本発明は、酵素の活性化方法、クエン酸類の使用方法、及び運動持久力の向上方法に関する。

一般に、クエン酸はレモン、ミカン等の柑橘類に多く含まれ(例えば、1350mg/レモン1個)、生体内においては、クエン酸回路(TCA回路、クレブス回路)の一成分をなす物質として知られている。また、これまでにクエン酸には生体に対する様々な効能があることが報告されている。例えば、特許文献1〜3は、クエン酸を摂取することにより、肉体的及び精神的疲労に対する予防効果や改善・回復促進効果が得られることを開示している。

特開平9−059161号公報

特開平10−175856号公報

特開2000−333651号公報

この発明の目的は、クエン酸シンテターゼ及びコハク酸デヒドロゲナーゼの少なくとも一種の酵素の活性化方法、新規なクエン酸類の使用方法、並びに運動持久力の向上方法を提供することにある。

上記の目的を達成するために請求項1に記載の酵素の活性化方法は、クエン酸及びクエン酸塩の少なくとも一種を取り込むことにより生体内のクエン酸シンテターゼ及びコハク酸デヒドロゲナーゼの少なくとも一種を活性化させることを特徴とする。

請求項2に記載の酵素の活性化方法は、クエン酸及びクエン酸塩の少なくとも一種を取り込むことにより生体内のクエン酸シンテターゼ及びコハク酸デヒドロゲナーゼの少なくとも一種により生成される生成物の単位時間当たり生成量の最大値を増加させることを特徴とする。

請求項3に記載のクエン酸類の使用方法は、クエン酸及びクエン酸塩の少なくとも一種のクエン酸類を組成物中に配合させることにより、前記組成物に対して、クエン酸シンテターゼ及びコハク酸デヒドロゲナーゼの少なくとも一種により生成される生成物の単位時間当たり生成量の最大値を増加させる機能を付与することを特徴とする。

請求項4に記載の運動持久力の向上方法は、クエン酸及びクエン酸塩の少なくとも一種を取り込むことにより運動持久力を向上させることを特徴とする。

本発明によれば、クエン酸シンテターゼ及びコハク酸デヒドロゲナーゼの少なくとも一種の酵素を活性化させることができる。また、新規なクエン酸類の使用方法が提供される。また、本発明によれば、運動持久力を向上させることができる。

クエン酸回路活性化剤を投与した場合におけるクエン酸シンテターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を測定した結果を示すグラフ。

クエン酸回路活性化剤を投与した場合における遊泳持続時間を測定した結果を示すグラフ。

以下、本発明を具体化したクエン酸回路活性化剤の実施形態を詳細に説明する。 本実施形態のクエン酸回路活性化剤は、クエン酸類を有効成分とするものであり、体内においてクエン酸回路を活性化させる作用を有する。より具体的には、クエン酸回路に関与する酵素を活性化させることにより、クエン酸回路全体の活性を高める作用を有する。なお、ここでいう酵素の活性化とは、単位時間当たりに生成される生成物の量が増加した場合すべてを含む。酵素反応により生成される生成物の量が増加する要因としては、例えば、酵素量の増加や反応速度の増加等が挙げられるが、酵素の反応速度が増加することがとくに好ましい。

クエン酸回路は、ほとんどの生物の酸化的代謝に共通な経路であり、アセチル−CoA(アセチル補酵素A)のアセチル基を2分子のCO₂に酸化するとともに、その際に遊離するNADH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)を電子伝達系においてATP(アデノシン三リン酸)の生産に利用するシステムである。ATPは生体内においてエネルギーを貯蓄・供給する作用を有する分子であるため、クエン酸回路は生体内のエネルギー生産に非常に重要な役割を担っているということができる。

具体的には、クエン酸回路は、クエン酸シンテターゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニル−CoAシンテターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼの8つの酵素が関与して構成されている。これら8酵素の酵素反応によって、1個のアセチル基が2分子のCO₂に酸化されるとともに、3分子のNADH、1分子のFADH₂、及び1分子のGTP(グアノシン三リン酸)又はATPが生産される。ここで生産された3分子のNADH及び1分子のFADH₂は、電子伝達系において11分子のATPの生産に寄与する。したがって、クエン酸回路が1回転することにより、合計12分子のATPが生産されることになる。

