一种检测抗胰岛素自身抗体的试纸条及其制备方法
阅读：332发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种检测抗胰岛素自身抗体的试纸条及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及免疫检测领域，公开了一种检测抗胰岛素自身 抗体 的 试纸 条，包括PVC 底板 、及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合释放垫、 硝酸 纤维 素膜和吸收垫，所述结合释放垫包被含胶体金标记的抗人IgG，所述硝酸 纤维素 膜上设有由羊抗鼠IgG抗体包被的质控线和胰岛素 抗原 包被的检测线。本发明还提供了所述试纸条的制备方法。本发明所述试纸条特异性强，不与其他自身抗体发生交叉反应；灵敏度检测结果显示性质稳定，重现性好。方法简单，操作方便，具有良好的应用前景。，下面是一种检测抗胰岛素自身抗体的试纸条及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种检测抗胰岛素自身抗体的试纸条，包括PVC底板、及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其特征在于，所述结合释放垫包被含胶体金标记的抗人IgG，所述硝酸纤维素膜上设有由所述抗人IgG的第二抗体包被的质控线和胰岛素抗原包被的检测线。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述抗人IgG为鼠源。
3.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述第二抗体为羊抗鼠二抗。
4.一种检测抗胰岛素自身抗体的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的试纸条。
5.根据权利要求1-3任一项所述试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备胶体金溶液；
(2)抗人IgG抗体进行胶体金标记；将胶体金与抗人IgG抗体混合，离心，用PBS溶液重悬沉淀，获得抗人IgG-胶体金复合物；
(3)制备金标结合释放垫：将抗人IgG-胶体金复合物均匀喷在结合释放垫上；
(4)制备硝酸纤维素膜：将所述抗人IgG的二抗和胰岛素抗原分别包被在硝酸纤维素膜上的质控线和检测线上；
(5)试纸条的组装：在干燥环境下，将样品垫、结合释放垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸收垫粘贴在PVC板上，裁切，获得试纸条。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述抗人IgG为鼠源。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述抗人IgG的二抗为羊抗鼠二抗。
一种检测抗胰岛素自身抗体的试纸条及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种免疫检测领域，特别是涉及一种检测抗胰岛素自身抗体的试纸条及其制备方法。
背景技术
[0002] 糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的常见病，临床以高血糖为主要标志，常见症状有多饮、多尿、多食以及消瘦等，分为1型和2型糖尿病两种类型。
[0003] 1型糖尿病有一定的家族聚集性。有研究报告双亲有糖尿病史，其子女1型糖尿病发病率为4％～11％；兄弟姐妹间1型糖尿病的家族聚集的发病率为6％～11％；同卵双生子1型糖尿病发生的一致性不到50％。
