一种抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记及其应用
阅读：1037发布：2020-06-17
专利汇可以提供一种抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种抗 烟草 黑胫病Ph基因连 锁 的分子标记及其应用，抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的编号为Scf_30K、TM62、ST141，InDel标记为InDel0617，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系（群体）中的应用和在黑胫病抗性改良中的应用。本发明提供了与抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记及其在改良已有优良品种抗性上的应用，为抗黑胫病Ph基因的精细 定位 和基因克隆奠定 基础 ，可以在烟草抗性改良候选材料的杂交、回交及其后续世代对其进行抗性筛选，具有便捷、准确、高效、且呈共显性的优点，为利用分子标记辅助选择（MAS）改良烟草品种抗性提供便捷、实用、科学、高效的途径。，下面是一种抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记及其应用专利的具体信息内容。
1.一种抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记，其特征在于所述抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的编号为Scf_30K、TM62、ST141、InDel0617，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述分子标记所对应的4个位点的引物序列分别为：
Scf_30K序列为Scf_30KF：5’-GAGAAGCCCATCACCTTTTG-3’，
Scf_30KR：5’-TTCGAAATAAAGGCTCCCTCT-3’；
TM62序列为TM62F：5’-AG ACGGGGC TAAATTTGACA-3’，
TM62R：5’-AGCGGAAGAGTT GAGGA CA A-3’；
ST141序列为ST141F：5’-CCATTCTAGCAAAGCCCATAA-3’，
ST141R：5’-CAGA GGCAACAATGCATACG-3’；
InDel0617序列为InDel0617F：5’-TGGCTTTGCGGTCCTATTAC-3’，
InDel0617R：5’-GCTCTGCAGATGCAAAGGTT-3’。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于含有Ph基因的烟草育种材料为抗黑胫病菌0号生理小种。
3.一种权利要求1或2所述分子标记的应用，其特征在于所述分子标记在黑胫病抗性改良中的应用，包括以下具体步骤：
（1）改良烟草品种的轮回亲本♀为红花大金元，非轮回亲本♂为RBST，采用所述分子标记的引物对改良烟草品种的基因组DNA分别进行PCR扩增；
（2）对扩增结果进行凝胶电泳检测；
（3）从检测结果中筛选扩增出同时含有如SEQ ID No. 1 4所示扩增产物核苷酸序列的~
片段的材料。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于PCR反应体系为：30-50ng/µL DNA，正向和反向引物各1.0µmol/L，1.5mmol/L dNTPs，2µL 10×PCR Buffer，Buffer为Mg2+ plus的Buffer，0.75 1.0U Taq聚合酶，Taq聚合酶为TaKaRa Ltd.的rTaq，加双蒸水至20µL。
~
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸30sec，30个循环后，72℃再延伸5min。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述凝胶电泳检测指采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，1×TBE电泳缓冲液，于500V恒压电泳1.5小时分离，最后银染显色。
一种抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 红花大金元是从美国引进的大金元品种变异株选育出来的优良烤烟品种，因其花色深红而得名。红花大金元烟叶具有独特的香气特征、优良的质量风格，一直是国内最具有特色的优质烤烟品种之一，并为卷烟工业企业所青睐。但由于该品种对黑胫病（Phytophthoranicotianae）抗性较差，严重地限制了其生产规模。因此，改良红花大金元黑胫病抗性育种具有重要的现实意义。
