用于核酸序列分析的具有反应性表面的流动池
阅读：926发布：2020-05-08
专利汇可以提供用于核酸序列分析的具有反应性表面的流动池专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种流动池制品，其包括：腔室；以及腔室的至少一个表面，其包括：具有 反应性 表面的固体基材，其包括：共价附接于固体基材的 偶联剂 ；共价附接于偶联剂的 聚合物 ；和共价附接于聚合物的核酸探针。还公开了制造所述制品的方法和使用所述制品的方法。，下面是用于核酸序列分析的具有反应性表面的流动池专利的具体信息内容。
1.一种流动池制品，其包括：
腔室；和
腔室的至少一个表面，其包括：
具有反应性表面的固体基材，其包括：
共价附接于固体基材的偶联剂；
共价附接于偶联剂的式(I)的聚合物；
所述聚合物具有以下中的至少一种：多个马来酸酐反应性基团(m)，多个经反应的基团(n)，或者(m)和(n)的混合物，其中
X是二价NH、O或S；
R是H，取代或未取代的、直链或支链烷基，低聚(环氧乙烷)、低聚(乙二醇)、或二烷基胺；
R’是已经与马来酸酐共聚的第一不饱和单体的残基；马来酸酐反应性基团与经反应的基团的相对比值(m:n)为0.5至10；
m为1至10,000，并且n为0至9,500；和
共价附接于聚合物的核酸探针。
2.如权利要求1所述的制品，其中，核酸探针是胺封端的核酸，或胺封端的核酸的混合物。
3.如权利要求1或2所述的制品，其中，固体基材是玻璃、玻璃陶瓷、硅、熔凝二氧化硅或石英。
4.如权利要求1-3中任一项所述的制品，其中，核酸探针分子的密度是每平方微米表面积为1至500,000个探针分子。
5.如权利要求1-4中任一项所述的制品，其中，偶联剂是硅烷、倍半硅氧烷或其混合物。
6.如权利要求5所述的制品，其中硅烷是3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷，并且倍半硅氧烷是氨基丙基倍半硅氧烷。
7.一种制造如权利要求1-6中任一项所述的制品的方法，其包括：
使固体基材与偶联剂接触，以使偶联剂共价附接于固体基材而形成经偶联剂改性的固体基材；
使经偶联剂改性的固体基材与式(I)的聚合物接触以将所述聚合物共价附接于经偶联剂改性的固体基材，从而形成经聚合物和偶联剂改性的固体基材；以及使经聚合物和偶联剂改性的固体基材与核酸探针接触以将核酸探针共价附接于经聚合物和偶联剂改性的固体基材，从而形成所述制品。
8.如权利要求7所述的方法，其中，固体基材为玻璃、玻璃陶瓷、硅、熔凝二氧化硅或石英。
9.如权利要求7或8所述的方法，其还包括：通过对聚合物与核酸探针的比值进行选择来控制核酸探针的密度。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，在使经聚合物和偶联剂改性的固体基材与核酸探针接触的步骤中还包括调节小分子。
11.如权利要求10所述的方法，其中，调节小分子是乙醇胺、低聚乙二醇、聚乙二醇或其混合物。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，通过采用调节小分子与核酸探针的不同比值，调节小分子控制附接于聚合物的核酸探针的密度。
13.一种将如权利要求1所述的制品用于核酸序列分析的方法，所述方法包括：
使制品与潜在含有一种或多种核酸的样品接触，所述核酸具有与核酸探针互补的核酸序列。
用于核酸序列分析的具有反应性表面的流动池
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请依据35U.S.C.§119要求于2017年9月18日提交的系列号为62/559,951的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并将其通过引用全文纳入本文。
[0004] 背景
[0005] 本公开涉及用于核酸序列分析的具有反应性表面的流动池。发明内容
[0006] 在实施方式中，本公开提供了用于核酸序列分析的具有反应性表面的流动池制品。
