技术领域
[0001] 本
发明属于动物保护及兽医领域，涉及一种动物毛发中皮质醇检测的预处理方法。
背景技术
[0002] 野生动物环境压
力、应激研究可以通过体内皮质醇含量进行判断。此前使用的血液检测对动物个体影响较大，不利于动物保护和实验的准确性。毛发和
粪便都属于非损伤取样，通过检测毛发中的皮质醇含量判断动物压力情况对于野生动物环境压力、应激研究是十分重要的。
[0003] 由于野生动物毛发难以收集，并受自身分泌物和环境中尘土、雨
水等影响，
采样时无法避免污染，尽量减弱污染带来的影响，提高萃取效率及避免实验过程高温对样品的影响是从毛发中萃取皮质醇实验方案中重要的部分。
[0004] 虽然目前的技术随着各种仪器的出现不断完善，但是在实验方案方面依旧存在一些问题。包括但不限于因有些毛发较长必须进行预剪切导致的无法避免的局部高温，为了减少实验时间清洗后对毛发进行加热烘干和加热萃取对样品造成的影响。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于克服
现有技术中存在的
缺陷，提供一种快速准确，成本低廉/省时高效的毛发皮质醇提取方法，以推动科学领域相关研究。
[0006] 本发明提供了一种动物毛发皮质醇检测的预处理方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤一：获得毛发样品；
[0009] 步骤三：利用液氮冷冻，在研钵中
磨碎清洁并
去角质化后的毛发；
[0010] 步骤四：萃取步骤三中磨碎的毛发；
[0011] 步骤五：离心，取上清，干燥萃取液所得的溶质并加入
磷酸缓冲盐溶液。
[0012] 步骤一中，采用非损伤方式获得动物毛发样品，如脱落毛发，捕捉、救护等时剪取少量毛发。由于非损伤取样可获得的毛发样品量有限，且所获得的毛发可能将用于许多实验，需要尽量减少毛发样品用量。而本发明所需毛发用量少，并可以接受有一定污染的毛发。其中，所述收集动物脱落毛发不少于50mg。
[0013] 步骤二中，先使用蒸馏水进行毛发的清洗，后使用异丙醇进行去角质化。由于野生动物生存环境中容易
接触到泥土，首先使用蒸馏水进行清洗，洗去表面杂质后，使毛发样品得到彻底清洁，而保持毛发本身不发生其它化学反应；再使用异丙醇去角质化能够更好地起到效果，得到的结果也会更准确。
[0014] 步骤二中，本发明去角质化后的毛发在室温下进行干燥，避免
温度过高影响毛发稳定。
[0015] 步骤三中，不使用
剪刀剪碎毛发而是经过液氮冷冻后直接利用简单易得的研钵进行
研磨，防止室温研磨或剪碎过程中的局部高温影响实验结果。
[0016] 步骤四中，所述萃取的具体步骤为：使用无水甲醇按照每50mg毛发1ml无水甲醇的比例在室温下于旋转混匀仪上以40rpm进行24h萃取，操作简单，容易实施。
[0017] 步骤五中，所述干燥在通
风橱内65℃水浴中进行，通过使用
通风橱和水浴锅结合替代氮吹仪，省去了利用吹氮的步骤，减少了仪器使用，提高了干燥速度，缩短了实验时间。
[0018] 步骤五中，所述离心的条件为8000g、15min。
[0019] 步骤五中，所述磷酸缓冲盐溶液的浓度为0.01M，即1×缓冲液。
[0020] 步骤五中，所述磷酸缓冲盐溶液的pH＝7.2-7.4。
[0021] 步骤五中，在65℃水浴条件下溶解溶质。能使溶质快速均匀分布在磷酸缓冲盐溶液中。
[0022] 步骤五中，所述溶质为毛发中可被甲醇溶解的物质包括皮质醇。
[0023] 本发明步骤五之后还包括步骤六：将溶解在磷酸缓冲盐溶液中的溶质保存于-20℃
冰箱至检测日。
[0024] 本发明步骤五之后还包括步骤七：使用ELISA
试剂盒对溶质中的皮质醇进行测定。
[0025] 其中，所述步骤七中，使用混合均匀的溶质和缓冲液的
混合液进行检测。可以避免不同样品间因为不均匀混合或溶解不充分导致的差异。
[0026] 其中，所述溶质为皮质醇。
[0027] 其中，所述缓冲液为磷酸缓冲盐溶液。
[0028] 本发明可作为酶联
免疫吸附法测定毛发中皮质醇含量的前处理，特异性强，检测灵敏度较高。
[0029] 本发明预处理方法中，室温干燥(避免毛发中其他成分在高温下影响皮质醇)、液氮研磨(避免局部高温影响)、无水甲醇室温萃取、水浴干燥皮质醇甲醇溶液(水浴加热提高效率、通风橱替代氮吹节约设备且更加安全，并达到实验效果)对本发明动物毛发皮质醇检测的预处理方法是至关重要的。
[0030] 在本发明中，可耐受污染较严重的毛发样品，实验过程提取效率高而稳定，显著减少毛发用量。由于大多数动物毛发本身长度问题，不需要再对样品进行预剪切。本发明通过采用室温干燥和室温萃取的方式避免加温对样品的影响，保障抽提和处理过程成分稳定。且本发明通过简化实验仪器使用和步骤如：使用研钵代替球磨仪，毛发经过液氮冷冻后可以被研钵轻易磨碎；使用水浴锅结合通风橱替代氮吹仪，该方法相较使用氮吹仪不会影响皮质醇的后续检测，因此该实验方案使得实验隐形成本降低，节约资金、空间，并相对更为安全，从而对实验仪器要求的减弱使得实验方案可被更多实验室使用。
附图说明
[0031] 图1：检测的标准曲线。
具体实施方式
[0032] 结合以下具体
实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的