[0003] 烟草黑胫病的抗性改良自然涉及到烟草黑胫病的抗性育种。烟草黑胫病抗性育种研究始于美国，1922年Tisdale在佛罗里达州发现大古巴和小古巴对黑胫病有抗性，通过杂交与选择，1931年育成一些高抗黑胫病的雪茄包皮烟品系，其中Florida 301抗性最好，也是各种类型中抗性最好的一个。同年育成抗黑胫病品种Rg。1943年育成第一个抗黑胫病的烤烟品种Oxford，进而育成DB101、DB102等一系列抗黑胫病的烤烟品种。此外，Johnson E S 等（Jonhson E S, Wolff M F, Wernsman E A,et al. Origin of the black shank resistance gene，Ph in tobacco cultivar Coker 371 Gold. Plant Disease， 2002， 86(10):1080-1084）首次报道了高抗烟草黑胫病0号生理小种的研究，利用RAPD 分析结果表明来自野生烟草N.plumbaginifolia和N.longiflora的黑胫病抗性基因是等位基因，并用BSA 法找到了与烤烟品种Coker 371-Gold 中抗黑胫病Ph基因连锁的RAPD 标记。发明人也曾开发了一种用于抗黑胫病Ph基因辅助选择的分子标记TM29和TM50，分别位于Ph基因两侧，与之紧密连锁，分子标记TM29与Ph基因的遗传距离为0.091cM，分子标记TM50与Ph基因的遗传距离为0.148cM。但还远远不能满足精确定向改良优质烟草品种黑胫病抗性的需求，因此深入开发研究是非常必要的。
发明内容
[0004] 本发明的第一目的在于提供一种抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记；第二目的在于提供所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的应用；第三目的在于提供所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的应用所得到的烟草品种、及其种子和无性繁殖体；第四目的在于提供所述的所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的表达盒；第五目的在于提供所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的表达盒辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系（群体）中的应用；第六目的在于提供所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的转基因细胞系；第七目的在于提供所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的转基因细胞系辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系（群体）中的应用；第八目的在于提供所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的重组菌；第九目的在于提供所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的重组菌辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系（群体）中的应用。
[0005] 本发明的第一目的是这样实现的，所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的编号为Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1（196bp）、SEQ ID No.2（490bp）、SEQ ID No.3（294bp）和SEQ ID No.4（298bp）所示。
[0006] 本发明的第二目的是这样实现的，所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系（群体）中的应用。
[0007] 所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的应用为所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记在黑胫病抗性改良中的应用，包括以下具体步骤：
[0008] （1）采用所述分子标记的引物对改良烟草品种的基因组DNA分别进行PCR扩增；
[0009] （2）对扩增结果进行凝胶电泳检测；
[0010] （3）从检测结果中筛选扩增出同时含有如SEQ ID No. 1 4所示扩增产物核苷酸序~列片段的材料。
[0011] 本发明的第三目的是这样实现的，所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的应用所得到的烟草品种、及其种子和无性繁殖体。
[0012] 本发明的第四目的是这样实现的，所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的表达盒。
[0013] 本发明的第五目的是这样实现的，所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的表达盒辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系（群体）中的应用。
[0014] 本发明的第六目的是这样实现的，所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的转基因细胞系。
[0015] 本发明的第七目的是这样实现的，所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的转基因细胞系辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系（群体）中的应用。