[0007] 在实施方式中，本公开提供了具有胺反应性聚合涂层的流动池制品，所述胺反应性聚合涂层用于共价偶联胺封端的核酸(例如，DNA)探针分子。
[0008] 在实施方式中，本公开提供了一种流动池制品，其具有共价偶联到胺反应性聚合涂层的胺封端的核酸(例如DNA)探针分子。
[0009] 在实施方式中，可精确控制附接的核酸(例如DNA)探针分子的密度。
[0010] 在实施方式中，本公开提供了一种控制附接的胺封端的核酸(例如DNA)探针分子的密度的方法，其可精确地控制含有与核酸探针互补的接头序列的DNA片断的杂交量，这可改进多克隆簇化(clustering)和测序效率。附图说明
[0011] 在本公开的实施方式中：
[0012] 图1示出了共价偶联到固体载体的DNA探针分子的示意图(100)。
[0013] 图2示出了在不同条件下与Cy3标记的dT30杂交后，存在dA30的表面的荧光强度的条形图。
[0014] 图3示出了用0.05M NaOH处理并随后在不同条件下与Cy3标记的dT30杂交后，存在dA30的表面的荧光强度的条形图。
[0015] 图4示出了在与Cy3标记的dT30杂交后，表面的荧光图像。
[0016] 图5A和5B分别示出了具有8个通道并且每个通道由附接于反应性聚合物涂层的胺封端的dA30组成的完整流动池的照片图(5A)和荧光图(5B)。荧光图(5B)在与Cy3标记的dT30杂交后获得。
具体实施方式
[0017] 下面参考附图(若有)对本公开的各个实施方式进行详细描述。参考各个实施方式不限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的范围限制。此外，在本说明书中列出的任何实例都不是限制性的，并且仅列出了要求保护的本发明的诸多可能的实施方式中的一些实施方式。
[0018] 在实施方式中，所公开的制品及制造和使用方法提供了一个或多个优势特征或方面，包括例如，如下文所述的优势特征或方面。在任何一项权利要求中所述的特征或方面一般可适用于本发明的所有方面。在任一项权利要求中所述的任何单个或多个特征或方面可以结合任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面，或与任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面置换。
[0019] 定义
[0020] “下一代测序”、“NGS”是一种DNA测序技术类型，其利用对来自生物样品的许多DNA小片断进行平行测序来确定基因序列。NGS可用于对基因组中的每个核苷酸，或者小部分的基因组(例如外显子或预选的基因子集)进行测序。
[0021] “玻璃”或类似术语是指适合作为基材的玻璃和玻璃陶瓷。
[0022] “包括”、“包含”或类似术语意为包括但不限于，即，内含而非排他。
[0023] 在描述本公开的实施方式中所使用的修饰例如组合物中成分的量、浓度、体积、工艺温度、工艺时间、产量、流率、压力、粘度等数值及其范围，或者部件尺寸等数值及其范围的“约”是指数量的变化，可发生在例如：用于制备材料、组合物、复合物、浓缩物、部件零件、制造制品或应用制剂的典型测定和处理步骤中；这些程序中的无意误差；用来实施所述方法的起始材料或成分的制造、来源、或纯度方面的差异中；以及类似的考虑因素中。术语“约”还包括由于组合物或制剂的老化而与特定的初始浓度或混合物不同的量，以及由于混合或加工组合物或制剂而与特定的初始浓度或混合物不同的量。
[0024] “任选的”或“任选地”意为随后描述的事件或情形可发生，或可不发生，而且该描述包括事件或情形发生的情况和所述事件或情形不发生的情况。
[0025] 除非另有说明，否则，本文所用的不定冠词“一个”或“一种”及其相应的定冠词“该/所述”表示至少一个/种，或者一个/种或多个/种。
[0026] 可采用本领域普通技术人员熟知的缩写(例如，表示小时的“h”或“hrs”；表示克的“g”或“gm”；表示毫升的“mL”；表示室温的“rt”；表示纳米的“nm”以及类似缩写)。