よって、クエン酸回路を活性化させる作用を有する本実施形態のクエン酸回路活性化剤を生体に適用すると、生体内においてより効率的にエネルギーが生産されるという優れた効果を発揮する。また、クエン酸回路は老化とともにその機能が低下することが示唆されているため、本実施形態のクエン酸回路活性化剤はそのようなクエン酸回路の機能低下に対する予防・改善に対しても有用であることが期待できる。

本発明のクエン酸回路活性化剤の有効成分として含有されるクエン酸類としては、クエン酸及びクエン酸塩から選ばれる少なくとも一種が挙げられる。クエン酸としては、クエン酸無水物及びクエン酸水和物のいずれを用いてもよい。クエン酸塩としては、薬学的に許容される塩であればよく、例えばクエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸マグネシウム、クエン酸カルシウム等が挙げられる。これらのクエン酸類としては、発酵法による生合成品、化学合成品、天然物から水・親水性有機溶媒等を用いて抽出した抽出品のいずれを使用してもよい。クエン酸類の配合形態としては、生合成品、化学合成品、天然物からの抽出又は精製品を直接クエン酸回路活性化剤中へ配合してもよく、クエン酸類を含有する素材をクエン酸回路活性化剤中に配合させてもよい。なお、これらのクエン酸類は、単独で配合してもよく、二種以上を組み合わせて配合してもよい。

また、クエン酸類を含有する素材としては、例えば野菜、果実、もろみ酢等が挙げられる。とくにウメや柑橘類といった果実にクエン酸類は多く含まれており、クエン酸類を含有する素材として、好ましくはレモン、オレンジ、ライム、グレープフルーツ、スダチ等の柑橘類が用いられる。クエン酸類を含有する素材として、柑橘類由来の原料を使用する場合、好ましくは柑橘類の果汁等の圧搾液又はその濃縮物が用いられる。その他、果実(果皮(アルベド、フラベド)、じょうのう膜及びさのう等)、又はその果実の構成成分の一部を含有するものの圧搾液を使用してもよい。

本実施形態のクエン酸回路活性化剤は、主にクエン酸回路を活性化する作用を効果・効能とする医薬品、医薬部外品、健康食品、特定保健用食品、健康飲料、栄養補助食品等の組成物に配合されることにより摂取される。

本実施形態のクエン酸回路活性化剤を医薬品として使用する場合は、服用(経口摂取)により投与する場合の他、血管内投与、経皮投与等のあらゆる投与方法を採用することが可能である。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。また、本発明の目的を損なわない範囲において、添加剤としての賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。

本実施形態のクエン酸回路活性化剤を飲食品として使用する場合、種々の食品素材又は飲料品素材に添加することによって、例えば、粉末状、錠剤状、顆粒状、液状(ドリンク剤等)、カプセル状、シロップ、キャンディー等の形状に加工して健康食品製剤、栄養補助食品等として使用することができる。上記の飲食品としては、具体的にはスポーツドリンク、茶葉やハーブなどから抽出した茶類飲料、牛乳やヨーグルト等の乳製品、ペクチンやカラギーナン等のゲル化剤含有食品、グルコース、ショ糖、果糖、乳糖やデキストリン等の糖類、香料、ステビア、アスパルテーム、糖アルコール等の甘味料、植物性油脂及び動物性油脂等の油脂等を含有する飲料品や食料品が挙げられる。また、本発明の目的を損なわない範囲において、基材、賦形剤、添加剤、副素材、増量剤等を適宜添加してもよい。

なお、このクエン酸回路活性化剤を医薬品又は飲食品として摂取する場合には、成人1日当たりクエン酸類含有量として好ましくは1〜10g、より好ましくは2〜5gである。有効成分であるクエン酸類の1日当たりの摂取量が1g未満の場合にはクエン酸類によるクエン酸回路活性化作用を効果的に高めることができないおそれがある。一方、1日当たりの摂取量が10gを超える場合には、その多くが排泄されてしまうために不経済である。

