技术领域
[0001] 本
发明属于有效物质的提取工艺技术及应用技术领域，具体涉及工业大麻花粉提取物及其制备和应用。
背景技术
[0002] 大麻(Cannabis sativa L.)，为大麻科(Cannabinaceca)大麻属(Cannabis)一年生草本
植物，其根、茎、花、叶、
种子等皆有广泛应用，相关产品种类已超过25000种。到目前为止，在大麻中已经发现了150多种具有潜在药用价值的成分，包括大麻素类化合物(包括四氢大麻酚(Tetrahydrocannabinol,THC)、大麻二酚(Cannabidiol,CBD)、大麻酚(Cannabinol,CBN)、大麻萜酚(Cannabigerol,CBG)和大麻环萜酚(Cannabichromene,CBC)等等)，黄
酮类化合物，多糖类，萜烯类等。
[0003] 大麻花粉中含有丰富的
蛋白质、
碳水化合物、黄酮类化合物、萜烯类化合物、微量元素等有效成分。经
云南省农业科学院大麻团队前期关于工业大麻花粉提取物
生物活性研究表明，提取物具有抗
氧化、抗
肿瘤、抗
辐射、抗疲劳、降血脂、降血糖、降低胆固醇、改善前列腺功能、提高免疫
力、增强智力发育等功效。但到目前为止，却未见对工业大麻花粉中有效物质提取方法的报道。
[0004] 工业大麻是四氢大麻酚含量＜0.3％的大麻，其含量通常
采样中国NY/T 3252.1-2018中推荐方法检测。
发明内容
[0005] 本发明针对上述问题，提供了一种工业大麻花粉提取物及其制备和应用。其技术方案如下：
[0006] 一种工业大麻花粉提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0007] (1)搅拌提取或
超声波提取，在工业大麻花粉中加入提取剂，采用搅拌提取或
超声波提取，过滤得到滤液为提取
混合液Ⅰ，得到的滤渣为剩余固体物；
[0008] (2)生物酶解提取，对剩余固体物用蛋白
水解酶酶解提取，过滤所得滤液为提取混合液Ⅱ；
[0009] (3)合并提取混合液Ⅰ和提取混合液Ⅱ得液体工业大麻花粉提取物，或合并提取混合液Ⅰ和提取混合液Ⅱ经浓缩干燥得固体工业大麻花粉提取物。
[0010] 进一步，步骤(1)中加入提取剂按工业大麻花粉
质量:提取剂体积为1kg:5～50L的比例加入提取剂。
[0011] 进一步，步骤(1)中所述的提取剂为水、甲醇、
乙醇、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、环己烷、正己烷中的一种或二种以上可以混溶的
溶剂，水为纯化水，其余物质为分析纯。
[0012] 进一步，步骤(1)中所述的搅拌提取是在
温度20～65℃下，搅拌反应1～24h，重复提取1～3次，提取2-3次时，将每次提取过滤得到的滤液合并为提取混合液Ⅰ，最后一次搅拌提取过滤得到的滤渣为剩余固体物；步骤(1)中所述的超声波提取是在温度为20～65℃、超声
频率为10-50KHz，超声0.5～12h，超声波提取1～3次，提取2-3次时，将每次提取过滤得到的滤液合并为提取混合液Ⅰ，最后一次超声波提取过滤得到的滤渣为剩余固体物。
[0013] 进一步，步骤(2)中所述的对剩余固体物用蛋白水解酶酶解提取具体包括，在剩余固体物中按1kg剩余固体物加入1～10L水或按1kg剩余固体物加入1～10L缓冲液的比例加入水或缓冲液，pH调整为2～10，再加入为剩余固体物质量的0.01～5％的蛋白水解酶，于20～65℃酶解0.5～72h，酶解后加热使酶失活，然后过滤，所得滤液为提取混合液Ⅱ。
[0014] 进一步，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液、
磷酸缓冲液或
醋酸缓冲液。
[0015] 进一步，步骤(2)中所述的蛋白水解酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、
风味蛋白酶、
碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或二种以上。
[0016] 本发明提供的一种工业大麻花粉提取物，用上述工业大麻花粉提取物的制备方法制备得到。
