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一种具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊及其制备方法

阅读：0发布：2020-06-26

专利汇可以提供一种具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊的制备方法，包括以下步骤：(1)胱胺结合的透明质酸的制备；(2)酯化胱胺结合的透明质酸的制备；(3)多功能化透明质酸(Z‑HA‑SH)的制备；(4) 氨基化叶酸的制备；(5)载药纳米胶囊前体的制备；(6)具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊的制备。本发明制备的载药纳米胶囊生物相容性好，无免疫原性，安全性高，能促进药物的生物利用度，提高抗肿瘤效果，降低对正常组织的毒副作用。，下面是一种具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)胱胺结合的透明质酸的制备
将透明质酸溶于浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS溶液中，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑反应4-6h，然后加入胱胺二盐酸盐，室温下搅拌反应22-26h，透析、干燥得胱胺结合的透明质酸；其中透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑和胱胺二盐酸盐的摩尔比为1:3:3:3；
(2)酯化胱胺结合的透明质酸的制备
将胱胺结合的透明质酸溶解于0.01mol/L，pH＝7.4的PBS和二甲基甲酰胺按体积比为
4:1的混合液中，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯和三乙胺，室温条件下搅拌反应14-15天，反应结束后，利用去离子水透析72h，然后加入二硫苏糖醇，室温条件下搅拌10-12h，接着用去离子水透析72h，最后冷冻干燥，制得侧链含烯键的酯化胱胺结合的透明质酸；其中胱胺结合的透明质酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯、三乙胺和二硫苏糖醇的摩尔比为1:20:20:5；
(3)多功能化透明质酸的制备
利用2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯和β-丙内酯开环反应制备羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体，再加入溴化亚铜、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺、2-(2-溴异丁氧基)甲基丙烯酸乙酯和侧链含烯键的酯化胱胺结合的透明质酸，油浴下反应20-24h，反应温度为60℃，制得侧链为羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯聚合物的巯基化透明质酸；其中酯化的胱胺结合的透明质酸上的烯键、羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯、溴化亚铜、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺，2-(2-溴异丁氧基)甲基丙烯酸乙酯的摩尔比为1:10:2:4:1；
(4)氨基化叶酸的制备
将叶酸溶于二甲基亚砜，然后添加二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，于50℃搅拌反应10-12h，向反应混合物中加入乙二胺和吡啶，室温搅拌反应10-14h；反应结束后，过滤，再用去离子水透析72h，最后冷冻干燥，制得；其中叶酸、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、乙二胺和吡啶的摩尔比为1:1.2:2.0:10:0.001；
(5)载药纳米胶囊前体的制备
将溶解有活性物质的有机溶剂与溶解有多功能化透明质酸的PBS溶液按体积比为1:20混合，在超声探头作用下，利用超声乳化法制备纳米胶囊，将得到的乳液置于黑暗环境下挥发除去有机溶剂，再利用去离子水透析，最后冷冻干燥，制得载药纳米胶囊前体；其中活性物质和多功能化透明质酸的质量比为1:2.5；PBS溶液的浓度为0.01mol/L，pH＝7.4；其中，活性物质为阿霉素；
(6)具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊的制备
将载药纳米胶囊前体分散于浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS溶液中，加入二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，室温搅拌反应4-6h，然后加入氨基化叶酸，室温搅拌反应12-
14h，再利用去离子水透析纯化，最后冷冻干燥，制得；其中载药纳米胶囊前体外围羧基、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、氨基化叶酸的摩尔比为1:1.2:2.0:10:0.2。
2.根据权利要求1所述的具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体的制备方法为：
①将2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯溶于无水丙酮中，使2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯的浓度为0.2mol/L；
②氮气保护下，将β-丙内酯溶于无水丙酮中，使β-丙内酯的浓度为1.2mol/L；
③将步骤②所得溶液滴加到步骤①所得溶液中反应4-6h，反应温度为10℃；其中2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯和β-丙内酯的摩尔比为1:1.2；滴加时间控制在15min之内；
④反应结束后，用无水丙酮沉淀产物，然后再用无水丙酮和无水乙醚洗涤，真空干燥，制得。
3.根据权利要求1所述的具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤(5)中有机溶剂为苯、甲苯、氯仿、环己烷、二氯甲烷或三氯甲烷。
4.根据权利要求3所述的具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊的制备方法，其特征在于，有机溶剂为三氯甲烷或二氯甲烷。
5.如权利要求1-4任一项方法制备得到的具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊。

