技术领域
[0001] 本
发明涉及一
种子宫内膜干细胞的定向分化培养，属于干细胞培养技术领域。
背景技术
[0002] 人子宫内膜是一个高度再生的组织，女性一生大约要经历子宫内膜400多个周期的脱落和再生。研究发现，子宫内膜这种巨大的再生能
力被认为与人类子宫内膜干细胞有直接关系，受到越来越多学者的关注。目前，子宫内膜干细胞分类较为多样化，包括子宫内膜细胞侧群(side population，SP)、子宫内膜间充质干细胞、月经血来源的干细胞等，其
中子宫内膜间充质干细胞因其数量较多，
生物学特性明显人类子宫内膜是一种高度动态的组织，周期性地经历增殖期、分泌期、月经期，
[0003] 具有显著的再生能力，能从月经后最初的0.5-1毫米长到5-7毫米。据文献报道，来源于子宫内膜组织的间充质干细胞不仅存在于基底层，经血中也存在。子宫内膜组织可全子宫
切除术后标本、诊刮组织等中获取，即使绝经后期女性也可在无禁忌情况下应用雌
激素刺激内膜生长来获取。hEMSCs因其显著的增殖能力、容易获取，成为构建组织工程韧带具有吸引力的、新的细胞来源。等受到更多关注。
[0004] 本发明旨在提供一种子宫内膜干细胞的定向分化培养成骨细胞的方法，在骨组织修复工程上可能具有很大的应用潜力。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种子宫内膜干细胞的高效定向分化培养成骨细胞的方法，在组织修复工程上可能具有很大的应用潜力。
[0006] 鹿瓜多肽是鹿科动物梅花鹿(Cervus Nippon Temmick)的骨骼和葫芦科
植物甜瓜(Cucumis melo L.)的干燥成熟种子，经分别提取后制成的灭菌
水溶液。适用于
风湿、类风湿性关节炎、骨折的早期愈合、骨关节炎、腰腿
疼痛及创伤恢复等。该品为为淡黄色的澄明液体。
[0007] 本
发明人发现，1-羟基-4-O-鼠李糖-2-
萘甲酸甲酯可以用于高效诱导子宫内膜干细胞成骨分化，但是在低剂量和鹿瓜多肽合用进行诱导，则可以诱导得到骨细胞。
[0008] 本发明用到的成骨诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+10-15μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+20μg/mL鹿瓜多肽注射液+50μg/mL
抗坏血酸。
[0009] 本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。
[0010] 一种子宫内膜干细胞的高效定向分化培养成骨细胞的方法，其包括：
[0011] 使用1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯和鹿瓜多肽进行诱导培养，1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯结构如下：
[0012]
[0013] 作为优选，本发明用到的成骨诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+10-15μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+20μg/mL鹿瓜多肽注射液+50μg/mL抗坏血酸。
[0014] 具体步骤如下：
[0015] hEMSCs的原代培养：
[0016] 子宫内膜组织被运送至实验室后，将组织浸于PBS中，用手术刀片轻轻刮除组织表面的凝血
块，反复洗涤2-3次至PBS洗涤液清亮基本无血迹。用眼科剪将组织剪成约1mm3大小，肉眼观察呈糊状。将组织转移至50ml离心管中，加入适量的Collagenase Type III和Deoxyribonuclease I置于37℃、5％CO2
培养箱消化50-60min，消化过程中每5min摇匀1次，结束后在离心管中加入等量培养基终止消化。将消化后的
混合液经70um细胞筛过滤，收集滤液，1000r/min离心4min，弃去上清，将获得的细胞用含20％FBS的DMEM/F12(1:1)培养基重悬后接种于培养瓶中。首次换液时间为培养的4-5d，可去除大部分未贴壁细胞及残留的红细胞，并观察细胞的形态。期间2-3d换液1次，待细胞融合达到80％左右时，按1-1：2比例进行传代。
[0017] 按照
现有技术的方法对hEMSCs进行传代、纯化、冻存及复苏。
[0018] 复苏后上流式细胞仪检测细胞表面特异性
抗原阳性率，鉴定确认为hEMSCs。
[0019] 诱导培养
[0020] 诱导培养步骤如下：
[0021] (1)选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
[0022] (2)使用成骨诱导液进行诱导培养10d，成骨诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+10-15μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+20μg/mL鹿瓜多肽注射液+50μg/mL抗坏血酸。
[0023] 诱导培养3d后观察，细胞
密度逐渐增加，呈铺路石状。随诱导时间的延长，多处细胞外出现圆形致密矿化结节，并逐渐变大，
颜色逐渐加深，诱导10d后矿化结节呈黑褐色，茜素红
染色显示：矿化结节分散分布，呈橘红色沉淀。
[0024] 本发明的优点：