[0016] 本发明的第八目的是这样实现的，所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的重组菌。
[0017] 本发明的第九目的是这样实现的，所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的重组菌辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系（群体）中的应用。
[0018] 本发明以优良感病的烤烟品种红花大金元为轮回亲本♀，以具有野生烟草染色体导入片段的抗病烟草育种材料RBST为非轮回亲本♂构建F1和回交、自交群体，通过对6世代群体的表型鉴定，对抗黑胫病Ph基因进行遗传规律分析。以BC1F1群体为作图群体，利用BSA法和基于分子标记的染色体步移技术，实现Ph基因所在的野生烟草染色体片段的精细定位，并获得紧密连锁标记，不仅为抗黑胫病Ph基因的精细定位和基因克隆奠定基础，同时也为利用分子标记辅助选择（MAS）改良已有优良品种的抗性提供理论依据。
[0019] 本发明提供了与抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记，并提供了其在改良已有优良品种的抗性上的应用，为抗黑胫病Ph基因的精细定位和基因克隆奠定基础，可以在烟草抗性改良候选材料的杂交、回交及其后续世代对其进行抗性的筛选，具有便捷、准确、高效、且呈共显性的优点，为利用分子标记辅助选择（MAS）改良烟草品种抗性提供便捷、实用、科学、高效的途径。附图说明
[0020] 图1为本发明4个分子标记Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617对轮回亲本材料红花大金元、非轮回亲本材料RBST以及BC3F1和BC3F2世代入选单株的检测结果；
[0021] 其中：左侧为8株入选的BC3F1单株及轮回亲本材料红花大金元、非轮回亲本材料RBST、F1共11份样品的基因型；右侧为5株入选BC3F2单株及轮回亲本材料红花大金元、非轮回亲本材料RBST、F1共8份样品的基因型；图中最右边泳道为Marker，与之相邻的3个泳道分别为：（从左到右）轮回亲本材料红花大金元、非轮回亲本材料RBST、F1。
具体实施方式
[0022] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0023] 本发明所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的编号为Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617，其扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1（196bp）、SEQ ID No.2（490bp）、SEQ ID No.3（294bp）和SEQ ID No.4（298bp）所示。
[0024] 所述的分子标记所对应的4个位点的引物序列分别为：
[0025] Scf_30K序列为Scf_30KF：5’-GAGAAGCCCATCACCTTTTG-3’，
[0026] Scf_30KR：5’-TTCGAAATAAAGGCTCCCTCT-3’；
[0027] TM62序列为TM62F：5’-AG ACGGGGC TAAATTTGACA-3’，
[0028] T M62R：5’-AGCGGAAGAGTT GAGGA CA A-3’；
[0029] ST141序列为ST141F：5’-CCATTCTAGCAAAGCCCATAA-3’，
[0030] ST141R：5’-CAGA GGCAACAATGCATACG-3’；
[0031] InDel0617序列为InDel0617F：5’- TGGCTTTGCGGTCCTATTAC-3’，
[0032] InDel0617R：5’- GCTCTGCAGATGCAAAGGTT-3’。
[0033] 所述的含有Ph基因的烟草育种材料为抗黑胫病菌0号生理小种。
[0034] 本发明所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的应用为所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系（群体）中的应用。
[0035] 本发明所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的应用为所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记在黑胫病抗性改良中的应用，包括以下具体步骤：
[0036] （1）采用所述分子标记的引物对改良烟草品种的基因组DNA分别进行PCR扩增；
[0037] （2）对扩增结果进行凝胶电泳检测；
[0038] （3）从检测结果中筛选扩增出同时含有如SEQ ID No. 1 4所示扩增产物核苷酸序~列片段的材料。
[0039] 所述的改良烟草品种的轮回亲本♀为红花大金元，非轮回亲本♂为RBST。
[0040] 所述PCR反应体系为： 30-50ng/µL DNA，正向和反向引物各1.0µmol/L，1.5mmol/L dNTPs，2µL 10× PCR Buffer（Mg2+ plus），0.75 1.0 U Taq聚合酶（rTaq，TaKaRa Ltd.），加~双蒸水至20µL。