说明书全文

一种具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊及

其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊及其制备方法。

背景技术

[0002] 化学治疗(Chemotherapy，简称化疗)为临床上恶性肿瘤的治疗提供了可行的手段，也在一定程度上提高了患者的生存率，但是由于此策略中使用的抗肿瘤化学药物自身的一些缺点，例如低水溶性、高毒性、缺乏对肿瘤部位特异性识别等，导致这一方法在临床使用中受限。纳米药物载体为解决这一问题提供了一条思路。通过纳米药物载体递送抗肿瘤药物分子，可以在避免上述药物自身缺点的同时，保证药物在血液中安全运输，提高其在肿瘤部位的蓄积，并且能够通过肿瘤微环境的信号刺激实现药物在肿瘤细胞内部的可控释放，从而最大限度的提高药物分子的生物利用度，达到抑制肿瘤生长或消退肿瘤的目的。

[0003] 纳米胶囊是一种区别于传统纳米载体诸如脂质体、纳米粒子、胶束、组装大分子等的新型纳米载体。在结构上，纳米胶囊具有稳定的壳层结构和由壳层结构构筑的大腔体组成。纳米胶囊的壳层厚度通常在数纳米至几十纳米，而大腔体结构是荷载化学药物的优良腔室。与所有纳米载体构建面临的问题一样，如何构建具有纳米尺寸并且分散性良好的纳米胶囊是制约其发展的主要原因之一。利用三维网络状的水凝胶(hydrogel)构建纳米胶囊壳层(shell)结构是解决其纳米胶囊团聚(aggregation)的可行策略。通过此方法构建的水凝胶纳米胶囊因其壳层可以吸附大量的水分子，使得其在水溶液中具有非常好的分散性。

[0004] 在构筑纳米胶囊壳层结构的同时引入具有肿瘤微环境响应的功能基团可以实现基于肿瘤微环境刺激的纳米胶囊解体，达到在特定肿瘤或肿瘤细胞部位药物释放的目的。例如，引入巯基(-SH)基团可以通过其氧化形成二硫键(-S-S-)实现胶囊壳层的交联，达到稳定胶囊结构的目的；而在肿瘤细胞内部高还原性谷胱甘肽(3-10mM)的作用下，二硫键的断裂可以触发胶囊的迅速解体，实现药物快速释放。另一方面，除了基于肿瘤部位增强的渗透和滞留作用(EPR)下的被动靶向(passive targeting)效应，引入主动靶向(active targeting)配体(targeting ligand)是促进主动的引导纳米载药系统面向肿瘤部位的有效富集。叶酸是小分子靶向配体的典型代表之一。通过叶酸与肿瘤(如，乳腺癌，肺癌，卵巢癌等)细胞上高表达(与正常细胞相比，表达量可达到100-300倍)的叶酸受体的特异性结合，可以引导纳米载药胶囊更高效的富集于肿瘤部位。但现有的抗肿瘤药物纳米胶囊递送体系有以下缺点：生物相容性差，对正常组织有毒副作用，安全性低等。

发明内容

[0005] 针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊及其制备方法，可有效解决现有的载物纳米胶囊生物相容性差，对正常组织有毒副作用，安全性低等问题。

[0006] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0007] 一种具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊的制备方法，包括以下步骤：

[0008] (1)胱胺结合的透明质酸(HA-Cys)的制备

[0009] 在含有透明质酸的PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑反应4-6h，其目的是用于活化羧基，然后加入胱胺二盐酸盐，室温条件下搅拌反应22-26h，利用去离子水透析除去未反应的分子和缩合剂等；其中透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑和胱胺二盐酸盐的摩尔比为1:3-5:3-5:3-5；