[0027] 在组分、成分、添加剂、尺寸、条件、时间和类似方面公开的具体和优选的数值及其范围仅用于说明；它们不排除其他限定数值或限定范围内的其他数值。本公开的组合物和方法可包括本文所述的任何数值或者各数值、具体数值、更具体的数值和优选数值的任何组合，包括显义或隐义的中间数值和中间范围。
[0028] 所述实施方式、本公开一般涉及核酸分析，更具体地，涉及用于例如大规模平行基因组分析(例如，下一代测序，NGS)的方法和流动池装置。
[0029] 许多重要的分子应用，例如DNA微阵列、NGS或基于DNA的生物传感器使用合成的DNA探针分子，其附接于包括平坦二维表面的固体载体，例如玻璃、二氧化硅或硅载片，以及附接于三维表面，例如微珠和微颗粒/纳米颗粒。DNA探针分子在表面上的固定化可通过多种方法来实现，例如，静电相互作用、共价偶联、包埋及类似方法。本公开提供了用于将胺封端的DNA探针分子共价偶联到固体载体的材料和方法，以用于核酸分析，尤其是基因测序。
[0030] 在过去的几十年中，在对人类遗传变异进行分类并将这些变异与疾病易感性，对特定疗法的反应性，对危险药物副作用的易感性以及其他医学上可操作的特征相关联方面取得了非凡的进步。NGS的进步降低了每兆碱基的成本并增加了测序的基因组的数目和多样性。全基因组测序进展的关键是使用流通池将由生物DNA样品产生的数百万个DNA片段分配到流通池的表面上，以便可对几乎所有固定的片段同时测序。一些NGS技术，尤其是短读测序技术，要求将DNA片断共价固定到流动池的表面上来进行测序。对于测序效率和质量来说，重要的是实现将DNA分子稳定、可重复和最佳地附接到流动池表面上的能力。
[0031] 本公开提供了一种用于共价捕捉胺封端的DNA探针片段的反应性表面。可精确控制片段密度和位置，以使得可空间控制形成的多克隆簇，并且有效地测序且具有提高的质量。
[0032] 在实施方式中，本公开提供了一种流动池制品，其包括：
[0033] 腔室；和
[0034] 腔室的至少一个表面，其包括：
[0035] 具有反应性表面的固体基材，例如玻璃，其包括：
[0036] 共价附接于固体基材的偶联剂；
[0037] 共价附接于偶联剂的式(I)的聚合物；
[0038]
[0040] X例如可以是二价NH、O或S；
[0041] R例如可以是H，取代或未取代的、直链或支链烷基，低聚(环氧乙烷)、低聚(乙二醇)、或二烷基胺；
[0042] R’例如可以是已经与马来酸酐共聚的第一不饱和单体的残基；
[0043] 马来酸酐反应性基团与经反应的基团的相对比值(m:n)为0.5至10；
[0044] m例如可以是1至10,000，并且n例如可以是0至9,500；和共价附接于聚合物的核酸探针。
[0045] 在实施方式中，核酸探针例如可以是胺封端的核酸或核酸片段。
[0046] 在实施方式中，所述核酸探针分子的密度例如可以是对于每个式(I)的聚合物为1至10,000个探针分子。
[0047] 在实施方式中，所述核酸探针分子的密度例如可以是每平方微米的表面积为1至500,000个探针分子。优选地，当需要多克隆簇化来测序时，所述核酸探针分子的密度例如可以是每平方微米(μm2)表面积为1,000至500,000个探针分子。替代性地，当需要单分子分析用于测序时，所述核酸探针分子的密度例如可以是每μm2表面积为1至1000个探针分子。
[0048] 在实施方式中，偶联剂例如可以是胺官能化的硅烷、倍半硅氧烷或其混合物。
[0049] 在实施方式中，胺官能化的硅烷例如可以是3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷，并且倍半硅氧烷例如可以是氨基丙基倍半硅氧烷。
[0050] 在实施方式中，本公开提供了一种制造上述制品的方法，所述方法包括：
[0051] 使固体基材与偶联剂接触以使偶联剂共价附接于固体基材，从而形成经偶联剂改性的固体基材；
[0052] 使经偶联剂改性的固体基材与式(I)的聚合物接触以将所述聚合物共价附接于经偶联剂改性的固体基材，从而形成经聚合物和偶联剂改性的固体基材；以及
