低温保存运输培养基
阅读：79发布：2020-05-08
专利汇可以提供低温保存运输培养基专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种低温保存运输培养基，包括以下组分：黑素 皮肤 模型培养液、缓冲体系、琼脂糖、 蔗糖 、甘 氨 酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、鞘氨醇-1- 磷酸 、Y-27632和肝素。所述黑素皮肤模型培养液包括 基础 培养液、氢化可的松、胰岛素、生长因子、肾上腺素、12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、干细胞因子、谷氨酰胺、氯化 钙 和抗生素。，下面是低温保存运输培养基专利的具体信息内容。
1.黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述黑素皮肤模型培养液包括基础培养液、氢化可的松、胰岛素、生长因子、肾上腺素、12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、干细胞因子、谷氨酰胺、氯化钙和抗生素。
2.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述基础培养液为K-SFM或F12/DMEM，所述F12/DMEM中F12和DMEM的体积比为1:1。
3.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述氢化可的松在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为50-200μg/L。
4.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述胰岛素在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.2-20μg/L。
5.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述生长因子包括：β-成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和角质细胞生长因子，所述β-成纤维细胞生长因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为1-10μg/L；所述表皮生长因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.5-10ng/L；所述角质细胞生长因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.1-5ng/L。
6.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述肾上腺素在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为50-200μg/L。
7.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为1-50ng/L。
8.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述干细胞因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为10～100μg/L。
9.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述谷氨酰胺在所述所述黑素模型黑素皮肤模型培养液中的终浓度为2-6mM/L。
10.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述氯化钙在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为 0.1-5mM/L。
11.根据权利要求1所述的黑素皮肤模型培养液，其特征在于，所述抗生素包含青霉素、链霉素或二者的组合，所述青霉素、链霉素或二者的组合在所述黑素模型培养基中的体积配比为0.5-5%。
12.低温保存运输培养基，其特征在于，所述低温保存运输培养基包括以下组分：权利要求1-12任一项所述的黑素皮肤模型培养液、缓冲体系、琼脂糖、蔗糖、甘氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、鞘氨醇-1-磷酸、Y-27632和肝素。
13.根据权利要求12所述的低温保存运输培养基，其特征在于，所述缓冲体系选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸在所述低温保存运输培养基中的终浓度为1-