[0010] (2)酯化胱胺结合的透明质酸(GM-HA-SH)的制备

[0011] 将胱胺结合的透明质酸溶解于PBS/二甲基甲酰胺混合液中(PBS和二甲基甲酰胺的体积比为4:1，PBS浓度为0.01mol/L，pH＝7.4)，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯和三乙胺，室温条件下搅拌反应14-15天，反应结束后，利用去离子水透析72h(透析袋截留分子量3500道尔顿)，然后加入二硫苏糖醇，室温条件下搅拌10-12h，接着用去离子水透析72h(透析袋截留分子量3500道尔顿)，最后冷冻干燥，制得侧链含烯键的酯化胱胺结合的透明质酸；其中胱胺结合的透明质酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯、三乙胺和二硫苏糖醇的摩尔比为1:20-23:20-23:5-8；

[0012] (3)多功能化透明质酸(Z-HA-SH)的制备

[0013] 利用2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯和β-丙内酯开环反应制备羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体，以羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体为原料，溴化亚铜为催化剂，1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺为配体，2-(2-溴异丁氧基)甲基丙烯酸乙酯为引发剂，再加入步骤(2)中所制备的侧链含烯键的酯化胱胺结合的透明质酸(GM-HA-SH)，油浴下反应20-24h，反应温度为60℃，制备得到侧链为羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯聚合物的巯基化透明质酸；其中酯化的胱胺结合的透明质酸上的烯键、羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯、溴化亚铜、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺，2-(2-溴异丁氧基)甲基丙烯酸乙酯的摩尔比为0.8-1.2:8-12:1.5-2.5:3-5:0.8-1.2；

[0014] (4)氨基化叶酸的制备

[0015] 将叶酸溶解于二甲基亚砜中，然后添加二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，于50℃搅拌反应10-12h，向反应混合物中加入乙二胺和少量的吡啶，室温搅拌反应10-14h；反应结束后，利用0.45微米孔径的滤器过滤除去不溶物，再用去离子水透析72h(透析袋截留分子量3500道尔顿)，最后冷冻干燥，制得；其中叶酸、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、乙二胺和吡啶的摩尔比为0.8-1.2:1.2-1.5:1-3:8-12:0.001-0.002；

[0016] (5)载药纳米胶囊前体的制备

[0017] 将溶解有活性物质的有机溶剂与溶解有多功能化透明质酸的PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)按体积比为1:20混合，在超声探头作用下，利用超声乳化法制备纳米胶囊，将得到的乳液置于黑暗环境下挥发除去有机溶剂，再利用去离子水透析，除去未被包裹的活性物质，最后冷冻干燥，制得载药纳米胶囊前体；其中活性物质和氨基化叶酸的质量比为1-2:2.5-4；

[0018] (6)具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊的制备

[0019] 将步骤(5)所得的载药纳米胶囊前体分散于PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)中，加入二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺，室温搅拌反应4-6h，然后加入步骤(4)所制备的氨基化叶酸，室温搅拌反应12-14h，再利用去离子水透析透析纯化，最后冷冻干燥，制得；其中载药纳米胶囊前体外围羧基、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、氨基化叶酸的摩尔比为1:1-2:1.5-3:8-12:0.1-0.3。

[0020] 进一步地，步骤(1)中透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑和胱胺二盐酸盐的摩尔比分别为1:3:3:3。

[0021] 进一步地，步骤(2)中胱胺结合的透明质酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯、三乙胺和二硫苏糖醇的摩尔比分别为：1:20:20:5。

[0022] 进一步地，羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体的制备方法为：

[0023] ①将2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯溶于无水丙酮中，使2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯的浓度为0.2mol/L；

[0024] ②氮气保护下，将β-丙内酯溶于无水丙酮中，使β-丙内酯的浓度为1.2mol/L；

[0025] ③将步骤②所得溶液滴加到步骤①所得溶液中反应4-6h，反应温度为10℃；其中2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯和β-丙内酯的摩尔比为1:1.2；

[0026] ④反应结束后，用无水丙酮沉淀产物，然后再用无水丙酮和无水乙醚洗涤，真空干燥，制得。

[0027] 进一步地，步骤③中滴加速度为1滴/秒，滴加时间控制在15min之内。

[0028] 进一步地，步骤(3)中酯化的胱胺结合的透明质酸(GM-HA-SH)上的烯键、羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯聚合物、溴化亚铜、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺，2-(2-溴异丁氧基)甲基丙烯酸乙酯的摩尔比分别为1:10:2:4:1。

[0029] 进一步地，步骤(4)中叶酸、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、乙二胺和吡啶的摩尔比分别为1:1.2:2.0:10:0.001。

