一种可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化的试剂盒
及其应用
技术领域
[0001] 本
发明涉及一种可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化程度的试剂盒及其应用，属于辅助诊断恶性肝癌的检测试剂盒技术领域。
背景技术
[0002] 肝癌是肝脏部分的
肿瘤病变，分为原发性肝癌和继发性肝癌。原发性肝癌是全世界范围内最常见的
恶性肿瘤之一，位于临床恶性肿瘤发病率第5位，病死率更是高居第3位，但对其发病分子机制尚不完全清楚。目前，肝癌的筛查主要应用甲胎蛋白(AFP)、超声和其它影像学结合的诊断技术，但超声或影像学手段受到技术设备或
费用的限制，无法广泛应用。AFP被临床广泛认为是诊断肝癌的首选血清标志物，但对早期肝癌的检出率不高，其诊断准确性及敏感性均不太令人满意。因此，有必要探索更多的分子检测指标，对肝癌患者做到及早诊断，提高肝癌患者总体生存率。
[0003] GRB2是包含SH2功能域的接头蛋白，它在致癌基因Ras的信息传导途径中起着关键的作用，被认为是抗肿瘤药物设计的优秀靶标。GRB2在多种肿瘤中高表达，如膀胱癌、
乳腺癌和肝癌，并且GRB2的表达与
预后不良密切相关。近年来，RNA甲基化被证实参与调控肿瘤的发生与发展。研究表明，癌相关基因RNA的高甲基化能促进结肠癌的发生，并于预后低生存率密切相关。癌细胞的低分化与癌细胞的恶性程度呈高度相关，即分化越低的癌细胞恶性程度越高。我们在肝癌中同样发现了癌相关基因GRB2 mRNA的异常高甲基化，并发现它与肝癌的恶性程度显著相关。本
专利所涉及的试剂盒和方法提供了一种高效的GRB2 mRNA甲基化检测途径，方便快捷地在分子
水平上实现对肝癌的恶性程度进行辅助检测。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服
现有技术中存在的
缺陷和不足，在上述研究的
基础上，提供一种可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化程度的试剂盒及其应用，其中GRB2 mRNA甲基化水平在肝癌中显著高于正常肝组织，可通过对样本RNA甲基化水平测定辅助诊断肝癌。
[0005] 本发明的目的是这样实现的，一种可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化程度的试剂盒，包括GRB2 mRNA甲基化特异性扩增上游引物、GRB2 mRNA甲基化特异性扩增下游引物及其GRB2 mRNA甲基化特异性测序引物，其中所述的GRB2 mRNA甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
[0006] 5’-TGTTTAGGGTGTAGTGTGAGTGT-3’；
[0007] 所述的GRB2 mRNA甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
[0008] 5’-Biotin-ACTTCCTCCTCCACTCTCCTTATCTA-3’；
[0009] 所述的GRB2 mRNA甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
[0010] 5’-AAGAGGGAAGGTGAT-3’。
[0011] 上述可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化程度的试剂盒的应用，其特征在于：该试剂盒可用于恶性肝癌辅助诊断，具体步骤为：
[0012] 1)、从待检测组织样本中提取RNA；
[0013] 2)、将提取的RNA进行重亚
硫酸盐修饰；
[0014] 3)、将重亚
硫酸盐修饰后的RNA逆转录成cDNA；
[0015] 4)、将获得的cDNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列为引物序列，进行PCR扩增反应；
[0016] 5)、以SEQ ID NO.3序列为测序引物序列，通过焦
磷酸测序方法，对上述PCR产物进行甲基化定量检测分析。
[0017] SEQ ID NO.1：5’-TGTTTAGGGTGTAGTGTGAGTGT-3’。
[0018] SEQ ID NO.2：5’-Biotin-ACTTCCTCCTCCACTCTCCTTATCTA-3’。
[0019] SEQ ID NO.3：5’-AAGAGGGAAGGTGAT-3’。
[0020] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含一对GRB2 mRNA甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，GRB2 mRNA的高甲基化与肝癌的恶性程度显著相关，通过检测GRB2 mRNA的甲基化程度，为恶性肝癌辅助诊断提供新的思路。
[0021] 综上所述，以基因GRB2 mRNA甲基化水平为基础的
诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对恶性肝癌的检测。
附图说明
[0022] 图1为被检测序列所在的区域(NM_002086.5，2408C)，以及所检测位点在肝癌及癌旁组织中的平均甲基化水平(n＝55)；
[0023] 图2为甲基化水平检测结果示例(如图所示，肝癌样本中甲基化水平为46％，对应癌旁样本中甲基化水平为21％)。
具体实施方式
[0024] 下面结合具体
实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0025] 1、研究对象的收集
[0026] 本研究选取北京某医院手术
切除的肝癌患者55例手术标本(含对应癌旁组织)作为研究对象。所有病例诊断依据患者的临床资料和影像学检查等，并得到术后病理诊断确认。手术切除肝癌组织和癌旁组织(距离癌组织至少5cm以上的正常组织)立即液氮速冻并保存于-80℃