次に本実施形態における作用効果について、以下に記載する。 (1)本実施形態のクエン酸回路活性化剤は、クエン酸類を有効成分とし、体内においてクエン酸回路を活性化させる作用を有している。このため、本実施形態のクエン酸回路活性化剤は、生体内における効率的なエネルギー生産を促す生体機能促進剤として使用することができる。また、本実施形態のクエン酸回路活性化剤は、クエン酸回路の機能低下に対する予防・改善にも有用である。また、生体内においてエネルギー生産が効率化されることにより、運動持久力の向上や疲労を軽減させることができる。

(2)本実施形態におけるクエン酸類は柑橘類に多く含有されるため、抽出処理等を行なうことによりクエン酸類を容易かつ適切に精製・入手することができる。とくに、柑橘類としてレモンを用いると高濃度のクエン酸類を容易に入手することが可能である。また、柑橘類由来のクエン酸類を利用した場合には、天然成分由来であることから、安全性が高く、医薬品、飲食品に容易に適用することができる。

なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。 ・ 本実施形態のクエン酸回路活性化剤を、例えば馬、牛等のヒト以外の動物に使用してもよい。

・ 本実施形態のクエン酸回路活性化剤を、クエン酸回路に関与する酵素を活性化させる酵素活性化剤として使用してもよい。 ・ 本実施形態のクエン酸回路活性化剤を、疲労軽減剤として使用してもよい。

次に、各試験例を挙げて前記実施形態をさらに具体的に説明する。 (試験例1:クエン酸回路活性化剤によるクエン酸回路に関与する酵素の活性化に関する試験) 複数のddYマウス(6週齢、オス)を用意し、これらを5日間の予備飼育後に遊泳運動を行わせ、体重と遊泳時間が平均的となるように投与群1と対照群1との2群に群別し、これらを用いて本発明のクエン酸回路活性化剤のクエン酸回路活性化効果を検証した。投与群のddYマウスには、体重1kg当たり125mgとなる量のクエン酸を蒸留水500μlに溶解させたもの(実施例1)を、また、対照群のddYマウスには蒸留水500μl(比較例1)をそれぞれ定期的に経口投与した。投与スケジュールは、週6日間(月〜土)、1日1回、原則として16:00〜17:00の間とし、これを5週間継続した。また、各群のddYマウスには1週間毎に遊泳運動を行なわせた。遊泳運動は、体重の7%の錘を付け、頭部が水面下に5秒間沈むまで行った。

投与5週目は、遊泳運動を行なわせることなく、各群のddYマウスの解剖を行なった。そして、各群のddYマウスにおける筋肉中のクエン酸シンテターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性をそれぞれ測定した。

クエン酸シンターゼ活性は、Srereらの方法により測定を行った。具体的には、筋肉ホモジネート液に1mM DTNB、10mM acetyl−CoAを含む0.1M Tris−HCl Bufferを加え、25℃の温水中に10分間静置し、温度平衡に達した後、10mM oxaloacetateを添加して反応を開始させた。反応開始後5分間にわたり分光光度計を用いて412nmの吸光度の変化を測定した。

コハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、Ackrellらの方法により測定を行った。具体的には、0.3M リン酸緩衝液、30mM EDTA、0.4M コハク酸、3%ウシ血清アルブミン、10mM フェリシアン化カリウムを加え、25℃の温水中に10分間静置した。筋肉ホモジネート液を加え、反応を開始させた。反応開始後10分間の455nmの吸光度の変化を測定した。

リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性は、Pattakらの方法により測定を行った。具体的には、筋肉ホモジネート液を500mM imidazole−HCl buffer pH 7.4で希釈した。その0.02mlをマイクロセルに取り、50mM imidazole−HCl buffer pH 7.4を加え、1.5mM NADHを加え、30℃で5分間静置後、412nmで吸光度を測定した。さらに、5mM oxaloacetateを加え、同様に1分間静置し、3分間の吸光度測定を行った。

