质体可到达治疗靶点通过的大的孔(Jain,Microcirculation,4:1-23(1997),Hobbs等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:4607-4612(1998))。化学治疗剂或其它药物与长循环LN的稳定结合因此可以提高到达治疗靶点的药物的量，通过从LN中的可控(持续)释放来延长靶点与药物的治疗水平的接触时间，降低在健康的、非靶向组织中的积聚，由此提高效果和降低毒性。在实体瘤的情况下，在动物模型和临床研究中，化学治疗剂的LN制剂在治疗指数、耐受性、效果及其它性能方面已经得到了显著的提高。
[0008] 对感兴趣的药物应用LN技术，要求药物能够装填到脂质体载体中，并且以合适的速率在治疗靶上或其附近释放。药物加载到脂质体中的能力取决于药物的化学性质、脂质体膜和脂质体的内部环境。通常，使用被动式加载技术(其依靠水溶性药物与覆盖(lining)内部脂质体膜和/或含水脂质体内部的极性磷脂的结合，以及脂溶性药物与脂双层的结合)，可以将水溶性和脂溶性药物加载到脂质体中。然而，许多有效的药物具有更复杂的溶解特性，使得它们较不适于被动式加载方法。
[0009] 将溶解性差的药物加载到脂质体中的一个方法是将药物修饰，从而易于被动式加载。例如，已经开发了脂质体制剂，在这种制剂中，通过下列方法将紫杉烷(taxane)修饰：加入含有负电“水解-促进基团”(HPG)的烃链，形成在脂双层中溶解度增加的脂肪酸衍生物，如美国专利6,482,850和相关申请所述。然而，被动式加载方法通常具有差的加载效率，并且使得脂质体具有差的药物保持和释放特性，限制了所得到制剂的应用性。
[0010] 为了克服与被动式加载有关的局限性，已经开发了一些主动加载技术，从而使所加载的药物具有高效率和高保持性。特别有效的方法包括：通过形成跨脂质体膜的pH梯度以生成具有酸性脂质体内部环境和比脂质体内部环境的pH值高的外部环境(例如中性pH)的脂质体来加载弱碱性药物(例如，Maurer,N.,Fenske,D.,and Cullis,P.R.(2001)Developments in liposomal drug delivery systems.Expert Opinion in Biological Therapy 1,923-47；Cullis 等 人，Biochim Biophys Acta.,1331:187-211(1997)；Fenske 等 人，Liposomes:A practical approach.Second Edition.V.Torchilin and V.Weissig,eds.,Oxford University Press,p.167-191(2001))。弱碱性药物可以存在两种共同存在(平衡)形式：电中性(可透过膜)形式和带电/质子化(不能透过膜)形式。药物的中性形式倾向于穿过脂质体膜进行扩散，直到内部和外部浓度相等为止。然而，酸性内部环境导致中性形式的质子化，由此造成化合物的连续吸收，将其截留在脂质体内部。另一个方法包括使用金属离子梯度(例如Cheung BC,Sun TH,Leenhouts JM,Cullis
2+
PR:Loading of doxorubicin into liposomes by forming Mn -drug complexes.Biochim Biophys Acta(1998)1414:205-216)。脂质体内部的金属离子浓度高；外部环境没有金属离子。这种加载方法依靠与pH梯度技术相同的基本原理。弱碱性药物的中性形式可以渗过膜，并且通过形成药物-金属离子复合物而保留在脂质体的含水内部。在这种情况下，形成药物-金属离子复合物可以导致药物的连续吸收。
2+
PR:Loading of doxorubicin into liposomes by forming Mn -drug complexes.Biochim Biophys Acta(1998)1414:205-216)。脂质体内部的金属离子浓度高；外部环境没有金属离子。这种加载方法依靠与pH梯度技术相同的基本原理。弱碱性药物的中性形式可以渗过膜，并且通过形成药物-金属离子复合物而保留在脂质体的含水内部。在这种情况下，形成药物-金属离子复合物可以导致药物的连续吸收。
[0011] 一些抗癌和抗微生物药物，例如长春新碱、长春瑞宾、多柔比星、环丙沙星和诺氟沙星，使用pH梯度主动加载技术，可以容易地加载并稳定地保留在LN中(例如Drummond 等 人，Pharmacol.Rev.,51:691-743(1999),Cullis 等 人，Biochim Biophys Acta.,1331:187-211(1997)；Semple等人，J.Pharm.Sci.,94(5):1024-38(2005))。然而，许多临床重要的药物不是弱碱性药物，并由此不适于这种主动加载技术(例如Soepenberg等人，European J.Cancer,40:681-688(2004))。例如，许多抗癌药，包括某些基于紫杉烷(taxane)的药物(例如紫杉醇和多西紫杉醇)和鬼臼毒素衍生物(例如依托泊苷)，不能使用标准方法容易地配制为LN。
[0012] (多西紫杉醇)和 (紫杉醇)是市场上最普遍的处方抗癌药，并且与许多药理学和毒理学内容有关，包括变化剧烈(多西紫杉醇)和非线性的(紫杉醇)药物动力学，与制剂载体(Cremophor EL，Tween 80)有关的严重的过敏性反应，和剂量限制性骨髓抑制和神经毒性。在 的情况下，药物动力学的可变性大会引起毒性和效果、以及与全身接触未结合的药物有关的血液学毒性的显著可变性。另外，由于紫杉烷(taxane)的治疗活性随着肿瘤细胞药物接触的持续时间而提高，所以，商业紫杉烷(taxane)制剂的剂量限制性毒性基本上限制了它们的治疗潜力。
[0013] 因此，本领域需要能够使多种药物配制为LN的策略，并由此实现脂质体递送技术的益处。
发明内容
[0014] 在一方面，提供了式I的药物衍生物∶
[0015]
[0016] 其中
[0017] D是药物；
[0018] n是1、2或3；和
[0019] Z是式II的脂质体增溶单元(Solubilization Unit)∶
[0020]
[0021] 其中
[0023] [S]是间隔基，选自∶
[0024] C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，每个任选被一个或多个选自下列的取代基取2
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
[0025] Y是杂原子，选自∶N、O、S和Si，和
[0026] R2选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；
[0027] C1-C10杂烷基，任选被-YR2取代一或多次，其中
[0028] Y是选自N、O、S和Si的杂原子，和
[0029] R2选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；和
[0030] 环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和
[0031] [N]是通式III的增溶域(Solubilization Domain)∶
[0032]
[0033] 其中
[0034] R和R'独立地选自∶H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和可质子化的含氮杂环体系；或[0035] R和R'与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0036] 在一些方面，[N]具有至少大约5.5的pKa。
[0037] 在进一步方面，[N]具有小于或等于约12.0的pKa。
[0038] 在一些方面，药物衍生物适合于主动(actively)加载到具有含水内部的脂质体纳米颗粒中。
[0039] 在进一步方面，药物衍生物适合于主动加载到脂质体纳米颗粒的含水内部中。在一些方面，相对于外部介质，脂质体纳米颗粒的含水内部具有酸性pH值。在进一步方面，药物衍生物在脂质体纳米颗粒的含水内部中被质子化。
[0040] 在其它方面，该药物衍生物适于主动加载，使得药物衍生物存在于脂质体纳米颗粒膜之内或稳定地与脂质体纳米颗粒膜结合。在一些方面，[N]选自式IVa或IVb:
[0041]
[0042] 其中:
[0043] A选自:羰基、亚甲基和NR-C＝O，其中R是氢或C1-C5烷基；
[0044] R1和R2独立地选自:直链或支链C1-C30烷基、C2-C30烯基和C2-C30炔基；和[0045] R3和R4独立地选自:氢；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；或
[0046] R3和R4与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0047] 本文还提供了本文所提供的药物衍生物的脂质体纳米颗粒制剂。在一些方面，脂质体纳米颗粒制剂是如下形成的：将药物衍生物主动加载到具有含水内部的脂质体纳米颗粒中。
[0048] 在进一步方面，药物衍生物存在于脂质体纳米颗粒的含水内部。在一些方面，相对于外部介质，脂质体纳米颗粒的含水内部具有酸性pH值。在进一步方面，药物衍生物在脂质体纳米颗粒的含水内部之中被质子化。
[0049] 在进一步方面，药物衍生物存在于脂质体纳米颗粒膜内或稳定地与脂质体纳米颗粒膜结合。在进一步方面，[N]为式IVa或IVb的基团:
[0050]
[0051] 其中∶
[0052] A选自:羰基、亚甲基和NR-C＝O，其中R是H或C1-C5烷基；
[0053] R1和R2独立地选自:直链或支链C1-C30烷基、C2-C30烯基和C2-C30炔基；和[0054] R3和R4独立地选自:H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；或
[0055] R3和R4与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0056] 在另一个方面，本文提供了药物组合物，其包含本文所提供的药物衍生物的脂质体纳米颗粒制剂和可药用赋形剂。
[0057] 在另外的方面，本文提供了将药物修饰从而便于药物加载到LN中的方法，该方法包括：使式II的脂质体增溶单元(Z)与药物缀合(conjugating)
[0058]
[0059] 其中
[0060] [L]是连接基，选自∶氧基羰基、羰基氧基、氧基羰基亚氨基、亚氨基羰基氧基、和烷基甲硅烷基。
[0061] [S]是间隔基，选自∶
[0062] C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，每个任选被一个或多个选自下列的取代基取2
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
[0063] Y是杂原子，选自∶N、O、S和Si，和
[0064] R2选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；
[0065] C1-C10杂烷基，任选被-YR2取代一或多次，其中
[0066] Y是选自N、O、S和Si的杂原子，和
[0067] R2选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；和
[0068] 环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和
[0069] [N]是通式III的增溶域∶
[0070]
[0071] 其中
[0072] R和R'独立地选自∶H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和可质子化的含氮杂环体系；或[0073] R和R'与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0074] 在另外的方面，本文提供了将药物加载到脂质体纳米颗粒中的方法，该方法包括下列步骤：使式II的脂质体增溶单元(Z)与药物缀合，形成药物衍生物；且将药物衍生物主动加载到具有含水内部的脂质体纳米颗粒中，
[0075] 其中
[0076] 式II是∶
[0077]
[0078] [L]是连接基，选自∶氧基羰基、羰基氧基、氧基羰基亚氨基、亚氨基羰基氧基、和烷基甲硅烷基。
[0079] [S]是间隔基，选自∶
[0080] C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，每个任选被一个或多个选自下列的取代基取2
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
[0081] Y是杂原子，选自∶N、O、S和Si，和
[0082] R2选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；
[0083] C1-C10杂烷基，任选被-YR2取代一或多次，其中
[0084] Y是选自N、O、S和Si的杂原子，和
[0085] R2选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；和
[0086] 环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和
[0087] [N]是通式III的增溶域∶
[0088]
[0089] 其中
[0090] R和R'独立地选自∶H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和可质子化的含氮杂环体系；或[0091] R和R'与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0092] 在一些方面，药物衍生物适合于主动加载到脂质体纳米颗粒的含水内部中。在进一步方面，相对于外部介质，脂质体纳米颗粒的含水内部具有酸性pH值。在进一步方面，药物衍生物在脂质体纳米颗粒的含水内部之中被质子化。
[0093] 在一些方面，将药物衍生物主动加载，使得它存在于脂质体纳米颗粒膜之内或稳定地与脂质体纳米颗粒膜结合。在进一步方面，[N]为式IVa或IVb的基团:
[0094]
[0095] 其中∶
[0096] A选自:羰基、亚甲基和NR-C＝O，其中R是H或C1-C5烷基；
[0097] R1和R2独立地选自:直链或支链C1-C30烷基、C2-C30烯基和C2-C30炔基；和[0098] R3和R4独立地选自:H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；或
[0099] R3和R4与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0100] 在又一个方面，提供了治疗疾病或病症的方法，包括给予需要治疗的患者有效量的本文所描述的药物组合物。
[0101] 因此，本发明包括但不限于以下内容：
[0102] 1.式I的药物衍生物∶
[0103]
[0104] 其中
[0105] D是药物；
[0106] n是1、2或3；和
[0107] Z是式II的脂质体增溶单元∶
[0108]
[0109] 其中
[0110] [L]是连接基，选自∶氧基羰基、羰基氧基、氧基羰基亚氨基、亚氨基羰基氧基、和烷基甲硅烷基，
[0111] [S]是间隔基，选自∶
[0112] C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，每个任选被一个或多个选自下列的取代基取2
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
[0113] Y是杂原子，选自∶N、O、S和Si，和
[0114] R2选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；
[0115] C1-C10杂烷基，任选被-YR2取代一或多次，其中
[0116] Y是选自N、O、S和Si的杂原子，和
[0117] R2选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；和
[0118] 环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和
[0119] [N]是通式III的增溶域∶
[0120]
[0121] 其中
[0122] R和R'独立地选自∶H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和可质子化的含氮杂环体系；或[0123] R和R'与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0124] 2.项1的药物衍生物，其中[N]具有至少大约5.5的pKa。
[0125] 3.项1的药物衍生物，其中[N]具有小于或等于大约12.0的pKa。
[0126] 4.项1的药物衍生物，其适合于主动加载到具有含水内部的脂质体纳米颗粒中。
[0127] 5.项4的药物衍生物，其适合于主动加载到脂质体纳米颗粒的含水内部。
[0128] 6.项5的药物衍生物，其中脂质体纳米颗粒的含水内部相对于外部介质具有酸性pH值。
[0129] 7.项4的药物衍生物，其适合于主动加载，使得药物衍生物存在于脂质体纳米颗粒膜内或稳定地与脂质体纳米颗粒膜结合。
[0130] 8.项7的药物衍生物，其中[N]选自式IVa或IVb的基团∶
[0131]
[0132] 其中∶
[0133] A选自:羰基、亚甲基和NR-C＝O，其中R是H或C1-C5烷基；
[0134] R1和R2独立地选自:直链或支链C1-C30烷基、C2-C30烯基和C2-C30炔基；和[0135] R3和R4独立地选自:H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；或
[0136] R3和R4与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0137] 9.项1的药物衍生物的脂质体纳米颗粒制剂。
[0138] 10.项9的脂质体纳米颗粒制剂，其通过将药物衍生物主动加载到具有含水内部的脂质体纳米颗粒中而形成。
[0139] 11.项10的脂质体纳米颗粒制剂，其中药物衍生物存在于脂质体纳米颗粒的含水内部中。
[0140] 12.项11的脂质体纳米颗粒制剂，其中脂质体纳米颗粒的含水内部相对于外部介质具有酸性pH值。
[0141] 13.项10的脂质体纳米颗粒制剂，其中药物衍生物存在于脂质体纳米颗粒膜内或与脂质体纳米颗粒膜稳定地结合。
[0142] 14.项13的脂质体纳米颗粒制剂，其中[N]为式IVa或IVb的基团∶
[0143]
[0144] 其中∶
[0145] A选自:羰基、亚甲基和NR-C＝O，其中R是H或C1-C5烷基；
[0146] R1和R2独立地选自:直链或支链C1-C30烷基、C2-C30烯基和C2-C30炔基；和[0147] R3和R4独立地选自:H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；或
[0148] R3和R4与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0149] 15.药物组合物，其包含项9的脂质体纳米颗粒制剂和可药用赋形剂。
[0150] 16.将药物修饰以促进药物加载到LN中的方法，该方法包括∶
[0151] 使式II的脂质体增溶单元(Z)与药物缀合
[0152]
[0153] 其中
[0154] [L]是连接基，选自∶氧基羰基、羰基氧基、氧基羰基亚氨基、亚氨基羰基氧基、和烷基甲硅烷基。
[0155] [S]是间隔基，选自∶
[0156] C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，每个任选被一个或多个选自下列的取代基取2
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
[0157] Y是杂原子，选自∶N、O、S和Si，和
[0158] R2选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；
[0159] C1-C10杂烷基，任选被-YR2取代一或多次，其中
[0160] Y是选自N、O、S和Si的杂原子，和
[0161] R2选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；和
[0162] 环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和
[0163] [N]是通式III的增溶域∶
[0164]
[0165] 其中
[0166] R和R'独立地选自∶H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和可质子化的含氮杂环体系；或[0167] R和R'与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0168] 17.将药物加载到脂质体纳米颗粒中的方法，包括∶
[0169] 使式II的脂质体增溶单元(Z)与药物缀合，形成药物衍生物；和
[0170] 将药物衍生物主动加载到具有含水内部的脂质体纳米颗粒中，
[0171] 其中
[0172] 式II是∶
[0173]
[0174] [L]是连接基，选自∶氧基羰基、羰基氧基、氧基羰基亚氨基、亚氨基羰基氧基、和烷基甲硅烷基。
[0175] [S]是间隔基，选自∶
[0176] C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，每个任选被一个或多个选自下列的取代基取2
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
[0177] Y是杂原子，选自∶N、O、S和Si，和
[0178] R2选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；
[0179] C1-C10杂烷基，任选被-YR2取代一或多次，其中
[0180] Y是选自N、O、S和Si的杂原子，和
[0181] R2选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；和
[0182] 环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和
[0183] [N]是通式III的增溶域∶
[0184]
[0185] 其中
[0186] R和R'独立地选自∶H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和可质子化的含氮杂环体系；或[0187] R和R'与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0188] 18.项17的方法，其中将药物衍生物主动加载到脂质体纳米颗粒的含水内部。
[0189] 19.项18的方法，其中脂质体纳米颗粒的含水内部相对于外部介质具有酸性pH值。
[0190] 20.项18的方法，其中主动加载药物衍生物，使得药物衍生物存在于脂质体纳米颗粒膜内或稳定地与脂质体纳米颗粒膜结合。
[0191] 21.项20的方法，其中[N]是式IVa或IVb的基团∶
[0192]
[0193] 其中∶
[0194] A选自:羰基、亚甲基和NR-C＝O，其中R是H或C1-C5烷基；
[0195] R1和R2独立地选自:直链或支链C1-C30烷基、C2-C30烯基和C2-C30炔基；和[0196] R3和R4独立地选自:H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；或
[0197] R3和R4与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0199] 图1.前体药物在pH7.4缓冲水溶液中和磷酸盐缓冲的小鼠血浆(pH7.4)中的水解动力学(在37℃)。