50mM/L。
14.权利要求13所述的低温保存运输培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）取权利要求1-12任一项所述的在黑素皮肤模型培养液，分别加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、蔗糖、甘氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、鞘氨醇-1-磷酸、Y-27632和肝素，充分溶解后，过滤除菌，获得第一组分；
2）将琼脂糖用去离子水溶解，灭菌备用，获得第二组分；
3）按照体积比1:1的比例在第二组分中缓慢加入第一组分，振荡混匀后，获得所述黑素皮肤模型低温保存运输培养基。
低温保存运输培养基
技术领域
[0001] 本发明属于组织工程技术领域，具体来说，涉及一种低温保存运输培养基。
背景技术
[0002] 黑素细胞是一种来源于外胚层神经嵴，广泛存在于机体各组织，如表皮、毛囊、真皮、眼、外周神经及交感神经干、软脑膜等结构。黑素细胞产生黑色素颗粒，传递给周围的角质形成细胞，并在角质形成细胞中重新分布，黑色素颗粒能够吸收紫外线，保护皮肤免受紫外线引起的伤害。黑素细胞的体外培养和3D皮肤模型的构建对于研究皮肤色素代谢、皮肤老化、色素障碍性疾病等的研究具有重要意义。近十年来，黑素细胞体外培养方法逐渐成熟，从单一的黑素细胞培养到含黑素细胞等多种细胞混合的皮肤模型，为理解黑色素产生和调节的复杂机制，以及白化病，白癜风，黑素瘤等疾病的发病机理和治疗提供了有用的工具，同时为化妆品和美白产品的安全性和功效性研究提供了有效模型。虽然目前已经成功开发了各种用于制备含黑素细胞的3D皮肤模型的技术，但是这些模型所需的最佳储存和运输条件很少被人关注。
[0003] 通常的皮肤模型产品需要数周才能生产，由于产品中含有活细胞，使得这类产品对于长期储存是不切实际的，所以必须在制造后数小时或数天内使用。目前皮肤模型产品必须在精心控制的条件下储存和运输，以保持活力和功能，因此皮肤模型的推广应用范围受到其保存运输条件的制约。黑素细胞的加入增加了保存运输的难度，相比于只含角质形成细胞的表皮模型，含黑素细胞的皮肤模型生产工艺更加复杂，因为黑色素的产生需要加入一定的诱导条件，如UVB照射或色素诱导因子，而通常需要数天（5～7天）的色素诱导才能出现明显的色素沉着，与此对应，色素的消除也需要数天（5～7天）的时间，所以黑素模型需要更长的生产周期和检测周期。由于含色素细胞的皮肤模型自身性能的特点，要求不仅能够在体外保持长期的组织活力，而且还要保持色素系统的正常生理功能，如关键的色素沉着蛋白质表达，黑色素生成和色素沉着刺激，从而确保测试结果的准确性，这些限制对于开发方便且成本有效的保存运输体系提出了重大挑战。
[0004] 目前常见的组织保存方法有低温保存和常温保存两种，低温保存又可以分为冷藏保存(4℃～8℃)和冷冻保存(-80℃和-196℃)，由于低温冷冻过程中易产生冰晶，破坏细胞膜和渗透平衡诱导组织损伤，影响产品应用效果。此外，冷冻保存需要使用液氮来保持温度低于-100°C，价格昂贵，比较危险，并且不是一般实验室或第三方普遍可用的。因此，组织工程皮肤模型常用的保存温度是4℃～8℃，然而，在4℃～8℃的低温条件下，尤其是在一个相对缺氧的无菌保存条件下，许多细胞在几天后收缩并显示出超微结构损伤，结果这些细胞及其组织在冷藏后不能存活。
[0005] 针对上述问题，相继出现了许多组织低温保存改进方法，如UW液(威 斯康星大学研制的低温保存液，HTS-BASE(HYPOTHERMOL)， HTS-FRS，L-15液，DMEM等。但这些保存液主要用于保存离体器官，并且应用此类保存液要求将组织器官完全浸没其中，并需要一定的设备辅助完成保存。而皮肤模型主要用于化妆品药品中化学物质成分的安全性检测，在其表面不能接触任何可能会影响测试结果的化学物质，因此上述保存方法不适用。
[0006] 中国专利200910078302.X中提到在基础培养液中加入营养物质和琼脂，制成固体培养基，用来保存组织工程皮肤，但该培养基仅限于常温保存，因地域、季节等多种因素，要维持常温保存条件需要特殊的温控设备，从而大幅度增加运输成本。中国专利201410418456.X中公开了一种可用于组织工程皮肤模型的低温保存用固体培养基及保存方法。通过给表皮细胞常用培养基中添加低温保护剂，制成基础培养液，然后将该基础培养液与琼脂糖凝胶混合凝固后形成可适于皮肤模型的固体培养基；组织工程皮肤模型嵌入该培养基中，在4℃～8℃保存后，用于检测使用。201410418456.X中公开的固体低温保存运输培养液，虽然涉及到含黑素细胞的组织工程低温保存固体培养基，能在4℃～8℃条件下有效维持模型在保存运输过程后的组织活力(保存运输时间在24h～48h内组织活力下降不超过20%)，但是复苏后模型对UVB等色素诱导刺激失去响应，并且在4℃～8℃条件下不能长期保存，超过48h模型组织活力损失大约在50%左右, 不能满足后续检测所需的活力和功能要求。