权利要求书为保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，本发明没有特别限制内容。
[0033] 1.实验采用试剂和仪器
[0034] 表1.实验所用的仪器
[0035]
[0036]
[0037] 表2.实验采用的试剂
[0038]
[0039] 实施例1
[0040] 1.1实验设计：
[0041] 本次实验收集了六只獐个体的毛发，每个发样做三个平行，检测时使用缓冲液作为空白组，标准曲线作为质控组，测定使用均匀混合的溶液。
[0042] 1.2样品前处理：
[0043] (1)获得獐的毛发(本实验所使用的毛发来自死亡个体、脱落及新生幼獐)；
[0044] (2)收集毛发样品后放于塑封袋中，置于冰盒内运输至实验室-80℃冰箱保存至预处理日；
[0045] (3)发样分别称重，每个发样萃取需要50mg，为使实验真实可靠设置三个平行，需要共计150mg，放入10ml EP管中加入5ml水，然后将样品室温下在旋转混匀仪上轻轻混合，洗涤3分钟，重复一次后，使用5ml异丙醇洗涤两次，后室温下于通风橱中干燥过夜；
[0046] (4)利用液氮和研钵磨碎清洗后的毛发；
[0047] (5)称出三份50mg研磨后毛发于2ml EP管中。向每管中加入1ml甲醇，并在室温下温育24小时；
[0048] (6)8000g离心混合溶液15min，然后取上清300μl，通风橱内65℃水浴干燥，所得的溶质中加入150μl磷酸缓冲盐溶液(实验过程中根据溶解情况可酌情增减缓冲液量，在本次实验中4加入了150μl，其它加入200μl)，-20℃冰箱储存至检测日；
[0049] 1.3酶联免疫吸附测定
[0050] 使用鹿皮质醇试剂盒，按照
说明书进行实验操作。
[0051] 操作步骤具体如下：
[0052] (1)标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。
[0053] (2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
[0054] (3)加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
[0055] (4)温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
[0056] (5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
[0057] (6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
[0058] (7)显色：每孔先加入
显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
[0059] (8)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
[0060] (9)测定：以空白孔调零，450nm
波长依序测量各孔的吸光度(0D值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
[0061] 表3.加样顺序表
[0062]
[0063] 表4.标准品数据
[0064]
[0065] 表5样品皮质醇测得数据
[0066]
[0067] 通过上述检测得到獐毛发中的皮质醇的浓度为0.987ng/mg～1.495ng/mg，(1.241±0.254)ng/mg(平均值±标准差)。
[0068] 2.总结
[0069] 2.1液氮研磨
[0070] 因为剪碎和室温研磨会引起毛发的局部高位影响实验的准确性。在本发明中通过液氮冷冻毛发，之后使用简单易得的研钵对毛发进行研磨，由于动物毛发本身就不长，因此完全不需要进行预剪，也因此避免了初步剪短带来的影响，并节约了操作时间。
[0071] 2.2室温萃取
[0072] 在预处理中，本发明采用了室温萃取，同时结合旋转混匀仪缓慢旋转，既保证了萃取的有效进行，也避免了高温处理带来的能耗问题，并且研磨后的毛发能够更好的和萃取液接触而不会因为需要保持温度处于静止状态影响萃取。且由于萃取时间多经过夜晚，相对于加热萃取的15-18h，24h对于实验时间上的影响并不显著，但室温更利于样品的稳定和提高抽提产量，从而更适用于样品少的情况。
[0073] 2.3萃取液通风橱内水浴干燥
[0074] 因为相较氮吹仪，水浴锅虽然不含氮吹的组件，但是却更易获得，不仅达到抽提效果，且水浴加热可以提高效率，同时由于不涉及氮气的使用，减少了实验的成本，对于实验人员的安全也有一定的意义，使实验操作者能更快的掌握实验的流程和仪器的使用。
[0075] 2.4溶质通风橱内水浴溶解
[0076] 本发明采取水浴溶解，能够使溶质完全溶解于缓冲液，避免了溶解不充分给实验带来的影响。同时也
加速了溶解，缩短了试验所需时间，提高了时间效率和抽提物的产量。
[0077] 本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