[0200] 图2.将多西紫杉醇衍生物加载到LN中。经由在LN内的300mM硫酸铵和外部不含硫酸铵的介质(在pH 5条件下缓冲)形成的pH(铵离子)梯度，通过在60℃温育使衍生物加载到DSPC/chol LN中。(A)在前体药物与脂质的比例为0.1wt/wt(■)，0.2wt/wt(◆)和0.4wt/wt(▲)时，多西紫杉醇前体药物TD1的加载效率。(B)在前体药物与脂质的比例为0.2wt/wt的条件下，用DSPC/Chol LN温育的多西紫杉醇的C-2'-哌嗪基酯(TD1-TD3)、C-2'-哌啶酯(TD7)和C-7-氨基酯(TD10)衍生物的加载效率(loading efficiency)。
[0201] 图3.泼尼松衍生物加载到LN中。在60℃将该衍生物加载到DSPC/chol LN中(通过pH(铵离子)梯度，该梯度由LN内的300mM硫酸铵和外部不含硫酸铵的介质(在pH5条件下缓冲)形成)。(A):泼尼松的N-甲基-哌嗪基丁酸酯衍生物(◆)相对于母体药物(■)在药物与脂质的比例为0.12wt/wt时的加载效率。泼尼松衍生物不会自发地分配到LN双层中；由此，在没有硫酸铵(pH)梯度的情况下，没有可测量量的与LN载体结合的衍生物。(B):在60℃温育15分钟之后，具有不同的连接基长度的泼尼松衍生物的加载效率：N-甲基-哌嗪基丁酸酯(B)和N-甲基-哌嗪基乙酸酯(E)衍生物的对比。N-甲基-哌嗪基丁酸酯衍生物显示了100％加载效率，而N-甲基-哌嗪基乙酸酯衍生物显示了约75％加载效率。
[0202] 图4.依托泊苷衍生物加载到LN中。在60℃将N-甲基-哌嗪基丁酸酯衍生物加载到DMPC/Chol LN中(通过pH(铵离子)梯度，该梯度由LN内的300mM硫酸铵和外部不含硫酸铵的介质(在pH5条件下缓冲)形成)。在60℃温育15分钟之内，在药物与脂质比例为0.16wt/wt的条件下，该衍生物显示了100％加载效率。
[0203] 图5.制剂稳定性。在4个月期间内(在7℃冷藏)，含有不同脂质组合物(DSPC/Chol、DPPC/Chol和DMPC/Chol)的LN-多西紫杉醇衍生物制剂的稳定性。制剂的前体药物与脂质的比例是0.2wt/wt。(A)前体药物水解；通过UHPLC确定母体药物(多西紫杉醇)增加，(B)保留在LN中的前体药物的百分比，(C)通过动态光散射测定的LN大小和多分散性。
[0204] 图6.对小鼠静脉内(i.v.)给药之后的TaxotereTM(▲)、用与TaxotereTM(乙醇/聚山梨醇酯80/生理盐水)同样的方法配制的TD1(■)和TD1的DSPC/Chol LN制剂(前体药物与脂质的比例为0.2(wt/wt))(◆)的血浆消除曲线。以等摩尔的多西紫杉醇剂量(20mg/kg多西紫杉醇)给雌性Swiss Webster小鼠静脉内注射单剂量的各种制剂。用UHPLC-MS测定血浆中的前体药物水平。数据点表示每个小鼠组的平均值±标准偏差(n＝4)。
[0205] 图7.血浆药物保留特性。体外(A)和体内(B)测定多西紫杉醇衍生物TD1在DSPC/Chol(◆)、DPPC/Chol(■)和DMPC/Chol(▲)中的保留。在小鼠血浆中，在DSPC/chol LN中的TD1的体外保留与其它多西紫杉醇衍生物(TD2-3和TD7)(在相同的药物与脂质比例下、在DSPC/chol LN中配制)相比较(C)。将包含痕量放射性同位素标记的脂质3
[H]-CHE的LN制剂静脉内注射到雌性Swiss Webster小鼠中(以20mg/kg的多西紫杉醇的等价剂量)，或在37℃、在小鼠血浆中体外温育。分别用液体闪烁计数和UHPLC分析指定时间点获取的血浆样品的脂质和前体药物含量。为了进行体外保留研究，用尺寸排阻色谱(使用葡聚糖凝胶Sephadex G50旋转柱)从血浆样品中除去未俘获(释出)的药物，而后分析脂质和药物含量。数据点表示平均值±标准偏差(n＝4)。
[H]-CHE的LN制剂静脉内注射到雌性Swiss Webster小鼠中(以20mg/kg的多西紫杉醇的等价剂量)，或在37℃、在小鼠血浆中体外温育。分别用液体闪烁计数和UHPLC分析指定时间点获取的血浆样品的脂质和前体药物含量。为了进行体外保留研究，用尺寸排阻色谱(使用葡聚糖凝胶Sephadex G50旋转柱)从血浆样品中除去未俘获(释出)的药物，而后分析脂质和药物含量。数据点表示平均值±标准偏差(n＝4)。
[0206] 图8.抗癌效果。在Rag2M小鼠中，皮下MDA435/LCC6人乳腺癌异种移植物对用TMTaxotere 和LN-包封的TD1治疗的响应。(A)用各种LN制剂进行治疗，测定脂质组合物关于功效的效果。LN制剂(前体药物与脂质的比例为0.2wt/wt)由DSPC/Chol(■)、DPPC/Chol(▲)和DMPC/Chol(*)组成，并以40mg/kg的多西紫杉醇的等价剂量给药。未经治疗的对照物接受盐水注射(◆)。(B)以25(x)、40(*)和88(▲)mg/kg的多西紫杉醇的等价剂量给药的DSPC/Chol LN制剂(前体药物与脂质的比例为0.2wt/wt)的剂量-响应。未TM
经治疗的对照物接受盐水注射(◆)。包括Taxotere (25mg/kg多西紫杉醇)用于对比TM
(■)。(C)Taxotere 与88mg/kg DSPC/Chol LN制剂的对比。用标准偏差显示肿瘤增长曲线。在第35天，用单次静脉内快速浓注开始治疗。点表示相对肿瘤体积(在给定时间点测定的肿瘤体积与在治疗日测定的肿瘤体积的比例)的平均值；提供每组6个小鼠的平均值。
经治疗的对照物接受盐水注射(◆)。包括Taxotere (25mg/kg多西紫杉醇)用于对比TM
(■)。(C)Taxotere 与88mg/kg DSPC/Chol LN制剂的对比。用标准偏差显示肿瘤增长曲线。在第35天，用单次静脉内快速浓注开始治疗。点表示相对肿瘤体积(在给定时间点测定的肿瘤体积与在治疗日测定的肿瘤体积的比例)的平均值；提供每组6个小鼠的平均值。
[0207] 图9.游离长春新碱(VCR)(2mg/kg)和包封在100nm卵鞘磷脂/胆固醇LN中的长春新碱(2mg/kg)(给携带A431肿瘤的SCID小鼠静脉内注射)的体内动力学和抗癌活性。(8A)在血浆中，游离VCR(□)和LN配制的VCR(●)随时间变化的浓度曲线。游离VCR快速地从循环中除去，而LN配制的VCR具有延长的循环半衰期。(8B)随时间的变化，游离VCR(●)从LN制剂中的释放(％保留)。LN配制的VCR在循环中显示了持续释放特性。
(8C)给予游离VCR(□)和LN配制的VCR(●)之后随时间变化的VCR的肿瘤浓度(μg/ml)。随时间的变化，LN配制的VCR的延长半衰期和持续释放特性导致VCR的肿瘤积聚升高。(8D)游离VCR(□)和LN配制的VCR(●)相对于盐水对照物(■)的抗癌活性。与游离化合物相比，LN配制的VCR具有显著更大的抗癌活性。纳米脂质体制剂增加了到达肿瘤生长位点的药物的量，并且延长了与治疗活性水平的药物接触的时间，从而提高了抗癌活性。
(8C)给予游离VCR(□)和LN配制的VCR(●)之后随时间变化的VCR的肿瘤浓度(μg/ml)。随时间的变化，LN配制的VCR的延长半衰期和持续释放特性导致VCR的肿瘤积聚升高。(8D)游离VCR(□)和LN配制的VCR(●)相对于盐水对照物(■)的抗癌活性。与游离化合物相比，LN配制的VCR具有显著更大的抗癌活性。纳米脂质体制剂增加了到达肿瘤生长位点的药物的量，并且延长了与治疗活性水平的药物接触的时间，从而提高了抗癌活性。
[0208] 图10.基于位于药物上的羟基的酯化来合成弱碱药物衍生物所使用的化学策略的示意图。
[0209] 发明详述
[0210] 本文使用的术语“脂质体”或“脂质体纳米颗粒”或“LN”是指包含一个或多个脂双层的自我组装结构(self-assembling structure)，其每个包含两个含有反向定向的两亲(amphipathic)脂质分子的单层。两亲脂质包含与一个或两个或多个非极性(疏水性)酰基或烷基链共价连接的极性(亲水性)头基。在疏水性的酰基链和周围的含水介质之间的非常不利的接触导致两亲脂质分子本身进行排列，以使极性头基朝向双层的表面定向而酰基链朝向双层的内部定向，有效地防止酰基链与水性环境接触。
[0211] 本文所描述方法和组合物所使用的脂质体可以具有环绕或包封含水隔室(compartment)的单个脂质双层(单层脂质体)或多个脂质双层(多层脂质
体)。例如在下列中描述了各种型式的脂质体：Cullis等人，Biochim.Biophys Acta，
559∶399-420(1987)。
体)。例如在下列中描述了各种型式的脂质体：Cullis等人，Biochim.Biophys Acta，
559∶399-420(1987)。
[0212] 两亲脂质典型地包括脂质体脂质囊泡的主要结构单元。脂质的亲水特性来源于磷酰基(phosphato)、羧基、硫酰基(sulfato)、氨基、巯基、硝基及其它类似的极性基团的存在。可以通过所包括的基团而具有疏水性，这种基团包括但不局限于：长链饱和和不饱和脂肪烃基团，其可以被一个或多个芳香、环脂族基或杂环基团取代。优选的两亲化合物的例子是磷酸甘油酯和鞘脂，其代表性的例子包括：磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，磷脂酸，磷脂酰甘油，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰乙醇胺，双肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二油酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二亚油酰磷脂酰胆碱和卵鞘磷脂(egg sphingomyelin)。其它脂质例如鞘脂和糖鞘脂也用于本文提供的方法和组合物中。另外，上述两亲脂质可以与其它脂质例如三酰基甘油和甾醇混合。
[0213] 本文使用的术语“C1-10-烷基”是指直链或支链饱和烃链，其中最长的链具有一至十个碳原子，例如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，异戊基，新戊基，己基，等等。
[0214] 本文使用的术语“C2-10-烯基”是指具有两个至十个碳原子并且含有一个或多个双键的直链或支链烃基团。C2-10-烯基的非限制性例子包括烯丙基，高烯丙基(homo-allyl)，乙烯基，巴豆基，丁烯基，戊烯基，己烯基，庚烯基，辛烯基，等等。具有多于一个双键的C2-10-烯基的非限制性例子包括丁二烯基，戊二烯基，己二烯基，庚二烯基，庚三烯基，辛三烯基等等基团，以及这些基团的支链形式。不饱和(双键)的位置可以是沿着碳链的任何位置。
[0215] 本文使用的术语“C2-10-炔基”是指具有两个至八个碳原子并且含有一个或多个三键的直链或支链烃基团。C2-10-炔基的非限制性例子包括乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基，己炔基，庚炔基，辛炔基等等基团，以及这些基团的支链形式。不饱和(三键)的位置可以是沿着碳链的任何位置。一个以上的键可以是不饱和键，因此，“C2-10-炔基”可以是二炔或烯二炔。
[0216] 本文使用的术语“杂烷基”是指含有1个或多个(优选1或2个)选自O、S和N的杂原子的烷烃基团。如果存在的话，这种杂原子任选进一步被选自O、S、N和Si的杂原子取代，或被任选被卤素取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或杂芳基取代。非限制性实例包括(一或多种)醚、硫醚、酯和酰胺基。
[0217] 本文使用的术语“芳基”和“环烷基”指的是包含5至12个碳原子的单和双环结构，优选包含5至6个碳原子的单环。如果这种环包含一个或多个杂原子(选自N、S和O)(即，杂环或杂芳基环)，这种环包含总共5至12个原子，更优选5至6个原子。杂环包括但不局限于：呋喃基，吡咯基，吡唑基，噻吩基，咪唑基，吲哚基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，吲唑基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，异噁唑基，噁唑基，噻唑基，异噻唑基，吡啶基，哌啶基，哌嗪基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，吗啉基，噁二唑基，噻二唑基，咪唑啉基，咪唑烷基等等。环可以被一个或多个选自O、S和N的杂原子取代。如果存在的话，这种杂原子任选进一步被选自O、S、N和Si的杂原子取代，或被任选被卤素取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或杂芳基取代。
[0218] 如果存在的话，取代基C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C1-10烷氧基、C1-10杂烷基、C1-10氨基烷基、C1-10卤代烷基和/或C1-10烷氧羰基可以被一个或多个羟基、C1-6烷氧基、卤素、氰基、氨基或硝基取代。
[0219] 本文使用的术语“卤素”或“卤”包括氯、氟(这两个是优选的)和碘和溴。
[0220] 本发明通常涉及将药物修饰、从而便于药物加载到脂质体纳米颗粒(LN)中的药物化学平台。在一些优选方面，使用标准技术，将抵抗或不能包封到脂质体中的亲脂性/不溶于水的药物修饰，形成可以有效地加载到LN中的药物衍生物，其中LN具有跨脂质体膜的pH梯度。尽管相对于化疗剂描述了本发明的各个方面，但本文提供的方法和组合物代表弹性技术平台，其可以和其中脂质体递送是有利的的任何药物或治疗剂一起使用，包括但不局限于：用于治疗癌症、炎症性病症、传染病及其它适应症的确定的化疗剂和药物。
[0221] 本文还提供了能够有效加载到显示跨膜pH或离子梯度的LN中的药物衍生物，以及包含这种药物衍生物的LN制剂和药物组合物。在各个实施方案中，通过将具有一或多种妨碍有效加载到脂质体中的特性(例如但不局限于：差的水溶性)的已知药物进行化学修饰来制备药物衍生物。在一些优选实施方案中，药物是化疗剂。
[0222] 在一些方面，本文提供的药物衍生物是通过用“增溶单元(solubilizing unit)”(其具有一或多种便于将衍生化药物加载到LN中的特性)将药物衍生化形成的。在不同方面，将增溶单元进行生理化学设计，从而便于衍生化药物有效加载到LN中，和/或在优选条件下、在治疗靶点上或其附近从LN中有效释放药物。
[0223] 在一些优选方面，增溶单元包括：在跨膜pH或离子梯度的存在下便于药物衍生物主动加载到LN中的弱碱性氨基。本文使用的术语“弱碱性衍生物”是指按照本文所提供方法修饰的药物，包含弱碱性部分，例如伯、仲或叔胺。
[0224] 在一些方面，弱碱性部分是可电离的氨基，例如N-甲基-哌嗪子基(piperazino)，吗啉代(morpholino)，哌啶子基(piperidino)，双-哌啶子基(bis-piperidino)或二甲基氨基。用于合成弱碱性药物衍生物的修饰基团的例子包括但不局限于：N-甲基-哌嗪基(例如，在抗癌药物 中)，双-哌嗪子基，双-哌啶子基(例如，在抗癌药物依立替康中)，哌啶子基，吗啉代，二甲基氨基，氨基甲基(甘氨酸)，氨基乙基(丙氨酸)和氨基丁酰基，和具有可质子化胺基团的脂质。
[0225] 在一些方面，弱碱性氨基选自∶
[0226]
[0227] 其中n在1和大约10之间，或更优选1和4之间。
[0228] 在一些方面，增溶单元进一步包括连接基单元，其便于增溶单元连接到用于衍生化的药物上。在一些方面，连接基包括反应性羰基(例如羧酸部分)，其与药物上的游离OH基团反应，形成羧基酯连接。在进一步方面，连接基包括二烷基甲硅烷基，其与药物上的游离OH基团反应，形成甲硅烷基醚连接。在其它方面，连接基包括氨基甲酸酯基(carbamate group)。
[0229] 在不同方面，提供了下列通式结构的药物衍生物，其中Z是水-增溶单元，D是药物，n是1、2或3∶
[0230]
[0231] 在一些方面，Z包括式II的基团，其中∶
[0232]
[0233] 波状线表示连接式IIA与药物中反应性基团(例如游离O原子)的键；
[0234] [L]是连接基，选自∶氧基羰基、羰基氧基、氧基羰基亚氨基、亚氨基羰基氧基、和烷基甲硅烷基；
[0235] [S]是间隔基，选自∶
[0236] C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，每个任选被一个或多个选自下列的取代基取2
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
代∶卤素；C1-C10烷基；环烷基；和-YR ，其中
[0237] Y是杂原子，选自∶N、O、S和Si，和2
[0238] R选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；2
[0239] C1-C10杂烷基，任选被-YR 取代一或多次，其中
[0240] Y是选自N、O、S和Si的杂原子，和2
[0241] R选自∶H；选自N、O和S的杂原子；各自任选被卤素取代的C1-C10烷基和环烷基；和
[0242] 环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和
[0243] [N]是增溶域，包括便于药物衍生物加载到LN中的弱碱性基团，其中LN显示跨膜pH或离子梯度，其中[N]是通式III，其中∶
[0244]
[0245] R和R'独立地选自∶H；C1-C10烷基，C2-C10烯基，C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；和可质子化的含氮杂环体系；或[0246] R和R'与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0247] 在不同方面，对增溶单元进行设计，从而便于药物衍生物主动加载到LN之内的特定位置。例如，在一些方面，用便于药物衍生物主动加载到LN的含水内部中的水-增溶单元将药物衍生化。加入胺基团是提高水溶性的常见的药物修饰策略(例如，Capdeville等人，Nature Reviews Drug Discovery，1∶493-502(2002)；Pizzolato and Saltz，Lancet，361∶2235-2242(2003))，本领域已知制备胺药物衍生物的各种方法，包括可逆的药物缀合(例如通过酶作用体内除去基团)。具有改善的水溶性的胺修饰药物的非限制性例子包括：抗癌剂Glivec(N-甲基-哌嗪)，依立替康(双-哌啶)和托泊替康(乙基二甲基氨基)。
[0248] 在其它方面，用脂质-增溶单元将药物衍生化，从而便于药物衍生物的主动加载，这样就可以使衍生物存在于脂质体膜中，或稳定地与脂质体纳米颗粒膜结合。在一些方面，脂质-增溶单元包括弱碱性基团和亲脂性基团。可以选择亲脂性基团，促进药物主动加载到LN中、药物在LN内的稳定性和/或药物在治疗靶点上或其附近的释放。在一些方面，亲脂性基团具有与脂质体膜类似的或互补性的脂质组成。在一些这样的方面中，脂质-增溶单元选自式IVa或IVb的基团∶
[0249]
[0250] 其中∶
[0251] A选自:羰基、亚甲基和NR-C＝O，其中R是H或C1-C5烷基；
[0252] R1和R2独立地选自:直链或支链C1-C30烷基、C2-C30烯基和C2-C30炔基；和[0253] R3和R4独立地选自:H；C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基，每个任选被卤素取代；和环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，每个任选被卤素取代；或
[0254] R3和R4与它们相连接的氮原子一起形成具有四至五个碳原子的杂环，其可以构成环体系内多环中的一个。
[0255] 通过施用跨脂质体膜(内部酸性)的pH梯度，并且用待包封的药物与脂质体温育，可以将弱碱衍生物加载到LN中。根据pH，弱碱性衍生物可以存在带电(质子化)形式(例如，其中pH低于pKa)，或中性形式(例如，其中pH是pKa或高于pKa)。只有中性形式可以快速地渗透跨脂质体膜。一旦到达酸性脂质体内部，采取带电的不可透过膜的形式，使化合物在脂质体内部继续吸收和保留。
[0256] 在一些优选方面，通过选择和/或修饰衍生物胺基团和/或衍生物亲脂性基团的一或多种特性，可以精细地调节本文提供的弱碱性衍生物的药物加载特性。例如，可以选择衍生物胺基团的pKa，以使胺基团在所使用的LN制剂的含水内部被质子化(例如，在低pH值条件下)，在外部介质中不被质子化(例如，在中性或碱性pH值条件下)。
[0257] 在一些方面，衍生物胺基团的pKa小于或等于大约12.0，小于或等于大约11.5，小于或等于大约11.0，小于或等于大约10.5，小于或等于大约10.0，小于或等于大约9.5，或小于或等于大约9.0。
[0258] 在一些方面，衍生物胺基团的pKa至少为大约5.0，至少大约5.5，至少大约6.0，至少大约6.5，至少大约7.0，至少大约7.5，至少大约8.0，或至少大约8.5。
[0259] 包括弱碱性部分的增溶单元可以与用于修饰的药物上的任何合适的反应性官能团相连接。这样的官能团尤其包括羟基、巯基和羧基。在一些方面，增溶单元通过药物上的游离OH基团连接，例如，通过羧基酯键。
[0260] 在一些方面，在对目标治疗活性不重要的区域将药物衍生化，以使衍生物的活性基本上与游离药物的活性相等。例如，在一些方面，弱碱性衍生物包括在浆果赤霉素骨架的7-OH基团处衍生化的紫杉烷(taxane)多西紫杉醇。
[0261]
[0262] 在进一步方面，在对活性重要的区域将药物衍生化，以使衍生物是必须转变为母体化合物或另一种活性形式的前体药物，以产生目标治疗效果。例如，在一些方面，本文提供了多西紫杉醇衍生物，其在对多西紫杉醇活性必要的2'-OH基团处被衍生化。
[0263]
[0264] 优选，本文提供的前体药物衍生物一旦从LN载体中释放并接触体内生理条件时能够快速转变为游离药物。例如，在一些优选方面，在从脂质体中释放之后，例如，通过内原性酶的作用和/或通过自发水解反应，本文提供的弱碱性衍生物的衍生物氨基从药物上快速地除去。
[0265] 由此，在一些方面，增溶单元可逆地缀合到药物衍生物上，形成前体药物，该前体药物在一些条件下(例如，在加载、配制、储存和/或给药LN组合物期间)是稳定的，并且在它的一个或多个治疗靶点上或其附近分解释放游离药物，例如，在内原性酶的作用下，和/或在一些生理条件(例如pH值，离子强度)下。
[0266] 在一些方面，对弱碱性衍生物进行设计，使其在脂质体纳米载体内部是稳定的(例如，在低pH值条件下)，但在生理pH值下可以‘自我释放’，以使前体药物一旦从脂质体中释放就可以快速地转变为它的活性形式。这可以例如通过下列方式实现：氨基丁酰基连接到未质子化形式(pH7.4)的多西紫杉醇上可通过对酯羰基进行亲核进攻而引起释放。
[0267] 在一些方面，利用一或多种下列效应，可以调节弱碱性衍生物的酯连接的水解稳定性∶
[0268] i)诱导效应∶借助于蛋白酶或通过自发水解，或通过使增溶氨基更靠近(去稳定)或更远离(稳定)羰基中心，可以在生理pH值下使酯稳定或去稳定(对于裂解)。氨基的pKa也在这方面中起一定作用∶在生理条件下，带电(质子化)的胺促进酯水解。通过合适地选择氨基上的R基团，可以调节N-中心，以便达到理想的酯裂解速率。
[0269] ii)化学和邻近效应∶用例如4-氨基丁酰基(其中氨基单元具有～6的pKa)进行酯化产生一种单元，其在低pH值下(例如，在加载硫酸铵的LN内所得到的pH值下)以其质子化形式存在。这种衍生物从LN载体中释放并接触生理条件(例如pH7.4)促进游离碱形式的形成，使游离胺通过对酯羰基的亲核进攻来引发衍生化单元的“自我释放”。有利地，这可以使前体药物衍生物一旦从LN中释放就可以快速地转变为活性形式。
[0270] 在进一步方面，可以调节弱碱性衍生物的甲硅烷基醚连接的水解稳定性，以便促进自发水解。与酯连接基不同的是，没有内源性的去甲硅烷基化的酶。由此，包含甲硅烷基醚连接的衍生物优选包括可在生理条件下水解的连接基。甲硅烷基裂解速率的主要决定因素是Si原子周围的空间位阻(steric bulk)。调节这种生理化学特性需要改变甲硅烷基卤化物中的基团R和R'的大小，例如，通过Me、Et、i-Pr、t-Bu、Ph系列等等。与酯的情况一样，氨基的pKa也在限定衍生物的稳定性方面起一定作用。例如，在生理pH值下，具有pKa～6的氨基将主要以游离碱形式存在，由此促进甲硅烷基的裂解。
[0271] 在进一步方面，可以选择亲脂性衍生物基团的大小和/或化学组成，以便增加药物在脂质体膜中的溶解度和/或药物在脂质体内的稳定性(例如，通过将药物固定在脂质体膜中)。
[0272] 有利地，本文所提供药物的弱碱性衍生物可以比游离药物更有效地加载到脂质体中。在一些方面，本文所提供的弱碱性衍生物可以在很宽的药物与脂质的比例范围内(例如从大约0.01mg/mg至大约10mg/mg或更高)加载到脂质体中，其加载效率至少大约50％，至少大约55％，至少大约65％，至少大约70％，至少大约75％，至少大约80％，至少大约85％，或更高。