[0007] 现有技术中尚没有一种较理想的针对含黑素细胞的皮肤模型的低温保存运输体系，理想的低温保存运输体系应具有减少组织细胞低温缺氧损伤，有效保证色素诱导响应功能，同时方便操作及长途运输的特点。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于，针对现有技术中含黑素细胞的皮肤模型在保存运输中存在的组织活力降低、色素诱导响应丢失，保存后无法长期培养等问题，提供一种用于黑素皮肤模型低温保存的低温保存运输培养基。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一方面，提供一种黑素皮肤模型培养液，所述黑素皮肤模型培养液包括基础培养液、氢化可的松、胰岛素、生长因子、肾上腺素、12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、干细胞因子、谷氨酰胺、氯化钙和抗生素。
[0010] 优选地，所述基础培养液为K-SFM或F12/DMEM，所述F12/DMEM中F12和DMEM的体积比为1:1。
[0011] 优选地，所述氢化可的松在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为50-200μg/L。
[0012] 优选地，所述胰岛素在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.2-20μg/L。
[0013] 优选地，所述生长因子包括：β-成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和角质细胞生长因子，所述β-成纤维细胞生长因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为1-10μg/L；所述表皮生长因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.5-10ng/L；所述角质细胞生长因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为0.1-5ng/L。
[0014] 优选地，所述肾上腺素在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为50-200μg/L。
[0015] 优选地，所述12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为1-50ng/L。
[0016] 优选地，所述干细胞因子在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为10～100μg/L。
[0017] 优选地，所述谷氨酰胺在所述所述黑素模型黑素皮肤模型培养液中的终浓度为2-6mM/L。
[0018] 优选地，所述氯化钙在所述黑素皮肤模型培养液中的终浓度为 0.1-5mM/L。
[0020] 另一方面，提供一种低温保存运输培养基，所述低温保存运输培养基包括以下组分：权利要求1-12任一项所述的黑素皮肤模型培养液、缓冲体系、琼脂糖、蔗糖、甘氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、鞘氨醇-1-磷酸、Y-27632和肝素。
[0021] 优选地，所述缓冲体系选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸在所述低温保存运输培养基中的终浓度为1-50mM/L。
[0022] 优选地，所述琼脂糖的质量浓度为0.5％～5％。
[0023] 优选地，所述蔗糖在所述低温保存运输培养基中的终浓度为0.1～10mM/L。
[0024] 优选地，所述甘氨酸在所述低温保存运输培养基中的终浓度为0.5～50mM/L。
[0025] 优选地，所述腺苷在所述低温保存运输培养基中的终浓度为0.1～5mM/L。
[0026] 优选地，所述α-生育酚在所述低温保存运输培养基中的终浓度为0.01～1mM/L。
[0027] 优选地，所述维生素C在所述低温保存运输培养基中的终浓度为0.01～1mM/L。
[0028] 优选地，所述鞘氨醇-1-磷酸在所述低温保存运输培养基中的终浓度为0.1～10μM/L。
[0029] 优选地，所述Y-27632在所述低温保存运输培养基中的终浓度为0.01-100 μM。
[0030] 优选地，所述肝素在所述低温保存运输培养基中的终浓度为0.1-5μg/L。
[0031] 再一方面，提供上述的黑素皮肤模型低温保存运输培养基的制备方法，包括以下步骤：1）取权利要求1-12任一项所述的在黑素皮肤模型培养液，分别加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、蔗糖、甘氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、鞘氨醇-1-磷酸、Y-27632和肝素，充分溶解后，过滤除菌，获得第一组分；