[0004] 人类白细胞抗原(HLA)基因位于第6对染色体短臂上，为一组密切连锁的基因群，HLA由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3类基因编码。Ⅰ类基因区域包括HLA-A、HLA-B、HLA-C和其他一些功能未明的基因及假基因，其编码的抗原分子存在于全部有核细胞的表面，负责递呈外来抗原给CD8的T淋巴细胞；Ⅱ类基因区域主要包括HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP3个亚区，分别编码DR、DQ和DP抗原，存在于成熟B淋巴细胞及抗原递呈细胞表面，负责递呈抗原给CD4细胞；Ⅲ类基因区域编码包括某些补体成分在内的一些可溶性蛋白，如C2C4A、C4B、肿瘤坏死因子(TNF)和热休克蛋白(HSP)等。HLA通过主要组织相溶性复合体(MHC)限制，参与T淋巴细胞识别抗原和其他免疫细胞的相互作用，以及自身耐受的形成和维持，在识别自身和异己、诱导和调节免疫反应等多个方面均具有重要作用。可见，HLA在许多自身免疫性疾病包括1型糖尿病的发生有相关性。
[0005] 1型糖尿病发生常与某些感染有关或感染后随之发生。常见的感染原有腮腺炎病毒、风疹病毒、巨细胞病毒、麻疹病毒、流感病毒、脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒及Epstein-Barr病毒等。
[0006] 已明确1型糖尿病由免疫介导的胰岛β细胞破坏所致，现已证实在1型糖尿病的发生发展过程中，可检测到多种针对胰岛β细胞的自身抗体(IAA)。在已确诊的1型糖尿病患者中，胰岛素自身抗体IAA的阳性率约为50％。胰岛素自身抗体对糖尿病的诊断、鉴别诊断及治疗具有非常重要的意义。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于，提供一种检测抗胰岛素自身抗体的试纸条，包括PVC底板、及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述结合释放垫包被含胶体金标记的抗人IgG，所述硝酸纤维素膜上设有由所述抗人IgG的第二抗体包被的质控线和胰岛素抗原包被的检测线。
[0008] 作为优选，所述抗人IgG为鼠源。更优选的，所述抗人IgG的二抗为羊抗鼠二抗。
[0009] 本发明应用抗原抗体反应及免疫层析一步法原理，即血清中抗胰岛素自身抗体(Human insulin autoantibodies，简称IAA)与检测试剂中胶体金标记的抗人IgG结合，再与硝酸纤维素膜上固定的胰岛素抗原结合，从而沉积下来形成检测色带，根据试纸中段检测线(Test-line简称T线)及其上方表示试纸有效的质控线(Control-line，简称C线)处有无色带显示，作为胰岛素依赖型糖尿病(1型糖尿病)辅助诊断的快速检测试纸。
[0010] 本发明还提供了包含所述试纸条的检测抗胰岛素自身抗体的试剂盒。
[0011] 本发明还提供所述试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (1)制备胶体金溶液；
[0013] (2)抗人IgG抗体进行胶体金标记；将胶体金与抗人IgG抗体混合，离心，用PBS溶液重悬沉淀，获得抗人IgG-胶体金复合物；
[0014] (3)制备金标结合释放垫：将抗人IgG-胶体金复合物均匀喷在结合释放垫上；
[0015] (4)制备硝酸纤维素膜：将所述抗人IgG的二抗和胰岛素抗原分别包被在硝酸纤维素膜上的质控线和检测线上；
[0016] (5)试纸条的组装：在干燥环境下，将样品垫、结合释放垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸收垫粘贴在PVC板上，裁切，获得试纸条。
[0017] 作为优选，所述抗人IgG为鼠源。更优选的，所述抗人IgG的二抗为羊抗鼠二抗。
[0019] 图1本发明所述试纸条的结构示意图。
[0020] 1-样品垫
[0021] 2-含胶体金标记的抗人IgG的结合释放垫
[0022] 3-包被胰岛素抗原和羊抗鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜
[0023] 4-吸收垫
[0024] 5-PVC底板。具体实施方式：
[0025] 本发明公开了一种抗胰岛素自身抗体检测试纸条，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0026] 实施例1：
[0027] 1)中间品溶液配制
[0029] 2、1％柠檬酸钠溶液的配制
[0030] 3、1％氯金酸溶液的配制
[0032] 5、0.1M tris-HCL PH8.0-8.5溶液配制方法
[0033] 6、0.1M磷酸盐缓冲液配制方法