[0273] 在进一步方面，通过例如将LN载体膜的脂质组合物进行修饰，可以使本文所提供的弱碱性衍生物的LN制剂最佳化，以便实现药物衍生物的持续释放。例如，在不同方面，本文所提供的LN制剂具有大约1至大约96小时、或大约2至大约72小时、或大约4至大约48小时之间的体内释放半衰期。
[0274] 本文提供的方法可用于修饰合乎脂质体制剂需要的任何药物或治疗剂。在一些优选方面中，药物是亲脂性的和/或水溶性差的药物。有利地，按照本文所提供方法进行的这种药物的修饰，相对于游离药物，可以提高溶解度、降低毒性、提高效能和/或其它益处。
[0275] 表1给出了可以按照本文所提供方法修饰并加载到LN中的药物的非限制性例子。
[0276] 表1.用于衍生的示例性药物。
[0277]
[0278]
[0279]
[0280] pred.＝预测的
[0281] 来源∶R.G.Strickley,Pharm.Res.21(2):201(2004)；DrugBank，位于http://www.drugbank.ca/
[0282] 在一些优选方面，药物是化疗剂。可以按照本文所提供方法衍生化的已确定的药物或药物类别的例子包括：紫杉烷(taxane)(例如紫杉醇和多西紫杉醇)和鬼臼毒素衍生物(例如依托泊苷和替尼泊苷)。紫杉烷(taxane)(其包括多西紫杉醇(Taxotere)和紫杉醇(Taxol))是广泛应用于临床肿瘤学中的药物的重要家族。象大部分抗癌药一样，紫杉烷对于癌细胞是非选择性的，并且还可以损害健康细胞。因为紫杉烷在水溶液中的溶解性差，所以，典型地将它们配制在载体例如Cremophor和聚山梨醇酯80中，这种载体本身可导致患者的不良反应。常常使用甾体和抗过敏的预给药法，以便使载体的副作用最小。有利地，本文提供的LN紫杉烷制剂允许在不使用毒性载体的条件下给药紫杉烷。此外，因为LN可以脱离血流，并且优先以高浓度聚集在肿瘤中(这是由于在这些位点处的血管的“泄漏”性质)，所以，与批准的母体化合物的制剂Taxotere相比，LN紫杉烷制剂可以提供优越的抗癌症活性，同时副作用更小(例如，改善的治疗指数)。
[0283] 在一些方面，本文提供的LN制剂提高特异到达肿瘤生长位点的化疗剂的量，和/或延长肿瘤与治疗活性水平的药物的接触时间，例如，通过延长的LN的血浆半衰期和/或化疗剂从LN载体中的持续释放。
[0284] 在一些方面，该药物是多西紫杉醇 或紫杉醇，其结构如下所示。两个药物在侧链(在多西紫杉醇中是叔丁氧羰基或BOC；在紫杉醇中是苯甲酰基)的氮原子上所存在的酰基水平上不同，因此，C-10OH基团在多西紫杉醇中是游离的，但它在紫杉醇中是乙酰化的。
[0285]
[0286] 按照本文所提供方法进行的多西紫杉醇和紫杉醇的修饰包括用合适基团将一个或多个游离OH单元衍生化。在一些方面，药物是在C-1OH处衍生化的。在其它优选方面，药物是在C-2'、C-7和/或C-10OH处衍生化的，产生下列衍生物，其中与C-2'、C7和/或C-10OH连接的基团Z独立地是H或含有可质子化氮官能团(functionality)的残基。按类似于多西紫杉醇和紫杉醇的方式，任何药物都可以在游离OH基团或其它反应性官能团(其可以存在于天然药物或药物的修饰形式上)处衍生化。
[0287]
[0288] 在一些方面，本文提供的LN制剂具有脂质体长春新碱 (其目前在III期临床试验中用于治疗各种癌症)的一或多种药理学特性(例如，Boman等人，Brit.J.Cancer 72:896-904(1995),Shan等人，Cancer Chemother.Pharmacol.58(2):245-55(20
06),Waterhouse等人，Methods Enzymol.391:40-57(2005))。
06),Waterhouse等人，Methods Enzymol.391:40-57(2005))。
[0289] 在不同方面，提供了下列通式结构的药物衍生物，其中Z是水-增溶单元，D是药物∶
[0290]
[0291] 在一些方面，Z包括式IIA的基团，其中∶
[0292]
[0293] (i)波状线表示连接式IIA与药物(例如上面的化合物3和/或4)中反应性基团(例如游离O原子)的键；
[0294] (ii)[S]是“间隔基”，包括∶
[0295] (a)(CH2)n类型的链，其中n可以在1至10的范围，或
[0296] (b)上述(CH2)n的衍生物，其中一个或多个H原子被下列代替∶含有1至10个C原子的直链、支链或环状烷基；杂原子例如N、O、S、Si，其可以进一步与H原子连接，或与杂原子例如N、O、S连接，或与含有1至10个C原子并任选地引入一个或多个卤素原子的直链、支链或环状烷基连接；卤素原子；或
[0297] (c)上述(CH2)n的衍生物，其中一个或多个CH2被下列代替∶杂原子例如N、O、S、Si，其可以进一步与H原子连接，或与杂原子例如N、O、S连接，或与含有1至10个C原子并任选地引入一个或多个卤素原子的直链的、支链的或环状的烷基连接；由3至10个碳原子组成并任选地引入一个或多个杂原子例如N、O、S、Si或卤素以及在成对原子间的多重键的环状结构；或
[0298] (d)上述(CH2)n的衍生物，其中一个或多个相邻的C原子对共享E-或Z-几何形状的双键、或三键。
[0299] 这种间隔基[S]的例子包括但不局限于：
[0300]
[0301]
[0302] (iii)[N]是增溶域，其包括促进药物衍生物加载到LN(其显示跨膜pH或离子梯度)中的弱碱性基团，选自：
[0303] (a)通式结构R-N-R'的取代基，其中N(氮)原子与间隔基连接，其中R和R'可以独立地是∶H；含有1至10个C原子并任选掺入一个或多个杂原子例如N、O、S、Si和卤素以及在成对原子间的多重键的直链的、支链的或环状的烷基；或由3至10个碳原子组成并任选掺入一个或多个杂原子例如N、O、S、Si或卤素以及在成对原子间的多重键的环状结构的部分。
[0304] 这种R和R'的例子包括但不局限于下列：
[0305] H，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，苯基，苄基，
[0306]
[0307] 或
[0308] (b)可质子化的含氮杂环体系，例如吡咯烷，哌啶，哒嗪，吗啉，硫吗啉，奎宁环，咪唑，吡啶，等等，或其取代的变体，如下列代表性的(但不是唯一的)实例所说明，其中波状线表示连接杂环结构与间隔基的键∶
[0309]
[0310] 上面式IIA的代表性的方面由此包括但不局限于下列∶
[0311]
[0312] 用多达三个式IIA的单元(可以不同或相同)进行多西紫杉醇的衍生化，产生如下所示的A、B、C、D、E、F和G类型的单、二或三酯。
[0313]
[0314] 多西紫杉醇的单酯衍生物
[0315]
[0316] 多西紫杉醇的二酯衍生物
[0317]
[0318] 多西紫杉醇的三酯衍生物
[0319] 用类似的方式，紫杉醇可以转变为如下所示的H、I和J类型的单和二酯衍生物∶[0320]
[0321] 紫杉醇的单酯衍生物
[0322]
[0323] 紫杉醇的二酯衍生物
[0324] 将多西紫杉醇或紫杉醇加工为这些衍生物的方法包括：例如，利用本领域技术人员熟知的现代有机化学的标准技术，使未保护的或部分保护的母体药物与5的羧酸形式偶合。
[0325] 在一些方面，Z包括式IIB的基团，其中∶
[0326]
[0327] (i)波状线表示连接式IIB与药物[D](例如化合物3和/或4)中的合适反应性基团(例如游离O原子)的键；
[0328] (ii)“间隔基”[S]如上面式IIA所详述；
[0329] (iii)增溶单元[N]如上面式IIA所详述；
[0330] (iv)R'是H，或含有1至10个C原子并任选掺入一个或多个杂原子如N、O、S、Si和卤素以及成对原子间的多重键的直链的、支链的或环状的烷基。
[0331] 这种R'的例子包括但不局限于下列：
[0332] H，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，苯基，苄基，
[0333]
[0334] 上面结构式IIB的代表性的方面包括但不局限于下列∶
[0335]
[0336] 用多达三个类型6的单元(可以不同或相同)进行多西紫杉醇的衍生化，产生如下所示的A、B、C、D、E、F和G类型的单、二或三氨基甲酸酯。
[0337]
[0338] 多西紫杉醇的单氨基甲酸酯衍生物
[0339]
[0340] 多西紫杉醇的二氨基甲酸酯衍生物
[0341]
[0342] 多西紫杉醇的三-氨基甲酸酯衍生物
[0343] 用类似的方式，紫杉醇可以转变为如下所示的H、I和J类型的单和二-氨基甲酸酯衍生物∶
[0344]
[0345] 紫杉醇的单氨基甲酸酯衍生物
[0346]
[0347] 紫杉醇的二-氨基甲酸酯衍生物
[0348] 将多西紫杉醇或紫杉醇加工为这种衍生物的方法包括：例如，利用本领域技术人员熟知的现代有机化学的标准技术，使未保护的或部分保护的母体药物与6的异氰酸酯(R″＝H)或咪唑鎓(imidazolide)(R″≠H)形式偶合。
[0349] 在一些方面，Z是通式IIC的基团，其中∶
[0350]
[0351] (i)波状线表示连接式IIC与药物[D](例如化合物3和/或4)中的合适反应性基团(例如游离O原子)的键；
[0352] (ii)“间隔基”如上面式IIA所详述；
[0353] (iii)基团[N]如上面式IIA所详述；
[0354] (iii)RA和RB独立地表示含有1至10个C原子并且任选掺入一个或多个杂原子例如N、O、S、Si和卤素以及成对原子间的多重键的直链的、支链的或环状的烷基。
[0355] 这种RA和RB的例子包括但不局限于下列∶H，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，苯基和苄基。
[0356] 上面式IIC的代表性的方面包括但不局限于下列∶
[0357]
[0358] 用多达三个式IIC的单元(可以不同或相同)进行多西紫杉醇的衍生化，将其转化为如下所示的A、B、C、D、E、F和G类型的单、二或三-甲硅烷基醚。
[0359]
[0360] 多西紫杉醇的单-甲硅烷基醚衍生物
[0361]
[0362] 多西紫杉醇的二-甲硅烷基醚衍生物
[0363]
[0364] 多西紫杉醇的三-甲硅烷基醚衍生物
[0365] 用类似的方式，紫杉醇可以转变为如下所示的H、I和J类型的单和二醚衍生物∶[0366]
[0367] 紫杉醇的单-甲硅烷基醚衍生物
[0368]
[0369] 紫杉醇的二-甲硅烷基醚衍生物
[0370] 将多西紫杉醇或紫杉醇加工为这种衍生物的方法包括：例如，利用本领域技术人员熟知的现代有机化学的标准技术，使未保护的或部分保护的母体药物与式IIC的氯化物或咪唑鎓形式偶合。
[0371] 上面用紫杉烷举例说明的技术适用于具有用于式IIA、IIB或式IIC的增溶单元[Z]的合适固定位点例如OH、COOH(羧基)或NH基团的任何药物。
[0372] 在一些方面，药物是依托泊苷，其是广泛使用的、批准用于治疗淋巴瘤、肺和睾丸癌的抗癌剂。依托泊苷显示了差的水溶性，经历代谢性灭活，并且具有显著的毒性副作用。在各种优选方面，本文提供的依托泊苷LN制剂具有明显降低的毒性、提高的溶解度和生物利用率和提高的效能。
[0373] 为了举例说明，依托泊苷8和皮质类甾醇泼尼松9可以转变为酯、氨基甲酸酯或甲硅烷基醚衍生物，如上面对于紫杉烷的详细说明。这些衍生物中的[Z]如先前紫杉醇(taxol)系列中的化合物所定义。
[0374]
[0375] 用类似的方式，环孢菌素10、硫唑嘌呤11等等可以转变为适合于脂质体制剂的衍生物∶
[0376]
[0377] 在一些方面，感兴趣的药物是用包括弱碱性胺基团和亲脂性基团的脂质增溶单元衍生化的。在一些优选方面，该增溶单元具有与构成脂质体膜的脂质相似的结构。例如，在一些方面，药物衍生物是下列通式：[D]-[L]-[S]-[N]，其中[S]是上面关于式IIA-IIC所定义的间隔基，[N]是增溶域，[L]是连接基，如下定义。
[0378] 在一些方面，[N]是式IVA的基团(“内部”衍生物)或式IVB的基团(“端部”衍生物)，其中∶
[0379]
[0380] (i)A表示羰基(C＝O)；氨基甲酰基(NR-C＝O，其中R是H或1至5个C原子的烷基)；或亚甲基(CH2)；
[0381] (ii)R1和R2表示含有多达30个碳原子并且任选在相邻碳原子对之间引入一个或多个多重键的直链或支链亲脂性烷基，；
[0382] (iii)R3和R4独立地表示H；或1至5个C原子的烷基，例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，等等；或环结构，例如吡咯烷，哌啶，哌嗪，吗啉，硫吗啉等等的支链。
[0383] (iii)连接基[L]是∶
[0384] (a)羰基，C＝O；
[0385] (b)氨基甲酰基，NR-C＝O，其中R是H或1至5个C原子的烷基；或
[0386] (c)基团RA-Si-RB如上所定义。
[0387] 下面是许多用增溶基团(包括弱碱性部分和亲脂性部分)衍生化的临床上显著的紫杉烷，以形成“端部”类型(式IVB)衍生物和“内部”类型(式IVA)衍生物。这种衍生物可以例如如下制备：使用本领域已知的技术，使任何未保护的或部分保护的母体药物与连接基[L]的羧酸、酰基咪唑鎓、氨基甲酰基咪唑鎓、甲硅烷基氯或甲硅烷基咪唑鎓形式偶合。可以将得到的衍生物主动加载到LN中，以使药物存在于脂质体膜中。
[0388] 式IVA的多西紫杉醇衍生物包括具有下列代表性结构的酯、氨基甲酸酯(carbamate)和甲硅烷基醚∶
[0389]
[0390] 式IVA的多西紫杉醇单酯、单氨基甲酸酯和单甲硅烷基醚
[0391] 式IVA的紫杉醇衍生物包括具有下列代表性结构的酯、氨基甲酸酯和甲硅烷基醚∶
[0392]
[0393] 式IVA的紫杉醇单酯、单氨基甲酸酯和单甲硅烷基醚
[0394] 式IVB的多西紫杉醇衍生物包括先前所描述的一般类型的酯、氨基甲酸酯和甲硅烷基醚，但具有下列代表性的结构∶
[0395]
[0396] 式IVB的多西紫杉醇单酯、单氨基甲酸酯和单甲硅烷基醚
[0397] 式IVB的紫杉醇衍生物包括先前所描述的一般类型的酯、氨基甲酸酯和甲硅烷基醚，但具有下列代表性的结构∶
[0398]
[0399] 式IVB的紫杉醇单酯、单氨基甲酸酯和单甲硅烷基醚
[0400] 类似地，依托泊苷8、泼尼松9、环孢菌素10、硫唑嘌呤11及其它药物可以用包括弱碱性基团和亲脂性基团的增溶单元衍生化，以使药物可以主动地加载在LN膜内。对于化合物8-11、13和14，指的是式[D]-[L]-[S]-[N]的衍生物，15和16指的是式[L]-[S]-[N]的衍生物，其中，[N]按照式IVB(在类型13中)和式IVA(在类型14中)，[L]和[S]如上所述。
[0401]
[0402]
[0403] 在一些方面，药物是选自例如组合库的新化学个体(NCE)，根据治疗功效和一或多种特性，例如亲油性和/或低水溶性，这些特性在无本方法的情况下将会妨碍药物的药物应用性。
[0404] 在进一步方面，药物衍生物是通过将新开发的和/或表征的药物(例如新化学个体(NCE))修饰来制备的。通常，对于药学开发和使用来说，从化学库筛选出的药理有效的物质经常被证明不太适合作为理想的候选物。例如，溶解度问题是主要原因，大部分NCE不能继续开发并被放弃。本文列出的化学平台能够通过下列方式开发和使用这些化合物：使用已知的方法，用促进在LN中配制的弱碱性化学部分将它们特定地修饰。将产生和筛选药物候选物的高通量组合化学方法与本文所描述的药物化学平台进行整合，提供了药物(和诊断剂)开发的替代性方法，其可以替换现有的、在发现具有药物类特性的化合物基础上预测的药物开发策略。
[0405] 相应地，在一些方面，本文提供了鉴定具有使人们感兴趣的治疗活性和低水溶性、亲油性和/或妨碍或干扰游离化合物使用和/或妨碍化合物有效加载到LN中的其它特性的药物候选物的方法。例如，在一些方面，提供了包括下列步骤的方法：将通过组合化学产生的化合物群体进行筛选，以便鉴定具有使人感兴趣的治疗活性的药物候选物，并且筛选药物候选物的一或多种其它性能，以便鉴定用于按照本文所描述方法衍生的候选物。在进一步方面，用于衍生化的候选物用弱碱性基团衍生化，主动加载到LN中，并且筛选LN，以便鉴定具有目标治疗活性的制剂候选物。有利地，本文所提供的筛选法鉴定用于LN制剂、且使用标准方法不能检测的药物候选物。
[0406] 在本文所提供的方法和组合物中使用的脂质体可以由标准形成囊泡的脂质形成，其通常包括中性和带负电荷或带正电荷的磷脂和甾醇，例如胆固醇。脂质的选择通常根据例如脂质体大小、脂质体在血流中的稳定性、所需释放速率及本领域已知的其它因素。
[0407] 在一些方面，在本文所描述方法和组合物中使用的脂质体的主要脂质组份是磷脂酰胆碱。可以使用具有多种不同的链长和饱和度的酰基链基团的磷脂酰胆碱。在一些方面，优选含有碳链长度在C14至C22范围内的饱和脂肪酸的磷脂酰胆碱。饱和长链磷脂酰胆碱比它们的不饱和对应物的体内渗透性更小且更稳定。也可以使用具有单或二不饱和脂肪酸和饱和与不饱和脂肪酸的混合物的磷脂酰胆碱。其它合适的脂质包括例如醚脂质(etherlipid)，在这种脂质中，脂肪酸通过醚连接(而不是酯连接)与甘油连接。本文使用的脂质体还可以由具有头基(不同于胆碱)的鞘磷脂或磷脂构成，该头基例如乙醇胺，丝氨酸，甘油，磷脂酸和肌醇。
[0408] 在一些优选方面，脂质体包括甾醇，优选胆固醇，摩尔比为0.1至1.0(胆固醇∶磷脂)。优选的脂质体组合物的例子包括二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇，二棕榈酰磷脂酰胆碱/胆固醇，双肉豆蔻酰磷脂酰胆碱/胆固醇和卵鞘磷脂(egg sphingomyelin)/胆固醇。
[0409] 在其它方面，脂质体可以含有带负电荷或带正电荷的脂质。使用的带负电荷的脂质的例子包括但不局限于：二肉豆蔻酰-、二棕榈酰-和二硬脂酰磷脂酰甘油，二肉豆蔻酰-、二棕榈酰-和二棕榈酰磷脂酸，二肉豆蔻酰-、二棕榈酰-和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，它们的不饱和二酰基和混合的酰基链对应物以及心磷脂。带正电荷的脂质的非限制性例子包括：N,N'-二甲基-N,N'-双十八烷基(dioctacyl)溴化铵(DDAB)和N,N'-二甲基-N,N'-双十八烷基氯化铵(DDAC)，N-(1-(2,3-二油酰(dioleyl)氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)，3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基)胆固醇(DC-chol)，1,2-二油酰氧基-3-[三甲基铵(ammonio)]-丙烷(DOTAP)，1,2-双十八烷基氧基-3-[三甲基铵基]-丙烷(DSTAP)和1,2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟乙基氯化铵(DORI)和例如在下列中所描述的阳离子脂质：B.Martin,M.Sainlos,A.Aissaoui,N.Oudrhiri,M.Hauchecorne,J.-P.Vigneron,J.-M.Lehn and P.Lehn The design of cationic lipids for gene delivery.Current Pharmaceutical Design 2005,11,375-394。
[0410] 在进一步方面，本文使用的脂质体涂有聚合物层，以便增加LN的体内稳定性(例如，空间上稳定的脂质体)。例如，在一些实施方案中，LN由含有聚(乙二醇)-缀合的脂质(PEG-脂质)的脂质体形成，其形成提高LN的循环半衰期并且增加到达治疗靶点(例如，感染位点或肿瘤位点)的LN的量的亲水性表面层。一般方法描述在例如下列中：Working等人J Pharmacol Exp Ther,289:1128-1133(1999)；Gabizon等人，J Controlled Release 53:275-279(1998)；AdlakhaHutcheon等人，Nat Biotechnol 17:775-779(1999)；
和Koning等人，Biochim Biophys Acta 1420:153-167(1999)。使用的PEG-脂质的例子包括但不局限于：1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-350](mPEG350PE)；1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-550](mPEG550PE)；1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-750](mPEG750PE)；1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000](mPEG 1000PE)；1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](mPEG 2000PE)；1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](mPEG 3000PE)；1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](mPEG 5000PE)；N-酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)750](mPEG 750Ceramide)；N-酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)2000](mPEG 2000Ceramide)；和N-酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)5000](mPEG
5000Ceramide)。
和Koning等人，Biochim Biophys Acta 1420:153-167(1999)。使用的PEG-脂质的例子包括但不局限于：1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-350](mPEG350PE)；1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-550](mPEG550PE)；1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-750](mPEG750PE)；1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000](mPEG 1000PE)；1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](mPEG 2000PE)；1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](mPEG 3000PE)；1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](mPEG 5000PE)；N-酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)750](mPEG 750Ceramide)；N-酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)2000](mPEG 2000Ceramide)；和N-酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)5000](mPEG
5000Ceramide)。
[0411] 可获得的制备脂质体的各种方法例如描述在下列中：Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)；美 国 专 利 4,235,871、4,501,728 和 4,837,028；Liposomes,Marc J.Ostro,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1983,Chapter 1；和Hope等人Chem.Phys.Lip.40:89(1986)，本文引入其所有内容作为参考。在一些优选方面，脂质体是直径为大约100nm的小脂质体，是挤压水合脂质分散体通过具有100nm孔的滤膜而形成的，通常如下列所描述：Hope等人，Biochim.Biophys.Acta,812:55-65(1985)，将其引入本文中作为参考。