2）将琼脂糖用去离子水溶解，灭菌备用，获得第二组分。
2）将琼脂糖用去离子水溶解，灭菌备用，获得第二组分。
[0032] 3）按照体积比1:1的比例在第二组分中缓慢加入第一组分，振荡混匀后，获得所述黑素皮肤模型低温保存运输培养基。
[0033] 本发明所述低温保存运输培养基的使用方法，包含以下步骤：1）在无菌环境下，将含黑素细胞的皮肤模型连同外部培养小室嵌入固体培养基，使小室底部与固体培养基接触，注意避免产生气泡以影响保存效果；
2）将固体培养基连同皮肤模型置于无菌袋中封口，4℃-25℃条件下 保存24-72小时；
3）在含黑素细胞的皮肤模型使用前，将模型放在黑素模型培养液中， 在二氧化碳培养箱中复苏18～24小时，即可用于后续检测项目。
2）将固体培养基连同皮肤模型置于无菌袋中封口，4℃-25℃条件下 保存24-72小时；
3）在含黑素细胞的皮肤模型使用前，将模型放在黑素模型培养液中， 在二氧化碳培养箱中复苏18～24小时，即可用于后续检测项目。
[0034] 相对于现有技术，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点或有益效果：因为所述黑素皮肤模型培养液包含氢化可的松、谷氨酰胺、12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、氯化钙以及胰岛素、生长因子、肾上腺素和干细胞因子等适宜浓度的因子和蛋白，可以维持一个非常适合角质形成细胞和黑色素细胞活性的外在环境，从而能够使黑素皮肤模型在体外保持长期的组织活力，而且能够保持色素系统的正常生理功能。
[0035] 本发明优选方案的低温保存运输培养基包括4-羟乙基哌嗪乙磺、蔗糖、甘氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、鞘氨醇-1-磷酸、Y-27632和肝素等有效成分，这些成分具有调节细胞离子转运、维持渗透压，清除自由基，提高细胞能量代谢率、抑制细胞凋亡等作用，可保护细胞、组织免受低温损伤。其中4-羟乙基哌嗪乙磺缓冲体系提供维持细胞活性所需的pH范围。蔗糖用于维持细胞内外液体渗透压。α-生育酚、维生素C用于维持细胞的氧化还原环境，降低ROS对细胞的伤害。鞘氨醇-1-磷酸可激活细胞存活-信号级联反应，起到细胞保护作用。Y-27632是一种选择性ROCK抑制剂，可抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的功能。
[0036] 通过优化固态培养基配方，较好地保持了含色素细胞的皮肤模型在低温保存运输后的生物学活性及色素沉着功能。固态培养基的使用，便于组织工程模型长途运输，为皮肤模型的推广应用提供了便利，具有重要的实际应用价值。
[0037] 组合应用多种黑素细胞生长和功能的调节因子以及低温保护有效成分，开发了一种适用于含色素细胞的皮肤模型低温保存运输培养基，该低温保存运输培养基能有效的降低皮肤模型在低温保存运输后的活力损失，并保持皮肤模型在保存复苏后的特异性功能，主要体现在以下三个方面：1. 所述低温保存运输培养基可有效减少皮肤模型低温保存损伤，延长保存时间，在4-
8℃ 条件下，保存72h，组织活力降低不超过30%，保存96h，组织活力降低不超过50% ，有效解决了皮肤模型保存时限较短的问题，使得皮肤模型可以通过飞机等现代化交通工具送达全国各地以及周边国家，大大增加了使用组织工程皮肤模型的范围，是一些 将保存运输温度扩大到 在保持皮肤模型生物活 性的同时，不需特殊温控设备辅助即可完成皮肤模型的低温保存运输。
8℃ 条件下，保存72h，组织活力降低不超过30%，保存96h，组织活力降低不超过50% ，有效解决了皮肤模型保存时限较短的问题，使得皮肤模型可以通过飞机等现代化交通工具送达全国各地以及周边国家，大大增加了使用组织工程皮肤模型的范围，是一些 将保存运输温度扩大到 在保持皮肤模型生物活 性的同时，不需特殊温控设备辅助即可完成皮肤模型的低温保存运输。
[0038] 2. 所述低温保存运输培养基，将保存温度的范围扩大到4-25℃，即可用于低温保存运输，也可实现常温保存运输，在4-25℃条件下，保存72h，组织活力降低不超过20%，在一般情况下不需借助特殊的温控设备即可完成皮肤模型的保存运输，降低了模型保存运输成本。
[0041] 图5为采用本发明一个实施例中的低温保存运输培养基保存0-72h的含色素细胞的皮肤模型的组织学活力(MTT实验) 检测结果。
[0042] 图6-图9为采用本发明一个实施例中的低温保存运输培养基保存0-72h的含色素细胞的皮肤模型的黑色素颗粒银染检测结果。具体实施例