[0017] 本发明还提供工业大麻花粉提取物制剂，所述工业大麻花粉提取物制剂是用上述工业大麻花粉提取物制成临床上或药学上可接受的包括但不限于如下剂型的制剂：粉剂、片剂、胶囊剂，软胶囊剂、糖浆剂、酊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、水性药物、乳剂、混悬剂、凝胶、乳膏、
软膏、乳液、半固体膏、贴剂、喷雾剂或气雾剂。
[0018] 本发明还提供了上述工业大麻花粉提取物或工业大麻花粉提取物制剂在制备
治疗癌症药物中的应用。以及上述工业大麻花粉提取物在制备治疗肝癌药物或
肺癌药物中的应用，上述工业大麻花粉提取物制剂在制备治疗肝癌药物或肺癌药物中的应用。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 1.本发明的提取工艺独特，第一步采用搅拌提取或超声波提取，主要以得到的小分子化合物混合液，第二步采用生物酶解提取主要以得到肽类化合物，分开提取，最大程度的提取工业大麻花粉中的有效成分，经应用表明，本发明工业大麻花粉提取物在对肝癌细胞的生长、肺癌细胞的生长均有显著的抑制作用，并且对正常细胞的生长没有毒
副作用。
[0021] 2.工艺简单，条件温和，安全环保。提取全过程未使用毒性大的溶剂或
试剂。
具体实施方式
[0022] 以下结合具体
实施例，对本发明进一步详细说明。
[0023] 以下各实施例中所述的经除杂处理的工业大麻花粉是将工业大麻花粉过400目筛子，其
筛下物为经除杂处理的工业大麻花粉。
[0024] 实施例1工业大麻花粉提取物制备方法之一
[0025] (1)超声波提取：取1kg经除杂处理的工业大麻花粉，加入乙醇-水提取剂50L，在65℃下超声0.5h，超声频率为50KHz，用
滤纸过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，所述乙醇-水提取剂为分析纯乙醇:蒸馏水的体积比为1:1的混合溶剂，向滤渣Ⅰ中加入所述的乙醇-水提取剂10L，在65℃下超声0.5h，超声频率为50KHz，用滤纸过滤得滤液Ⅱ和滤渣Ⅱ，在滤渣Ⅱ中加入所述的乙醇-水提取剂10L，在65℃下超声0.5h，超声频率为50KHz，用滤纸过滤得滤液Ⅲ和滤渣Ⅲ，合并三次滤液(即合并滤液Ⅰ、滤液Ⅱ和滤液Ⅲ)、采用减压蒸馏方法浓缩合并的滤液至恒定重量即得提取混合液Ⅰ；滤渣Ⅲ即为剩余固体物质，滤渣Ⅲ0.85Kg备用。
[0026] (2)生物酶解提取：在步骤(1)所得的滤渣Ⅲ即剩余固体物质中加入8.5L醋酸缓冲液，调节pH值为10，加入17g木瓜蛋白酶和25.5g碱性蛋白酶，65℃下酶解72h后，加热至150℃维持3min使酶失活，然后用滤纸过滤，收集滤液采用减压蒸馏方法浓缩至恒定重量即得提取混合液Ⅱ。
[0027] (3)合并提取混合液Ⅰ和提取混合液Ⅱ，并
冷冻干燥(100Pa，72h)至固体即得工业大麻花粉提取物0.11kg，收率11％。
[0028] 实施例2：工业大麻花粉提取物制备方法之二
[0029] (1)搅拌提取：取1kg经除杂处理的工业大麻花粉，加入石油醚-乙酸乙酯提取剂5L，所述石油醚-乙酸乙酯提取剂为分析纯石油醚:分析纯乙酸乙酯的体积比为1:1的混合溶剂，在20℃下以转速为1000rpm搅拌反应24h，用滤纸过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，向滤渣Ⅰ中加入所述的石油醚-乙酸乙酯提取剂5L，在20℃下以转速为1000rpm搅拌反应24h，用滤纸过滤得滤液Ⅱ和滤渣Ⅱ，在滤渣Ⅱ中加入所述的石油醚-乙酸乙酯提取剂5L，在20℃下以转速为
1000rpm搅拌反应24h，用滤纸过滤得滤液Ⅲ和滤渣Ⅲ，合并滤液Ⅰ、滤液Ⅱ和滤液Ⅲ，采用减压蒸馏方法浓缩合并的滤液至恒定重量即得提取混合液Ⅰ0.74Kg；得滤渣Ⅲ(即剩余固体物质)为0.74kg备用。
[0030] (2)生物酶解提取：在滤渣Ⅲ(即剩余固体物质)中加入1L Tris-HCl缓冲液，调节pH值为2，加入7.4g胃蛋白酶，20℃下酶解0.5h后，加热至150℃维持3min使酶失活，然后用滤纸过滤，收集滤液采用减压蒸馏方法浓缩至恒定重量即得提取混合液Ⅱ。
[0031] (3)合并提取混合液Ⅰ和提取混合液Ⅱ，并冷冻干燥(100Pa，72h)至固体即得工业大麻花粉提取物0.19kg，收率19％。