[0034] 1、胶体金溶液的制备
[0035] 1.1制备器具：
[0037] 1.2配方：
[0038] 100ml水中加入1％氯金酸溶液1ml,煮沸后加入1.0-1.8ml 1％柠檬酸钠溶液。
[0039] 1.3操作步骤：
[0040] 1.3.1量取制备数量体积的实验室三级水；
[0041] 1.3.2把1％氯金酸溶液按一定比例完全溶解于实验室三级水中混匀加热至沸；
[0042] 1.3.3加入1％柠檬酸溶液，搅拌，溶液颜色发生变化，至颜色不再发生变化，停止搅拌加热，自然冷却到室温。
[0043] 2、鼠抗人IgG抗体标记、离心
[0044] 2.1制备器具：
[0045] 移液枪、烧瓶、电子控温磁力搅拌电热套、离心机
[0046] 2.2配方：
[0047] 1毫升胶体金溶液中加入2-6微升0.2M碳酸钾溶液，震荡混匀后加入10-15微升1.0mg/ml的
[0048] 鼠抗人IgG抗体混匀，1ml的标记蛋白的胶体金溶液中加入10％BSA 100ul为稳定剂，离心后复溶用之前溶液十分之一体积溶解。
[0049] 2.3操作步骤：
[0050] 2.3.1取检验合格的胶体金溶液。
[0051] 2.3.2搅拌状态下加入计算确定量的0.2M的碳酸钾溶液，然后加入1.0mg/ml的鼠抗人IgG抗体混匀；静止20分钟。
[0052] 2.3.3按计算数量加入10％牛血清白蛋白溶液混匀静止20分钟；
[0053] 2.3.4然后放入离心管内，10000rpm，离心10min，弃上清。
[0054] 2.3.5沉淀用计算的量的tris-HCL PH8.0-8.5复溶液溶解。
[0055] 3、IAA喷金
[0056] 3.1所需器具：
[0057] 三维平面划膜仪试剂瓶移液枪
[0058] 3.2工艺条件：
[0059] 干燥需在35～40℃，相对湿度≤40％的干燥箱内干燥。
[0060] 3.3操作步骤：
[0061] 3.3.1将三维平面划膜仪的喷金吸液管放入标记蛋白的胶体金溶液中。
[0062] 3.3.2取玻纤平铺在仪器上，设定8-12μl/cm喷量，进行喷金。
[0063] 3.3.3将喷好的玻纤置于试管架上，放入干燥箱内，35～40℃，相对湿度≤40％，干燥5～8小时。
[0064] 4、IAA包被
[0065] 4.1所需器具：
[0066] 连续划膜仪试剂瓶移液枪
[0067] 4.2工艺条件
[0068] 干燥需在35～40℃，相对湿度≤40％的干燥箱内干燥。
[0069] 4.3操作步骤：
[0070] 4.3.1移液枪量取按生产量计算的胰岛素抗原和羊抗鼠二抗分别于试剂瓶中。
[0071] 4.3.2用0.1M磷酸缓冲液分别稀释胰岛素抗原至0.8-2.0mg/ml,羊抗鼠二抗至0.8-2.0mg/ml.
[0072] 4.3.3撕去PVC板中端衬纸，对齐下划线粘贴宽度相当的硝酸纤维素膜，然后平铺在连续划膜仪上划线，设定划线浓度为0.8-1.5μl/cm，一号管路包被胰岛素抗原，二号管路包被羊抗鼠二抗。
[0073] 4.3.4将喷好的PVC板置于试管架上，放入干燥箱内，35～40℃，相对湿度≤40％，干燥5～8小时。
[0074] 5、IAA大板组装
[0075] 5.1所需器具：
[0076] 裁纸刀
[0077] 5.2操作步骤：
[0078] 6.2.11取检验合格的粘贴好的试纸大板，(条型(卡型不需要)：手持端贴不干胶，加样品端贴标有MAX线的不干胶)，放入斩切机中，切成指令中规定宽度的试纸条。批量切条前，先切10条，由生产人员从中随机抽查测量3条，正常试纸条宽度误差不大于±0.04mm。卡型：将试纸放入卡塑件，使用压壳机压壳。
[0079] 6.2.2装袋
[0082] 实施例2：质控标准
[0083] 1)原料质量标准
[0084] 1.1外观
[0085] 肉眼观察，抗体均为澄清透明的液体，不含异物，浑浊或摇不散的沉淀。
[0086] 1.2纯度和分子量：
[0087] 鼠抗人IgG抗体蛋白分子量主要集中在25KD左右纯度≥95％
[0088] 羊抗鼠IgG二抗纯度≥90％
[0089] 1.3蛋白浓度
[0090] 胰岛素抗原的含量≥27U/ml
[0091] 鼠抗人IgG抗体≥1.0mg/ml、羊抗鼠IgG二抗≥1.0mg/ml。
[0092] 1.4效价：
[0093] 鼠抗人IgG抗体效价1：64