[0043] 下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0044] 实施例1本实施例提供一种黑素皮肤模型培养液，所述黑素皮肤模型培养液包括基础培养液、氢化可的松、胰岛素、β-成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和角质细胞生长因子、肾上腺素、12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、干细胞因子、谷氨酰胺、氯化钙和抗生素。所述基础培养液为K-SFM或F12/DMEM，所述F12/DMEM中F12和DMEM的体积比为1:1。
[0045] 本实施例所述黑素皮肤模型培养液的制备方法，包括以下步骤：1）黑素皮肤模型培养液制备：以市售的表皮细胞培养液K-SFM为基础，取100ml的K-SFM按所示终浓度向其中添加氢化可的松50μg/L，胰岛素10μg/L，β-成纤维细胞生长因子2μg/L，表皮生长因子2ng/L，角质细胞生长因子在培养液中的终浓度为5ng/L，肾上腺素50μg/L，
12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇12ng/L，干细胞因子10μg/L，谷氨酰胺6mM/L，氯化钙1.5mM/L，1%青霉素和链霉素。
12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇12ng/L，干细胞因子10μg/L，谷氨酰胺6mM/L，氯化钙1.5mM/L，1%青霉素和链霉素。
[0046] 实施例2本实施例提供一种低温保存运输培养基，所述低温保存运输培养基包括以下组分：实施例1所述的黑素皮肤模型培养液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、琼脂糖、蔗糖、甘氨酸、腺苷、α-生育酚、维生素C、鞘氨醇-1-磷酸、Y-27632和肝素。
[0047] 本实施例所述低温保存运输培养基制备，配制方法如下：A液：取100ml 黑素模型培养液，按所示终浓度向其中添加：4-羟乙基哌嗪乙磺酸
20mM/L，蔗糖2mM/L，甘氨酸25mM/L，腺苷0.2mM/L，α-生育酚0.05mM/L，维生素C 0.05mM/L，鞘氨醇-1-磷酸10μM/L，Y-27632 10 μM，肝素3μg/L，充分溶解后使用0.22μm滤膜过滤除菌。
20mM/L，蔗糖2mM/L，甘氨酸25mM/L，腺苷0.2mM/L，α-生育酚0.05mM/L，维生素C 0.05mM/L，鞘氨醇-1-磷酸10μM/L，Y-27632 10 μM，肝素3μg/L，充分溶解后使用0.22μm滤膜过滤除菌。
[0048] B液：称取2g琼脂糖，加入100ml去离子水溶解，制成浓度为2%的琼脂糖溶液，高压灭菌备用。
[0049] 取灭菌好的B液，手握不烫手时与等体积的预先孵育至30℃的A液混合均匀，边添加边晃动，以免混合时温度下降较快导致琼脂糖溶液快速凝结。混合好的凝胶，按照每孔1.1ml迅速添加到预先准备好的无菌24孔板中，室温静置约20min左右使凝胶完全凝结。
[0050] 本实施例所述低温保存运输培养基的使用方法如下：将培养完成的含色素细胞皮肤模型连同培养小室，嵌入低温保存运输培养基表面，无菌条件下封口后，置于4℃-25℃条件下保存24-72h。
[0051] 保存结束后用37℃预温的黑素模型培养液对皮肤模型进行复温，18h后进行后续检测。
[0052] 实施例3本实施例提供一种黑素皮肤模型培养液，所述黑素皮肤模型培养液由以下方法制备而成：取F12/DMEM(1:1)培养基100ml，按所示终浓度向其中添加氢化可的松50μg/L，胰岛素10μg/L，β-成纤维细胞生长因子2μg/L，表皮生长因子2ng/L，角质细胞生长因子在培养液中的终浓度为5ng/L，肾上腺素50μg/L，12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇12ng/L，干细胞因子10μg/L，谷氨酰胺6mM/L，氯化钙1.5mM/L，1%青霉素和链霉素。
[0053] 实施例4本实施例提供一种低温保存运输培养基，所述低温保存运输培养基配制方法如下：
A液：取100ml 实施例3实施例3所述黑素皮肤模型培养液，按所示终浓度向其中添加：
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 20mM/L，蔗糖2mM/L，甘氨酸25mM/L，腺苷0.2mM/L，α-生育酚0.05mM/L，维生素C 0.05mM/L，鞘氨醇-1-磷酸10μM/L，Y-27632 10 μM，肝素3μg/L，充分溶解后使用
0.22μm滤膜过滤除菌。
A液：取100ml 实施例3实施例3所述黑素皮肤模型培养液，按所示终浓度向其中添加：