また、有意差検定については、実施例1を投与した投与群1と比較例1を投与した対照群1との比較について対応のあるt検定を実施した。それらの結果を図1に示す。なお、図1において、「*」は、t検定の結果がp<0.05であることを示す。

図1に示す結果から、比較例1を投与した対照群1と比較して、実施例1を投与した投与群1では、クエン酸シンテターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼのいずれにおいても、その活性が高められる傾向にあることが確認された。とくに、クエン酸シンテターゼ及びコハク酸デヒドロゲナーゼの酵素活性については、比較例1を投与した場合と比較して実施例1を投与した場合に有意に高められることが確認された。

上記結果から、クエン酸を摂取することによりクエン酸シンテターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性が高められることが確認された。クエン酸シンテターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、クエン酸回路に関与する酵素であるため、クエン酸を摂取することによりクエン酸回路全体の活性が高められるということができる。

上述したとおり、クエン酸回路は生体内のエネルギー生産に寄与するシステムであることから、クエン酸回路が活性化されることによって、生体内においてより効率的にエネルギーが生産されるということが示唆される。これらの結果から、実施例1のクエン酸回路活性化剤は、生体内において効率的なエネルギー生産を促すという作用を発揮するものであるということができる。よって、生体内における効率的なエネルギー生産を促す生体機能促進剤として使用可能である。

(試験例2:クエン酸回路活性化剤による運動持久力の向上に関する試験) 複数のddYマウス(4週齢、オス)を用意し、これらを7日間の予備飼育後に遊泳運動を行わせ、体重と遊泳時間が平均的となるように、投与群2、投与群3及び対照群2の3群に群別し、これらを用いて本発明のクエン酸回路活性化剤の運動持久力の向上効果を検証した。投与群2のddYマウスには、体重1kg当たり62.5mgとなる量のクエン酸を蒸留水500μlに溶解させたもの(実施例2)を、投与群3のddYマウスには、体重1kg当たり125mgとなる量のクエン酸を蒸留水500μlに溶解させたもの(実施例3)を、また、対照群2のddYマウスには蒸留水500μl(比較例2)をそれぞれ定期的に経口投与した。実施例2、3及び比較例2は、1日1回ずつ投与し、これを5週間継続した。また、1週間毎に遊泳運動を行い、遊泳持続時間を測定した。遊泳持続時間は、体重の10%の錘を付けた遊泳運動において、頭部が水面下に5秒間沈むまでの時間とした。

また、有意差検定については、実施例2、3を投与した投与群2、3と比較例2を投与した対照群2との比較について対応のあるt検定を実施した。それらの結果を図2に示す。なお、図2において、「**」は、t検定の結果がp<0.01であることを示し、「***」は、t検定の結果がp<0.005であることを示す。

図2の結果から、比較例2を投与した対照群2と比較して、実施例2、3を投与した投与群2、3では、遊泳持続時間が長くなることが確認された。とくに、実施例3を投与した投与群3の遊泳持続時間は、3週目以降、対照群2と比較して有意に長くなることが明らかになった。この運動持久力の向上は、クエン酸を摂取することにより、クエン酸回路が活性化されたことに起因するものであると考えられる。また、この結果はクエン酸が抗疲労作用を有することを示唆する。

次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について記載する。 ○ クエン酸類を有効成分として含有し、クエン酸回路に関与する酵素を活性化させることを特徴とする酵素活性化剤。

○ クエン酸類を有効成分として含有し、クエン酸シンテターゼを活性化させることを特徴とするクエン酸シンテターゼ活性化剤。 ○ クエン酸類を有効成分として含有し、コハク酸デヒドロゲナーゼを活性化させることを特徴とするコハク酸デヒドロゲナーゼ活性化剤。

○ クエン酸類を有効成分として含有し、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを活性化させることを特徴とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性化剤。 ○ 前記クエン酸類は柑橘類由来であることを特徴とするクエン酸回路活性化剤。

○ 前記クエン酸回路活性化剤を有効成分として含有することを特徴とする飲料組成物。