[0030] 进一步地，步骤(5)中活性物质和氨基化叶酸的质量比为1:2.5。

[0031] 进一步地，步骤(5)中活性物质为抗肿瘤药物、荧光分子、光敏剂、四氧化三铁磁粒子或金纳米粒子，优选为抗肿瘤药物，具体为阿霉素、紫杉醇或吉西他滨。

[0032] 进一步地，步骤(5)中有机溶剂为苯、甲苯、氯仿、环己烷、二氯甲烷或三氯甲烷，优选为三氯甲烷或二氯甲烷。

[0033] 进一步地，步骤(6)中载药纳米胶囊前体外围羧基、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、氨基化叶酸的摩尔比分别为1:1.2:2.0:10:0.2。

[0034] 制备过程中所用的PBS均是浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS。

[0035] 通过上述方法制备的具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊。

[0036] 本发明提供的一种具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊及其制备方法，具有以下有益效果：

[0037] 骨架材料透明质酸(HA)是构成细胞外基质和胞间质的主要成分，具有很好的生物安全性；骨架材料透明质酸(HA)可以与肿瘤部位过表达的受体结合，增强对肿瘤细胞的亲和性；利用具有高生物相容性的透明质酸(HA)三维网状结构构建胶囊壳层结构，通过吸附大量水分子，赋予其类似纳米水凝胶的性质；该纳米胶囊外围为亲水的两性离子链段(羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体聚合物)，具有较好的抗非特异性蛋白吸附特性，可以帮助纳米胶囊载体实现血液中的长循环；粒径在EPR效应(实体瘤的高通透性和滞留效应，enhanced permeability and retention effect)范围内，可实现被动靶向通过血液循环富集于肿瘤部位；具有叶酸靶向配体，可以通过主动靶向富集于具有叶酸受体高表达的肿瘤(例如，乳腺癌，肺癌，卵巢癌等)部位；HA壳层结构中具有还原性敏感的二硫键(disulfide bond)，可实现在肿瘤细胞内部高谷胱甘肽水平(glutathione，GSH)条件下断裂，实现胶囊壳层结构溶胀和解体，可以帮助药物载体从溶酶体有效逃逸，避免药物分解，同时实现在肿瘤细胞内部药物快速释放；抗肿瘤效率高，对正常组织毒副作用小。附图说明

[0038] 图1为本发明具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊的示意图；

[0039] 图2为利用透明质酸(HA)制备酯化胱胺结合的透明质酸(GM-HA-SH)化学反应过程图；

[0040] 图3为Z-HA-SH、GM-HA-SH和HA-Cys的1H-NMR表征图以及Z-HA-SH结构示意图；

[0041] 图4为制备末端氨基化的叶酸(folic acid，FA)的化学反应过程图；

[0042] 图5为具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊透射电子显微镜图(TEM)；

[0043] 图6为具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊扫描电子显微镜图(SEM)；

[0044] 图7为具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊在水溶液中的粒径分布图；

[0045] 图8为具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊在不同谷胱甘肽(GSH)浓度条件下释放曲线图；

[0046] 图9为具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊对乳腺癌细胞(4T1)的毒性作用图(以自由药盐酸阿霉素DOX·HCl为对照组)；

[0047] 图10为具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊对荷瘤小鼠的体内抑制肿瘤生长数据(以自由药盐酸阿霉素DOX·HCl和生理盐水Saline为对照组)；

[0048] 图11为具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊在荷瘤小鼠主要脏器以及肿瘤部位的蓄积随时间变化情况(左列为定性分析，右列为定量分析；以自由药盐酸阿霉素DOX·HCl为对照组)；

[0049] 图12为主要脏器的HE切片图(以自由药盐酸阿霉素DOX·HCl和生理盐水Saline为对照组；线圈或箭头所示为脏器损伤)。

具体实施方式

[0050] 具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊的示意图，如图1所示，其制备过程如下：

[0051] 实施例1胱胺结合的透明质酸(HA-Cys)的制备

[0052] 将5g透明质酸溶解于250ml PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)中，加入3倍当量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和3倍当量的1-羟基苯并三唑，室温搅拌，活化羧基4h；然后加入3倍当量的胱胺二盐酸盐，室温条件下搅拌反应24h，再利用去离子水透析72h(透析袋截留分子量3500道尔顿)，除去未反应的分子和缩合剂等；其中透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑和胱胺二盐酸盐的摩尔比为1:3:3:3。