冰箱，用于总RNA提取。所有研究对象都签署知情同意书。
[0027] 2、总RNA提取
[0028] 通过TRizol法提取组织总RNA,并通过NanoDrop3000超微量分光光度计检测所得RNA的浓度。
[0029] 3、RNA甲基化水平测定
[0030] 本实验采用焦磷酸测序技术对GRB2 mRNA C2408位点进行甲基化分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理RNA样品后，甲基化的胞嘧啶(C)不发生变化，而非甲基化的C转变成尿嘧啶(U)，随后进行逆转录并用特异性引物对靶区域PCR扩增，通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生甲基化。本研究通过PyroMark Assay Design
软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：
[0031] 甲基化特异性上游引物的核苷酸序列如下：
[0032] 5’-TGTTTAGGGTGTAGTGTGAGTGT-3’；
[0033] 甲基化特异性下游引物的核苷酸序列如下：
[0034] 5’-Biotin-ACTTCCTCCTCCACTCTCCTTATCTA-3’；
[0035] 甲基化特异性测序引物的核苷酸序列下：
[0036] 5’-AAGAGGGAAGGTGAT-3’。
[0037] RNA甲基化水平测定的具体步骤：
[0038] 第一步：采用EZ RNA甲基化试剂盒(EZ RNA Methylation Kit；Zymo Research，A-R5001)对样本RNA进行亚硫酸盐转化；
[0039] 第二步：使用HiScriptIII1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme，R312)将重亚硫酸盐转化的总RNA逆转录成cDNA。取1ulcDNA产物，利用Pyromark PCR Kit(Qiagen，978703)以及上述GRB2甲基化特异性扩增上游引物和下游引物进行PCR扩增，扩增条件：95℃15min预变性；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共45个循环扩增；72℃10min终延伸。
[0040] 第三步：首先配置预混液，包括40ul结合缓冲液(PyroMark Binding Buffer，Qiagen，979006)，1ul链霉亲和素包被的琼脂糖珠(GE Healthcare，17-5113-01)，19ul超纯水。24孔PCR板每孔加入60ul预混液，并加入20ul PCR产物，1400rpm震荡混匀10min。将测序引物用
退火缓冲液(PyroMark Annealing Buffer，Qiagen，979009)稀释至0.375uM，向24孔加样板(PyroMark Q24 Plate)每孔加入20ul稀释后的测序引物。在
真空工作站(PyroMark Q24 Vacuum Workstation)对应槽中加入40ml70％
乙醇、40ml变性缓冲液(PyroMark Denaturation Solution，Qiagen，979007)、50ml1×洗涤缓冲液(PyroMark Wash Buffer，Qiagen，979008)和50ml超纯水。打开真空工作站的
泵，将真空滤头(PyroMark Vacuum Prep Filter Probe)在超纯水中清洗30秒，然后将真空滤头移到震荡结束的24孔PCR板，抓取结合有PCR产物的琼脂糖珠。随后保持
真空泵开启，真空滤头依次通过70％乙醇5秒、变性缓冲液5秒和洗涤缓冲液10秒。关闭真空泵，将琼脂糖珠释放至含有测序引物的24孔加样板中，使用超纯水清洗真空滤头。将24孔加样板80℃加热5分钟，随后立即进行焦磷酸测序反应。
[0041] 第四步：在PyroMark Q24 Advanced焦磷酸测序仪上，采用PyroMark Q24 Advanced CpG Reagents(Qiagen，970922)对步骤三24孔加样板中的样本进行测序，测序运行程序及结果通过PyroMark Q24 Advanced 3.0软件进行设计和分析。甲基化水平检测结果示例见图2，如图所示百分比为对应位点的甲基化程度，正常肝组织中甲基化水平为46％，对应肝癌样本中甲基化水平为21％。
[0042] 4、数据分析
[0043] 通过IBM SPSS Statistics 21软件对数据进行统计分析，结果发现，在肝癌样本中GRB2 mRNA C2408位点的甲基化程度显著高于癌旁组织中该位点的甲基化程度(p<0.001，见图1)。对病人各项病例信息及GRB2 mRNA甲基化水平关联分析结果表明(见表1)，GRB2 mRNA甲基化水平与肝癌低分化显著相关(χ2＝18.675，p<0.001)，而与其它指标如年龄、性别等无显著关联(p>0.05)。
[0044] 综上所述，本发明可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化程度的试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对GRB2基因mRNA甲基化水平进行检测，能够快速可靠的为恶性肝癌的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。
[0045] 表1:GRB2 mRNA甲基化水平与肝癌患者各项病例指标的分析(n＝55)。
[0046]
[0047]
[0048] 注：根据肝癌样本和癌旁样本中GRB2 mRNA甲基化水平的差异将病人分成两组，甲基化水平差异高于10％的为阳性组(+)，低于10％的为阴性组(-)。N表示样本个数，通过卡方测验进行相关性分析，p<0.05具有统计学意义。
[0049] 上述说明并非对本发明的限制，本发明也不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以
权利要求书为准。