[0053] 使经聚合物和偶联剂改性的固体基材与核酸探针接触，这任选地在调节小分子的存在下进行，以将核酸探针共价附接于经聚合物和偶联剂改性的固体基材，从而形成制品，其中，所述调节小分子通过使用调节小分子与核酸探针的不同比值可控制附接于聚合物的核酸探针的密度。
[0054] 在实施方式中，所述调节小分子是含胺的小分子。所述调节小分子例如可选自乙醇胺、胺封端的聚乙二醇或低聚乙二醇。所述调节小分子还可防止在测序期间生物分子与表面的非特异性结合，并且在测序循环中减少背景信号。
[0055] 在实施方式中，所述方法还可包括：通过提前确定和选择(例如通过化学计量)聚合物与核酸探针的比值来控制核酸探针的密度。
[0056] 在实施方式中，本公开提供了一种将上述制品用于核酸序列分析的方法，所述方法包括：
[0057] 使制品与潜在含有一种或多种靶核酸的样品接触，所述靶核酸具有与核酸探针互补的核酸序列。
[0058] 本公开在多个方面有优势，包括例如：
[0059] 本发明能够实现将胺封端的核酸(例如DNA)探针分子(例如，5’-胺-dA30或5’-胺-dT30)迅速地共价偶联到固体载体上。相比于选择双官能连接物(例如，BS3，双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸)将胺封端的DNA偶联到存在胺的表面(例如，涂覆有ATPES的表面)时的通常16小时的偶联反应，所述偶联例如可在1小时内完成。
[0060] 相比于使用双官能连接物或其他手段的偶联，本公开将DNA探针分子更稳定地附接到固体载体上。这主要是由于聚合物层对存在胺的表面(例如APTES)的多价、牢固的锚定。由于DNA测序常需要运行许多个反应循环，并且涉及一些苛刻的处理，例如在测序读取之前的NaOH清洗以使任何双链DNA变性，因此，这是重要的。相反，基于双官能连接物的附接主要是线性的，即，胺-双官能连接物-DNA探针的表面结构，其因为这些苛刻的化学处理而易于降解损失或表面分离。
[0061] 本公开还提供了精确控制DNA探针分子与含有与探针互补的接头序列的靶DNA片断之间的杂交(并最终使其更有效杂交)的方法。这主要是由于聚合物链的柔性所致，即使在涂覆后也如此。相反，对于基于双官能连接物的DNA附接，这些DNA分子极靠近表面，因此阻止了有效杂交。
[0062] 本公开还提供了对附接于表面的DNA探针分子的密度的精确控制，这允许实现DNA杂交效率和随后的簇化效率的用户决定性调整。这种控制可以两种不同化学反应中的任一种来实现。第一种，用有机胺小分子(例如，丙胺等)使胺反应性聚合物部分改性和衍生化。这控制了聚合物在用于涂覆的溶液中的溶解度以及一旦附接于存在胺的表面时的反应位点。第二种，在特定浓度的调节小分子，例如，乙醇胺或类似试剂的存在下，用胺封端的DNA探针分子孵育经胺反应性聚合物改性的表面。该步骤控制了共价偶联反应，进而控制了附接的DNA探针分子的密度。这两种不同反应的组合允许对附接于基材表面的核酸探针分子或DNA探针分子进行优异的密度控制，并最终对所形成的簇的密度进行优异控制并具有优异的测序效率。
[0063] 本公开提供的制品和方法对基于合成测序的下一代测序(NGS)技术特别有用，在该技术中，一般先形成多克隆簇再进行测序。在探针和DNA片段分子附接于表面之后，可使用例如成桥扩增、排他性扩增或模板行走方法来实现簇生成。
[0065] 本公开对使用基于核酸的生物传感器进行的任何生物分子分析也是有用的，其中，附接的核酸探针分子的密度对生物试验的成功是重要的。
[0066] 本公开在多个其他方面也有优势，包括例如：
[0067] 所公开的流动池装置提供了胺反应性、经聚合物改性的表面，其中，胺反应性聚合物被例如含胺的小分子预衍生化，以控制胺反应性位点的数目和性质。预衍生化的聚合物在溶剂，例如，异丙醇、乙醇或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中还可具有更佳的溶解性，并且可均匀地涂覆流动池的表面。在表面与胺反应性聚合物接触之前，对流动池的至少一个表面进行预涂覆，即，与含胺硅烷反应。