[0412] 在一个方法中，如下制备大小不均匀的多层囊泡：在合适有机溶剂或溶剂体系中，将形成囊泡的脂质溶解，并真空(或在惰性气体条件下)干燥混合物，形成薄脂质膜。或者，可以将脂质溶于合适溶剂例如叔丁醇中，而后冷冻干燥，形成更均匀的脂质混合物。用单价或二价金属离子的含水缓冲溶液覆盖膜或粉末，并使其水合，典型地经15-60分钟周期，同时搅拌。通过在更剧烈搅拌条件下使脂质水合，或通过加入增溶清洁剂(detergent)例如脱氧胆酸盐，可将得到的多层囊泡的尺寸分布朝着更小尺寸的方向移动。在另一个方法中，将脂质溶于水可混溶的有机溶剂例如乙醇中，而后同水性缓冲液相混合，形成多层脂质体悬浮液。或者，将脂质溶于与水不混溶的有机溶剂中，与含水介质混合，并通过蒸发有机溶剂而形成脂质体。
[0413] 可以使用一些技术将脂质体筛选至所需大小。一种筛选方法描述在美国专利4,737,323中，将其引入到本文中作为参考。通过浴槽式或探头式声裂法来超声处理脂质体悬浮液，制备尺寸渐进性降低至小于大约0.05微米的小单层囊泡。均化或微流化是依靠剪切能量(shearing energy)将大的脂质体破碎为更小脂质体的其它方法。在典型的均化方法中，使多层囊泡再循环通过标准乳液均化器，直到观察到选定的脂质体大小为止，典型地在大约0.1和0.5微米之间。在两种方法中，可以利用常规激光束粒径辨别方法来监控颗粒大小分布。
[0414] 挤压脂质体通过小孔的聚碳酸酯膜或不对称的陶瓷膜，是将脂质体大小降低至相对良好限定的大小分布的非常有效的方法。典型地，使悬浮液循环通过膜一或多次，直到获得所需脂质体大小分布为止。可以将脂质体挤压通过孔连续变小的膜，以便实现脂质体大小的逐渐降低。
[0415] 在一些方面，提供了使用主动加载技术将弱碱性衍生物加载到脂质体中的方法。在一些方面，通过施用跨脂质体膜的pH梯度(其中脂质体内部是酸性的)并用待包封的药物与脂质体温育来加载脂质体，如下列中所描述：Maurer,N.,Fenske,D.,and Cullis,P.R.(2001)Developments in liposomal drug delivery systems.Expert Opinion in Biological Therapy 1,923-47；N.L.Boman,D.Masin,L.D.Mayer,P.R.Cullis and M.B.Bally(1994)“Liposomal Vincristine Which Exhibits Increased Drug Retention and Increased Circulation Longevity Cures Mice Bearing P388Tumors”,Cancer Res.54,2830-2833；D.N.Waterhouse,T.D.Madden,P.R.Cullis,M.B.Bally,L.D.Mayer,M.Webb,Preparation,characterization,and biological analysis of liposomal formulations of vincristine.Methods Enzymol.391(2005)40-57,本文将其引入作为参考。在一些优选方面，pH梯度是硫酸铵梯度，通常如下列中所描述：G.Haran,R.Cohen,L.K.Bar,Y.Barenholz,Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.Biochim.Biophys.Acta 1115(1993)201-215 and U.S.Pat.No.5,316,771,本文将其引入作为参考。
一旦药物已经加载到脂质体中，可以直接使用组合物，或可以进一步处理该组合物，以便除去任何未加载的药物。
一旦药物已经加载到脂质体中，可以直接使用组合物，或可以进一步处理该组合物，以便除去任何未加载的药物。
[0416] pH加载技术通常包括两步：形成具有低的脂质体内部(intraliposomal)pH值的pH梯度，随后加载药物。可以通过多种方式形成跨膜质子梯度。可以在低pH值缓冲液例如pH 4柠檬酸盐缓冲液中制备脂质体，而后相对于pH7.5缓冲液来交换外部缓冲溶液(例如Madden等人，Chem.Phys.Lipids,53:37-46(1990))。或者，可以与阳离子梯度(高的内部阳离子浓度)协同使用离子载体(例如Fenske等人，Biochim Biophy.Acta,1414:188-204(1998))。离子载体例如尼日利亚菌素和A23187分别将单价或二价阳离子的外部移动与质子的内部移动进行联合，由此酸化脂质体内部。此外，脂质体可以在高浓度弱碱例如硫酸铵的存在下来制备(Haran等人，Biochim.Biophys.Acta,1151:201-215(1993))。按照相同原理，除去外部铵盐溶液导致pH梯度的形成，这对随后的药物加载过程也是起作用的。硫酸铵加载技术不需要大的pH梯度来实现有效加载，这是因为加载过程是通过两种不同的胺的交换来持续进行的(药物进入，氨出来)，由此在极低外部pH值下也能够较好地进行。如果例如药物在中性pH值下不稳定或不溶解，这种技术是有利的。除了pH梯度之外，可以使用金属离子梯度来进行主动加载(例如Cheung等人，Biochim Biophys Acta,1414:205-216(1998))。这种加载方法依靠与pH梯度技术相同的基本原理。弱碱性药物的中性形式可以渗过膜，并且通过形成药物-金属离子复合物而保留在含水的脂质体内部。
[0417] 为了将水溶性的弱碱性药物加载到LN中，可以将药物溶于水溶液(例如300mM蔗糖或具有合适pH值的等渗缓冲溶液)中，同脂质体悬浮液相混合，而后在合适的温度下温育。药物溶液可以含有少量(非膜渗透的)的水可混溶的有机溶剂，以便提高药物的溶解度(例如，<10％乙醇)。温育温度和时间取决于脂质组合物和药物的性质。典型地，与短链饱和脂质(例如DMPC/chol)或不饱和脂质形成的LN相比，由胆固醇和长链饱和脂肪酸例如DSPC/chol LN构成的脂质体渗透性更小，需要更高温度来实现快速和有效的加载。例如，DSPC/chol LN典型地需要等于或高于60℃的温度；加载典型地在5-15分钟之后完成，但可以用至多2小时。
[0418] 为了加载亲脂性的弱碱性药物，可以象脂质一样来处理药物。例如，可以将脂质和药物共同混合，并形成如上所述的脂质体；然后将亲脂性药物分布在脂质体双层的两个单层之间。然后使用上述方法，在对跨膜pH值或其它离子梯度响应的情况下，将外部单层中的药物加载到脂质体内部(翻转至(flipped to)LN双层的内部单层)。
[0419] 在另外的方面，提供了包含本文所提供的LN制剂的药物组合物。本文还提供了治疗疾病或病症的方法，包括给予本文所提供的LN组合物。在进一步方面，提供了药盒(kits)，其包含本文所描述的LN组合物和教导本文所描述的本发明方法和使用的指导材料。
[0420] 包含本发明的脂质体和化合物的药物组合物是按照标准技术以及上述那些技术制备的。优选，胃肠外给予药物组合物，即关节内(intraanicularly)、静脉内、皮下或肌肉内给予。更优选，药物组合物通过快速浓注或输液的方式静脉内给予。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa.，17th ed.(1985))中可以得到用于本发明的合适制剂。
[0421] 优选，静脉内给予药物组合物。由此，本发明提供了静脉内给予的组合物，其包括悬浮在可接受的载体(优选水性载体)中的脂质体。可以使用多种水性载体，例如水，缓冲水，0.9％等渗盐水，等等。可以用常规众所周知的杀菌技术或可以进行无菌过滤将这些组合物灭菌。可以将得到的水悬浮液包装，用于原态使用，或冻干，在给药之前，将冻干的制品与无菌的水溶液混合。该组合物可以含有近似生理条件所要求的药用助剂物质，例如pH值调节剂和缓冲剂，张力调节剂，等等，例如，乙酸钠，乳酸钠，氯化钠，磷酸钠，聚乙二醇(PEG400)，等等。
[0422] 按照所选择的具体给药模式，药物制剂中的脂质体的浓度可以广泛地变化，即，从小于大约0.5mg/mL脂质，通常是或至少大约10-50mg/mL脂质，至100mg/mL脂质或更高，并且主要通过流体体积、粘度、稳定性、需要的药物剂量等等来选择。
[0423] 脂质体电荷是脂质体从血液中清除的重要决定因素，带负电荷的脂质体被网状内皮系统更快速地吸收(Juliano，Biochem.Biophys.Res.Commun.63:651(1975))，并由此在血流中具有更短的半衰期。具有延长的循环半衰期的脂质体典型地合乎治疗和诊断使用的需要(其中脂质体必须聚集在远端疾病位点(例如肿瘤)处)。例如，具有2、8、12或高达24小时循环半衰期的脂质体是尤其优选的。
[0424] 另外，脂质体悬浮液可以包含脂质-保护剂，在储存过程中，其保护脂质抵御自由基和脂质-过氧化的危害。亲脂性的自由基淬灭剂，例如α-生育酚，和水溶性的铁特异性螯合剂，例如铁氧胺(ferrioxamine)，或抗氧化剂，例如抗环血酸是合适的。
[0425] 提供下列实施例作为实例，但不是限制性的。实施例
[0426] 实施例1-化学合成方法
[0427] 利用超高效液相色谱(UPLC)定量弱碱性衍生物和未修饰的药物。使用由下列组TM成的仪器： Acquity UPLC系统，配备光二极管矩阵检测器(PDA)和三重-四
极(TQ)MS检测器；EmpowerTM数据采集软件版本2.0(Waters，USA)。如下进行分离：使用TM
Acquity BEH C18柱(1.7μm，2.1x100mm)，流速0.25mL/min，流动相A和B分
别由含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水和含有0.1％TFA的乙腈组成。对于泼尼松和依托泊苷衍生物和未修饰的药物，流动相由含有0.1％甲酸的水(A)和含有0.1％甲酸的乙腈(B)组成。在程序化的线性梯度下、在23℃的柱温下输送流动相。
极(TQ)MS检测器；EmpowerTM数据采集软件版本2.0(Waters，USA)。如下进行分离：使用TM
Acquity BEH C18柱(1.7μm，2.1x100mm)，流速0.25mL/min，流动相A和B分
别由含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水和含有0.1％TFA的乙腈组成。对于泼尼松和依托泊苷衍生物和未修饰的药物，流动相由含有0.1％甲酸的水(A)和含有0.1％甲酸的乙腈(B)组成。在程序化的线性梯度下、在23℃的柱温下输送流动相。
[0428] 对于多西紫杉醇衍生物和多西紫杉醇，用50:50(A:B)的流动相比例开始分离。使用线性曲线，在2分钟期间内将比例改为10:90(A:B)，而后在10:90(A:B)下保持0.5分钟时间。随后在0.1分钟期间内将流动相变回到50:50(A:B)，并保持该比例0.4分钟，而后注射下一个样品。对于泼尼松衍生物和泼尼松，用80:20(A:B)的流动相比例开始分离。使用线性曲线，在4分钟期间内将比例改为40:60(A:B)，而后在0.1分钟期间内改为10:90(A:B)。将后面的比例保持0.4分钟。随后在0.1分钟期间将流动相变回到80:20(A:B)，并保持该比例0.9分钟，而后注射下一个样品。对于依托泊苷衍生物和依托泊苷，用80:20(A:B)的流动相比例开始分离。使用线性曲线，在1分钟期间内将比例改为72.5:27.5(A:B)，然后在3分钟期间内改为60:40(A:B)，在0.1分钟期间内改为
10:90(A:B)。将该比例保持0.4分钟。随后在0.1分钟期间将流动相变回到80:20(A:B)，并保持该比例0.4分钟，而后注射下一个样品。
10:90(A:B)。将该比例保持0.4分钟。随后在0.1分钟期间将流动相变回到80:20(A:B)，并保持该比例0.4分钟，而后注射下一个样品。
[0429] 分别在230nm波长(在多西紫杉醇和多西紫杉醇衍生物的情况下)和254nm(对于+泼尼松和依托泊苷衍生物)的波长处和ES离子模式(具有30V的锥电压)下，利用PDA和TQ-MS检测器来检测分析物。将LN配制的衍生物溶解在TFA-或甲酸-酸化的乙醇(0.1％vol)中。为了检测血浆样品中的LN配制的药物，将50μL血浆加入到150μL甲醇(用TFA或甲酸(0.1％v/v)酸化)中，并将混合物在4℃、在10,000x g下离心30分钟，使沉淀的蛋白形成团(pellet)。将甲醇酸化是稳定前体药物所必需的。当使用TFA-酸化的甲醇时，对于多西紫杉醇和多西紫杉醇衍生物(TD-1)，MS检测的极限(LOD)在大约1-50ng/mL之间。
如果需要使用甲酸来代替TFA，该极限可以降低至nM浓度以下(sub nM concentration)。
如果需要使用甲酸来代替TFA，该极限可以降低至nM浓度以下(sub nM concentration)。
[0430] 除非另有陈述，否则，在室温下，用Bruker AV-300型(对于1H：300MHz，对于13C：1 13 1 13
75MHz)和AV-400(对于 H：400MHz，对于 C：100MHz)记录 H和 CNMR谱。化学位移是以δ标尺的百万分之一(ppm)报道的，偶合常数J的单位是赫兹(Hz)。多重性被描述为“s”(单峰)，“d”(双峰)，“t”(三重峰)，“q”(四重峰)，“dd”(双二重峰)，“dt”(双三重峰)，“m”(多重峰)，“b”(宽峰)。低分辨率质谱(m/z)是以电喷雾(ESI)模式获得的。
75MHz)和AV-400(对于 H：400MHz，对于 C：100MHz)记录 H和 CNMR谱。化学位移是以δ标尺的百万分之一(ppm)报道的，偶合常数J的单位是赫兹(Hz)。多重性被描述为“s”(单峰)，“d”(双峰)，“t”(三重峰)，“q”(四重峰)，“dd”(双二重峰)，“dt”(双三重峰)，“m”(多重峰)，“b”(宽峰)。低分辨率质谱(m/z)是以电喷雾(ESI)模式获得的。
[0431] 用Cryo-TEM(用Tecnai G2 20 TWIN Mk.2透射电子显微镜(CDRD Imaging，Vancouver，Canada)进行)观察LN配制的衍生物。该仪器是在200kV下、以明视野模式操作的。用FEI Eagle 4k HR CCD摄像机和分析软件FEI TIA记录低剂量条件下的数字图象。1-3μm的弱焦用于增加图像对比度。用Vitrobot Mark IV玻璃化自动装置、在Lacey Formvar 300栅极(#01890，Ted Pella制造)上制备样品制剂。
[0432] 所有的试剂和溶剂是商业产品，并且不用进一步纯化就可以使用。快速色谱是在Silicycle 230-400目硅胶上进行的。用带有荧光指示器的Merck硅胶60板来进行分析和制备TLC。用UV光、KMnO4或对甲氧基苯甲醛使斑点显像。
[0433] 一般合成策略
[0434] 本文提供的一般策略(图10)包括：用恰当设计的增溶单元(由通式结构2表示)将含有合适固定位点(例如OH或NH基团)的不溶于水的药物1衍生化。该一般流程还适用于亲脂性的弱碱性药物衍生物的合成。可以使用pH或离子梯度作为驱动力，将得到的水溶性缀合物3加载到LN中。衍生物3可以本身是活性的，和/或可以在生理条件下快速地转变为活性母体药物1。
[0435] 该技术基于3的许多物理性能，例如：(i)水溶性；(ii)质子化的氮官能团的pKa；(iii)在脂质体加载条件下的稳定性；(iv)在生理条件下的游离药物的释放速率。因此，这
1 2
些特性为2中的连接基的性质、间隔基的性质和基团R和R 的性质的函数。
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些特性为2中的连接基的性质、间隔基的性质和基团R和R 的性质的函数。
[0436] 在一些方面，增溶单元包括羧基连接基、间隔基例如正C1-C4链和胺基团，例如N-甲基哌嗪，吗啉，哌啶，吡咯烷或二甲胺。示范性的增溶单元包括∶
[0437]
[0438] 其中n在1和大约10之间，或更优选1和4之间。
[0439] 实施例2-紫杉烷衍生物
[0440] 在C-2'位置的羟基处，用N-甲基-哌嗪基丁酸将多西紫杉醇衍生化，形成氨基酯前体药物(TD1)，如下所述。
[0441] 多西紫杉醇的2'-O-(N-甲基-哌嗪基丁酸酯)衍生物(TD1)
[0442] 连接基合成∶4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酸盐酸盐
[0443]
[0444] 在室温下，将1-甲基哌嗪(7.68mL，70mmol，4当量)加入到4-溴丁酸乙酯(2.5mL，17.3mmol)的乙酸乙酯(50mL)搅拌溶液中。在25℃搅拌溶液1小时，形成白色沉淀，而后在油浴上加热至70℃，保持1小时。TLC分析(20％乙酸乙酯(EtOAc)/己烷，Rf＝0.9(起始原料)，0.1(产物)，用碘(I2)显像)表明溴化物试剂完全消耗。用EtOAc(100mL)稀释反应，转入分液漏斗中，用水(100mL)、碳酸氢钠(NaHCO3，饱和，2x 100mL)、盐水(100mL)洗涤有机相，用硫酸镁(MgSO4)干燥，浓缩，得到淡黄色油状物。将该油状物溶于二氯甲烷(20mL)中，并加载到预平衡过的硅胶填料上(20％EtOAc/己烷，150mL SiO2)。用极性渐增的洗脱液(首次用20％EtOAc/己烷，然后用5-25％MeOH(含有5％NH4OH)/EtOAc)从硅胶上洗脱所需产物。
[0445] 收集含有所需物质的级分，浓缩，得到4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酸乙酯(3.63g，定量)。将水(20mL)和盐酸(HCl，10M，20mL，10当量)加入到含有所得到的油状物的烧瓶中。使烧瓶配备回流冷凝器，并在110℃加热3小时。然后将反应混合物冷却至室温，随后真空浓缩，直到只剩余油性残余物为止。将该残余物再溶于蒸馏水中，并重复浓缩过程。将剩余的浆液在85℃溶于乙醇(50mL)中。为了溶解所有的固体，需要加入少量的水(～
1mL)(加入大量的水将会不利地影响产率)。将该溶液在室温下静置3小时，然后转入冰箱(5℃)中，保持16小时。滤出沉淀，转入预先称量的小瓶中，并放入干燥器中(用Drierite，高真空)16小时，得到4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酸盐酸盐，其为结晶并且不吸湿的物质(3.02g，80％，基于单HCl盐)。
1mL)(加入大量的水将会不利地影响产率)。将该溶液在室温下静置3小时，然后转入冰箱(5℃)中，保持16小时。滤出沉淀，转入预先称量的小瓶中，并放入干燥器中(用Drierite，高真空)16小时，得到4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酸盐酸盐，其为结晶并且不吸湿的物质(3.02g，80％，基于单HCl盐)。
[0446] 1H NMR(D2O,400MHz)δ(ppm)＝3.60(br s,8H),3.26-3.22(m,2H),2.93(s,3H),2.43(t,J＝7.0Hz,2H),1.99-1.91(m,2H).13C NMR(D2O,100MHz)δ(ppm)＝176.5,55.9,50.2,48.7,42.8,30.3,18.7。
[0447] 酯化和盐的形成∶TD-1盐酸盐
[0448]
[0449] 将三乙胺(NEt3，10.0mL，5当量)加入到多西紫杉醇(3.997g，4.95mmol)和4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酸盐酸盐(1.213g，5.44mmol，1.1当量)的二氯甲烷(CH2Cl2，
60mL)搅拌溶液中。然后在冰浴中冷却反应容器，并加入Mukaiyama试剂(2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物，1.667g，6.53mmol，1.32当量)。随着吡啶鎓盐的溶解，溶液变成黄色。30分钟之后，从冰浴上移开烧瓶，并使反应另外进行16小时。TLC表明了起始原料良好转化为所需产物，但转化不完全(8％MeOH(含有5％NH4OH)在CH2Cl2中的溶液，用5％H2SO4在乙醇中的溶液染色)。将另外0.5当量的吡啶鎓盐(0.632g，0.5当量)和氨基酸(0.120g，0.1当量)加入到冰冷却的溶液中，同时搅拌。3小时之后，在旋转蒸发器上高真空浓缩反应混合物，得到淡橙色固体。将该固体溶于CH2Cl2(150mL)和EtOAc(20mL)中，转入分液漏斗中，并在有机相和饱和NaHCO3溶液(100ml)之间分配。然后用盐水(100mL)洗涤有机相，用MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到淡金色浆液。将该浆液溶于CH2Cl2(20mL)中，加载到预平衡过的硅胶柱(4％MeOH(含有5％NH4OH)在CH2Cl2中的溶液，250mL，40mm直径)上，用极性渐增的溶剂(4-10％MeOH(含有5％NH4OH)在CH2Cl2中的溶液，2％增量，500mL/增量)洗脱。
1
60mL)搅拌溶液中。然后在冰浴中冷却反应容器，并加入Mukaiyama试剂(2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物，1.667g，6.53mmol，1.32当量)。随着吡啶鎓盐的溶解，溶液变成黄色。30分钟之后，从冰浴上移开烧瓶，并使反应另外进行16小时。TLC表明了起始原料良好转化为所需产物，但转化不完全(8％MeOH(含有5％NH4OH)在CH2Cl2中的溶液，用5％H2SO4在乙醇中的溶液染色)。将另外0.5当量的吡啶鎓盐(0.632g，0.5当量)和氨基酸(0.120g，0.1当量)加入到冰冷却的溶液中，同时搅拌。3小时之后，在旋转蒸发器上高真空浓缩反应混合物，得到淡橙色固体。将该固体溶于CH2Cl2(150mL)和EtOAc(20mL)中，转入分液漏斗中，并在有机相和饱和NaHCO3溶液(100ml)之间分配。然后用盐水(100mL)洗涤有机相，用MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到淡金色浆液。将该浆液溶于CH2Cl2(20mL)中，加载到预平衡过的硅胶柱(4％MeOH(含有5％NH4OH)在CH2Cl2中的溶液，250mL，40mm直径)上，用极性渐增的溶剂(4-10％MeOH(含有5％NH4OH)在CH2Cl2中的溶液，2％增量，500mL/增量)洗脱。
1
[0450] 收集含有所需物质的级分，浓缩，得到3.8909g(80.5％)化合物。该化合物的 H NMR分析表明良好的纯度，同时存在(～10％)区域异构体的峰。将该物质再溶于CH2Cl2中，并进行与上述相同的色谱条件，使用CH2Cl2中的1％增量的MeOH，从5-10％(500mL/增量)。用TLC鉴定含有纯物质的级分，收集，浓缩，得到2.96g具有清晰NMR谱的化合物。
[0451] 将该物质溶于2-丙醇(45mL)中，并在冷却下(0℃)逐滴加入HCl(6.3mL，1M，在乙醚(Et2O)中，2.05当量)，形成盐酸盐。将悬浮液浓缩至干，并将得到的奶油色固体在高真空下干燥，通过加入Et2O(10mL)，从2-丙醇(45mL)重结晶。用布氏漏斗滤出沉淀，高真空干燥18小时，得到～2.5g。多西紫杉醇衍生物(TD-1)通过NMR、质谱、元素分析和UHPLC-UV表征，从而确定身分和纯度。色谱纯度(利用UHPLC-UV)是96.7％。
[0452] 1H NMR(400MHz,D2O):δ(ppm) ＝ 8.11(d,J ＝ 7.4Hz,2H),7.65(t,J＝ 7.4Hz,1H),7.56(t,J ＝ 7.7Hz,2H),7.43-7.37(m,4H),7.25(br t,J ＝
6.2Hz,1H),6.09(m,1H),5.61(d,J＝ 7.1Hz,1H),5.32(m,1H),5.27-5.24(m,2H),4.99(d,J＝8.1Hz,1H),4.22-4.13(m,3H),3.83(br d,J＝6.8Hz,1H),3.61(s,1H),3.21-3.09(m,2H),2.67-2.33(m,6H),2.23-2.17(m,1H),2.12-1.98(m,2H),1.97-1.76(m,5H),1.68(s,3H),
1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).