[0041] 所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸30sec， 30个循环后，72℃再延伸5min。
[0042] 所述凝胶电泳检测指采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，1×TBE电泳缓冲液，于500V恒压电泳1.5小时分离，最后银染显色。
[0043] 所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的应用所得到的烟草品种、及其种子和无性繁殖体。
[0044] 含有所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的表达盒。
[0045] 所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的表达盒辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系（群体）中的应用。
[0046] 含有所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的转基因细胞系。
[0047] 所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的转基因细胞系辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系（群体）中的应用。
[0048] 含有所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的重组菌。
[0049] 所述的抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记的重组菌辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系（群体）中的应用。
[0050] 下面结合实施例进行进一步的说明：
[0051] 材料与方法
[0052] 亲本选择：云南省烟草农业科学研究院烟草行业烟草生物技术重点实验室以优质烤烟品种红花大金元为轮回亲本，利用远缘杂交技术并结合母本起源的烟草单倍体育种技术培育获得的高抗烟草黑胫病0号生理小种和烟草普通花叶病的育种材料RBST（该品种因含有烟草野生种N.plumbaginifolia的染色体片段而具有烟草黑胫病0号生理小种的极高抗性）（中国发明专利申请号201410819251.2）为非轮回亲本，采用杂交、回交、，导入片段中目的抗性Ph基因分子标记定位及分子标记辅助选择技术对含有野生烟草染色体导入片段的株系进行连续4年的黑胫病0号生理小种抗性检测，筛选出高抗烟草黑胫病0号生理小种的导入系W67-23-115。该导入系的黑胫病0号生理小种抗性与供体亲本一致，其余性状与受体亲本相当，也即具有受体亲本-红花大金元的遗传背景。所用的亲本及导入系本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
[0053] 分子引物：由两部分来源构成，一是由Bindler等公开发表的5119对PT序列引物，详细结果可以参见Bindler等在Theor. Appl. Genet. 2011年第123卷发表的文章《A high density genetic map of tobacco (NicotianatabacumL.) obtained from large scale microsatellite marker development》；另一部分是由我们依据中国烟草基因组数据库（CTGDB）自行开发的13648对TM序列引物（该部分数据目前尚未公开）。PCR实验使用宝生物（TaKaRa Ltd）公司的Taq聚合酶（rTaq，TaKaRa Ltd.）和dNTPs（2.5 mM each，TaKaRa Ltd.）；电泳凝胶使用台湾生工公司的30%非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6%后使用。
[0054] 实施例1 抗黑胫病Ph基因连锁分子标记的筛选
[0055] 步骤1，烟草黑胫病表型鉴定
[0056] 2010年在云南省烟草农业科学研究院试验基地大田以红花大金元为母本，RBST为父本配制杂交F1，2011年夏季在基地大田夏季分别种植两行红花大金元和F1，以红花大金元为父本，F1为母本配制杂交产生BC1F1，成熟后全部混收；同时进行F1自交，获得F2。同年冬季至次年春季在基地阳光大棚里分别种植两行红花大金元和BC1F1，以红花大金元为父本，BC1F1为母本配制杂交产生BC2F1，成熟后全部混收。通过杂交、自交、回交，获得F1、F2及BC1F1、BC2F1群体。
[0057] 2012年夏季在基地实验大棚中采用采用162孔漂浮育苗盘对红花大金元、RBST和F1、F2、BC1F1、BC2F1进行漂浮育苗，每群体10盘，常规管理至成苗。每群体筛选整齐一致的成苗1080株移栽小花盆，菌丝块微伤贴接茎基部法测定苗期黑胫病抗性（中国发明专利申请号201510617233.0）。
[0059] 结果显示：杂交后代F1均表现为抗；F2抗感的分离比例经卡方测验符合3:1；回交群体中，抗感的比例为1:1。由此可验证，烟草黑胫病抗性是由1对核基因控制的，且为显性基因。