[0053] 实施例2酯化胱胺结合的透明质酸(GM-HA-SH)的制备

[0054] 将1g胱胺结合的透明质酸(HA-Cys)溶解于25ml PBS/二甲基甲酰胺混合液中(PBS和二甲基甲酰胺的体积比为4:1)，加入过量的甲基丙烯酸缩水甘油酯和三乙胺，于室温条件下搅拌反应14天，反应结束后，利用去离子水透析72h(透析袋截留分子量3500道尔顿)，接着加入过量的二硫苏糖醇，室温条件下搅拌10h，再利用去离子水透析纯化72h(透析袋截留分子量3500道尔顿)，最后冷冻干燥，制得侧链含烯键的酯化胱胺结合的透明质酸(GM-HA-SH)；其中胱胺结合的透明质酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯、三乙胺和二硫苏糖醇的摩尔比为1:20:20:5。反应过程图如图2所示。

[0055] 实施例3多功能化透明质酸(Z-HA-SH)的制备

[0056] 利用2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯和β-丙内酯开环反应制备羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体。具体方法为：

[0057] ①将30mmol的2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯溶解到150ml无水丙酮中；

[0058] ②氮气保护条件下，将36mmol的β-丙内酯溶解于30ml无水丙酮中；

[0059] ③将步骤②所得溶液滴加到步骤①所得溶液中，保持滴加速率为1滴/秒，滴加时间控制在15min之内，然后搅拌反应5h，整个反应过程中利用冰浴将反应体系温度保持在10℃；

[0060] ④反应结束后，利用无水丙酮沉淀产物，并利用无水丙酮和无水乙醚交替洗涤多次，然后在真空干燥箱中干燥，得到白色粉末状产物即羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体。

[0061] 将所得羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体作为原料，溴化亚铜为催化剂，1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺为配体，2-(2-溴异丁氧基)甲基丙烯酸乙酯为引发剂，再加入步骤(2)中所制备的侧链含烯键的酯化胱胺结合的透明质酸(GM-HA-SH)，在无氧条件下，通过原子转移自由基聚合反应，制备得到侧链为羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯聚合物的巯基化透明质酸；整个反应过程中利用油浴将反应体系温度保持在60℃，搅拌反应24h；其中酯化的胱胺结合的透明质酸上的烯键、羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯、溴化亚铜、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺的摩尔比为1:10:2:4:1。

[0062] 将所得产物冷冻干燥，溶解于重水中(D2O)，做600MHz 1H NMR扫描，其结果如图3所示。

[0063] 实施例4氨基化叶酸的制备

[0064] 将450mg叶酸溶解于50ml二甲基亚砜中，向其中添加1.2倍当量二环己基碳二亚胺和2.0倍当量的N-羟基丁二酰亚胺，50℃搅拌反应10h，向反应混合物中加入10倍当量的乙二胺和0.001倍当量的吡啶，室温搅拌反应12h，反应结束后，利用0.45微米孔径的滤器过滤除去不溶物，再用去离子水透析72h(透析袋截留分子量3500道尔顿)，最后冷冻干燥；其中叶酸、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、乙二胺和吡啶的摩尔比为1:1.2:2.0:10:0.001。反应过程图如图4所示。

[0065] 实施例5载药纳米胶囊前体的制备与表征

[0066] 将100mg阿霉素盐酸盐分散于5ml氯仿溶剂中，加入3倍当量的三乙胺(24ul)，超声水浴处理1min；将250mg多功能化透明质酸(Z-HA-SH)溶解于100ml PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)中，与溶解有阿霉素的氯仿混合，在超声探头作用下(600W)处理5min，利用超声乳化法制备纳米胶囊；将得到的红色乳液置于黑暗环境下室温搅拌12h，以挥发除去溶剂中的氯仿，再利用去离子水透析72h(透析袋截留分子量3500道尔顿)，除去未被包裹的阿霉素后，冷冻干燥，形成载药纳米胶囊前体。