6.2Hz,1H),6.09(m,1H),5.61(d,J＝ 7.1Hz,1H),5.32(m,1H),5.27-5.24(m,2H),4.99(d,J＝8.1Hz,1H),4.22-4.13(m,3H),3.83(br d,J＝6.8Hz,1H),3.61(s,1H),3.21-3.09(m,2H),2.67-2.33(m,6H),2.23-2.17(m,1H),2.12-1.98(m,2H),1.97-1.76(m,5H),1.68(s,3H),
1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).
[0453] 13C NMR(100MHz,D2O):δ(ppm)＝211.22,173.26,172.48,170.57,167.58,157.22,138.72,136.13,134.48,129.96,129.29,129.00,128.77,126.95,84.49,80.87,78.51,76.55,75.55,75.04,74.26,72.65,71.28,57.39,55.59,50.32,48.78,46.29,42.83,42.68,35.25,34.73,30.13,29.83,29.60,27.51,25.900,23.69,22.43,20.75,18.77,16.78,13.60,9.55.
[0454] 元素分析∶基于TD-1+2HCl+1H2O计算：C,58.53；H,6.90；Cl,6.65；N,3.94；观测值∶C,58.50；H,6.97；Cl,6.58；N,4.13；HPLC/MS(m/z)；977.4(m+H),96.7％面积(UPLC-UV)。
[0455] TD1类似物
[0456] TD1含有氨基二羧酸酯(在O-2'处)，认为其通过邻基参与帮助母体化合物(多西紫杉醇)的定向释放。如下所述，合成一系列TD1类似物。该类似物的氨基-酰基连接基的链长和设计用来通过邻位协助调节酯水解速率的碱性氨基-酰基部分的结构具有变化(Pop等人，Pharmaceutical Research，13(3):469-475(1996)；Rautio等人，J.Med.Chem.,43(3):1489-1494(2000))，使得对于各种治疗应用能够精细调节母体化合物的释放速率。
[0457] 对于闭环反应，当反应中心是sp2杂化时，与在分子内部酯水解的情况下一样，3-7元环过渡状态(transition state)是有利的。有两种可能的水解模式∶模式A，其中胺直接对羰基起作用，形成母体药物和活化的酰基-铵中间体；和模式B，其中胺的作用与常规碱一样，增加溶剂(在这种情况下是水)的亲核性，由此提高水解速率，并放出两性离子氨基酸。下面合成的TD1类似物都可以利用模式A进行水解。只有较短的氨基酸酯(n＝1-3)允许利用模式B进行水解。
[0458] 在第一系列类似物中，弱碱性增溶单元包括哌嗪基氨基部分，其相对于TD1具有不同长度的烷基连接基。在下一个系列类似物中，使用相同的烷基连接基，且氨基部分是变化的，以包括吗啉代(morpholino)和哌啶基取代基。按照下列顺序，氨基部分在亲核性方面有变化∶N-甲基哌嗪>吗啉>哌啶(例如Baldwin,J.Chem.Soc.Chem.Commun.,734-736(1976)；Baldwin等人，J.Org.Chem.,42(24):3846-3852(1977))。碱性相反，N-甲基哌啶具有比N-甲基哌嗪高2个单位的pKa。因此，预计N-甲基哌嗪子基(piperazino)化合物对于模式A水解更敏感，并且需要较低的pH值以便实现质子化。
[0459] 氨基-酯的N-烷基化(一般方法)
[0460] 3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙酸叔丁酯
[0461]
[0462] 在0℃，将4-甲基哌嗪(7.68mL，70mmol，4当量)加入到3-溴丙酸叔丁基酯(3.0mL，18mmol)的乙酸乙酯(15mL)搅拌溶液中。在25℃搅拌溶液1小时，形成白色沉淀，而后在油浴中加热至55℃，保持2小时。TLC分析(20％EtOAc/己烷，Rf＝0.9(起始原料)，0.1(产物))表明溴化物试剂完全消耗。用EtOAc(100mL)稀释反应，转入分液漏斗中，用水(100mL)、NaHCO3(饱和，2x 100mL)、盐水(100mL)洗涤有机相，用MgSO4干燥，浓缩，得到淡黄色油状物。将该油状物溶于二氯甲烷(20mL)中，加载到预平衡过的硅胶填料上(20％EtOAc/己烷，150mL，SiO2)，且所需产物用极性渐增的洗脱液(EtOAc/己烷，起始于20％，
200mL体积，以15％增量增加，至100％)从二氧化硅洗脱。将含有所需物质的级分浓缩，得到3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙酸叔丁酯(4.1g，定量的)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)＝3.45(d,J＝3Hz,2H),2.64(t,J＝7.3Hz,2H),2.47(br s,6H),2.38(t,J＝7.3Hz,2H),
2.25(s,3H),1.42(s,9H)。
200mL体积，以15％增量增加，至100％)从二氧化硅洗脱。将含有所需物质的级分浓缩，得到3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙酸叔丁酯(4.1g，定量的)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)＝3.45(d,J＝3Hz,2H),2.64(t,J＝7.3Hz,2H),2.47(br s,6H),2.38(t,J＝7.3Hz,2H),
2.25(s,3H),1.42(s,9H)。
[0463] 使用相同的一般方法来制备下列类似物∶
[0464] 2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酸苄酯
[0465]
[0466] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)＝7.33-7.27(m,5H),5.15(s,2H),3.25(s,2H),2.60(br s,4H),2.48(br s,4H),2.27(s,3H).
[0467] 5-(4-甲基哌嗪-1-基)戊酸乙酯
[0468]1
[0469] H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)＝4.10(q,J＝7.2Hz,2H),2.43(br s,6H),2.35-2.28(m,4H),2.26(s,3H),1.79(br s,2H),1.62(p,J＝7.2Hz,2H),1.54-1.46(m,2H),1.23(t,7.2Hz)。
[0470] 2-吗啉代乙酸苄酯
[0471]
[0472] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm) ＝ 7.46-7.30(m,5H),5.16(s,2H),3.74(t,J ＝4.7Hz,4H),3.25(s,2H),2.58(t,J＝4.7Hz,4H)。
[0473] 3-吗啉代丙酸叔丁酯
[0474]
[0475] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm) ＝ 3.68(t,J ＝ 4.5,$H),2.63(t,J ＝7.3Hz,2H),2.44(t,J＝4.5Hz,4H),2.39(t,J＝7.3Hz,2H),1.44(s,9H)。
[0476] 4-吗啉代丁酸乙酯
[0477]1
[0478] H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)＝4.11(q,J＝7.1Hz,2H),3.68(t,j＝4.7Hz,4H),2.42-2.38(m,4H),2.37-2.31(m,4H),1.80(p,J＝7.3Hz,2H),1.24(q,J＝7.1Hz,3H)。
[0479] 5-吗啉代戊酸乙酯
[0480]
[0481] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)＝4.11(q,J＝7.1Hz,2H),3.68(t,j＝4.7Hz,4H),2.42-2.38(m,4H),2.37-2.27(m,4H),1.80-1.73(m,2H),1.53-1.45(m,2H),1.24(q,J ＝7.1Hz,3H)。
[0482] 氨基酸水解(一般方法)
[0483] 3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙酸盐酸盐(TD11)
[0484]
[0485] 向含有3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙酸叔丁酯(4.1g，18mmol)的圆底烧瓶中加入磁性搅拌棒、水(20mL)和HCl(10M，20mL，10当量)。使烧瓶配备回流冷凝器，放入油浴中，并加热到110℃的浴温，保持3小时。不进行该反应的TLC分析。从油浴中移开反应，并冷却至室温。一旦反应充分冷却，将其转入旋转蒸发器中，其中旋转蒸发器连接油驱动的高真空泵。将烧瓶的内含物浓缩，直到压力是0.1mm Hg并且只剩余油性残余物为止。然后移开烧瓶，将内含物再溶于蒸馏水中，重复蒸发过程，这次得到浆液，当脱水之后处于高真空条件下时，其形成泡沫体。应注意，如果粗品含有大量残留的HCl，当进行下列结晶条件时，酸将会再酯化，不利地影响产率。加入乙醇(50mL)和磁性搅拌棒，并将烧瓶浸在85℃油浴中，以便溶解浆液。即使在回流条件下，不是所有物质都溶解，因此，逐滴加入少量的水(～1mL)，直到所有的固体溶解为止。如果在这时候加入过量的水，将会不利地影响产率。
[0486] 将得到的溶液从油浴中移开，在室温下静置3小时，而后转入冰箱(5℃)中，保持16小时。通过超声处理使固体悬浮，以便使它们从烧瓶的侧面松散开，并过滤到衬在布氏漏斗上的滤纸上。然后将晶体转入预先称量的小瓶中，小瓶放置在干燥器中(用Drierite，高真空)16小时，得到固体、空气稳定的、结晶和不吸湿的物质(3.07g，1
82 ％，基 于 单 HCl盐 )。H NMR(D2O,400MHz)δ(ppm) ＝3.6(br s,8H),3.48(t,J ＝
6.8Hz,2H),2.93(s,3H),2.83(t,J＝6.8Hz,2H)。
82 ％，基 于 单 HCl盐 )。H NMR(D2O,400MHz)δ(ppm) ＝3.6(br s,8H),3.48(t,J ＝
6.8Hz,2H),2.93(s,3H),2.83(t,J＝6.8Hz,2H)。
[0487] 使用相同的一般方法来制备下列类似物∶
[0488] 2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酸盐酸盐(TD2)
[0489]
[0490] 1H NMR(D2O,400MHz)δ(ppm)＝3.87(s,2H),3.85-3.35(br m,8H),2.93(s,3H)。
[0491] 5-(4-甲基哌嗪-1-基)戊酸盐酸盐(TD3)
[0492]
[0493] 1H NMR(D2O,400MHz)δ(ppm) ＝ 3.59(br s,8H),3.22(t,J ＝7.8Hz,2H),2.93(s,3H),2.36(t,J＝7.2Hz,2H),1.75-1.69(m,2H),1.57(p,J＝7.8Hz)。
[0494] 4-吗啉代丁酸盐酸盐(TD4)
[0495]
[0496] 1H NMR(D2O,400MHz)δ(ppm) ＝ 4.02(br d,J ＝ 12.3Hz,2H),3.73(br t,J ＝ 12.3Hz,2H),3.46(br d,J ＝ 12.3Hz,2H),3.15-3.06(m,4H),2.41(t,J ＝7.1Hz,2H),1.97-1.89(m,2H)。
[0497] 2-吗啉代乙酸盐酸盐(TD5)
[0498]1
[0499] H NMR(D2O,400MHz)δ(ppm)＝4.10-3.70(m,6H),3.50(br s,2H),3.2(brs,2H)。
[0500] 3-吗啉代丙酸盐酸盐(TD6)
[0501]
[0502] 1H NMR(D2O,400MHz)δ(ppm) ＝ 4.02(br d,J ＝ 12.3Hz,2H),3.73(br t,J＝ 12.3Hz,2H),3.46(br d,J ＝ 12.3Hz,2H),3.39(t,J ＝ 7.0Hz,2H),3.13(br t,J ＝12.3Hz,2H),2.79(t,J＝7.0Hz,2H)。
[0503] 5-吗啉代戊酸盐酸盐(TD12)
[0504]
[0505] 1H NMR(D2O,400MHz)δ(ppm) ＝ 4.02(br d,J ＝ 12.3Hz,2H),3.73(br t,J ＝12.3Hz,2H),3.46(br d,J＝12.3Hz,2H),3.15-3.06(m,4H),2.41(t,J＝7.1Hz,2H),1.72-
1.66(m,2H),1.60-1.52(m,2H)。
1.66(m,2H),1.60-1.52(m,2H)。
[0506] 4-(哌啶-1-基)丁酸盐酸盐(TD7)
[0507]
[0508] 1H NMR(D2O,400MHz)δ(ppm)＝3.43(br d,J＝12.1Hz,2H),3.04-2.99(m,2H),2.88(td,J＝2.7,12.1Hz,2H),2.38(t,J＝7.1Hz,2H),1.95-1.80(m,4H),1.76-1.55(m,3H),1.45-1.32(m,1H)。
[0509] 2-(哌啶-1-基)乙酸盐酸盐(TD8)
[0510]
[0511] 5-(哌啶-1-基)戊酸盐酸盐(TD9)
[0512]
[0513] 1H NMR(D2O,400MHz)δ(ppm)＝3.43(br d,J＝12.1Hz,2H),3.04-2.99(m,2H),2.80(td,J＝2.7,12.1Hz,2H),2.38(t,J＝7.1Hz,2H),1.88-1.78(m,2H),1.76-1.49(m,7H),1.45-1.32(m,1H)。
[0514] 3-(哌啶-1-基)丙酸盐酸盐(TD13)
[0515]
[0516] 1H NMR(D2O,400MHz)δ(ppm) ＝ 3.43(br d,J ＝ 12.1Hz,2H),3.29(t,J ＝7.1Hz,2H),2.88(td,J＝2.7,12.1Hz,2H),2.76(t,J＝7.1Hz,2H),1.85-1.80(m,2H),1.76-1.62(m,3H),1.45-1.32(m,1H)。
[0517] 2’-O-酰化(一般方法)
[0518] TD4∶吗啉代丁酸酯
[0519]
[0520] 在25mL圆底烧瓶中，将4-吗啉代丁酸盐酸盐(0.095g，0.45mmol，1.2当量)在吡啶(4mL)和DBU(0.140mL，3当量)中的搅拌溶液在0℃冰浴中冷却，并加入乙腈(2mL)，而后加入 (0.303g，0.375mmol，1当量)。用15分钟分几份加入1-乙基-3-(3'-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI，0.180g，2.5当量)。将得到的悬浮液搅拌，随着冰浴融化经
16小时的时间逐渐地升温至室温。在这时候，TLC分析(EtOAc中的30％己烷/6％MeOH(用
5％NH4OH终止(spiked))显示几乎完全转化。加入乙醇(2mL)，并将烧瓶转入旋转蒸发器中，高真空浓缩。将得到的油状物再溶于乙醇中，再次浓缩。将干燥残余物溶于二氯甲烷(～4mL)中，并加载到预平衡过的硅胶柱(60mL硅胶，EtOAc中的30％己烷/2％MeOH(用
5％NH4OH终止))上，用极性渐增的溶剂混合物洗脱(2-8％MeOH，2％增量，100mL/增量)。
收集含有所需物质的级分，浓缩，得到所需化合物(0.255g，71％)。
16小时的时间逐渐地升温至室温。在这时候，TLC分析(EtOAc中的30％己烷/6％MeOH(用
5％NH4OH终止(spiked))显示几乎完全转化。加入乙醇(2mL)，并将烧瓶转入旋转蒸发器中，高真空浓缩。将得到的油状物再溶于乙醇中，再次浓缩。将干燥残余物溶于二氯甲烷(～4mL)中，并加载到预平衡过的硅胶柱(60mL硅胶，EtOAc中的30％己烷/2％MeOH(用
5％NH4OH终止))上，用极性渐增的溶剂混合物洗脱(2-8％MeOH，2％增量，100mL/增量)。
收集含有所需物质的级分，浓缩，得到所需化合物(0.255g，71％)。
[0521] 1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm)＝8.11(d,J＝7.4Hz,2H),7.71-7.48(m,3H),7.48-7.31(m,4H),7.25(m,1H),6.09(m,1H),5.63(d,J＝ 7.1Hz,1H),5.40-5.16(m,3H),4.99(d,J＝8.1Hz,1H),4.28-4.13(m,3H),3.86(br d,J＝6.8Hz,1H),3.64(m,4H),2.67-2.10(m,14H),1.99-1.72(m,7H),1.68(s,3H),1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).
[0522] 从EtOAc/己烷将该物质重结晶，并用于生物学和溶解度试验。重结晶之后，HPLC/MS(m/z)；963.2(m+H)99.8％面积(通过UV)。
[0523] 使用相同的一般方法来形成下列类似物∶
[0524] TD2∶N-甲基-哌嗪基乙酸酯
[0525]
[0526] 1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm) ＝ 8.11(d,J ＝ 7.4Hz,2H),7.66(t,J ＝7.4Hz,1H),7.57(t,J ＝ 7.7Hz,2H),7.41(m,4H),7.25(m,1H),6.08(m,1H),5.62(d,J ＝
7.1Hz,1H),5.42(d,2H),5.27(s,1H),4.99(d,J ＝ 8.1Hz,1H),4.29-4.13(m,3H),3.85(br d,J ＝ 6.8Hz,1H),3.42-3.33(m,3H),2.71-2.27(m,16H),2.03(q,1H),1.92(s,3H),1.89-1.79(m,1H),1.68(s,3H),1.39(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；
949.4(m+H)95％面积(通过UV)。
7.1Hz,1H),5.42(d,2H),5.27(s,1H),4.99(d,J ＝ 8.1Hz,1H),4.29-4.13(m,3H),3.85(br d,J ＝ 6.8Hz,1H),3.42-3.33(m,3H),2.71-2.27(m,16H),2.03(q,1H),1.92(s,3H),1.89-1.79(m,1H),1.68(s,3H),1.39(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；
949.4(m+H)95％面积(通过UV)。
[0527] TD3∶N-甲基-哌嗪基戊酸酯
[0528]1
[0529] H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm) ＝ 8.11(d,J ＝ 7.4Hz,2H),7.66(t,J ＝7.4Hz,1H),7.57(t,J ＝ 7.7Hz,2H),7.41(m,4H),7.25(m,1H),6.08(m,1H),5.62(d,J ＝
7.1Hz,1H),5.37-5.18(m,3H),4.99(d,J ＝ 8.1Hz,1H),4.29-4.13(m,3H),3.85(d,J ＝
6.8Hz,1H 1H),3.63-3.48(m,5H),2.80-2.27(m,24H),2.27-2.13(m,1H),2.03(q,2H),1.97-1.54(m,19H),1.57-1.49(br m,H),1.39(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；
990.6(m+H)96％面积(通过UV)。
7.1Hz,1H),5.37-5.18(m,3H),4.99(d,J ＝ 8.1Hz,1H),4.29-4.13(m,3H),3.85(d,J ＝
6.8Hz,1H 1H),3.63-3.48(m,5H),2.80-2.27(m,24H),2.27-2.13(m,1H),2.03(q,2H),1.97-1.54(m,19H),1.57-1.49(br m,H),1.39(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；
990.6(m+H)96％面积(通过UV)。
[0530] TD5∶吗啉代乙酸酯
[0531]
[0532] 1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm) ＝ 8.12(d,J ＝ 7.4Hz,2H),7.64(t,J ＝ 7.4Hz,1H),7.59-7.50(m,2H),7.44-7.34(m,4H),7.32-7.20(m,1H),6.16(m,1H),5.64(d,J ＝7.1Hz,1H),5.42(br d,2H),5.27(s,1H),5.01(d,J＝8.1Hz,1H),4.27-4.15(m,3H),3.89(d,J＝ 6.8Hz,1H),3.71-3.58(m,4H),3.38(d,1H),2.54-2.26(m,9H),2.12-2.01(m,1H),1.