[0068] 流动池例如可包括使用例如激光辅助工艺、胶带或聚酰亚胺粘合剂结合在一起的两个固体基材。这两个基材可以相同或不同。所述基材例如可以是塑料、玻璃、硅、熔凝二氧化硅或石英。流动池限定了腔室或腔体。流动池可包括，例如用于使介质流(例如液体)流到腔室及从腔室中流出的端口[参见Illumina.com；亿明达测序技术公司(Illumina Sequencing Technology)，聚焦： 测序]。
[0069] 含胺硅烷例如可以是单氨基硅烷、二氨基硅烷和三氨基硅烷，例如，γ-氨基丙基硅烷、3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、3-氨基丙基二甲基甲氧基硅烷、3-氨基丙基(二乙氧基)甲基硅烷、氨基丙基倍半硅氧烷(APS)、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、或N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺。
[0070] 含胺小分子例如可以是丙胺、烯丙胺、乙醇胺或者类似的分子或胺。
[0071] 胺反应性聚合物例如可以是聚(乙烯-交替-马来酸酐)(EMA)、苯乙烯马来酸酐(SMA)、马来酸酐共聚物，例如聚(甲基乙烯基醚-交替-马来酸酐)以及类似聚合物或其组合(参见共同拥有的US 7981665)。
[0072] 在实施方式中，本公开还提供了具有经DNA探针分子改性的表面的流动池，其中，DNA探针分子的密度可得到精确控制，从而可实现优异的DNA杂交，随后的多克隆簇形成和测序。通过在特定浓度的第二调节小分子的存在下用胺封端的DNA探针分子孵育经聚合物表面改性的流动池表面，DNA探针分子可共价附接于涂覆有胺反应性聚合物的流动池表面。
[0073] 第二调节小分子的存在可用于例如胺封端的DNA探针分子偶联反应到聚合物表面的程度，这可控制或确定所附接的探针分子的密度。胺封端的DNA探针分子与第二调节小分子的比值决定了DNA探针分子的偶联程度。取决于期望的密度，优选地，探针与调节小分子的摩尔比(P:S)例如可以是0.01:1、0.1:1、1:1、1:2、1:5、1:10；1:20、1:50、1:100、1:1000、1:10,000及类似比值，包括中间数值和范围。例如，对于使用成桥扩增的无规簇化，DNA探针分子的密度优选相对较低(例如，每平方微米表面积10,000个DNA探针分子)。对于使用模板行走的的无规簇化，DNA探针分子的密度优选相对较高(例如，每平方微米表面积250,000个DNA探针分子)。
[0074] DNA探针分子例如可以是5’-胺封端的dA30、3’-胺封端的dA30、胺封端的dT30和类似的探针分子。在实施方式中，DNA探针分子可被RNA探针分子取代以用于对RNA进行测序。
[0075] 在实施方式中，含胺的第二调节小分子优选是乙醇胺或者胺封端的聚乙二醇或低聚乙二醇。乙醇胺与聚合物涂层的酸酐基团的反应得到OH封端的富OH表面，其可防止非特异性结合，并且提供了优选的低背景信号。
[0076] 在实施方式中，本公开提供了具有胺反应性聚合物涂层或共价结合的DNA探针分子的离散点阵列的流动池。纳米图案化可例如使用最先进的光刻法或纳米压印技术来实现。
[0077] 参考附图，图1示出了共价偶联到固体载体的DNA探针分子的示意图(100)。固体载体或基材(110)先用存在胺的硅烷分子(120)改性，随后共价偶联胺反应性聚合物(130)以形成胺反应性聚合物涂层或层(140)，最后共价偶联胺封端的DNA探针分子(150)。