[0094] 羊抗鼠IgG二抗1：64
[0095] 1.5生物活性
[0096] 用胶体金制备的一般方法，用胰岛素抗原包被检测线，用羊抗鼠IgG抗体包被质控线，用鼠抗人IgG抗体标记胶体金，制备试剂小样，检测灵敏度、特异性、稳定性符合要求。
[0097] 2)辅料验收标准
[0098] 1硝酸纤维素膜
[0099] 厚度：215±20um。
[0100] 毛细迁移速率：每4cm，水的层析时间是135±30s。
[0101] 2.玻璃纤维素膜
[0102] 外观：表面平整、无污迹，纤维结构均匀、致密。
[0103] 厚度：胶金垫：0.5±0.05mm。
[0104] 液体移行速度：移行速度≥5mm×70mm/min
[0105] 3、其它辅料
[0106] PVC板、吸水滤纸、MAX线标贴、色皮标签等均购自有资质的厂家，并制定相应的验收标准。
[0107] 1、胶体金溶液的质量标准
[0108] 外观：玫瑰红色透明液体。
[0109] 吸光度：A395/A405吸光度≥1。
[0110] 2、标记、离心质量标准
[0111] 喷金烘干后外观：平整洁净，无破损，无污染。保持金标鼠抗人IgG抗体原有的玫瑰红色，不得发生颜色变化。
[0112] 性能检测：
[0113] 灵敏度检测：空白对照液：检测含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液不显色。检测含50mU/mLIAA标准品的样品液：只在质控线显色，检测线不显色。检测含150mU/mLIAA标准品的样品液：质控线和检测线均显色。检测含300mU/mLIAA标准品的样品液：质控线和检测线均显色。
[0114] 特异性检测：不与其他自身抗体发生交叉反应。
[0115] 批内精密度检测：检测含50mU/mLIAA标准品的样品液：反应结果一致，显色均一。检测含150mU/mLIAA标准品的样品液：反应结果一致，显色均一。检测含300mU/mLIAA标准品的样品液：反应结果一致，显色均一。
[0116] 3、半成品质量标准
[0117] 外观：平整洁净，无破损，无污染，各组分齐全，位置正确，粘贴牢固无脱落。
[0118] 灵敏度检测：空白对照液：检测含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液不显色。检测含50mU/mLIAA标准品的样品液：只在质控线显色，检测线不显色。检测含150mU/mLIAA标准品的样品液：质控线和检测线均显色。检测含300mU/mLIAA标准品的样品液：质控线和检测线均显色。
[0119] 特异性检测：不与其他自身抗体发生交叉反应。
[0120] 批内精密度检测：检测含50mU/mLIAA标准品的样品液：反应结果一致，显色均一。检测含150mU/mLIAA标准品的样品液：反应结果一致，显色均一。检测含300mU/mLIAA标准品的样品液：反应结果一致，显色均一。
[0121] 4、成品质量标准
[0122]
[0124] 实施例3：
[0125] 1.2功能性检验
[0126] 用检验合格的已经划膜的大板和待检的胶金垫粘贴后做成试纸条，做功能性检验。
[0127] 1.2.1灵敏度检测
[0128] 1.2.1.1试剂：空白对照液：含牛血清白蛋白(简称BSA，下同)的磷酸盐缓冲液(PBS)0.01mol/L，pH7.2～pH7.4。
[0129] 测定样品液：含有50mU/mL、150mU/mL和300mU/mL IAA标准品的样品液。
[0130] 配制方法:用含BSA的磷酸盐缓冲液稀释IAA标准品浓度分别为50mU/mL、150mU/mL和300mU/mL。
[0131] 1.2.1.2仪器：秒表
[0132] 1.2.1.3操作步骤：
[0133] 1.2.1.3.1随即抽取同一批号3份产品，检测空白对照液，条型的样品垫一端浸入样品液至少20秒钟后取出，若卡型的则在加样孔内加入3滴样品液，开始计时，在10-15分钟内读取结果，质控线显色均一，检测线均不显色，则判为合格，否则判为不合格；
[0134] 1.2.1.3.2 50mU/mL样品液检测量及检测方法同上，3份产品检测线的结果只在质控线显色，检测线不显色，则判为合格，否则判为不合格；
[0135] 1.2.1.3.3 150mU/mL样品液检测量及检测方法同1.2.1.3.1，3份产品检测线的结果质控线和检测线均显色，则判为合格，否则判为不合格；