[0067] 实施例6具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊的制备

[0068] 避光条件下，将100mg载药纳米胶囊前体分散在50ml PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)中，按照纳米胶囊外围pCBMA末端羧基摩尔数(约0.046mmol)，加入1.2倍当量的二环己基碳二亚胺(10.58mg)和2倍当量的N-羟基丁二酰亚胺(10.59mg)，室温搅拌反应4h，活化羧基，再加入10倍当量的氨基化叶酸(222.41mg)，室温搅拌反应12h，利用去离子水透析72h(透析袋截留分子量3500道尔顿)，最后冷冻干燥，得到具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊。

[0069] 将所得的载药纳米胶囊分散到纯净水中，取20ul滴加到铜网上，自然干燥，做透射电子显微镜表征，如图5所示，纳米胶囊体系呈分散良好的球形结构，可见明显空腔结构，水分挥发后其平均粒径明显变小(46.00±6.09nm)。

[0070] 取20ul滴加到硅片上，自然干燥，喷金处理，做扫描电子显微镜表征，结果如图6所示，纳米胶囊呈分散的球体结构，水分挥发后其粒径与透射电子显微镜基本一致(55.52±11.88nm)。

[0071] 取100ul，添加900ul水稀释，利用马尔文激光粒度分析仪表征，得到该纳米胶囊体系在液相中的水动力学尺寸分布，如图7所示，分散在水中后，纳米胶囊吸收大量水分，使得粒径增大(189.2nm，多分散指数PDI＝0.167)。

[0072] 相关表征结果表明，所制备的纳米胶囊体系分散性良好，尺寸适宜，有利于基于肿瘤部位增强的渗透和滞留作用(EPR)效应实现被动靶向。

[0073] 实施例7不同谷胱甘肽(GSH)浓度条件下载药纳米胶囊体系的药物释放行为[0074] 称取适量实例6中的冻干载药纳米胶囊，分散于PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)中，配置成阿霉素浓度为300ug/ml的分散液，然后分装于相同体积(约1.5ml)透析袋中(透析袋截留分子量1000道尔顿)，每袋装入1ml，将其分别浸没于以下缓冲液体系中，每个条件设置三个平行：

[0075] 1)20ml的PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)，不含GSH；

[0076] 2)20ml GSH浓度为10mM的PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)；

[0077] 3)20ml GSH浓度为2.8μM的PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)。

[0078] 将以上体系置于37℃恒温水浴摇床震荡，在设计的时间点(0-72h)分别取1ml透析袋外部的缓冲液用于测定所含药物浓度，并添加1ml缓冲液以保持其体积始终为20ml。以已知浓度的阿霉素药物作为参比，根据测试结果绘制阿霉素释放曲线，如图8所示。

[0079] 结果表明，阿霉素的释放行为与GSH浓度水平相关，高浓度(GSH＝10mM)条件下，阿霉素达到了最大的释放行为，而低浓度或无GSH缓冲液中，阿霉素释放很少。具体表现为，GSH＝10mM条件下，阿霉素在前12h有突释现象，累计释放达到69.49％，延长试验时间，释放量进一步增加，在24h后达到81.91％，并一直保持此水平直到整个测试周期(72h)。作为对照，当GSH＝2.8μM和GSH＝0的缓冲液体系在12h只检测到5％甚至更低的药物释放，当测试时间到达72h，分别探测到～17％和～12％药物释放。这些结果表明，本发明的载药纳米胶囊体系其药物释放是依赖于GSH浓度水平，并且肿瘤细胞微环境的高GSH浓度可以有利于这一载药体系实现快速的胞内药物释放，进一步有益于肿瘤治疗。

[0080] 实施例8肿瘤细胞生长抑制作用

[0081] 采用商用试剂盒通过CCK8方法对本发明中的载药纳米胶囊细胞生长抑制作用进行验证。具体方法为：将小鼠乳腺癌4T1细胞(5000个)接种于96孔细胞培养板上，当细胞达到90％融合时，分别加入不同浓度(0.001，0.01，0.10，1.0，10.0和100.0μg/ml)的自由药(盐酸阿霉素，DOX·HCl)和载药纳米胶囊(DOX/FA-Z-NC)，继续培养36h，再加入CCK8试剂(每孔10μl)，在37℃条件下继续避光孵育2h，用酶标仪测定各个孔在450nm处的光吸收值。每个实验组设置5个平行样，以不加任何药物或纳米胶囊的细胞组作为空白对照并记作
100％细胞存活，计算并将实验组数据表示成细胞存活率百分比。实验结果如图9所示。