[0078] 图2示出了在与Cy3标记的dT30杂交后，存在dA30的表面的荧光强度的条形图。存在dA30的表面通过下述来制造：首先用γ-氨基丙基硅烷涂覆玻璃基材，随后共价附接非衍生化(对照；实心条)或丙胺衍生化的聚(乙烯-交替-马来酸酐)(经丙胺处理；星点条)，最后用5’-胺-dA30处理。在不存在以及存在三种特定浓度[即，如图所指示的2微M(微摩尔/L)、10微M和50微M]的乙醇胺的情况下对1微M Cy3-标记的dA30孵育45分钟并用磷酸盐缓冲液清洗三次后，使用荧光扫描仪扫描载片。在用Cy3-标记的dT30孵育后，还检查用磷酸盐缓冲液(“PBS”)处理的表面或“无dA30”的表面，并且用作阴性对照。
[0079] 图3示出了用0.05M NaOH处理并随后在与Cy3标记的dT30杂交后，存在dA30的表面的荧光强度的条形图。存在dA30的表面通过下述来制造：首先用γ-氨基丙基硅烷涂覆玻璃基材，随后共价附接丙胺衍生化的聚(乙烯-交替-马来酸酐)和5’-胺-dA30。之后，用缓冲液(对照；实心条)或0.05M NaOH(经NaOH处理；星点条)孵育存在dA30的表面5分钟。对表面进行洗涤后，在不存在以及存在三种特定浓度(如图所指示的2微M、10微M和50微M)的乙醇胺的情况下用1微M Cy3-标记的dA30孵育表面45分钟并用磷酸盐缓冲液清洗三次。用荧光扫描仪扫描载片。在用Cy3-标记的dT30孵育后，还检查用磷酸盐缓冲液(“PBS”)处理的表面和“无dA30”(PBS)的表面，并且用作阴性对照。
[0080] 图4示出了在与Cy3标记的dT30杂交后，孔板表面的荧光图像(可获得原始的彩色图像；未提供)。首先用γ-氨基丙基硅烷涂覆载片，随后共价附接丙胺衍生化的聚(乙烯-交替-马来酸酐)。按如下单独处理载片的各区域，其中每个字母对应于标记有a、b、c、d、e和f的孔板的孔穴图像：
[0081] (a)用10微M的胺-dA30孵育表面45分钟，清洗三次，最后用1微M的Cy3标记的dT30靶杂交。
[0082] (b)在2微M的乙醇胺的存在下，用10微M的胺-dA30孵育表面45分钟，清洗三次，最后用1微M的Cy3标记的dT30靶杂交。
[0083] (c)在10微M的乙醇胺的存在下，用10微M的胺-dA30孵育表面45分钟，清洗三次，最后用1微M的Cy3标记的dT30靶杂交。
[0084] (d)在50微M的乙醇胺的存在下，用10微M的胺-dA30孵育表面45分钟，清洗三次，最后用1微M的Cy3标记的dT30靶杂交。
[0085] (e)用1微M的Cy3标记的dT30靶直接孵育表面。
[0086] (f)用磷酸盐缓冲液直接孵育表面。
[0087] 最后，清洗、干燥并荧光扫描载片。
[0088] 再次参考附图，图5A示出了具有8个通道的完整流动池的照片图(5A)，图5B示出了其共聚焦荧光图，每个通道由附接于反应性聚合物涂层的与Cy3标记的dT30杂交后的胺封端的dA30组成。具体地，首先用γ(伽马)-氨基丙基硅烷涂覆所有通道，随后共价附接丙胺衍生化的聚(乙烯-交替-马来酸酐)。之后，在100微M的乙醇胺的存在下，用50微M的5’-胺封端的dA30孵育所有通道，随后如下所述进行进一步处理。从顶部到底部，通道1至8为：
[0089] 通道1、2、7和8：用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三次。
[0090] 通道3和6：用0.05M NaOH孵育5分钟，用PBS清洗三次。
[0091] 通道4和5：用60℃水清洗五次，每次1分钟。
[0092] 最后，所有通道均用1微M的Cy3标记的dT30孵育45分钟。在用PBS清洗三次并干燥后，使用共聚焦显微技术扫描整个流动池。将采集的所有荧光图像组装在一起以形成如图所示的整个流动池的荧光图像。
[0093] 实施例
[0094] 以下实施例证明了所公开的制品的制造、使用和分析，以及按照上述一般程序所进行的方法。
[0095] 实施例1
[0097] 替代性地，用在水中的5％氨基丙基倍半硅氧烷(APS)涂覆玻璃载片，随后清洗并在氮气下干燥。结果显示，任何一种表面改性涂覆得到关于以下的相似结果：式(I)的聚合物涂层；dA30附接；以及随后的Cy3标记的dT30杂交效率。
[0098] 实施例2