92(s,3H),1.87-1.76(m,1H),1.69(s,3H),),1.39(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；936.1(m+H)98％面积(通过UV)。
92(s,3H),1.87-1.76(m,1H),1.69(s,3H),),1.39(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；936.1(m+H)98％面积(通过UV)。
[0533] TD6∶吗啉代丙酸酯
[0534]
[0535] 1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm)＝8.11(d,J＝7.4Hz,2H),7.66(t,J＝7.4Hz,1H),7.61-7.50(m,2H),7.45-7.33(m,4H),7.30-7.20(m,1H),6.09(m,1H),5.63(d,J＝ 7.1Hz,1H),5.39-5.16(m,3H),5.00(d,J＝8.1Hz,1H),4.27-4.13(m,3H),3.86(d,J＝6.8Hz,1H),
3.70-3.54(m,4H),2.72-2.56(m,4H),2.52-2.29(m,8H),2.29-2.14(m,1H),1.99-1.86(m,4H),1.86-1.75(m,2H),1.68(m,13H),1.39(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；
950.9(m+H)94％面积(通过UV)。
3.70-3.54(m,4H),2.72-2.56(m,4H),2.52-2.29(m,8H),2.29-2.14(m,1H),1.99-1.86(m,4H),1.86-1.75(m,2H),1.68(m,13H),1.39(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；
950.9(m+H)94％面积(通过UV)。
[0536] TD8∶哌啶基乙酸酯
[0537]
[0538] 1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm) ＝ 8.16(d,J ＝ 7.4Hz,2H),7.63(t,J ＝7.4Hz,1H),7.54(t,J＝ 7.7Hz,2H),7.44-7.34(m,4H),7.27(m,1H),6.17(m,1H),5.65(d,J＝ 7.1Hz,1H),5.49-5.38(m,2H),5.28(s,1H),5.01(d,J ＝ 8.1Hz,1H),4.24-4.15(m,3H),
3.90(d,J ＝ 6.8Hz,1H),3.36-3.32(m,1H),3.19-3.11(m,1H),2.57-2.25(m,9H),2.16-2.
06(m,1H),1.92(s,3H),1.87-1.76(m,1H),1.69(s,3H),1.65-1.50(m,4H),1.40-1.22(m,1
1H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；933.8(m+H)94％面积(通过UV)。
3.90(d,J ＝ 6.8Hz,1H),3.36-3.32(m,1H),3.19-3.11(m,1H),2.57-2.25(m,9H),2.16-2.
06(m,1H),1.92(s,3H),1.87-1.76(m,1H),1.69(s,3H),1.65-1.50(m,4H),1.40-1.22(m,1
1H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；933.8(m+H)94％面积(通过UV)。
[0539] TD7∶哌啶基丁酸酯
[0540]
[0541] 1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm) ＝ 8.11(d,J ＝ 7.4Hz,2H),7.65(t,J ＝7.4Hz,1H),7.56(t,J ＝ 7.7Hz,2H),7.44-7.33(m,4H),7.29-7.20(m,1H),6.09(m,1H),5.63(d,J ＝ 7.1Hz,1H),5.36-5.30(m,1H),5.29-5.26(m,2H),5.03-4.95(m,1H),4.27-4.14(m,3H),3.86(d,J ＝ 6.8Hz,1H),2.59-2.16(m,15H),2.01-1.75(m,8H),1.68(s,3H),1.64-1.54(m,5H),1.47(m,3H),1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；
962.5(m+H)94％面积(通过UV)。
962.5(m+H)94％面积(通过UV)。
[0542] TD9∶哌啶基戊酸酯
[0543]
[0544] 1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm) ＝ 8.11(d,J ＝ 7.4Hz,2H),7.66(,J＝ 7.4Hz,1H),7.57(t,J ＝ 7.7Hz,2H),7.45-7.33(m,4H),7.25(br
s,1H),6.08(m,1H),5.62(d,J ＝ 7.1Hz,1H),5.31(m,1H),5.28-5.18(m,2H),4.99(d,J ＝
8.1Hz,1H),4.27-4.15(m,3H),3.85(d,J ＝ 6.8Hz,1H),2.51-2.18(m,17H),1.97-1.75(m,5H),1.75-1.46(m,20H),1.43-1.38(m,10H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；
976.2(m+H)96％面积(通过UV)。
s,1H),6.08(m,1H),5.62(d,J ＝ 7.1Hz,1H),5.31(m,1H),5.28-5.18(m,2H),4.99(d,J ＝
8.1Hz,1H),4.27-4.15(m,3H),3.85(d,J ＝ 6.8Hz,1H),2.51-2.18(m,17H),1.97-1.75(m,5H),1.75-1.46(m,20H),1.43-1.38(m,10H),1.15(s,3H),1.11(s,3H).HPLC/MS(m/z)；
976.2(m+H)96％面积(通过UV)。
[0545] 7-OH酰化(一般方法)
[0546] 保护∶GCW00006-09
[0547]
[0548] 向多西紫杉醇(0.746g，0.923mmol)的二氯甲烷(20mL)和吡啶(1.6mL)的搅拌的冷却(-45℃)溶液中逐滴加入氯甲酸三氯乙酯(Troc-Cl，0.137mL，1.01mmol，1.1当量)。在降低温度下搅拌反应1小时，并逐滴加入第二个等份的Troc-Cl(0.137mL，1.01mmol，
1.1当量)。在搅拌下，用接下来的16小时时间使反应逐渐地升温至室温。这时，TLC分析(30％EtOAc/己烷)指示了最小量的剩余起始原料，并且形成三个新斑点，推测它们是
2',10-二-Troc、2',7-二-Troc和2',7,10-三-Troc保护的化合物。用最小量的乙醇稀释反应，并在高真空配备的旋转蒸发器上浓缩至干。然后将残余物溶于最小量的CH2Cl2中，并加载到预平衡过的硅胶柱(3cm x 20cm，20％EtOAc/己烷)上。使用极性渐增的溶剂混合物(20-60％EtOAc在己烷中的溶液，100mL体积，5％增量)从柱中小心地洗脱所需产物，并收集和浓缩纯净的级分，得到所需异构体，其为无定形白色固体(0.433g，40％)。
1.1当量)。在搅拌下，用接下来的16小时时间使反应逐渐地升温至室温。这时，TLC分析(30％EtOAc/己烷)指示了最小量的剩余起始原料，并且形成三个新斑点，推测它们是
2',10-二-Troc、2',7-二-Troc和2',7,10-三-Troc保护的化合物。用最小量的乙醇稀释反应，并在高真空配备的旋转蒸发器上浓缩至干。然后将残余物溶于最小量的CH2Cl2中，并加载到预平衡过的硅胶柱(3cm x 20cm，20％EtOAc/己烷)上。使用极性渐增的溶剂混合物(20-60％EtOAc在己烷中的溶液，100mL体积，5％增量)从柱中小心地洗脱所需产物，并收集和浓缩纯净的级分，得到所需异构体，其为无定形白色固体(0.433g，40％)。
[0549] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)＝8.11(d,2H),7.61(t,1H),7.51(t,2H),7.45-7.33(m,5H),6.29(m,1H),6.16(s,1H),5.69(d,1H),5.59-5.56(m,1H),5.55-5.42(m,2H),5.3
5(br s,1H),4.96(br d,1H),4.89(d,1H),4.76(q,2H),4.69(d,1H),4.41-4.37(m,1H),4.3
2(d,1H),4.18(d,1H),3.96-3.91(m,3H),3.78(d,1H),2.61-2.53(m,1H),2.43(s,3H),2.39-2.18(m,3H),2.11-1.76(m,11H),1.73(br s,1H),1.69(s,3H),1.32(s,9H),1.28-1.17(m,
6H)。
5(br s,1H),4.96(br d,1H),4.89(d,1H),4.76(q,2H),4.69(d,1H),4.41-4.37(m,1H),4.3
2(d,1H),4.18(d,1H),3.96-3.91(m,3H),3.78(d,1H),2.61-2.53(m,1H),2.43(s,3H),2.39-2.18(m,3H),2.11-1.76(m,11H),1.73(br s,1H),1.69(s,3H),1.32(s,9H),1.28-1.17(m,
6H)。
[0550] 使用相同的一般方法来形成下列类似物∶
[0551] 酯化∶GCW00006-10
[0552]
[0553] 向含有4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酸盐酸盐(0.58g，2.61mmol)和磁性搅拌棒的圆底烧瓶中加入亚硫酰氯(15mL)。将得到的溶液回流加热1.5小时，冷却至室温，在旋转蒸发器上浓缩，悬浮在无水甲苯(10mL)中，在旋转蒸发器再次浓缩，得到白色固体，并在高真空管中干燥3小时，达到稳定的重量，其不放出亚硫酰氯或盐酸的气味。
[0554] 向GCW00006-09(0.433g，0.375mmol)的二氯甲烷(Dri-Solve，8mL)溶液(包括磁力搅拌器)中加入N,N-二甲基氨基-吡啶(DMAP，0.229g，5当量)。将该溶液冷却至0℃，用几分种时间分几份加入上述氨基酰基氯盐酸盐(0.100g，1.1当量)。基于对起始原料消耗的TLC分析，进行随后的反应，因为DMAP倾向于与单-氨基酰化产物共同洗脱。2小时之后，通过TLC还观察到一些剩余起始原料，加入额外部分的氨基-酰基氯盐酸盐(0.05g，0.55当量)。在室温下额外搅拌一个小时之后，TLC显示几乎完全消耗了起始原料。在旋转蒸发器上浓缩反应，得到油状物，将油状物溶于最小量的CH2Cl2(5mL)中，并加载到预平衡过的硅胶柱(3cm x 20cm，4:1CH2Cl2/己烷)上，进行快速色谱(4:1CH2Cl2/己烷(含有1-10％MeOH(包含5％NH4OH)))。收集含有所需物质的级分，浓缩，得到无色玻璃状物(0.284g，57％)。
[0555] 1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm) ＝ 8.11(d,J ＝ 7.5Hz,2H),7.61(t,J ＝7.7Hz,1H),7.51(t,J ＝ 7.7Hz,2H),7.43-7.39(m,4H),7.28-7.26(m,1H),6.13-6.05(m,
2H),5.64(d,J ＝ 6.8Hz,1H),5.60-5.56(m,1H),5.55-5.42(m,2H),5.36-5.34(m,1H),4.
99(d,J ＝ 6.8Hz,1H),4.92(d,J ＝ 11.2Hz,1H),4.83(d,J ＝ 11.2Hz,1H),4.19(dd,J ＝
8.2,19.0Hz,1H),3.85(d,J ＝ 6.3Hz,1H),2.67-2.22(m,20H),2.05-1.89(m,4H),1.82-1.
71(m,6H),1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H)..HPLC/MS(m/z)；1325.7(m+H)83 ％面 积(通过UV)(被10％碳酸甲酯污染(m/z＝1210.4))。
2H),5.64(d,J ＝ 6.8Hz,1H),5.60-5.56(m,1H),5.55-5.42(m,2H),5.36-5.34(m,1H),4.
99(d,J ＝ 6.8Hz,1H),4.92(d,J ＝ 11.2Hz,1H),4.83(d,J ＝ 11.2Hz,1H),4.19(dd,J ＝
8.2,19.0Hz,1H),3.85(d,J ＝ 6.3Hz,1H),2.67-2.22(m,20H),2.05-1.89(m,4H),1.82-1.
71(m,6H),1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.11(s,3H)..HPLC/MS(m/z)；1325.7(m+H)83 ％面 积(通过UV)(被10％碳酸甲酯污染(m/z＝1210.4))。
[0556] 脱保护以形成TD10∶7-O-(N-甲基-哌嗪基丁酸酯)
[0557]
[0558] 向GCW00006-10(0.276g，0.2mmol)的甲醇和乙酸(50mL，10％乙酸)的剧烈搅拌溶液中加入元素锌粉(～0.1g)。用TLC监控反应，在1小时之内所有起始原料已经消耗，并且转变为单一的在下面运行的斑点(10％MeOH(w5％NH4OH)/CH2Cl2)。用MeOH(50mL)稀释该反应，并在衬在布氏漏斗上的滤纸上过滤。将得到的溶液在旋转蒸发器上浓缩至干，得到浓浆液，将其溶于CH2Cl2(5mL)中，并加载到预平衡过的硅胶柱(3cm x 15cm，2％MeOH(w5％NH4OH)/CH2Cl2)上，用极性渐增的溶剂洗脱(2-10％MeOH(w 5％NH4OH)/CH2Cl2，2％增量，150mL/增量)。收集包含纯净物质的级分(用TLC确定)，浓缩，得到白色固体(0.0764，
39％)。HPLC/MS显示微小的污染(～10％)(在母体化合物的未确定位置上包含甲基碳酸酯取代基)。
39％)。HPLC/MS显示微小的污染(～10％)(在母体化合物的未确定位置上包含甲基碳酸酯取代基)。
[0559] (m/z ＝ 1035.3)1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm) ＝ 8.12(d,J ＝7.5Hz,2H),7.68(t,J ＝ 7.7Hz,1H),7.58(t,J ＝ 7.7Hz,2H),7.43-7.39(m,4H),7.28-7.2
6(m,1H),6.13-6.05(m,2H),5.67(d,J ＝ 6.8Hz,1H),5.60-5.56(m,1H),5.38(s,1H),5.14(br s,1H),5.01(d,J＝6.8Hz,1H),4.52(br s,1H),3.98(d,J＝ 6.3Hz,1H),2.67-2.22(m,18H),2.10-1.71(m,10H),1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.12(s,3H).13C NMR(100MHz,CD3OD)δ(ppm) ＝ 209.32,173.04,172.30,170.61,166.25,156.36,145.92,139.27,138.27,136.40,133.20,129.98,129.78,128.31,128.19,127.38,126.83,83.70,80.46,79.32,77.75,76.12,74.86,74.24,74.03,71.68,71.00,57.16,57.00,56.14,54.18,52.14,46.06,44.
51,42.98,37.97,35.41,32.98,31.33,31.19,27.30,25.39,21.69,21.43,21.28,20.17.HPLC/MS(m/z)；977.1(m+H)85％面积(通过UV)。
6(m,1H),6.13-6.05(m,2H),5.67(d,J ＝ 6.8Hz,1H),5.60-5.56(m,1H),5.38(s,1H),5.14(br s,1H),5.01(d,J＝6.8Hz,1H),4.52(br s,1H),3.98(d,J＝ 6.3Hz,1H),2.67-2.22(m,18H),2.10-1.71(m,10H),1.40(s,9H),1.15(s,3H),1.12(s,3H).13C NMR(100MHz,CD3OD)δ(ppm) ＝ 209.32,173.04,172.30,170.61,166.25,156.36,145.92,139.27,138.27,136.40,133.20,129.98,129.78,128.31,128.19,127.38,126.83,83.70,80.46,79.32,77.75,76.12,74.86,74.24,74.03,71.68,71.00,57.16,57.00,56.14,54.18,52.14,46.06,44.
51,42.98,37.97,35.41,32.98,31.33,31.19,27.30,25.39,21.69,21.43,21.28,20.17.HPLC/MS(m/z)；977.1(m+H)85％面积(通过UV)。
[0560] 实施例3-水溶性的泼尼松衍生物
[0561] N-甲基-哌嗪基-丁酸酯
[0562] 连接基合成
[0563]
[0564] 将4-溴丁酸乙酯(5.75g，29.5mmol；Aldrich No.167118)和1-甲基哌 嗪(3.55mL，32.0mmol；Aldrich No.130001)和无水K2CO3(4.5g，32.5mmol；Fisher No.P208)在乙腈(MeCN，150mL)中的混合物回流18小时，而后真空浓缩。然后分离有机层，用二氯甲烷(DCM，3x 150mL)萃取水层。用水(150mL)洗涤合并的有机萃取物，干燥(Na2SO4)，真空浓缩，得到4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酸乙酯(6.01g，96％)的黄色油状物。
[0565] 1H NMR(CDCl3):4.03(q,2H,J＝7.15Hz),2.29-2.44(m,7H),2.21-2.28(m,5H),2.18(s,3H),1.67-1.75(m,2H),1.18(t,3H,J＝7.14Hz)
[0566] 13C NMR(CDCl3):174.4,61.1,58.5,56.1,54.0,47.0,33.2,23.1,15.2
[0567] ESI-MS:215.1[M+H]+；237.2[M+Na]+
[0568]
[0569] 向4-4(甲基哌嗪-1-基)丁酸乙酯(6.01g，28.1mmol)的四氢呋喃(THF，150mL)溶液中加入NaOH(1.20g，30mmol)在水(150mL)中的溶液。在室温搅拌混合物18小时，而后浓缩至干，得到4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酸钠(6.06g，定量)的白色粉末。
[0570] 13C NMR(MeOH-d4):181.0,58.2,54.2,52.4,44.8,35.7,23.2
[0571] ESI-MS:187.3[M+H]+；209.2[M+Na]+
[0572] 酯化
[0573]
[0574] 向4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酸钠(128mg，0.615mmol)和泼尼松(200mg，0.559mmol)的乙腈(MeCN，10mL)悬浮液中加入2-氯-1-甲基-吡啶鎓碘化物(235mg，
0.922mmol；Aldrich No.198005)。将得到的悬浮液在室温搅拌18小时，而后用水(30mL)淬灭。然后用乙酸乙酯(EtOAc，4x 20mL)萃取产物，用饱和NaHCO3水溶液(3x 20mL)和盐水(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，真空浓缩。在硅胶柱上进行进一步纯化(溶剂∶1％NH4OH，
10％MeOH，89％二氯甲烷)，得到衍生化泼尼松的游离碱(108mg，36％)的白色固体。
0.922mmol；Aldrich No.198005)。将得到的悬浮液在室温搅拌18小时，而后用水(30mL)淬灭。然后用乙酸乙酯(EtOAc，4x 20mL)萃取产物，用饱和NaHCO3水溶液(3x 20mL)和盐水(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，真空浓缩。在硅胶柱上进行进一步纯化(溶剂∶1％NH4OH，
10％MeOH，89％二氯甲烷)，得到衍生化泼尼松的游离碱(108mg，36％)的白色固体。
[0575] 1H NMR(CDCl 3):7.64(d,1H,J ＝ 10.40),6.08(dd,1H,J ＝10.40,1.90),6.06(t,1H,J ＝ 2.90),5.06(ABq,2H,J ＝ 94.78,17.81),2.85(d,1H,J ＝
12.32),2.65(t,1H,J ＝ 12.57),2.56–1.06(CM,32H),2.16(s,3H),1.34(s,3H),0.57(s,
3H)
12.32),2.65(t,1H,J ＝ 12.57),2.56–1.06(CM,32H),2.16(s,3H),1.34(s,3H),0.57(s,
3H)
[0576] 13C NMR(CDCl3):209.17,205.05,186.61,172.86,167.44, 155.93,127.29,124.31,88.18,67.78,60.05,57.30, 54.92,52.73,51.28,49.97,49.56,45.89,42.47,36.00,34.47,33.64,32.23,31.63,23.21,21.93,18.68,15.30
[0577] MS:527.4[M+H]+
[0578] N-甲基-哌嗪基乙酸酯
[0579] 连接基合成
[0580]
[0581] 将2-溴乙酸乙酯(4.93g，29.5mmol)、1-甲基哌嗪(3.55mL，32.0mmol；Aldrich No.130001)和K2CO3(4.5g，32.5mmol；Fisher No.P208)在CH3CN(150mL)中的混合物回流18小时，而后真空浓缩。然后分离有机层，用DCM(3x 150mL)萃取水层。用水(150mL)洗涤合并的有机萃取物，干燥(Na2SO4)，真空浓缩，得到4-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酸乙酯(5.26g，96％)的黄色油状物。
[0582] 1H NMR(CDCl3):3.76(q,2H,J＝7.14Hz),2.76(s,3H),2.30-1.90(br,4H),0.85(t,3H,J＝7.14Hz)
[0583] 13C NMR(CDCl3):169.55,59.90,58.93,54.44,53.26,52.47,45.59,13.84[0584] ESI-MS:187[M+H]+
[0585]
[0586] 向2-4(甲基哌嗪-1-基)乙酸乙酯(5.26g，28.3mmol)的THF(150mL)溶液中加入NaOH(1.20g，30mmol)在水(150mL)中的溶液。在室温搅拌混合物18小时，而后浓缩至干，得到4-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酸钠(5.24g，定量)白色粉末。13
[0587] C NMR(MeOH-d4):169.55,59.90,58.93,54.44,52.47,45.59+ +
[0588] ESI-MS:187.3[M+H]；209.2[M+Na]
[0589] 酯化
[0590]
[0591] 向2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酸钠(111mg，0.615mmol)和泼尼松(200mg，0.559mmol)的CH3CN(10mL)悬浮液中加入2-氯-1-甲基-吡啶鎓碘化物(235mg，
0.922mmol；Aldrich No.198005)。将得到的悬浮液在室温搅拌18小时，而后用水(30mL)淬灭。然后用EtOAc(4x 20mL)萃取产物，用饱和NaHCO3水溶液(3x 20mL)和盐水(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，真空浓缩。在硅胶柱上进行进一步纯化(溶剂∶1％NH4OH，10％MeOH，
89％DCM)，得到衍生化的泼尼松(154mg，38％)白色固体。
0.922mmol；Aldrich No.198005)。将得到的悬浮液在室温搅拌18小时，而后用水(30mL)淬灭。然后用EtOAc(4x 20mL)萃取产物，用饱和NaHCO3水溶液(3x 20mL)和盐水(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，真空浓缩。在硅胶柱上进行进一步纯化(溶剂∶1％NH4OH，10％MeOH，
89％DCM)，得到衍生化的泼尼松(154mg，38％)白色固体。
[0592] 1H NMR(CDCl 3):7.71(d,1H,J ＝ 10.28),6.19(dd,1H,J ＝10.24,1.96),6.07(t,1H,J＝1.93),4.93(ABq,2H,J＝124.45,17.56),3.33(s,1H),2.89(d,1H,J＝13.36),2.84–1.17(CM,32H),2.27(s,3H),1.43(s,3H),0.66(s,3H)
[0593] 13C NMR(CDCl3):208.88,204.58,186.58,169.85,167.06, 155.68,127.49,124.50,88.38,67.96,60.22,59.01, 54.73,53.42,52.71,51.43,49.67,49.56,46.00,42.45,36.06,34.79,33.73,32.25,23.26,18.75,15.45
[0594] MS:449.3[M+H]+
[0595] 实施例4-亲脂性的泼尼松衍生物
[0596] 内部亚油基(linoleyl)连接基
[0597] 1-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-3-(二甲基氨基)丙-2-醇
[0598] 将3-(二甲基氨基)-丙二醇(98％，1.00g，8.39mmol，1.0当量)和咪唑(0.57g，8.39mmol，1.0当量)的无水二氯甲烷(10mL)溶液在0℃、在氩气氛围中搅拌15分钟。将固体叔丁基二甲基甲硅烷基氯(1.26g，8.39mmol，1.0当量)加入到混合物中，并将生成物在0℃搅拌2小时。然后用20mL二氯甲烷稀释混合物，并倒入去离子水(15mL)中。分离有机层，用两个额外部分的二氯甲烷(20mL)萃取水层。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到粗品1-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-3-(二甲基氨基)丙-2-醇、浓的澄清油状物，其不用进一步纯化就可以使用。
[0599]
[0600] 1H NMR:3.72-3.80(m,1H),3.63(d,2H,J＝5.19),2.34-2.46(m,2H),2.33(s,6H),0.91(2,9H),0.08(s,6H)
[0601] 3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-N,N-二甲基-2-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丙-1-胺
[0602] 在0℃，在氩气氛围中，将粗1-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-3-(二甲基氨基)丙-2-醇(1.0g，4.29mmol，1.0当量)的甲苯(10mL)溶液小心地逐滴加入到NaH(60％，0.17g，4.29mmol，1.0当量)的甲苯悬浮液(5mL)中，并搅拌所得物15分钟。将亚油基甲磺酸酯(linoleyl methanesulfonate)(1.47g，4.29mmol，1.0当量)的甲苯溶液(5mL)逐滴加入到搅拌混合物中，然后在90℃搅拌反应18小时。然后将混合物冷却至室温，通过缓慢加入乙醇(10mL)来淬灭。然后浓缩混合物，用去离子水(15mL)吸收残余物，并用EtOAc(20mL)萃取三次。用去离子水(15mL)洗涤合并的有机萃取物，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。色谱纯化残余物(0-5％MeOH/氯仿)，得到109mg(53％产率)的3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-N,N-二甲基-2-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丙-1-胺稠澄清油状物。
[0603]1
[0604] H NMR:5.28-5.42(m,4H),3.47-3.62(m,4H),3.37-3.42(m,1H),2.77(t,2H,J ＝5.94),2.28-2.47(m,2H),2.25(s,6H),2.01-2.09(m,5H),1.50-1.58(m,2H),1.30(br,18H),0.09(s,9H),0.06(s,6H)。
13
13
[0605] C NMR:130.22,130.01,127.98,127.88,70.16,63.07,37.35,32.79,31.52,29.59,29.49,29.39,29.34,29.32,29.23,29.15,29.11,29.00,27.19,25.72,25.62,25.40,22.