[0060] 步骤2，DNA提取和分子标记分析
[0061] 取烟草植株的嫩叶，用改良的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取亲本及群体各单株的基因组DNA。
[0062] PCR反应体系为：总反应体系20µL，30-50ng/µL DNA，正向和反向引物各1.0µmol/L，1.5mmol/L dNTPs，2µL 10× PCR Buffer（Mg2+ plus），0.75 1.0 U Taq聚合酶（rTaq，~TaKaRa Ltd.），加双蒸水至20µL。分子引物使用依据中国烟草基因组数据库（CTGDB）自行开发的13648对TM序列引物（该部分数据目前尚未公开）和Bindler等开发的5119对引物。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸30sec， 30个循环后，72℃再延伸5min ，16℃ for ever。扩增产物用6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为1.0×TBE，500V恒压电泳分离1.5h，电泳后银染显色，统计带型。
[0063] 步骤3，分子标记筛选、数据统计及连锁图构建
[0064] 主要包括4步：（1）筛选在父母本间表现出多态且在子一代（F1）中呈共显性的分子标记；（2）在BC1F1群体中分别选取抗、感病单株的DNA 15份，根据BSA法构建抗、感2个近等基因池，并进一步筛选与目的基因（Ph）紧密连锁的标记；（3）利用获得的多态性引物分析BC1F1群体各单株基因型；（4）利用Joinmap 4.0软件进行连锁图的绘制。
[0065] 分子标记的统计方法：与母本（红花大金元）一致的带型记为a，与父本（RBST）一致的带型记为b，杂合的带型记为h，未扩增出的或模糊不清的记为u。
[0066] 结果显示：用18767（13648 TM +5119 PT）对分子标记引物对P1（红花大金元）和P2（RBST）进行筛选，其中在两个亲本间表现多态的引物有1501对，多态率8%。
[0067] 结合BSA法建池，进一步筛选得到了32个与目标基因（Ph）连锁的分子标记。
[0068] 利用筛选出的多态性标记对红花大金元×RBST组合的BC1F1群体进行基因型分析，结合抗性调查数据利用Joinmap 4.0构建连锁图。结果显示：共有84个分子标记和目标基因（Ph）定位在同一连锁群上（LOD=10），最终获得与Ph基因紧密连锁的4个分子标记Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617，遗传距离为0.089cM。此4个标记分别位于Ph基因两侧，其中分子标记InDel0617与Ph基因的遗传距离为0.018cM（即与先前报道的标记TM29位于同一侧，但距Ph更近；中国发明专利申请号201410250226.7），分子标记Scf_30K、TM62和ST141呈共分离状态（即该3个标记间的遗传距离为0）且与Ph基因的遗传距离为0.071cM（即与先前报道的标记TM50位于同一侧；中国发明专利申请号201410250226.7）。进一步将本试验得到的连锁图与已发表的烟草遗传图谱（Bindler et al.，2011）比较，发现本连锁群与第20染色体上共有23个共有标记（PT系列序列），据此将Ph基因定位在第20染色体上。
[0069] 步骤4，标记Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617 PCR扩增差异条带的回收纯化及测序
[0070] （1）目的片段的回收
[0071] 采用煮沸法。具体操作为：先从胶上分别将标记Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617 PCR扩增的差异条带挖下来装放入1.5mL的Eppendorf管内，向管内加入100μL超纯水，加水量视胶带颜色深浅而定；常温下浸泡24h，转入95℃水浴锅（或PCR仪）中煮30min后，5000r/m离心3min。产物即可取上清3μL做模板进行PCR扩增，剩余产物置-20℃保存备用。
[0072] （2）目的片段的纯化
[0073] 用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜放置，1,2000r/m离心5min就可以得到纯化产物。
[0074] （3）目的片段与载体的连接
[0075] 反应体系为10μL：PMD18-T Vector1.0μL；Ligation bufferⅠ5.0μL；目的片段4.0μL。
[0076] 在超净工作台上加样，混匀反应物，暂短离心，16℃连接约1h，过夜也不影响连接效率。
[0077] （4）连接产物的转化
[0078] 1）取出感受态细胞，Solution A，Solution B，置于冰上融化；
[0079] 2）感受态（50μL）+5μL Solution A+4μL Solution B+46μL预冷去离子水；
[0080] 3）用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到1.5mL离心管，每管加入105μL，再加入5μL的目的DNA，轻旋混匀；
[0081] 4）42℃水浴热激90s，注意不要晃动离心管；