[0136] 1.2.1.3.3 300mU/mL样品液检测量及检测方法同1.2.1.3.1，3份产品检测线的结果质控线和检测线均显色，则判为合格，否则判为不合格。
[0137] 1.2.2特异性测定
[0138] 不与其他自身抗体发生交叉反应。
[0139] 1.2.3批内精密度测定
[0140] 1.2.3.1试剂
[0141] 测定样品液：含有50mU/mL、150mU/mL和300mU/mL IAA标准品的样品液。
[0142] 配制方法:用含BSA的磷酸盐缓冲液配制50mU/mL、150mU/mL和300mU/mL IAA样品[0143] 1.2.3.2仪器：秒表
[0144] 1.2.3.3操作步骤
[0145] 1.2.3.3.1随即抽取同一批号10份产品，检测50mU/mL IAA标准品的样品液，条型的样品垫一端浸入样品液至少20秒钟后取出，若卡型的则在加样孔内加入3滴样品液，平放于平面上，开始计时，在10-15分钟内读取结果，反应结果应一致，显色应均一。
[0146] 1.2.3.3.2 150mU/mL IAA标准品的样品液测定方法同上。
[0147] 1.2.3.3.3 300mU/mL IAA标准品的样品液测定方法同上。
[0148] 3)胶金垫的检查方法及控制
[0149] 1.1外观：肉眼观察外观应符合要求。
[0150] 1.2功能性检验
[0151] 用检验合格的已经划膜的大板和待检的胶金垫粘贴后做成试纸条，做功能性检验。
[0152] 1.2.1灵敏度检测
[0153] 1.2.1.1试剂：空白对照液：含牛血清白蛋白(简称BSA，下同)的磷酸盐缓冲液(PBS)0.01mol/L，pH7.2～pH7.4。
[0154] 测定样品液：含有50mU/mL、150mU/mL和300mU/mL IAA标准品的样品液。
[0155] 配制方法:用含BSA的磷酸盐缓冲液稀释IAA标准品浓度分别为50mU/mL、150mU/mL和300mU/mL。
[0156] 1.2.1.2仪器：秒表
[0157] 1.2.1.3操作步骤：
[0158] 1.2.1.3.1随即抽取同一批号3份产品，检测空白对照液，条型的样品垫一端浸入样品液至少20秒钟后取出，若卡型的则在加样孔内加入3滴样品液，开始计时，在10-15分钟内读取结果，质控线显色均一，检测线均不显色，则判为合格，否则判为不合格；
[0159] 1.2.1.3.2 50mU/mL样品液检测量及检测方法同上，3份产品检测线的结果只在质控线显色，检测线不显色，则判为合格，否则判为不合格；
[0160] 1.2.1.3.3 150mU/mL样品液检测量及检测方法同1.2.1.3.1，3份产品检测线的结果质控线和检测线均显色，则判为合格，否则判为不合格；
[0161] 1.2.1.3.3 300mU/mL样品液检测量及检测方法同1.2.1.3.1，3份产品检测线的结果质控线和检测线均显色，则判为合格，否则判为不合格。
[0162] 1.2.2特异性测定
[0163] 不与其他自身抗体发生交叉反应。
[0164] 1.2.3批内精密度测定
[0165] 1.2.3.1试剂
[0166] 测定样品液：含有50mU/mL、150mU/mL和300mU/mL IAA标准品的样品液。
[0167] 配制方法:用含BSA的磷酸盐缓冲液配制50mU/mL、150mU/mL和300mU/mL IAA样品[0168] 1.2.3.2仪器：秒表
[0169] 1.2.3.3操作步骤
[0170] 1.2.3.3.1随即抽取同一批号10份产品，检测50mU/mL IAA标准品的样品液，条型的样品垫一端浸入样品液至少20秒钟后取出，若卡型的则在加样孔内加入3滴样品液，平放于平面上，开始计时，在10-15分钟内读取结果，反应结果应一致，显色应均一。
[0171] 1.2.3.3.2 150mU/mL IAA标准品的样品液测定方法同上。
[0172] 1.2.3.3.3 300mU/mLIAA标准品的样品液测定方法同上。
[0173] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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