57,14.07。
57,14.07。
[0606] 3-(二甲基氨基)-2-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丙-1-醇
[0607] 将TBAF(1.0M，在THF中，0.5mL，0.50mmol，1.2当量)以一份加入到3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-N,N-二甲基-2-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丙-1-胺(0.2g，0.42mmol，1.0当量)的无水THF(100μl)溶液中，并在室温下搅拌混合物2小时。浓缩混合物，在EtOAc(15mL)和饱和氯化铵水溶液(10mL)之间分配残余物。分离各层，用额外2份EtOAc(10mL)萃取水层。干燥(MgSO4)合并的萃取物，过滤，浓缩，得到粗品3-(二甲基氨基)-2-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丙-1-醇稠米色油状物，其不用进一步纯化就可以使用。
[0608]
[0609] 1H NMR:5.29-5.43(m,4H),3.77-3.82(m,1H),3.65-3.71(m,1H),3.42-3.51(m,3H),2.78(t,2H,J＝ 5.97),2.54-2.57(m,2H),2.30(s,6H),2.02-2.09(m,4H),1.50-1.57(m,2H),1.30(br,15H),0.87-0.92(m,4H)。
[0610] 4-(3-(二甲基氨基)-2-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丙氧基)-4-氧代丁酸
[0611] 将琥珀酸酐(0.60g，5.99mmol，1.1当量)以一份加入到3-(二甲基氨基)-2-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丙-1-醇(2.0g，5.45mmol，1.0当量)的无水THF(11mL)溶液中，并在氩气氛围中将反应物回流18小时。将混合物浓缩，而后溶于EtOAc(10mL)中，并倒入去离子水(20mL)中。分离各层，用额外两份EtOAc(25mL)萃取水层。干燥(MgSO4)合并的有机萃取物，过滤，浓缩，提供粗品4-(3-(二甲基氨基)-2-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丙氧基)-4-氧代丁酸稠黄色油状物，其不用进一步纯化就可以使用。
[0612]1
[0613] H NMR:5.29-5.43(m,4H),4.28(d,1H,J＝11.25),3.92-3.98(m,1H),3.84(br,1H),3.60-3.67(m,1H),3.43-3.50(m,1H),3.11-3.15(d,1H,J＝ 12.45),2.75-2.79(m,2H),2.67(s,6H),2.53-2.65(m,5H),2.01-2.08(m,4H),1.53-1.57(m,2H),1.29-1.30(br,18H),0.87-0.91(m,3H)。13
[0614] C NMR:176.63,172.55,130.09,129.98,127.91,127.84,73.90,69.90,67.85,62.54,59.08,44.11,31.44,30.53,29.97,29.93,29.58,29.42,29.36,29.27,29.20,27.14,27.11,26.04,25.55,22.50,14.01。
[0615] 外部亚油基连接基
[0616] 1-(二甲基氨基)-4-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丁-2-醇
[0617] 在0℃，在氩气氛围中，将3-(二甲基氨基)-1,2-丙二醇(98％，1.00g，8.39mmol，1.0当量))的甲苯(10mL)溶液小心地逐滴加入到NaH(60％，0.34g，8.39mmol，1.0当量)的甲苯悬浮液(5mL)中，并搅拌所得物15分钟。将亚油基甲磺酸酯(2.87g，8.39mmol，
1.0当量)的甲苯溶液(5mL)逐滴加入到搅拌混合物中，然后在90℃搅拌反应18小时。
然后将混合物冷却至室温，通过缓慢加入乙醇(10mL)来淬灭。浓缩混合物，用去离子水(20mL)吸收残余物，用EtOAc(30mL)萃取三次。用去离子水(20mL)洗涤合并的有机萃取物，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。色谱纯化残余物(0-5％MeOH/氯仿)，提供1-(二甲基氨基)-4-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丁-2-醇稠澄清油状物。
1.0当量)的甲苯溶液(5mL)逐滴加入到搅拌混合物中，然后在90℃搅拌反应18小时。
然后将混合物冷却至室温，通过缓慢加入乙醇(10mL)来淬灭。浓缩混合物，用去离子水(20mL)吸收残余物，用EtOAc(30mL)萃取三次。用去离子水(20mL)洗涤合并的有机萃取物，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。色谱纯化残余物(0-5％MeOH/氯仿)，提供1-(二甲基氨基)-4-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丁-2-醇稠澄清油状物。
[0618]
[0619] 4-(1-(二甲基氨基)-4-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丁-2-基氧基)-4-氧代丁酸
[0620] 将琥珀酸酐(0.60g，5.99mmol，1.1当量)以一份加入到1-(二甲基氨基)-4-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丁-2-醇(2.0g，5.45mmol，1.0当量)的无水THF(11mL)溶液中，并在氩气氛围中将所得物回流18小时。将混合物浓缩，在EtOAc(10mL)和去离子水(20mL)之间分配残余物。分离各层，用额外两份EtOAc(25mL)萃取水层。干燥(MgSO4)合并的有机萃取物，过滤，浓缩，提供粗品4-(1-(二甲基氨基)-4-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丁-2-基氧基)-4-氧代丁酸稠黄色油状物，其不用进一步纯化就可以使用。
[0621]
[0622] 带有内部连接基的泼尼松的酯化
[0623] 将 NEt3(100μl，0.74mmol，1.0 当 量 ) 逐 滴 加 入 到 4-(3-( 二 甲 基 氨基)-2-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基氧基)丙氧基)-4-氧代丁酸的无水二氯甲烷溶液(10mL)中，并在室温下、在氩气氛围中搅拌所得物15分钟。以一份加入PyBOP(0.48g，0.93mmol，1.25当量)，并搅拌所得物10分钟。将泼尼松(0.32g，0.89mmol，1.2当量)加入到该混合物中，并在室温下搅拌反应物18小时，而后浓缩，提供稠黄色油状物(90％纯度)。
快速柱色谱纯化(5-15％MeOH/氯仿(0-15％MeOH/EtOAc)，提供所需产物。
快速柱色谱纯化(5-15％MeOH/氯仿(0-15％MeOH/EtOAc)，提供所需产物。
[0624]1
[0625] H NMR(CDCl3):7.68(d,1H,J ＝ 10.23),6.20(dd,1H,J1＝ 10.23,J 2＝1.86),6.07(s,1H),5.27-5.42(m,4H),4.80(dd,1H,J1＝17.70,J2＝5.61),4.09-4.36(m,
3H),3.54-3.69(m,3H),3.34(m,1H),3.07-3.22(m,1H),2.94-2.98(m,1H),2.88(s,6H),
2.74-2.78(m,3H),2.65-2.68(m,3H),2.37-2.50(m,3H),2.25(dd,1H,J1＝ 12.24,J 1＝
2.31),2.00-2.05(m,8H),1.42(s,3H),1.30(br,18H),0.89(m,3H),0.64(s,3H)。
+
3H),3.54-3.69(m,3H),3.34(m,1H),3.07-3.22(m,1H),2.94-2.98(m,1H),2.88(s,6H),
2.74-2.78(m,3H),2.65-2.68(m,3H),2.37-2.50(m,3H),2.25(dd,1H,J1＝ 12.24,J 1＝
2.31),2.00-2.05(m,8H),1.42(s,3H),1.30(br,18H),0.89(m,3H),0.64(s,3H)。
+
[0626] MS:808.8[M+H]。
[0627] 实施例5-依托泊苷衍生物
[0628] 将4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酸二盐酸盐(4.20mg，0.09mmol)溶于SOCl2(0.5mL)中，并在室温下、在氩气氛中搅拌3小时。蒸发SOCl2，不用进一步纯化，在氩气氛中，将粗品酰基氯溶于无水CH3CN(1mL)中。将溶液冷却至0℃，逐滴加入溶于CH3CN(1mL)中的依托泊苷(6.50mg，0.085mmoles)，而后加入三乙胺(10μL)。继续搅拌2小时，同时用TLC监控反应。然后真空浓缩溶液，用水吸收粗品，用乙酸乙酯(3x10mL)萃取。用无水硫酸钠干燥合并的有机萃取物，真空浓缩。用硅胶(230-400目)柱色谱(梯度5-10％MeOH/CH2Cl2)纯化粗品，得到30mg所需依托泊苷衍生物7的游离碱白色固体。
[0629]
[0630] 1H NMR(CDCl3):6.83(s,1H),6.55(s,1H),6.27(s,2H),5.98-6.00(d,2H,J ＝7.15Hz),4.91-4.90(d,2H),4.73-4.78(q,1H),4.63-4.67(t,2H),4.40-4.46(t,1H),4.15-
4.26(m,2H),3.75-3.78(t,2H),3.66(s,3H),3.55-3.62(m),3.49(s,3H),3.25-3.47(m),2.
81-2.93(m),2.44-2.64(m),2.31(s,3H),1.87-1.97(m),1.39-1.40(d,3H).
4.26(m,2H),3.75-3.78(t,2H),3.66(s,3H),3.55-3.62(m),3.49(s,3H),3.25-3.47(m),2.
81-2.93(m),2.44-2.64(m),2.31(s,3H),1.87-1.97(m),1.39-1.40(d,3H).
[0631] ESI-MS:757.5[M+H]+。
[0632] 实施例6-他克莫司衍生物
[0633] 将4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酸盐酸盐(4.25mg，0.12mmol)溶于SOCl2(0.5mL)中，并在室温下、在氩气氛中搅拌3小时，然后蒸发SOCl2，不用进一步纯化，在氩气氛中，将化合物5溶于无水CH3CN(1mL)中。将溶液冷却至0℃，然后加入溶于CH3CN(1mL)中的他克莫司(8.80mg，0.1mmoles)，而后加入三乙胺(10μL)。继续搅拌2小时，然后真空浓缩溶液。用水吸收粗品，用乙酸乙酯(3x15mL)萃取。用无水硫酸钠干燥合并的有机萃取物，真空浓缩。用硅胶(245-400目)柱色谱(梯度5-10％MeOH/CH2Cl2)纯化粗品，得到45mg所需他克莫司衍生物9的游离碱白色固体。
[0634]
[0635] 1H NMR(CDCl3):5.63(m,1H),5.20-5.32(m,2H),6.27(s,2H),4.98-5.10(m),4.80(d,1H),4.63-4.63(d,1H),4.41-4.46(d,1H),4.25(s),3.87-3.92(m,2H),3.67-3.75(m),3-.56-3.60(m),3.30-3.44(m),2.97-3.06(br m),2.30-2.75(br m),0.81-2.28(宽的连续多重峰)(附有谱)
[0636] ESI-MS:973.0[M+H]+。
[0637] 实施例7-环孢菌素(cyclosporine)和硫唑嘌呤衍生物
[0638] 环孢菌素和硫唑嘌呤衍生物，例如如下所示的衍生物，基本上按照他克莫司所描述的方法制备，包括母体药物与酰基氯的反应。已良好确证的是，硫唑嘌呤选择性地在N-9与亲电试剂反应(Mishra等人，Ind.J.Chem.,Sec.B,26B:847-50(1987))。由此，在一些方面，本文提供的硫唑嘌呤衍生物将在N-9处被衍生化。
[0639]
[0640] 实施例8-弱碱性衍生物的溶解度
[0641] 在乙酸盐缓冲液(pH5)中测定多西紫杉醇衍生物的溶解度，该缓冲液是用于主动加载到LN中的缓冲液。将化合物以50mg/ml溶于乙醇中(TD2除外，其以25mg/ml溶解)。用10mM乙酸盐缓冲液(pH5)将等分样品(aliquot)稀释10倍，检测pH值，并根据需要重新调节至pH5。或者，将10mg各化合物称重到玻璃瓶中，并将2mL的10mM乙酸盐缓冲液(pH5)加入到化合物中，而后将悬浮液超声处理10分钟。然后使用Microcon MY100过滤器(截留MW 100,000Da)除去沉淀，并用UPLC-UV分析滤液中的药物含量。测定的溶解度是在非平衡条件下测定的动力学溶解度。
[0642] 少量(非膜渗透的)乙醇可以在加载期间任选用于增加水溶性。由此，溶解度数据产生于缓冲液和包含10％(v/v)乙醇的缓冲液。多西紫杉醇衍生物的水溶解度(表2)差异很大，溶解度值的范围为多西紫杉醇的大约20-500倍(Du等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry,15:6323-30(2007))。溶解度降低顺序为：N-甲基哌嗪子基(piperazino)>哌啶子基(piperdino)>>吗啉代。吗啉代衍生物的溶解度显著地比哌嗪子基和哌啶子基衍生物的溶解度低。
[0643] 表2.多西紫杉醇衍生物在pH5、在不存在和存在10％乙醇条件下的水中溶解度[0644]
[0645] 用酸碱滴定法测定的TD1的氨基的pKa是7.7，使得它很适合加载到LN中的pH梯度。如期望的那样，TD1盐酸盐的水溶解度随pH值增加而降低(在pH 4时是2.8mg/ml，在pH5时是1.7mg/ml)。
[0646] 实施例9-弱碱性衍生物的稳定性
[0647] 测定多西紫杉醇衍生物在不同pH值和温度下的水溶液中和在生物介质(小鼠血浆)中的化学稳定性。在1mL玻璃HPLC样品瓶(用聚四氟乙烯(Teflon)内衬的帽密封)中，将多西紫杉醇衍生物的等分样品(在乙腈中)与缓冲的柠檬酸盐/HEPES(10mM/10mM)溶液(pH 4.0和7.5)或小鼠血浆混合(最终体积0.25ml，最终多西紫杉醇衍生物浓度50μg/ml)。在37℃培养之后1、4和24小时，用UPLC-UV测定药物稳定性。在指明的时间点，将3倍过量的甲醇/0.1％TFA加入到样品中。如上所述，用UHPLC分析柠檬酸盐/HEPES缓冲的样品。对于血浆样品，在14,000x g下离心使通过加入甲醇/0.1％TFA所沉淀的蛋白形成团，并分析上清液中的药物衍生物。用100mM磷酸钠缓冲液将肝素化的(heparanized)小鼠血浆稀释至50％，以在整个实验中保持pH值恒定。
[0648] 为了适合于LN中的制剂，衍生物在pH 4(LN载体内部存在的pH值)时必须是稳定的。另外，一旦从LN中释放，前体药物衍生物应该在生理条件(例如在pH7.4和/或在内原性酶的存在下)容易形成活性药物。表3显示了多西紫杉醇衍生物在pH 4、pH7.4和在小鼠血浆中的水解稳定性(在37℃温育24小时之后)。在C-2'氨基酯多西紫杉醇衍生物当中，TD1-4、TD7和TD9在pH 4具有合适的稳定性。TD4在水中具有极其低的溶解度，在血浆中温育看来似乎对TD9没有影响。选择TD1-3和TD7用于加载到LN中，并且试验这种LN的体外药物释放。
[0649] 结果(表3和图1)表明，该衍生物在LN内部中所得到的低pH值(pH值大约4)下是稳定的，并且在从LN载体中释放之后能够快速体内转化为活性药物。转化为活性药物是pH值依赖性的(在pH值越高转化越快)，并且在存在于生物流体例如血浆中的水解酶的存在下，转化显著地加快。
[0650] 表3.在pH 4或7.4缓冲液或小鼠血浆中温育24小时之后的前体药物水平(％残留)
[0651]
[0652] 实施例10-加载效率
[0653] 试验多西紫杉醇的哌嗪基酯(TD1-TD3)、哌啶酯(TD7)和C-7氨基酯(TD10)衍生物、泼尼松的N-甲基-哌嗪基丁酸和乙酸的酯衍生物、以及依托泊苷的N-甲基-哌嗪基丁酸酯衍生物加载到LN中的效率。
[0654] LN的制备
[0655] 基于Boman等人(Cancer Res.；54:2830-2833(1994))所描述的乙醇方法，制备LN。简要地说，将脂质(磷脂/Chol，55/45摩尔比)溶于乙醇中，并在60℃慢慢地加入到包H含350mM硫酸铵的水溶液中；将痕量脂质标记物[3]CHE(0.15μCi/mg总脂质)与其它脂质共同溶解在乙醇中，制备用于释放研究的LN。最终乙醇浓度是15％(v/v)。在60℃，使用加热的热筒挤出机(Northern Lipids，Vancouver，Canada)将得到的LN分散体挤压通过两个叠加的100nm聚碳酸酯滤膜(Nucleopore，Pleasanton，CA)，如Hope等人(Biochim.Biophys.Acta；812∶55-65(1985))所描述。在室温下，通过切向流动透滤法除去残余TM TM
乙醇和外部硫酸铵，并用300mM蔗糖溶液代替(使用Midgee HOOP 超滤柱)(截留MW
100000；Amersham Biosciences)。使用NICOMP型370亚微米颗粒筛分机(Particle Sizing Systems，Santa Barbara，CA)，使用准弹性光散射(QELS)评定所挤压出的LN的尺寸分布(目标尺寸100±20nm)。
乙醇和外部硫酸铵，并用300mM蔗糖溶液代替(使用Midgee HOOP 超滤柱)(截留MW
100000；Amersham Biosciences)。使用NICOMP型370亚微米颗粒筛分机(Particle Sizing Systems，Santa Barbara，CA)，使用准弹性光散射(QELS)评定所挤压出的LN的尺寸分布(目标尺寸100±20nm)。
[0656] 药物加载
[0657] 使用Haran等人(Biochim.Biophys.Acta；1151:201-15(1993))所描述的基于硫酸铵的主动加载(remote-loading)方法，将多西紫杉醇、依托泊苷和泼尼松衍生物加载到DSPC/Chol(55:45mol％)LN中。简要地说，将TD1以2mg/mL溶解在10mM乙酸钠-缓冲的300mM蔗糖(pH5)中，将依托泊苷衍生物以2.5mg/mL溶解在10mM乙酸钠-缓冲的300mM蔗糖(pH5)中，将泼尼松衍生物以7mg/mL溶解在10mM乙酸钠缓冲液(pH5.3)中。将溶解的衍生物加入到预先加热(60℃)的LN悬浮液中，并在搅拌下、在60℃将混合物温育指定的时间(典型地是30分钟)。以5-10mg/ml之间的脂质浓度典型地制备LN制剂，且药物与TM TM
脂质的重量比为0.1-0.4mg/mg。使用Midgee HOOP 超滤柱(截留MW 100000；Amersham Biosciences)或尺寸排阻色谱法，通过切向流动透滤法除去未包封的多西紫杉醇衍生物。
用非缓冲的生理盐溶液代替外部溶液，并根据需要将样品浓缩。使药物加载的LN制剂(用于体内研究)通过0.2μm滤膜(Nalgene)进行过滤而使其灭菌，并随后在4℃保存。还将TD-1加载到由DPPC/chol(55:45mol％)和DMPC/chol(55:45mol％)构成的LN中。
脂质的重量比为0.1-0.4mg/mg。使用Midgee HOOP 超滤柱(截留MW 100000；Amersham Biosciences)或尺寸排阻色谱法，通过切向流动透滤法除去未包封的多西紫杉醇衍生物。
用非缓冲的生理盐溶液代替外部溶液，并根据需要将样品浓缩。使药物加载的LN制剂(用于体内研究)通过0.2μm滤膜(Nalgene)进行过滤而使其灭菌，并随后在4℃保存。还将TD-1加载到由DPPC/chol(55:45mol％)和DMPC/chol(55:45mol％)构成的LN中。