[0025] 本发明人发现，1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯可以用于高效诱导子宫内膜干细胞成骨分化，但是在低剂量和鹿瓜多肽合用进行诱导，则可以诱导得到骨细胞。本发明的方法简便易行，成本低，在诱导10天就可以明确诱导为骨细胞，诱导效率非常高。
附图说明
[0026] 图1为诱导分化前，图2为后矿化结节呈黑褐色，茜素红染色显示：矿化结节分散分布，呈橘红色沉淀。
具体实施方式
[0027] 实验于2019年2月至2019年10月在浙江省台州医院完成。下面详细描述本发明的
实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0028] 本发明的具体实施例如以下说明。
[0029] 实施例1
[0030] 子宫内膜组织取自浙江省台州医院因子宫肌瘤、
宫颈病变行全子宫切除术的患者，均为育龄期女性，术前3个月均未曾服用过激素类药物。组织均取自远离患处，标本包含5mm左右肌层的子宫内膜全层，获取子宫内膜组织后，立即置入无菌转移培养基中，4h内送至实验室进行处理。所有的子宫内膜组织均经过我院病理检查，排除子宫内膜炎性病变、子宫内膜增生症、子宫内膜恶性病变等，处于增殖期或分泌期。
[0031] hEMSCs的原代培养：
[0032] 子宫内膜组织被运送至实验室后，将组织浸于PBS中，用手术刀片轻轻刮除组织表面的凝血块，反复洗涤2-3次至PBS洗涤液清亮基本无血迹。用眼科剪将组织剪成约1mm3大小，肉眼观察呈糊状。将组织转移至50ml离心管中，加入适量的Collagenase Type III和Deoxyribonuclease I置于37℃、5％CO2培养箱消化50-60min，消化过程中每5min摇匀1次，结束后在离心管中加入等量培养基终止消化。将消化后的混合液经70um细胞筛过滤，收集滤液，1000r/min离心4min，弃去上清，将获得的细胞用含20％FBS的DMEM/F12(1:1)培养基重悬后接种于培养瓶中。首次换液时间为培养的4-5d，可去除大部分未贴壁细胞及残留的红细胞，并观察细胞的形态。期间2-3d换液1次，待细胞融合达到80％左右时，按1-1：2比例进行传代。
[0033] 按照现有技术的方法对hEMSCs进行传代、纯化、冻存及复苏。
[0034] 复苏后上流式细胞仪检测细胞表面特异性抗原阳性率，鉴定确认为hEMSCs。
[0035] 实施例2
[0036] 诱导培养
[0037] 诱导培养步骤如下：
[0038] (1)选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
[0039] (2)使用成骨诱导液进行诱导培养10d，成骨诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+10μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+20μg/mL鹿瓜多肽注射液+50μg/mL抗坏血酸。
[0040] 诱导培养3d后观察，细胞密度逐渐增加，呈铺路石状。随诱导时间的延长，多处细胞外出现圆形致密矿化结节，并逐渐变大，颜色逐渐加深，诱导10d后矿化结节呈黑褐色，茜素红染色显示：矿化结节分散分布，呈橘红色沉淀。参见图1和图2。
[0041] 实施例3
[0042] 诱导培养
[0043] 诱导培养步骤如下：
[0044] (1)选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
[0045] (2)使用成骨诱导液进行诱导培养10d，，成骨诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+12μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+20μg/mL鹿瓜多肽注射液+50μg/mL抗坏血酸。
[0046] 诱导培养3d后观察，细胞密度逐渐增加，呈铺路石状。随诱导时间的延长，多处细胞外出现圆形致密矿化结节，并逐渐变大，颜色逐渐加深，诱导10d后矿化结节呈黑褐色，茜素红染色显示：矿化结节分散分布，呈橘红色沉淀。
[0047] 实施例4
[0048] 诱导培养
[0049] 诱导培养步骤如下：
[0050] (1)选用复苏鉴定后的hEMSCs，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中1d；
[0051] (2)使用成骨诱导液进行诱导培养10d，成骨诱导液配方：DMEM低糖培养基+10％FBS+15μg/mL 1-羟基-4-O-鼠李糖-2-萘甲酸甲酯+20μg/mL鹿瓜多肽注射液+50μg/mL抗坏血酸。
[0052] 诱导培养3d后观察，细胞密度逐渐增加，呈铺路石状。随诱导时间的延长，多处细胞外出现圆形致密矿化结节，并逐渐变大，颜色逐渐加深，诱导10d后矿化结节呈黑褐色，茜素红染色显示：矿化结节分散分布，呈橘红色沉淀。
[0053] 需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出
说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。
[0054] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0055] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、
修改、替换和变型，本发明的范围由
权利要求及其等同物限定。