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 20mM/L，蔗糖2mM/L，甘氨酸25mM/L，腺苷0.2mM/L，α-生育酚0.05mM/L，维生素C 0.05mM/L，鞘氨醇-1-磷酸10μM/L，Y-27632 10 μM，肝素3μg/L，充分溶解后使用
0.22μm滤膜过滤除菌。
[0054] B液：称取2g琼脂糖，加入100ml去离子水溶解，制成浓度为2%的琼脂糖溶液，高压灭菌备用。
[0055] 取灭菌好的B液，手握不烫手时与等体积的预先孵育至30℃的A液混合均匀，边添加边晃动，以免混合时温度下降较快导致琼脂糖溶液快速凝结。混合好的凝胶，按照每孔1.1ml迅速添加到预先准备好的无菌24孔板中，室温静置约20min左右使凝胶完全凝结。
[0056] 使用方法如下：将培养完成的含色素细胞皮肤连同培养小室，嵌入固体培养基表面，无菌条件下封口后，置于4℃-25℃条件下保存24-72h。
[0057] 保存结束后用37℃预温的黑素模型培养液对皮肤模型进行复温，18h后进行后续检测。
[0058] 实施例5本实施例提供一种黑素模型培养液，所述黑素模型培养液制备方法如下：取K-SFM培养基100ml，按所示终浓度向其中添加氢化可的松50μg/L，胰岛素10μg/L，β-成纤维细胞生长因子2μg/L，表皮生长因子2ng/L，角质细胞生长因子在培养液中的终浓度为5ng/L，肾上腺素50μg/L，12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇12ng/L，干细胞因子10μg/L，谷氨酰胺6mM/L，氯化钙
1.5mM/L，α-黑素细胞刺激素2mM/L，内皮素-1 10mM/L。
1.5mM/L，α-黑素细胞刺激素2mM/L，内皮素-1 10mM/L。
[0059] 实施例6本实施例提供一种低温保存运输培养基，所述低温保存运输培养基的配制方法如下：
A液：取100ml 实施例5所述黑素模型培养液，按所示终浓度向其中添加：4-羟乙基哌嗪乙磺酸 20mM/L，蔗糖2mM/L，甘氨酸25mM/L，腺苷0.2mM/L，α-生育酚0.05mM/L，维生素C
0.05mM/L，鞘氨醇-1-磷酸10μM/L，Y-27632 10 μM，肝素3μg/L，充分溶解后使用0.22μm滤膜过滤除菌。
A液：取100ml 实施例5所述黑素模型培养液，按所示终浓度向其中添加：4-羟乙基哌嗪乙磺酸 20mM/L，蔗糖2mM/L，甘氨酸25mM/L，腺苷0.2mM/L，α-生育酚0.05mM/L，维生素C
0.05mM/L，鞘氨醇-1-磷酸10μM/L，Y-27632 10 μM，肝素3μg/L，充分溶解后使用0.22μm滤膜过滤除菌。
[0060] B液：称取1g琼脂糖，加入100ml去离子水溶解，制成浓度为1%的琼脂糖溶液，高压灭菌备用。
[0061] 取灭菌好的B液，手握不烫手时与等体积的预先孵育至30℃的A液混合均匀，边添加边晃动，以免混合时温度下降较快导致琼脂糖溶液快速凝结。混合好的凝胶，按照每孔1.1ml迅速添加到预先准备好的无菌24孔板中，室温静置约20min左右使凝胶完全凝结。
[0062] 使用方法如下：将未分化完成的含色素细胞皮肤模型连同培养小室，嵌入固体培养基表面，无菌条件下封口后，置于25℃条件下保存24-48h。保存结束后用，37℃预温的黑素模型培养液对皮肤模型进行复温，复温1h后更换新鲜培养液，在37℃，5%CO2孵箱中培养18h后，进行色素诱导，使用添加了α-黑素细胞刺激素和内皮素-1的黑素模型培养液继续培养6天，每天更换培养，可得到表皮分化完全的、色素沉积均匀的皮肤模型，用于进行后续检测。
[0063] 取黑素皮肤模型，使用本实施例所述低温保存运输培养基保存0-72h，组织学切片HE染色后的结果如图1-图4所示。可以看出采用本实施例所述保存运输培养基保存黑素皮肤模型可以有效防止组织损伤，保存72h后组织的活细胞层厚度稍有下降，基底层个别细胞出现凋亡，但组织形态基本正常。
[0064] 取黑素皮肤模型，使用本实施例所述低温保存运输培养基在4-25℃条件下，保存0-72h，黑素皮肤模型的组织学活力(MTT实验) 检测结果如图5所示。可以看出，保存72h，组织活力降低不超过20%。
[0065] 取黑素皮肤模型，使用本实施例所述低温保存运输培养基保存0-72h，黑素皮肤模型的黑色素颗粒银染检测结果如图6-图9所示。可以看出采用本实施例所述低温保存运输培养基保存黑素皮肤模型可以有效保护黑色素细胞的正常功能，保存72h后基底层黑素细胞仍然能够在色素诱导剂的作用下完成色素的生成和沉积。
[0066] 所述黑素皮肤模型采用专利CN201710460505.X或其他现有技术已知的方法构建而成。
[0067] 尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出多种形式的变化，这些均属于本发明保护之列。
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