[0082] 5）快速将1.5mL离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3 5min；~
[0083] 6）加入500μL LB液体培养基。在37℃，150r/m摇床上预培养1h；
[0084] 7）将菌液涂布到含有100μg/mL Amp、25μg/mL IPTG和40μg/mL X-GAL的LB固体培养基上，用一无菌的弯头玻棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；
[0085] 8）倒置平板，37℃培养12 16h。~
[0086] （5）重组质粒的蓝白斑筛选
[0087] 经37℃培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中，37℃、150r/m培养过夜。
[0088] （6）菌落PCR的检测
[0089] 吸取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。取4μL PCR产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，与DNA Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。
[0090] （7）阳性克隆的测序与分析
[0091] 每个标记分别取3个阳性克隆菌液在甘油（330μL甘油中加入1000μL菌液）中各保存两份，一份-20℃保藏，一份送去测序。测序结果如SEQ ID No.1 4所示。~
[0092] 实施例2 Ph基因紧密连锁标记的应用
[0093] 品种选育：2009年冬季至次年春季在云南省烟草农业科学研究院试验基地以云南烟区推广烤烟品种红花大金元为母本，RBST为父本配制杂交F1。2010夏季在基地分别种植两行红花大金元和F1，以红花大金元为父本，F1为母本配制杂交产生BC1F1，成熟后全部混收。同年冬季至次年春季在基地阳光大棚里分别种植两行红花大金元和BC1F1，以红花大金元为父本，BC1F1为母本配制杂交产生BC2F1，成熟后全部混收。田间管理按常规方法进行。
[0094] 分子标记辅助选择：2011 年夏季在基地种植三行BC2F1，每行15株，每株采集1-2片新鲜叶片放入-80℃超低温冰箱，然后利用液氮研磨，并应用CTAB 法（Paterson AH, Brubaker CL,Wendel JF. A rapid method for extraction of cotton （Gossypium spp.） genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis [J]. Plant MolBiol Rep, 1993， 11, 2: 122-127）提取DNA，采用RBST中野生烟草染色体导入片段上与黑胫病0号生理小种抗性Ph基因紧密连锁的分子标记（表1）进行PCR 扩增，扩增体系20uL，DNA 模板
1.5uL （30-50ng/uL），95℃预变性5min，95℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸30sec，
30个循环后，72℃再延伸5min，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度为6%，电泳缓冲液为1 x TBE，500V 恒压电泳1.5 小时。选择同时含有4个分子标记目标条带的8个单株继续与红花大金元回交交获得BC3F1，种子按单株收获。
1.5uL （30-50ng/uL），95℃预变性5min，95℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸30sec，
30个循环后，72℃再延伸5min，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度为6%，电泳缓冲液为1 x TBE，500V 恒压电泳1.5 小时。选择同时含有4个分子标记目标条带的8个单株继续与红花大金元回交交获得BC3F1，种子按单株收获。
[0095] 2011年冬季至次年春季在基地阳光大棚里每个BC3F1种植三行，每行15株，共计360株，每株采集叶片并提取DNA，利用表1 提供的分子标记确定BC3F1单株的基因型，选择4个标记均存在的单株自交，获得5株BC3F2。
[0096] 2012年夏季在基地每个BC3F2种植三行，每行15株，共计15行225株，单株采集新鲜叶片，提取DNA 后，利用表1 提供的分子标记确定BC3F2单株的基因型，选择4个标记同时存在且是纯合的单株自交获得5株BC3F3。
[0097] 田间抗性鉴定：2013年夏季，入选的每个BC3F3分别在云南玉溪、云南大理、云南峨山和云南石林四个点的烟草黑胫病0号生理小种病圃种植两行，每行30株，两次重复以检测其黑胫病0号生理小种抗性。以上所述的改良红花大金元的BC3F3中选择高抗烟草黑胫病0号生理小种的家系（在四个点的病圃中所有单株均无感病），即为育成品系“改良红大”。该品系的黑胫病0号生理小种的抗性与非轮回亲本RBST一致，品质、经济性状和田间农艺性状与轮回亲本红花大金元相当。
[0098] 表1 RBST中野生烟草导入片段上与黑胫病0号生理小种抗性Ph基因紧密连锁的分子标记
[0099]
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