[0082] 研究结果表明，含有药物的实验组均可对肿瘤细胞的生长产生抑制作用，并且随着阿霉素浓度的增高其肿瘤细胞生长抑制作用更加明显。与自由药(盐酸阿霉素，DOX·HCl)比较，载药纳米胶囊(DOX/FA-Z-NC)具有较相近的肿瘤细胞生长毒性。

[0083] 实施例9肿瘤模型动物体内抗肿瘤能力评价

[0084] 选取BALB/c雌性裸鼠(3-4周，18-19g)建立皮下乳腺癌肿瘤模型，待肿瘤生长至3
180cm时，将荷瘤裸鼠随机分组，每组5只。通过尾静脉注射方式分别将200μl生理盐水(空白对照组)，自由药(盐酸阿霉素，DOX·HCl)和载药纳米胶囊(DOX/FA-Z-NC)注射入荷瘤裸鼠体内，阿霉素总计计量为4μg/kg(裸鼠体重)。每4天注射一次，共计5次给药。每隔两天记录肿瘤体积和荷瘤裸鼠体重变化，观察期为23天。统计肿瘤体积变化和体重变化，结果如图
10所示。

[0085] 结果表明，载药纳米胶囊(DOX/FA-Z-NC)表现出比自由药(盐酸阿霉素，DOX·HCl)组更好的肿瘤生长抑制作用。在第23天，与原始肿瘤体积大小相比，DOX/FA-Z-NCs组的肿瘤体积仅为320.15±30.2％，自由药组为477.6±65.5％，而空白对照组为881.7±48.3％。这一结果说明本发明的载药纳米胶囊体系能够较好的抑制模型动物实体瘤生长。

[0086] 实施例10载药纳米胶囊在动物体内脏器及肿瘤分布研究

[0087] 选取BALB/c雌性裸鼠(3-4周，18-19g)建立皮下乳腺癌肿瘤模型，待肿瘤生长至180cm3时，将荷瘤裸鼠随机分组，每组3只。通过尾静脉注射将自由药(盐酸阿霉素，DOX·HCl)和载药纳米胶囊(DOX/FA-Z-NC)分别注射入荷瘤裸鼠体内，阿霉素总计计量为5μg/kg(裸鼠体重)。在2h，7h和24h分别处死裸鼠，并小心剥离主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤，利用活体成像仪对其进行扫描，以表征载药纳米胶囊在动物体内分布以及随时间变化趋势，实验结果如图11所示。

[0088] 结果表明，相对于自由药组，载药纳米胶囊(DOX/FA-Z-NC)可以随时间逐步实现在肿瘤部位的稳定累积(平均信号强度789.71±21.27；单位counts)，而在肝脏和肾脏表现出了有效地清除，从而表明本发明的载药纳米胶囊可以携带药物达到肿瘤部位，且减少对主要脏器的损伤。作为对比，自由药组在肿瘤的蓄积随着时间逐渐减少(肿瘤平均信号强度329.32±22.50；单位counts)，到达24h时其在心脏的蓄积仍然明显(183.42±5.29；单位counts)，具有较强的心脏毒性。

[0089] 实施例11主要脏器的组织学研究

[0090] 在实施例9中，于第23天，处死荷瘤裸鼠，并小心剥离主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)并对其进行石蜡包埋、切片和HE染色处理。通过观察所得切片，探讨生理盐水组，自由药(盐酸阿霉素，DOX·HCl)和载药纳米胶囊(DOX/FA-Z-NC)对主要脏器生理结构的影响，结果如图12所示。

[0091] 结果表明，不进行治疗(生理盐水组)，模型动物皮下肿瘤出现了在肝脏和肺部(如图中箭头所示)的转移，表明已对主要脏器造成了伤害。自由药组表现出了肝脏部位干细胞的坏死(图中黑线圈出)和心脏部位的心肌颗粒性病变，表明仅仅给自由药治疗，会对肝脏和心脏造成一定的损伤。而载药纳米胶囊均未发现上述损伤。综合以上结果，表明本发明的载药纳米胶囊体系可以有效地减少抗肿瘤药物阿霉素对主要脏器造成损伤，并且也能避免肿瘤细胞向脏器的转移。

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