[0658] 通过以下来测定加载效率：定量前体药物和脂质两者在外部(非包封的)前体药物与LN包封的前体药物分离(利用尺寸排阻色谱法，使用Sephadex G50旋转柱)前后的水平，并比较各自的前体药物/脂质比例。利用Fiske和Subbarow(J.Biol.Chem.；66∶375-379(1925))的磷试验来测定磷脂浓度，使用酶比色试验(Wako Chemicals，Richmond，VA)来定量胆固醇浓度。利用本文所描述的超高效液相色谱(UHPLC)来测定衍生物浓度。同时监控在加载期间的前体药物至母体药物的转化。结果见图2(多西紫杉醇衍生物)、3(泼尼松衍生物)和4(依托泊苷衍生物)。
[0659] 实施例11–LN制剂的稳定性
[0660] 在0.9％生理盐水中，以3mg/ml的衍生物浓度制备含有不同脂质组合物(DSPC/Chol、DPPC/Chol和DMPC/Chol，每个以55/45mol％，且衍生物/脂质的比例为0.2wt/wt)的LN-衍生物制剂。将LN制剂进行无菌过滤，并无菌填充到5mL玻璃瓶中，将瓶塞紧并封盖，而后在7℃保存。在4个月时间的各个时间点(在第一个月内每周一次，而后每月一次)，分析制剂的LN尺寸(QELS)、衍生物保留(葡聚糖凝胶(Sephadex)G-50旋转柱方法)和衍生物完整性。结果总结在图5A-C中。所有三个制剂都是极其稳定的；没有可检测的前体药物释放(图5B)；LN制剂的平均尺寸和尺寸分布保持没有变化(图5C)；前体药物水解小于4％(3.5-3.8％，图5A)。没有观察到其它降解产物。该数据表明了形成湿LN制剂的可行性。制剂的冷冻是另一种替代方案。
[0661] 使用硫酸铵梯度技术制备的LN具有大约4.0的囊内pH值(Maurer-Spurej等人，Biochim.Biophys.Acta,1416:1-10(1999))。根据衍生物在pH 4时显著更大的稳定性(相对于pH7.4)(参见上面表2)，LN包封极大地提高了所捕集衍生物的水解稳定性(与水溶液中的衍生物相比较)。例如，在pH 4时，TD1具有大约49天(或7周)的水解半衰期。相反，经4个月期间(16周)，小于3％的包封TD1转变为多西紫杉醇。Cryo-TEM显微术显示，前体药物在LN内部沉淀，并因此具有显著提高的稳定性。
[0662] 静脉内给予Swiss Webster小鼠TD1(用与TaxotereTM同样的方法、在LN中配制)TM和Taxotere 之后，研究该制剂从血液循环中除去的速率。给小鼠静脉内注射单次快速浓注的等摩尔剂量(20mg/kg多西紫杉醇)的制剂，通过UHPLC-MS测定TD1和多西紫杉醇的TM
血浆水平。结果示于图5中。多西紫杉醇/Taxotere 和衍生物两者都具有几分钟的血浆循环半衰期，且血浆浓度低于可检测的水平达2小时(图6)。相反，在DSPC/Chol LN中的衍生物的制剂使循环半衰期从几分钟延长至10-12小时，且血浆浓度提高两个数量级(图
6)。在16小时的时候，大约24％的注射剂量保留在循环中。LN配制的衍生物的消除似乎主要通过LN载体的消除速率来测定。该数据表明，衍生物的LN制剂在循环中是稳定的，并且可以达到有利于有效药物在治疗靶点积聚的循环半衰期。
血浆水平。结果示于图5中。多西紫杉醇/Taxotere 和衍生物两者都具有几分钟的血浆循环半衰期，且血浆浓度低于可检测的水平达2小时(图6)。相反，在DSPC/Chol LN中的衍生物的制剂使循环半衰期从几分钟延长至10-12小时，且血浆浓度提高两个数量级(图
6)。在16小时的时候，大约24％的注射剂量保留在循环中。LN配制的衍生物的消除似乎主要通过LN载体的消除速率来测定。该数据表明，衍生物的LN制剂在循环中是稳定的，并且可以达到有利于有效药物在治疗靶点积聚的循环半衰期。
[0663] 实施例12-药物衍生物从LN中的体外释放
[0664] 基于LN的药物的活性高度依赖于药物从载体中的释放速率。例如，如果药物快速地从LN载体当中渗出，到达疾病位点的LN将会携带很少药物或不携带药物，并且将会比游离药物具有可以忽略的治疗益处。另一方面，如果药物从LN中释放太慢，到达疾病位点的药物量将永远不会达到治疗浓度。药物保留/释放的主要决定因素是LN载体和药物的囊内形式的脂质组合物。使用不饱和脂质或具有较短酰基链的脂质有利于药物的更快释放。药物沉淀在LN内部可以增加药物保留。药物衍生物是否在LN内沉淀可以通过使用cryo-TEM和/或本领域已知的其它方法观察LN制剂来确定。
[0665] 在小鼠血浆中评价多西紫杉醇衍生物从LN中的体外释放。通过将前体药物与脂质的初始比例和在不同时间点得到的前体药物与脂质的比例进行比较，测定药物保留。多3
西紫杉醇衍生物被包封在含有痕量放射性同位素标记的脂质标记物 H-胆固醇基十六烷基
3
醚(H-CHE)的DSPC/chol、DPPC/Chol和DMPC/Chol LN(55:45mol％)中。将LN制剂与小鼠血浆混合，且最终脂质浓度为0.75mg/ml，而后在37℃培养。在不同时间点，获得等分样品，并使其流过葡聚糖凝胶(Sephadex)G-50旋转柱，以便除去未捕集的(unentrapped)前体药物(Pick,Arch.Biochem.Biophys.,212:186-194(1981))。通过UHPLC和液体闪烁计数分别测定洗脱物中的衍生物和脂质浓度。
西紫杉醇衍生物被包封在含有痕量放射性同位素标记的脂质标记物 H-胆固醇基十六烷基
3
醚(H-CHE)的DSPC/chol、DPPC/Chol和DMPC/Chol LN(55:45mol％)中。将LN制剂与小鼠血浆混合，且最终脂质浓度为0.75mg/ml，而后在37℃培养。在不同时间点，获得等分样品，并使其流过葡聚糖凝胶(Sephadex)G-50旋转柱，以便除去未捕集的(unentrapped)前体药物(Pick,Arch.Biochem.Biophys.,212:186-194(1981))。通过UHPLC和液体闪烁计数分别测定洗脱物中的衍生物和脂质浓度。
[0666] 图7A显示了TD1在LN中的保留百分比，其定义为：在具体时间点的样品中得到的衍生物/脂质(或前体药物/脂质)的比例除以药物与脂质的初始比例。经过实验的16小时时程，DSPC/Chol和DPPC/Chol LN两者都显示了没有释放或很少释放。DMPC/Chol LN释放的前体药物，具有大约6小时的半衰期，在注射后16小时，16％的前体药物保持被捕集状态。DSPC/Chol LN制剂(以0.1和0.2mg/mg加载)的保留特性的对比表明，药物保留不依赖于前体药物与脂质的比例。在小鼠血浆中进行的体外释放研究与体内研究非常相符(图7B)。相比于DSPC和DPPC/Chol LN，所看到的DMPC/Chol LN的释放增加与脱离DMPC过程中的膜透性降低相符，相对于较长链的脂质，DMPC具有最短的酰基链(C14)。图7C显示了DSPC/chol LN中的TD1的保留特性(相对于以相同的前体药物与脂质比例在DSPC/chol中配制的其它多西紫杉醇衍生物(TD2-3和TD7))。所有的衍生物都有效地保留。TD7以可反映(mirror)TD1速度的速率释放，而TD2和TD3以稍微更快的速度释放(百分比释放定义为：100减去百分比保留)。体外和体内数据表明，弱碱性衍生物可以有效地保留在LN中，并且可以通过改变LN载体的脂质组合物来调节其释放速度。
[0667] 实施例13-药物动力学和体内药物释放
[0668] 将LN包封的多西紫杉醇衍生物的药物动力学(PK)与TaxotereTM、可商购TM多西紫杉醇制剂和用与Taxotere 同样的方法配制的衍生物的PK进行比较。按照TM
Taxotere (Sanofi-Aventis，U.S.)的处方信息中描述的方法，使用乙醇/聚山梨醇酯80/TM
生理盐水溶液来溶解药物，将Taxotere 和类似配制的衍生物进行配制。使用硫酸铵加载技术，以0.2wt/wt的药物与脂质比例，将多西紫杉醇衍生物包封在DSPC/chol、DPPC/Chol和DMPC/Chol LN(55:45mol％)中。脂质组份含有痕量(0.15μCi/mg脂质)的脂质标记物
3
[H]CHE，使得可监控前体药物和LN载体两者从循环中的消除。
Taxotere (Sanofi-Aventis，U.S.)的处方信息中描述的方法，使用乙醇/聚山梨醇酯80/TM
生理盐水溶液来溶解药物，将Taxotere 和类似配制的衍生物进行配制。使用硫酸铵加载技术，以0.2wt/wt的药物与脂质比例，将多西紫杉醇衍生物包封在DSPC/chol、DPPC/Chol和DMPC/Chol LN(55:45mol％)中。脂质组份含有痕量(0.15μCi/mg脂质)的脂质标记物
3
[H]CHE，使得可监控前体药物和LN载体两者从循环中的消除。
[0669] PK和体内释放研究基于4个时间点(1、4、8和16小时)，每个时点4个小鼠。所有制剂通过外侧尾静脉静脉内给予，以20mg/kg的多西紫杉醇(或等价的多西紫杉醇)剂量，体积基于受试者重量(10mL/kg)。在不同的时间，用氯胺酮/赛拉嗪使小鼠麻醉，通过心脏穿刺收集血液，并放入EDTA微量采血管(microtainer tube)中。血液收集之后立即处死动物。通过在1,000g下离心10分钟从全血中分离血浆。通过向50μl血浆中加入150μl冰冷的甲醇(用0.1％TFA酸化)，使血浆蛋白沉淀。在4℃，在15,000x g下将甲醇溶液离心30分钟，使蛋白形成团，利用UHPLC分析上清液中的多西紫杉醇和药物衍生物。对于LN制剂，将25-50μl血浆加入到闪烁流体(PicoFluor 40，Perkin Elmer)中，并通过闪烁计3
数来分析脂质水平([H]-CHE放射性)。通过血浆样品中得到的前体药物/脂质比例除以所注射的LN制剂中的前体药物/脂质比例(作为100％)，计算保留在LN中的前体药物的百分比(药物保留)。结果示于图7B中。因为游离多西紫杉醇和多西紫杉醇衍生物的清除速率比LN包封形式更快，所以，可以认为从血浆样品中回收(recover)的前体药物/脂质比例是保持包封在LN中的前体药物量的直接指示。
数来分析脂质水平([H]-CHE放射性)。通过血浆样品中得到的前体药物/脂质比例除以所注射的LN制剂中的前体药物/脂质比例(作为100％)，计算保留在LN中的前体药物的百分比(药物保留)。结果示于图7B中。因为游离多西紫杉醇和多西紫杉醇衍生物的清除速率比LN包封形式更快，所以，可以认为从血浆样品中回收(recover)的前体药物/脂质比例是保持包封在LN中的前体药物量的直接指示。
[0670] 实施例14-体外抗癌活性
[0671] 通过测定TD1相对于母体化合物(多西紫杉醇)的体外抗癌活性，进一步研究衍生物形成活性药物(生物转化)的能力。针对3种人癌细胞系(包括卵巢癌细胞系ES-2，前列腺癌细胞系PC3和乳腺癌细胞系MDA435/LCC6(BC Cancer Research Centre,Vancouver,BC))，评 价 抗 癌 活 性 (Fields and Lancaster,Am.Biotechnol.Lab.,11:48-50(1993)；Nakayama等人，J.Immunol.Methods,204:205-208(1997))。72小时药物接触时间之后，使用阿尔玛蓝(Alamar blue)试验测定细胞毒性。简要地说，在不同量的TD1或母体药物(溶于DMSO中)的存在下，在37℃，将细胞在96孔板中培养72小时；在培养期的最后，将阿尔玛蓝溶液加入到所有孔中(20μl/孔，培养体积的10％)。将板放回到培养箱中4小时；在λex＝530nm和λem＝590nm处测定样品荧光。按照下列计算存活力(viability)∶细胞存活力(％)＝(F加药-F背景)/(F减药-F背景)*100，其中F加药是在药物的存在下的荧光读数，F减药是在没有药物的情况下的细胞对照，F背景是背景荧光(单独的介质)。通过将S形曲线与浓度-存活力绘图进行拟合，计算IC50值(nM)，并提供于表4中。
TD1与多西紫杉醇活性一样，表明该前体药物容易转变为活性化合物。
TD1与多西紫杉醇活性一样，表明该前体药物容易转变为活性化合物。
[0672] 表4：多西紫杉醇和多西紫杉醇衍生物的体外细胞毒性(IC50值)
[0673]
[0674] 实施例15-体内抗癌活性
[0675] 在单次快速浓注之后，在人乳腺癌(MDA-MB-435/LCC6)的皮下异种移植模型中评价LN-多西紫杉醇衍生物制剂的抗癌效能。在37℃，在5％CO2环境中，在含有2mM L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM中培养鼠的MDA-MB-435/LCC6细胞。在右后胁(hind flank)，给6 3
雌性RAG2-M小鼠皮下接种5×10(50μL)个细胞。一旦肿瘤达到100-150mm的大小，将动TM
物随机分组(每组6个动物)，并单次静脉内快速浓注Taxotere (25mg/kg的剂量)或三个不同剂量(31.25mg/kg、50mg/kg和110mg/kg，其与25、40和88mg/kg多西紫杉醇对应)的TD1的LN制剂(DSPC/Chol、DPPC/Chol和DMPC/Chol以55:45mol％，且前体药物/脂质重量比为0.2wt/wt)。每隔三天测定肿瘤生长和动物重量。通过用数字卡钳测定肿瘤尺寸来
2
监控肿瘤生长，并按照下列方程式来计算肿瘤体积：长度×(宽度 )÷2，其中长度(mm)是
3
肿瘤的较长的轴。使肿瘤生长至700mm的最大值，而后终止；使带有溃烂肿瘤的动物终结。
雌性RAG2-M小鼠皮下接种5×10(50μL)个细胞。一旦肿瘤达到100-150mm的大小，将动TM
物随机分组(每组6个动物)，并单次静脉内快速浓注Taxotere (25mg/kg的剂量)或三个不同剂量(31.25mg/kg、50mg/kg和110mg/kg，其与25、40和88mg/kg多西紫杉醇对应)的TD1的LN制剂(DSPC/Chol、DPPC/Chol和DMPC/Chol以55:45mol％，且前体药物/脂质重量比为0.2wt/wt)。每隔三天测定肿瘤生长和动物重量。通过用数字卡钳测定肿瘤尺寸来
2
监控肿瘤生长，并按照下列方程式来计算肿瘤体积：长度×(宽度 )÷2，其中长度(mm)是
3
肿瘤的较长的轴。使肿瘤生长至700mm的最大值，而后终止；使带有溃烂肿瘤的动物终结。
[0676] 通过抗癌活性确定的参数的对比，评价治疗效果，该参数包括下列：肿瘤生长抑制(最佳％T/C)；肿瘤生长延迟(T-C)；治疗肿瘤和对照肿瘤的大小加倍的时间差别；和NCI 评 分 (Plowman J,Dykes DJ,Hollingshead M,Simpson-Herren L,Alley MC.1997.Human tumor xenograft models in NCI drug development.In:Teicher BA,editor.Anticancer drug development guide:Preclinical screening,clinical trials,and approval.Totowa:Humana Press,Inc.pp101-125)。另外，记录任何药物相关的死亡(在最后剂量的15天之内和低肿瘤负荷的情况下)，以及最大体重减轻(组的平均值)。％T/C值和NCI评分计算如下∶每天计算每个治疗的(T)和对照的(C)肿瘤体积的变化，通过用具体观察天的肿瘤体积中值减去首次治疗当天的肿瘤体积中值来测定肿瘤。按照％T/C＝(ΔT/ΔC)×100，将得到的值用于计算百分比T/C。最佳(最低)值用于定量抗癌活性。NCI评分为“0”属于最佳％T/C>42，并且是指治疗无效。评分“1”属于最佳％T/C值1-42，并且表明肿瘤生长得到抑制(Capdeville等人，Nature Reviews Drug Discovery,1:493-502(2002))。
[0677] 在图8A中说明了LN载体的脂质组合物对包封TD1的效能的影响。以40mg/kg的多西紫杉醇等效剂量给予DSPC/Chol、DPPC/Chol和DMPC/Chol LN制剂(TD1与脂质比例为0.2wt/wt)。DSPC/Chol制剂抑制肿瘤生长最有效，而后是DPPC/Chol和DMPC/Chol(最小活性)制剂。抗癌效能与释放速率高度相关，显示最慢释放速率的制剂是最具活性的。
[0678] 同25mg/kg TaxotereTM/多西紫杉醇进行比较，用3个不同的剂量(25、40和88mg/kg多西紫杉醇)测定DSPC/Chol制剂(TD1与脂质比例为0.2wt/wt)的治疗活性。在等摩TM尔剂量(25mg/kg多西紫杉醇)下，Taxotere 比LN制剂稍微更有效一些。然而，LN制剂TM
的给药剂量可以比Taxotere 的MTD高得多。在这些剂量下，DSPC/Chol LN制剂显著地更有效(图8B)。在88mg/kg多西紫杉醇条件下，观察到最显著的肿瘤生长抑制，具有5％的TM
最佳％T/C值，和29天的肿瘤生长延迟(T-C)(与Taxotere 的9天相比)(表5)。该结TM
果表明，LN制剂潜在地比Taxotere 更加有效。
的给药剂量可以比Taxotere 的MTD高得多。在这些剂量下，DSPC/Chol LN制剂显著地更有效(图8B)。在88mg/kg多西紫杉醇条件下，观察到最显著的肿瘤生长抑制，具有5％的TM
最佳％T/C值，和29天的肿瘤生长延迟(T-C)(与Taxotere 的9天相比)(表5)。该结TM
果表明，LN制剂潜在地比Taxotere 更加有效。
[0679] 表5.多西紫杉醇衍生物TD1的抗肿瘤活性和耐受性参数的概述
[0680]a
[0681] 最佳％T/C。％T/C>42具有“0”的NCI评分(非活性)，％T/C从1-42具有“1”的NCI评分(代表肿瘤抑制)。b
[0682] 肿瘤生长延迟(治疗的和对照肿瘤的尺寸加倍的时间差别)。c
[0683] 药物相关死亡(DRD)。d
[0684] 每个治疗组的最大平均体重减轻百分比(％)，n＝6。
[0685] 实施例16-耐受性研究
[0686] 耐受性研究目的在于建立最大耐受剂量(MTD)和用于效能研究的剂量范围(效能研究基于单次静脉内注射)。用缺乏免疫力的SCID/Rag2-M小鼠(还用于效能研究)进行TM单剂量MTD研究，使用LN-包封的TD1、用和在Taxotere 中的多西紫杉醇同样的方法配制TM
的TD1和Taxotere 。该研究基于单剂量给药，并依据3个小鼠/组和剂量递增策略(基于三个剂量水平的衍生物和Taxotere，五个剂量水平的LN制剂(DSPC/Chol 55:45mol％，前体药物/脂质重量比为0.2mg/mg))。所有的制剂都通过尾部外侧静脉静脉内注射，体积为200μl/20g小鼠。
的TD1和Taxotere 。该研究基于单剂量给药，并依据3个小鼠/组和剂量递增策略(基于三个剂量水平的衍生物和Taxotere，五个剂量水平的LN制剂(DSPC/Chol 55:45mol％，前体药物/脂质重量比为0.2mg/mg))。所有的制剂都通过尾部外侧静脉静脉内注射，体积为200μl/20g小鼠。
[0687] 给予药物之后，在14天期间内，每天监控小鼠的毒性迹象。通过体重以及行为参数的变化来评价耐受性。MTD定义为：引起～15％体重损失并且不会导致死亡的剂量。在研究期间，每隔一天测定个体小鼠的体重。如果体重减轻不能良好的预测耐受性，使用以下剂量：在该剂量下没有动物因毒性而需要终结。TM
[0688] 结果总结在表6中。Taxotere 的单剂量MTD是29mg/kg，而TD1的MTD是16mg/kg(在相当于20mg/kg前体药物的多西紫杉醇等价物中的MTD)。在20mg/kg的多西紫杉醇等价剂量的时候，TD1显示了急性毒性(死亡)。急性毒性似乎与注射之后的药物沉淀有关。相反，在多西紫杉醇等价剂量高达88mg/kg的时候，LN-包封的TD1(DSPC/Chol 55:45mol％LN，前体药物/脂质重量比0.2mg/mg)良好耐受，没有毒性迹象(体重和行为参数没有显著TM
的变化)(表6)。LN制剂的MTD是Taxotere (29mg/kg)的至少3倍，表明它具有更好的耐受性(毒性更小)，并由此可以更高和更有效的剂量给予。单独的载体(聚山梨醇酯80/生理盐水)没有副作用。
的变化)(表6)。LN制剂的MTD是Taxotere (29mg/kg)的至少3倍，表明它具有更好的耐受性(毒性更小)，并由此可以更高和更有效的剂量给予。单独的载体(聚山梨醇酯80/生理盐水)没有副作用。
[0689] 表6.TaxotereTM的最大耐受剂量(MTD)。
[0690]
[0691] DRD∶药物相关的死亡
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