[0032] 实施例3工业大麻花粉提取物制备方法之三
[0033] (1)超声波提取：取1kg经除杂处理的工业大麻花粉，加入丙酮-水提取剂A15L，所述丙酮-水提取剂A为分析纯丙酮:蒸馏水的体积比为1:9的混合溶剂，在35℃和超声频率为10KHz下超声12h，用滤纸过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，在滤渣Ⅰ中加入丙酮-水提取剂B10L，在35℃和超声频率为10KHz下超声12h，用滤纸过滤得滤液Ⅱ和滤渣Ⅱ，所述的丙酮-水提取剂B为分析纯丙酮:蒸馏水的体积比为1:1的混合溶剂，在滤渣Ⅱ中加入丙酮-水提取剂B10L，在35℃和超声频率为10KHz下超声12h，用滤纸过滤得滤液Ⅲ和滤渣Ⅲ，合并滤液Ⅰ、滤液Ⅱ和滤液Ⅲ，用减压蒸馏方法浓缩合并的滤液至恒定重量即得提取混合液Ⅰ；得滤渣Ⅲ(即剩余固体物质)0.83kg，备用。
[0034] (2)生物酶解提取：在滤渣Ⅲ(即剩余固体物质)中加入5L磷酸缓冲液，调节pH值为7.4，加入14.4g菠萝蛋白酶和10.5g木瓜蛋白酶白酶，35℃下酶解4h后，加热至150℃维持
3min使酶失活，然后用滤纸过滤，收集滤液采用减压蒸馏方法浓缩至恒定重量即得提取混合液Ⅱ。
[0035] (3)合并提取混合液Ⅰ和提取混合液Ⅱ，并冷冻干燥(100Pa，72h)至固体即得工业大麻花粉提取物0.145Kg，收率14.5％。
[0036] 实施例4：工业大麻花粉提取物体外抗癌实验研究
[0037] 样品：肝癌细胞株(Hep G2)、肺腺癌细胞株(A549)、人胚肺细胞(MRC-5)，均为市售。
[0038] 分别在RPMI 1640培养液中分别悬浮培养肝癌细胞株(Hep G2)、肺腺癌细胞株(A549)、人胚肺细胞(MRC-5)，将培养的细胞接种到96孔板中，细胞的
密度控制在0.9×104～1.1×104个/100μL间，均在37℃,5％CO2的
培养箱中培养24小时后，分别使用新的RPMI 1640培养液(其中分别含不同浓度(0-100μM)的
顺铂(CDPP)、工业大麻花粉提取物(为具体实施例1所得，0-100μg/mL)替换先前的培养液。以不加样品的RPMI 1640培养基为阴性对照，以含有不同浓度顺铂的RPMI 1640培养基为阳性对照，继续培养48小时。培养完毕后，在
96孔板中加入MTT溶液(5mg/ml PBS)25μL，在37℃,5％CO2条件下继续培养4小时，高速离心得到沉淀，再加入160μL DMSO使沉淀完全溶解。溶液放置在490nm
波长下，读取结果。以上操作重复进行3次取平均值，结果如下表1。
[0039] 表1工业大麻花粉提取物体外毒性实验
[0040]
[0041] 实施例4表明工业大麻花粉提取物在体外展现较好的抗癌活性，同时对正常细胞无毒性。
[0042] 实施例5：工业大麻花粉提取物软膏的制备
[0043] 在烧杯中加入
硬脂酸1.6g、单硬脂酸甘油酯0.8g、十八醇0.8g、液状
石蜡1.2g、水貂油1.2g，水浴加热至熔融后，缓慢加入预先混合均匀的混合试剂C，快速搅拌，冷却至乳状，再加入工业大麻花粉提取物1.5g，混匀后即得工业大麻花粉提取物软膏，所述混合试剂C由三乙醇胺0.18ml，甘油1.2g，尼泊金乙酯0.02g，超纯水0.4ml混和而成。
[0044] 实施例6：工业大麻花粉提取物颗粒剂的制备
[0045] 取1kg工业大麻花粉提取物加适量水溶解至稠膏状，再加入适量
蔗糖和糊精制成软材，不间断揉搓，通过10％v/v的乙醇溶液调节软材干湿度，直至“手握成团，轻压即散”程度，然后过16目筛，制成颗粒，低温干燥后既得工业大麻花粉提取物颗粒剂。
[0046] 实施例7：工业大麻花粉提取物
雪花膏的制备
[0047] 在烧杯中加入硬脂酸13g、单甘酯1g、十八醇2g、
白油2g、尼泊金甲酯0.2g、尼泊金丙酯0.1g，水浴加热至90℃，缓慢加入预先混合均匀的混合试剂D,剧烈搅拌10min，搅拌冷却至50℃，加入工业大麻花粉提取物0.3g，继续搅拌冷却至室温，即得工业大麻花粉提取物雪花膏，所述混合试剂D由水72ml、氢氧化
钾0.8g、甘油8g，加热至85℃，维持10min灭菌而成。