[0099] EMA涂层 涂覆有APS的载片进一步用于共价偶联被丙胺预衍生化或未被丙胺预衍生化的EMA。具体地，首先在氩气下干燥从供应商处获得的聚(乙烯-交替-马来酸酐)(EMA)，随后，在不存在或者存在特定浓度的丙胺的情况下，将其溶解到无水N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中以分别形成EMA或衍生化EMA(dEMA)的储液。通过下述进行涂覆：用EMA的NMP溶液或者dEMA的NMP溶液孵育实施例1的经硅烷涂覆的玻璃载片30分钟，随后清洗，在氩气下干燥，并且在氮气下封装在塑料封套中。结果显示，相比于经dEMA涂覆的载片，经EMA涂覆的载片具有更高的疏水性。
[0100] 实施例3
[0101] 胺封端的dA30的共价附接 通过在不存在或存在不同浓度的乙醇胺的情况下，用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的10微M的5’-胺-dA30(纯化后)孵育经EMA或dEMA涂覆的载片并且孵育不同时间，将实施例2的经EMA或dEMA表面改性的载片进一步用于共价偶联胺封端的dA30。在用PBS清洗三次并干燥后，在氮气下储存经dA30涂覆的载片并将其直接用于dT30杂交。
[0102] 实施例4
[0103] 与Cy3标记的dT30的杂交 将实施例3的经dA30涂覆的载片用于与PBS中的1微M的Cy3标记的dT30杂交30分钟。杂交后，用PBS清洗载片三次，干燥，并且使用GenePix荧光扫描仪扫描。结果显示，无dA30的表面造成低背景，这与裸玻璃或者仅用缓冲液孵育的经dA30涂覆的表面相似，提示荧光dT30的非特异性结合很少或低(参见图2和图3)。结果还显示，在dA30偶联步骤期间，乙醇胺的共存影响由与Cy3标记的dT30的杂交引起的荧光(图2)。值得关注的是，关于经EMA涂覆的载片，随着乙醇胺的浓度增加，荧光强度增加，这提示在不存在或存在低浓度乙醇胺的情况下，附接的dA30的密度高，使得由于杂交后紧密堆积的Cy3标记的dT30，杂交后其发生荧光自淬灭。
[0104] 相比之下，对于经dEMA涂覆的载片，由Cy3标记的dT30杂交所产生的荧光强度似乎对乙醇胺的存在不敏感，无论其浓度如何。这一结果提示由于附接的dA30的相对较低的密度，进而使得与Cy3标记的dT30的杂交较少，因此很少有荧光自淬灭。
[0105] 还通过用0.05M NaOH孵育经dA30表面改性的载片检查了dA30附接的稳定性。已知NaOH处理造成Si-O-Si键的断裂，从而导致损失附接的分子。结果显示NaOH处理仅略微降低由Cy3标记的dT30杂交引起的荧光强度(图3)，这提示dA30附接是稳定的。
[0106] 使用扫描仪获得的荧光图像提示，斑点的荧光非常均匀(图4)。
[0107] 实施例5
[0108] 流动池中的DNA杂交 首先对玻璃基材进行化学蚀刻以形成八个独立的通道。用水清洗后，用5重量％APS溶液涂覆基材，然后清洗三次并干燥。用衍生化的EMA进一步涂覆经APS涂覆的基材。清洗和干燥后，使用激光辅助工艺将基材与盖板玻璃结合以形成流动池，使得具有形成于玻璃基材与盖板玻璃之间的八个通道，每个通道具有进口和出口(图5A)。在组装了流动池后，用含有50微M的5’-胺封端的dA30和100微M的乙醇胺的25微升的PBS缓冲溶液孵育所有通道，孵育1小时。随后，用0.05M NaOH进一步处理通道3和6，处理5分钟，同时用60℃热水进一步处理通道4和5，处理5次，每次1分钟。最后，用PBS缓冲液清洗所有通道三次，并且干燥。用共聚焦显微技术对整个流动池进行扫描成像。如图5B所示的整个流动池的荧光图像显示，在每个通道内和所有通道上，荧光强度非常均匀，这提示，NaOH或热水处理对附接的dA30影响很小，并且附接的dA30非常稳定且支持dT30的有效杂交。
[0109] 已经参考各种具体实施方式和技术描述了本公开。但应理解，可以做出许多变化和改进而仍在本公开的范围内。
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